CN1213402A

CN1213402A - 表层蛋白的重组表达

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Publication number: CN1213402A
Application number: CN97192940A
Authority: CN
Inventors: W·卢比茨; U·斯莱尔; B·库恩; M·特鲁皮; S·霍沃卡; S·里斯奇; G·施洛尔; M·萨拉
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-02-01
Filing date: 1997-01-31
Publication date: 1999-04-07
Also published as: CA2245584A1; JP4077878B2; EP0882129B1; DE59712554D1; DE19603649A1; US6777202B2; CA2245584C; ATE316138T1; AU1720397A; EP0882129A1; US20040265936A1; NZ331300A; JP2000503850A; US20020168728A1; WO1997028263A1; AU713999B2

Abstract

本发明涉及在革兰氏阴性宿主细胞内重组制备表层蛋白(Surface-layer proteins)的方法,另外,本发明还公开了一种新的表层蛋白基因的核苷酸序列,以及制备经修饰的表层蛋白的方法。

Description

表层蛋白的重组表达

本发明涉及在革兰氏阴性宿主细胞内重组生产表层(SurfaceLayers)蛋白和经修饰的表层蛋白的方法。

在许多真杆菌(eubacteria)及大部分的古细菌(archaebacteria)中，晶状细菌细胞表层(S-layers)形成细胞壁组分的最外层(Sleytr等，1988年，晶状细菌细胞表面层，“Springer Verlag Berlin”；Messner和Sleytr，高等微生物生理学(Adv.Microb.Physiol.)，第33卷，1992年，213-275页)。大部分目前已知的表层蛋白(S-layer protein)是由一表观分子量为40,000-220,000的同种蛋白质或糖蛋白所组成。表层组分进行自我装配，大部分晶格具有斜形(p2)、四方形(p4)或六方形(p6)对称性。细菌表层的功能仍未完全了解，但由于它们位于细胞表面，这种多孔晶状表层可能主要是用作保护性被膜、分子筛，或促进细胞粘着与表面识别。

多种微生物表层基因的遗传学数据与序列信息都已经很清楚。有关综述可参见Peyret等在“分子微生物学”(Mol.Microbiol.)第9卷(1993年)第97-109页，其中给出了这些数据的详细出处。kuen等人(基因(Gene)，第145卷(1994年)，115-120页)叙述了编码嗜热脂肪芽孢杆菌PV72表层蛋白的SbsA基因的序列及此基因的克隆方法。嗜热脂肪芽孢杆菌PV72为***，其表面包裹一层六角形排列的表层。表层的主要组分为一种128KD的蛋白质，这种蛋白质在细胞内非常丰富，大约占总蛋白组分的15％。已经分离鉴定了多个嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，这些菌株的表层晶格类型、表层组分的分子量和糖基化形式各不相同(Messner和Sleytr(1992年)，出处同前)。

德国专利申请号P44 25 527.6公开了嗜热脂肪芽孢杆菌表层基因的信号肽编码区序列以及由此推断出的氨基酸序列。信号肽与成熟蛋白之间的切割位点位于氨基酸序列中第30、31位氨基酸之间。编码信号肽的核酸可有效地连接至一种编码蛋白质的核酸中，以用于蛋白质的重组生产。这种生产方法中使用了已发生转化的宿主细胞。在能促使该核酸表达、生产和分泌该核酸所编码多肽的条件下培养该宿主细胞，再从培养基中分离所产生的多肽。原核生物特别是杆菌属的革兰氏阳性生物是优选的宿主细胞。

令人惊奇的是，已经发现，不仅可以在革兰氏阳性原核宿主细胞内，还可以在革兰氏阴性原核宿主细胞内重组生产表层蛋白。在后一种情形下，表层蛋白在宿主细胞内部不是以有序的包涵体形式形成的，而是出乎意料地以有序的单分子层形式形成的。

因此，本发明的一个主题是关于重组生产表层蛋白的一种方法，这种方法的特征在于：(a)提供一种转化有编码表层蛋白的核酸的革兰氏阴性原核宿主细胞，这些核酸选自(ⅰ)含有SEQ ID No:1中第1-3684位核苷酸的核酸，其中可选择性地不含有信号肽编码区，(ⅱ)含有在遗传密码简并性范围内，与(ⅰ)中核酸一致的核苷酸序列的核酸，(ⅲ)含有能在严谨条件下，与(ⅰ)或/和(ⅱ)来源的核酸相互杂交的一段核苷酸序列的核酸；(b)在能促使该核酸表达、生产由它所编码的多肽的条件下培养宿主细胞；以及(c)从宿主细胞内分离由上述所产生的多肽。

本发明内所用术语“严谨杂交”(stringent hybridization)是指在低盐含水缓冲液(如0.2×SSC)中于55℃、优选为60℃条件下洗膜后仍能发生的杂交(参见Sambrook等(1989)，分子克隆实验室指南(Molecular Cloning.A Laboratory Manual))。

本发明的方法是在革兰氏阴性原核宿主细胞内进行的。通过此方法，出人意料地在细胞内部获得了有序表层蛋白结构。肠杆菌，尤其是大肠杆菌，可作为优选的宿主细胞。特别优选的有大肠杆菌pop2125菌株。此菌株于1996年1月31日保藏于德国德意志微生物保藏中心(“Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH”,Mascheroder Weg 1b,D 38124Braunschweig)，保藏号为DSM 10509。

本发明的方法还可用于分离重组型表层蛋白。在这种应用中，使用了编码表层蛋白的核酸。此核酸含有一个或数个编码肽或多肽的***片段。这些***片段，一方面，可以编码只含有数个氨基酸如1-25个氨基酸的肽；另一方面，它们也可以编码更大的多肽，如可达1000个氨基酸，优选为达500个氨基酸，同时并不影响表层蛋白形成正确折叠结构的能力。除***外，重组型表层蛋白还可以具有氨基酸取代，尤其是在***位点区取代单个氨基酸，也可选择性地缺失单个氨基酸、或可达30个氨基酸的短氨基酸区。

SEQ ID No:1的核苷酸序列中第1-1200和2200-3000位核苷酸区是优选的多肽编码序列***位点。尤其优选的***位点有：第582位核苷酸处的NruⅠ酶切位点、第878位核苷酸处的PvuⅡ酶切位点、第917位核苷酸处的SnaB-Ⅰ酶切位点、第2504位核苷酸处的PvuⅡ酶切位点，以及第2649位核苷酸处的PvuⅡ酶切位点。已经证明能在第581位核苷酸的NruⅠ酶切位点***编码抗生蛋白链菌素的核酸。

优选的编码肽或多肽的***有选自编码下述氨基酸的核苷酸序列：半胱氨酸残基，含有数个带电氨基酸如精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或酪氨酸残基的氨基酸区，DNA结合性抗原决定基，抗原性、变应原性或免疫原性抗原决定基，金属结合性抗原决定基，抗生蛋白链菌素、酶类，细胞因子或抗体结合性蛋白质。

编码表层蛋白的核苷酸序列中尤其优选的一种***片段是编码抗生蛋白链菌素的核苷酸序列。在此情形下，可以获得通用性的载体分子，这些载体分子可与生物素酰化试剂相偶联并用于免疫或杂交测试方法中。

更为优选的***片段例有抗原性、变应原性或免疫原性抗原决定基如来自细菌、真菌、寄生虫等病源微生物和病毒的抗原决定基，或来自植物的抗原决定基，或抗内源物质如细胞因子的抗原决定基，或抗毒素特别是内毒素等的抗原决定基。尤其优选的免疫原性抗原决定基有来源于如疤疹病毒6或假狂犬病毒(Lomniczi等，病毒学杂志(J.Virol.)，第49卷(1984年)，970-979页)等疱疹病毒，特别是来源于gB、gC或/和gD基因的抗原决定基，或来源于***病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)尤其是编码VP1、VP2或/和VP3的基因区的抗原决定基。可选择能够通过刺激T细胞等促进抗体介导的免疫反应或/和产生细胞免疫反应的抗原决定基。合适的变应原性抗原决定基有桦花粉变应原，如BetvI(Ebner等，免疫学杂志(J.Immunol.)第150卷(1993年)，1047-1054页)。更优选能够从血清或其它体液中结合并滤除如细胞因子或毒素等内源或外源物质的抗原性抗原决定基。这类抗原决定基可包括细胞因子或毒素受体组分，或抗细胞因子或毒素的抗体的组分。

另一方面，这类***片段也可编码一些酶类，优选的实例有多羟基丁酸合成所需酶类，如PHB合成酶。表层嵌入PHB合成酶后，在提供了底物羟基丁酸以及合适的条件下，能导致形成分子纺丝头(a molecular spinning nozzle)。更为优选的酶类实例有细菌荧光素酶。在此情形下，当提供了酶的底物-一种醛类，并有O2存在，则能形成分子光(a molecular laser)。

类似的优选***片段有编码白细胞介素、干扰素或肿瘤坏死因子等细胞因子的核苷酸序列。这些分子可以与免疫原性抗原决定基组合，用于疫苗的生产中。

最后，优选的***片段也可以是编码抗体结合蛋白如蛋白A或蛋白G，或DNA结合和/或金属结合性抗原决定基，如亮氨酸拉链(Leucine zipper)、锌指(zinc finger)等。

因此，本发明首次提供了细胞质内含有定位的天然形式重组多肽如活性酶类的细胞。在此情形下，每平方米重组表层可以定位50,000-200,000个，平均大约100,000个重组分子。每千克重组大肠杆菌细胞可以产生高达3000平方米的表层。

按照本发明的方法，编码表层蛋白的核酸优选地与编码***的信号肽有效地连接，比如将信号肽编码核酸连接至表层蛋白编码核酸的5’侧。令人惊奇的是，这类不能在本发明所使用的革兰氏阴性宿主细胞内进行切割的信号肽的存在能提高表层结构的稳定性。编码信号肽的核酸尤其优选地含有(a)SEQ ID No:1所示核苷酸序列内的信号肽编码区，(b)在遗传密码简并性范围内与(a)中序列一致的核苷酸序列的核酸，或/和，(c)与(a)或/和(b)中序列具有至少80％，尤其是90％以上同源性的核苷酸序列。

本发明还涉及编码重组型表层蛋白的核酸，这种核酸选自(ⅰ)含有SEQ ID No:1中第1-3684位核苷酸的核酸，该核酸可选择性地不含有信号肽编码区，(ⅱ)含有在遗传密码简并性范围内，与(ⅰ)中核酸一致的核苷酸序列的核酸，和(ⅲ)含有能在严谨条件下，与(ⅰ)或/和(ⅱ)来源的核酸相互杂交的一段核苷酸序列的核酸。SEQ ID No:1中给出了嗜热脂肪芽孢杆菌来源的表层基因SbsA的核苷酸编码区，其中包括信号肽编码区。信号肽编码区由SEQID No:1中第1至90位核苷酸序列组成，成熟SbsA多肽的编码区由第91-3684位核苷酸序列组成。

嗜热脂肪芽孢杆菌的SbsA基因编码一个具有1228个氨基酸的蛋白质，其中含30个氨基酸的N-端信号肽(SEQ ID No:2)。信号肽与成熟蛋白之间的切割位点位于氨基酸序列中第30与31位氨基酸之间。此信号肽具有碱性氨基末端结构域及其后的疏水性结构域。

与其它一些信号肽的序列比较表明，此信号肽与肠杆菌内胞外蛋白的信号肽有一定同源性，如解淀粉芽孢杆菌的碱性磷酸酶和中性磷酸酶(Vasantha等，细菌学杂志(J.Bacteriol.)，第159卷，(1984年)，811-819页)的信号肽，以及球形芽孢杆菌基因125(Bowditch等，细菌学杂志(J.Bacteriol.)),171卷(1989年)，4178-4188页)和短芽孢杆菌的OWP基因(Tsuboi等，细菌学杂志(J.Bacteriol),168卷(1986年)，365-373页)的信号肽。

本发明还涉及含有至少一拷贝按照本发明的核酸的重组载体。优选为能在原核细胞内复制的载体。尤其优选的载体是原核质粒。

本发明也涉及按照本发明、转化有核酸或重组载体的宿主细胞。该细胞优选为革兰氏阴性原核微生物，最优选为大肠杆菌细胞。按照本发明，该细胞可在其内部含有重组型表层结构。利用核酸转化细胞的方法是本领域的通用技术(参阅Sambrook等，出处同前)，因此不需叙述。

本发明还涉及重组型表层蛋白，它在SEQ ID No:2所示氨基酸序列内含有至少一个肽***片段或/和多肽***片段。优选的肽***片段和多肽***片段例前面已有叙述。

根据本发明，可以通过重组型表层蛋白组装成重组型表层结构，根据本发明，其中含有至少一种重组型表层蛋白作为亚基。另外，根据本发明，优选的表层结构还含有未经修饰的表层蛋白作为稀释分子(diluent molecules)。未经修饰的表层蛋白占总表层蛋白的摩尔数比例优选为10-99％。

根据本发明，表层结构可以含有数层，它们之间共价地或通过亲合结合的方法连接在一起。共价连接可通过如***半胱氨酸残基并随后形成胱氨酸桥而导入。亲和结合连接包括如抗体-抗原、抗体-蛋白质A或抗体-蛋白质G或抗生蛋白链菌素-生物素之间的相互作用。

含有重组型表层蛋白的表层结构也可选择性地以载体结合形式制备。此时，在肽葡聚糖载体的存在下，各独立单元可重新装配成为表层结构，形成诸如肽葡聚糖层结构，其一侧或两侧覆盖有表层结构。另一种制备载体结合性表层结构的方法是在两种介质如水/空气的界面上生成表层，再将此表层固定于固相如滤膜上(参阅如Pum和Sleytr(1994年)，稀薄固相膜(Thin Solid Films)，第244卷，882-886页；Kupcu等，(1995年)，生物化学、生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta)，第1235卷，263-269页)。

本发明的重组型表层蛋白和表层结构在诸多应用中都是适用的。尤其优选的应用是作为疫苗或辅助剂，此时，所应用的重组型表层蛋白含有免疫原性抗原决定基和/或内源免疫刺激性多肽如细胞因子。在这一应用中重组型表层蛋白的纯化并非绝对必需。相反，它们可与诸如细菌空胞(bacterial ghost)组合使用，其中细菌空胞膜上可选择性地含有额外的免疫原性抗原决定基。

制备“细菌空胞”的适宜方法在如国际专利申请PCT/EP91/00967中已有叙述，本文以此作为参考文献。该专利申请公开了一类经修饰的细菌，这类转化细菌可通过如下步骤获得：利用噬菌体来源的裂解活性膜蛋白基因、裂解活性毒素释放蛋白基因或含其中能编码裂解蛋白的部分序列的基因转化革兰氏阴性细菌，培养该细菌，表达其中的裂解基因及随后从培养基中分离由此产生的细菌空胞。

如欧洲专利0516 655所述，通过在革兰氏阴性细菌中表达重组DNA，获得的重组蛋白可结合至这些细菌的膜上。此重组DNA中含有编码疏水性、非裂解性活性膜整合蛋白结构域的第一种DNA序列。该膜整合蛋白结构域具有α-螺旋结构，包含14-20个氨基酸，在这些氨基酸的N-和C-端外侧各有2-30个任意氨基酸。与上述第一种DNA序列有效地连接了第二种DNA序列，该序列编码目的重组蛋白。另外，革兰氏阴性细菌中还含有第三种DNA序列，该序列与第一、二种DNA序列的调控方式完全不同，它编码噬菌体来源的裂解性活性膜蛋白或裂解性活性毒素释放蛋白或编码它们的裂解性活性组分。通过这类重组型革兰氏阴性细菌的表达和裂解可获得所谓的“细菌空胞”，其中所说的重组型革兰氏阴性细菌含有在表面结合了免疫原性抗原决定基的完整表面的结构。

根据本发明，当这些细菌空胞与重组型表层组合时，可获得性质非常优良的疫苗和辅助剂。

重组型表层蛋白和表层结构的又一个尤其优选的应用是用作酶反应剂。通过如本发明的、在其内部含有重组型表层结构的细胞可形成此类酶反应剂。另一方面，通过分离的、体外重新装配的表层结构或各种表层结构组合也可形成此类酶反应剂。

已经发现，革兰氏阴性的嗜热脂肪芽孢杆菌PV72除含有SbsA外，还含有另一种表层蛋白，将其命名为SbsB(Sara和Sleytr(1994年)，细菌学杂志(J.Bacteriol.)第176卷，7182-7189页)。通过合适的核酸引物进行的扩增可分离和鉴定SbsB基因。SEQ IDNo:5中给出了嗜热脂肪芽孢杆菌来源的表层基因SbsB的核苷酸编码序列，其中包括由第1-93位核苷酸组成的信号肽编码区。由此推断出的氨基酸序列示于SEQ ID No:6中。SbsB基因所编码的蛋白质总共含有921个氨基酸，其中包括31个氨基酸的N-端信号肽。

因此，本发明涉及一种编码表层蛋白的核酸，它选自：

(ⅰ)含有SEQ ID No:5中第1-2763位核苷酸序列的核酸，其中可选择性地不合有信号肽编码区，

(ⅱ)含有在遗传密码简并性范围内，与(ⅰ)中核酸一致的核苷酸序列的核酸，和

(ⅲ)含有在严谨条件下，与(ⅰ)或/和(ⅱ)来源的核酸能相互杂交的一段核苷酸序列的核酸。

与SbsA基因一样，也可在SbsB基因的表层蛋白编码区***至少一段编码肽或多肽的核酸。SbsB基因的优选***片段实例与前述SbsA基因一样。

本发明还涉及包含有至少一拷贝SbsB基因的载体，sbs基因中还可选择性地含有***片段。此载体可在真核细胞或原核细胞内复制，或在真核细胞和原核细胞内均能复制。该载体可以是能整合至宿主细胞基因组内的载体，也可以是能以染色体外形式存在的载体。根据本发明，优选的载体是质粒，尤其是原核细胞类质粒。

本发明还涉及转化有SbsB基因的宿主细胞，其中SbsB基因可选择性地包含有***片段。宿主细胞可为原核或真核细胞，优选为原核生物。革兰氏阳性生物如芽孢杆菌属生物以及革兰氏阴性生物如肠杆菌属生物特别是大肠杆菌是其中的优选。核酸转化真核和原核细胞的方法是熟知技术，不需详细解释。

本发明还涉及一种SbsB蛋白，即由上述所定义的核酸编码的表层蛋白，尤其优选的是在SbsB序列内含有一个或数个肽或/和多肽***片段的重组型SbsB蛋白。按照本发明，尤其优选的多肽内SbsB部分是与SEQ ID No:6所示氨基酸序列同源性在80％以上，最好是在90％以上。

利用重组型SbsB表层蛋白分子也可以装配成与重组型SbsA表层结构类似的重组型表层结构。此结构中优选的未修饰性表层蛋白含量为占总表层蛋白摩尔数的10-99％以上。

重组型SbsB表层蛋白和表层结构的应用与前述SbsA的应用一样。其中值得一提的是它也可用作疫苗、辅助剂或酶反应剂。

重组型表层蛋白可通过下述方法获得，其中，

(a)提供含有编码表层蛋白的核酸的宿主细胞，该核酸在其表层蛋白编码区内含有一个编码肽或多肽的***片段，

(b)在能促使该核酸表达、生产由它所编码的多肽的条件下培养该宿主细胞，和

(c)从宿主细胞或培养基中分离由此产生的多肽。

本方法的第一个优选实施方案中可以制备重组型SbsA表层蛋白。编码该重组型表层蛋白的核酸选自：

(ⅰ)含有SEQ ID No:1中第1-3684位核苷酸序列的方案核酸，其中可选择性地不合有信号肽编码区，

(ⅲ)含有能在严谨条件下，与(ⅰ)或/和(ⅱ)来源的核酸相互杂交的一段核苷酸序列的核酸。

本方法的另一个优选实施方案中能够制备重组型SbsB表层蛋白。编码该重组型表层蛋白的核酸选自

(ⅲ)含有能在严谨条件下，与(ⅰ)或/和(ⅱ)来源的核酸相互杂交的核苷酸序列的核酸。

除了嗜热脂肪芽孢杆菌的重组型SbsA和SbsB表层蛋白外，还可以制备其它生物来源的重组型表层蛋白(参阅如Peyret等，(1993年)，出处同前)。

一方面，重组型表层蛋白可在异源细胞内即自身并不具有表层基因的宿主细胞内制备，此类异源宿主细胞的例子有革兰氏阴性原核生物，如大肠杆菌。

然而，也可在革兰氏阳性生物如枯草芽孢杆菌内异源表达表层蛋白。此时，载体优选为含有天然或/和重组表层基因的整合载体。使用天然信号肽时，表层蛋白将分泌至培养基上清中。

但是，通常优选在同源宿主细胞即自身含有天然表层基因的宿主细胞内生产重组型表层蛋白。这种同源表达的一个实施方案是，宿主细胞在导入重组型表层基因后，仍能表达另一个编码未经修饰的表层蛋白的表层基因。这种未修饰的表层蛋白能形成与重组型表层蛋白相容的表层结构。此同源表达的实施例之一是嗜热脂肪芽孢杆菌PV72，该细胞含有完整的天然SbsA基因或/和SbsB基因，并转化了含有重组型表层基因的质粒。

另一个实施方案是，还可在原有表层基因失活的宿主细胞内进行同源表达。因而此时，宿主细胞内编码未修饰表层蛋白的表层基因不表达，不与重组型表层蛋白形成相容性表层结构。这种宿主细胞的一个特别例子是基因组中通过如取代内源表层基因的同源重组等方法，导入了编码重组型表层蛋白的基因的嗜热脂肪芽孢杆菌PV72细胞。另一个例子是通过如位点特异性突变或/和同源重组失活了内源表层基因，而转化了含有重组型表层基因的载体的嗜热脂肪芽孢杆菌细胞。

重组型表层基因的同源表达通常使用革兰氏阴性原核生物作为宿主细胞。尤其优选的宿主细胞是嗜热性脂肪芽孢杆菌PV72。它可以在一定的合成培养基中，在较高的温度下培养(Schuster等，(1995年)，生物技术和生物工程(Biotechnol.and Bioeng.)第48卷，66-77页)。

本发明通过下面的实施例和附图进行进一步的说明。

SEQ ID No:1示嗜热脂肪芽孢杆菌表层基因SbsA编码区的完整核苷酸序列；

SEQ ID No:2示由SEQ ID No:1来源的氨基酸序列；

SEQ ID No:3示引物T5-X的核苷酸序列；

SEQ ID No:4示引物E的核苷酸序列；

SEQ ID No:5示嗜热脂肪芽孢杆菌表层基因SbsB编码区的完整核苷酸序列；

SEQ ID No:6示由SEQ ID No:5来源的氨基酸序列；

SEQ ID No:7示抗生蛋白链菌素基因部分片段的核苷酸序列；

SEQ ID No:8示引物NIS 2AG的核苷酸序列；

SEQ ID No:9示引物LIS C3的核苷酸序列；

图1图示了用于构建重组载体pBK4的SbsA PCR片段；

图2图示了SbsA表层蛋白氨基酸序列内的肽***情形；和

图3图示了重组表层蛋白中的氨基酸取代和氨基酸***情形。

实施例：

1．菌株，培养基和质粒

***-嗜热脂肪芽孢杆菌PV72株于58℃，在SVⅢ培养基(Bartelmus和Persehak,Z.Zuckerrind，第7卷(1957年)276-281页)中培养。大肠杆菌pop2135菌株(endA,thi,hsdR,malT,cI857,λpR,malPQ)于LB培养基(Sambrook等，(1989年)，出处同前)中培养。培养基中补加氨苄青霉素至终浓度100微克/毫升以筛选转化子。质粒pPLcAT 10(λPL,bla,col E1)(Stanssens等，基因(Gene)，第36卷，(1985年)，211-223页)用作克隆载体。

2．DNA片段操作

DNA限制性酶切，琼脂糖凝胶电泳以及DNA片段的克隆均按照Sambrook等(1989年，出处同前)叙述的标准方法进行。

感受态细胞的转化是通过Bio-Rad基因脉冲仪(Bio-Rad genePulser)(Bio-Rad Laboratories,Richmond,Calif.,USA)，按照制造商的说明书，采用电击法进行的。

质粒DNA的分离是按照Birnboim和Doly的方法(核酸研究(Nucleic Acids Res.)，第7卷(1979年)，1513-1523页)。按照Ausubel等叙述的方法(分子生物学现代技术)(CurrentProtocols in Molecular Biology)(1987年)，纽约，John Wiley)分离染色体DNA。

限制性内切酶及其它酶类购自Boehringer Mannheim,NewEngland Biolabs或Stratagene公司，按照生产商的说明书使用。

3．DNA测序

利用Sanger等的双脱氧链末端终止法测定载体pPLcAT10中SbsA基因的5’和3’区的DNA序列(包括信号肽编码区)。测序引物的构建是依据已发表的SbsA序列(Kuen等，基因(Gene)，第145卷，(1994年)，115-120页)。

4．SbsA的PCR扩增

SbsA基因的PCR扩增在100μl反应体系中进行，其中含有200μM脱氧核苷酸，1单位Pfu-聚合酶(Stratagene),1×Pfu-反应缓冲液，0.5μM每种寡脱氧核苷酸引物，100ng作为模板的嗜热脂肪芽孢杆菌基因组DNA。扩增反应在热循环仪(Biomedthermocycler 60)中进行30个循环，每一循环包括以下步骤：95℃ 1.5分钟的变性步骤、56℃ 1分钟和50℃ 1分钟的退火步骤以及72℃ 2分钟的延伸步骤。

SEQ ID No:3给出了所用引物T5-X的序列，它位于SbsA基因的5’侧，含有一个XbaⅠ位点；SEQ ID No:4给出了所用另一引物E的序列，它位于SbsA基因转录终止子上游20个核苷酸处，含有一个BamHⅠ位点。

PCR扩增产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，利用GeneClean公司的***(BIO 101 La Jolla，加利福尼亚，美国)进行纯化以备克隆之用。

5．SbsA基因克隆至载体pPLcAT10中

PCR扩增出的3.79kb SbsA基因经过纯化，利用限制性内切酶XbaⅠ和BamHⅠ进行酶解。由此产生的XbaⅠ-BamHⅠ片段克隆至载体pPLcAT10的相应酶切位点内，以使SbsA基因受置于其上游的pL启动子的转录调控。克隆过程中重新设计SbsA基因的ATG起始密码子。所克隆的SbsA基因含有SbsA的N-端信号肽序列，终止于转录终止子下游20个核苷酸处。SbsA片段与载体DNA连接后，通过电转化法转化大肠杆菌pop2135株。由此获得的克隆进行DNA限制性酶切分析，对筛选出的阳性克隆进行测序以证实DNA5’和3’末端的正确序列转换，此克隆被命名为pBK4。

附图1图示了SbsA基因3.79kb XbaⅠ片段，及它在质粒pBK4的多克隆位点中的位置(简写：tT：转录终止子，ori:DNA复制起始点，amp：氨苄青霉素抗性基因)。

6．SbsA基因在大肠杆菌中的重组表达

大肠杆菌pop2135/pBK4细胞于28℃培养，直至光密度OD600达到0.3。然后，将培养温度由28℃提高至42℃以诱导SbsA基因的表达。分别于SbsA诱导表达前及1,2,3小时后取1.5ml样品。大肠杆菌pop2135/pPLcAT10(在相同条件下培养)和嗜热脂肪芽孢杆菌PV72用作对照。

通过SDS-PAGE和Western免疫杂交测定所有样品的培养基上清和细胞提取物中表层蛋白的表达。

在转化有pBK4的大肠杆菌的抽提物中，检测到额外的一条与野生型SbsA蛋白质相同分子量大小的强蛋白质条带。在诱导表达后达5小时的期间内未发现SbsA本身的降解产物。因此表层蛋白SbsA在大肠杆菌内可能比较稳定，不被蛋白酶所降解。

通过光密度法测定SbsA蛋白的相对含量。在诱导后4小时的时间点，SbsA蛋白含量约占总细胞蛋白的16％。

大肠杆菌中制备的SbsA蛋白在SDS胶上，稍比嗜热脂肪芽孢杆菌来源的天然SbsA蛋白迁移慢一些。由于N-末端的封阻，未能通过Edman降解法测出SbsA蛋白的N-端氨基酸序列。因此推测此信号肽可能不能在大肠杆菌内切割。

对大肠杆菌/pBK4的总细胞抽提物和培养基上清进行的Western杂交分析也只得到一条SbsA特异性蛋白质条带，该蛋白比嗜热脂肪芽孢杆菌来源的野生型SbsA蛋白分子量稍大一些。

Western杂交时，蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，与抗兔SbsA的多克隆抗血清一起温育。此抗血清的制备方法参见Egelseer等(细菌学杂志(J.Bacteriol.)，第177卷(1995年)，1444-1451页)的描述。利用羊抗兔IgG和碱性磷酸酶结合物检测结合型SbsA-特异性抗体。

转化有pBK4的大肠杆菌细胞，即使进行了SbsA基因的诱导表达，在培养基的上清中也不能检测到SbsA蛋白的存在。由此表明SbsA蛋白不能输出至周围培养基中。

7．表层蛋白SbsA在大肠杆菌细胞质中的定位和组成

对在表层蛋白诱导表达后1、2、3、和5小时从培养物中收集的大肠杆菌pop2135/pBK4细胞进行SbsA在胞内组成的测定。培养于28℃的未诱导细胞和嗜热脂肪芽孢杆菌PV72用作对照。

测定时，按照Messner等的方法(国际***细菌学杂志(Int.J.Syst.Bacteriol.)，第34卷(1984年)，202-210页)固定上述生物的完整细胞并包埋于检测树脂中，随后制备包埋物的超薄切片，进行乙酸双氧铀染色。

未诱导的大肠杆菌细胞的细胞质具有典型的颗粒结构。即使培养悬液的OD值增加，这种颗粒结构也不发生变化。表层蛋白诱导表达1小时后的大肠杆菌细胞，其细胞质中纵剖面具有平行的叶状结构，而横剖面的结果表明这些结构同轴排列。

SbsA诱导表达后1至2小时内，叶状结构数量明显增加，此后，数量基本保持稳定。

通过免疫金标记技术，利用SbsA特异性抗体也能检测出大肠杆菌内重组产生的SbsA蛋白。通过这种检测方法发现重组产生的SbsA蛋白也具有有序结构。

从这些形态学结果可以明显看出，SbsA蛋白并不聚集形成不规则的包涵体，而是形成单分子的表层晶体。这些SbsA-表层层在大肠杆菌内装配的一个重要特性是它们以一定距离同轴排列。信号肽序列的存在并不影响正确装配。

8．重组型SbsA表层基因的制备

8.1***一段6bp的DNA序列

用于SbsA基因位点特异性***突变的修饰性卡那霉素表达盒(1.3kb)是从质粒pWJC3(来自W.T.McAllister，纽约)中通过SmaⅠ酶切、分离获得的。此表达盒连接至SbsA基因五个不同的平末端酶切位点，即582bp处的NruⅠ位点(pSL582),917bp的SnaBⅠ位点(pSL917)以及分别位于878bp处(pSL878)、2504bp处(pSL2504)和2649bp处(pSL2649)的PvuⅡ位点。经过卡那霉素抗性克隆筛选后，利用ApaⅠ酶切去除***位点处的表达盒，再重新连接表层质粒pBK4。此切出和重新连接方法引入了一个6bp的CCCGGG(ApaⅠ限制性位点)***片段。图2图示了此接头***(Linkerinsertion)体系。

由此获得的重组型表层基因编码加长了2个氨基酸的修饰性SbsA蛋白。

图3示SbsA蛋白一级结构上的特异性变化。克隆pSL582中，该***导致SbsA蛋白在N端第194和195位氨基酸之间引入了甘氨酸和脯氨酸。克隆pSL917则在第306和307位氨基酸之间引入了丙氨酸和精氨酸。克隆pSL2649在第883和884位氨基酸之间引入了甘氨酸和脯氨酸。克隆pSL878在第293和294位氨基酸之间引入了丙氨酸和脯氨酸。另外，第293位的丙氨酸被甘氨酸所代替。克隆pSL2504中，丙氨酸和脯氨酸***至第835和836位氨基酸之间，同时第835位的丙氨酸被甘氨酸所代替。

经***突变所获得的所有克隆均保持了合成表层蛋白的能力。

为测定这些修饰性蛋白装配成表层结构的能力，按照第七部分所叙述的方法，制备诱导条件下培养4小时的完整细胞的纵向超薄切片。可观察到所有五个克隆的细胞质中都充满了平行的叶状结构，它们沿着细胞极(Cell poles)曲线排列。所测定的五个不同克隆，其细胞质均没有形态学上的差异，观察到的是与大肠杆菌内野生型SbsA蛋白装配(第7部分)完全一样的叶状结构。

8.2***编码抗生蛋白链菌素的DNA序列

为了检查SbsA蛋白内能否***更大的蛋白质序列，在前页实施例中制备的pSL582、pSL878、pSL917和pSL2649克隆的SbsA基因的ApaⅠ限制性酶切位点，***连接有ApaⅠ接头的编码部分抗生蛋白链菌素(160个氨基酸)的DNA片段(SEQ ID No:7)。此抗生蛋白链菌素序列的***位置分别为：pSL582的第197位密码子内，pSL878的第295和296位密码子之间，pSL917的第308和309位密码子内，以及pSL2649的第886位密码子内。通过SDS-PAGE和免疫杂交，在所有构建体中都有可能检测到SbsA-抗生蛋白链菌素融合蛋白的表达。通过EM分析发现，在第197位密码子内及第295、296位密码子间含有***片段的这些融合蛋白，它们也可能进行表层结构的自我装配。

SbsA-抗生蛋白链菌素融合蛋白可以单体形式分离出来，重新装配形成同型SbsA-抗生蛋白链菌素表层或混合型SbsA-抗生蛋白链菌素/SbsA表层。它们可用于结合生物素酰化物质，也可用于测定酶和其它结合型分子的结合能力。

8.3***编码BetvⅠ的DNA序列

克隆pSL878的SbsA基因的ApaⅠ位点内***一段编码桦木主要花粉过敏原BetvⅠ(161个氨基酸)的开放阅读框的DNA序列(Ferreira等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，第268卷(1993年)，19574-19580页)。有可能检测到含有免疫活性BetvⅠ结构域的SbsA-BetvⅠ融合蛋白的表达。

所获得的融合蛋白可用于治疗和诊断中。因此，可以尝试服用此融合蛋白，以将T_H2引导的IgE抗体反应转化为T_H1介导的抗BetvⅠ反应。这样，就有可能抑制花粉过敏症状的发生。另外，SbsA-BetvⅠ融合蛋白还可用于测定抗BetvⅠ的抗体的浓度或/和降低抗BetvⅠ的IgE的高浓度。

8.4***编码假狂犬病毒抗原的DNA序列

将来源于假狂犬病毒的编码gB抗原决定基SmaBB(255个氨基酸)的DNA序列(相应于EMBL-Seq:HEHSSGP2第489-1224位核苷酸)***至SbsA基因第3484位核苷酸后的SSpⅠ位点(第1161和1162位密码子之间)。有可能检测到SbsA-SmaBB融合蛋白的表达。

上述融合蛋白可用于gB特异性免疫反应的测试中。利用对应于***序列的单克隆抗体进行的Western杂交分析表明，重组型SbsA-SmaBB蛋白具有病毒结构域的免疫活性。

8.5***编码真养产碱菌H16来源的PHB合成酶(PhbC)的DNA序列

在活细胞内生产固定化酶类，以及用于“制造”生物聚合物(biopolymer)合成所用分子机器的590个氨基酸长的PHB合成酶时，一个重要目标就是在表层表面有规律地排列具酶活性的多肽结构。

从质粒p4A(Janes等，真养产碱菌H16中多羟基丁酸生物合成的分子特性。引自：新型生物降解性微生物聚合物(Novel Biodegradable Microbial Polymers)(Daves E.A.出版)，第175-190页(1990年)，Kluver,Dordrecht)通过PCR扩增出phbC基因一段1770bp长的DNA片段(对应于590个氨基酸的开放阅读框)，将此扩增片段***至SbsA克隆pSL878的ApaⅠ酶切位点，获得质粒pSbsA-PhbC。在转化有这种质粒的大肠杆菌细胞内有可能检测到约195KD大小的SbsA-PhbC融合蛋白的表达。当两拷贝的phbC基因首尾相连地***至pSL878的ApaⅠ位点，有可能检测到约260KD大小的融合蛋白的表达。

在SbsA-PhbC构建体酶活性的功能性测试中，含有质粒pSbsA-PhbC的大肠杆菌细胞与质粒pUMS进行共转化，其中pUMS含有真养产碱菌H16来源的β-酮硫解酶(β-ketothiolase,PhbA)和乙酰乙酰辅酶A还原酶(PhbB)(Kalousek等，真养产碱菌H16的PHB合成酶的遗传工程。选自：细菌多羟基链烷酸酯国际专题会议通报(Proceedings ofthe International Symposium on BacterialPolyhydroxyalkanoates)，第426-427页(1993年)，Schlegel H.G.出版，Steinbuchel A.Goltze出版社，Gottingen)。通过苏丹黑染色、气相色谱法以及电子显微镱，在共转化大肠杆菌细胞内能检测到多-β-羟基丁酸的形成。这些发现表明，SbsA-PhbC构建体具有酶学活性，代表了细胞内表层基质上酶固化的一个成功实施例。

8.6***编码细菌荧光素酶基因的DNA序列

从质粒pT7mut3(Boylan等，生物化学杂志，第264卷(1989年)，1915-1918页)中通过PCR法扩增出2070nt长的含融合蛋白LuxAB的单顺反子LuxAB基因，此LuxAB融合蛋白由哈氏弧菌来源的细菌荧光素酶的LuxA和LuxB两个亚基所组成。将上述DNA扩增片段***至按实施例8.1所制备的克隆pSL878的ApaⅠ位点，获得质粒pBK878-LuxAB。在转化有此质粒的大肠杆菌细胞内能检测到分子量约207KD的SbsA-PhbC融合蛋白的表达。按照Boylan等(出处同前)介绍的方法测定了此融合蛋白的酶活性。

9．SbsB基因的分离和特性分析

SbsB基因的分离是依据SbsB蛋白N-端以及三个内部肽的氨基酸序列进行的。在这些肽的序列基础上，设计了简并性寡核苷酸引物，用于PCR扩增。这样，从嗜热脂肪芽孢杆菌的染色体中扩增出了1076bp长的PCR片段，并对此片段进行了克隆和测序(对应于SEQ ID No.5所示序列第100-1176位核苷酸)。

通过反向PCR法扩增SbsB基因的5’侧和3’侧部分，利用多种引物组合，扩增出逐段重叠的DNA片段，并进行了测序。

序列表中含有SbsB基因5’区的SEQ ID No.8中示意了引物NIS 2AG，含有SbsB基因3’区的SEQ ID No.9中示意了引物LIS C3。这两个引物用于完整SbsB基因的扩增。

由此获得的含有SEQ ID No.5所示核苷酸序列以及5’、3’BamHⅠ酶切位点的PCR扩增片段按照实施例5叙述的方法克隆至载体pPLcAT10中。此载体内由λPL启动子调控基因表达。

另外，具有5’侧EcoRⅠ酶切位点和3’侧BamHⅠ酶切位点的SbsB PCR扩增片段克隆至由Lac启动子调控表达的pUC18载体中。

按照实施例6和7中所述的方法，通过SDS凝胶电泳和电子显微镜检测SbsB的表达。

10．重组型SbsB表层基因的制备

类似于实施例8所叙述的方法制备重组型SbsB基因。

因此，与实施例8.1所叙述的方法一样，在SbsB表层基因的多个位点导入含ApaⅠ限制性酶切位点的一段6bp长的DNA序列，由此获得分别在第407(第136位密码子内)、481(第161与162位密码子之间)和1582(第528与529位密码子之间)位核苷酸处具有ApaⅠ酶切位点的重组SbsB克隆pAK407、pAK481和pAK1582。上述经***突变产生的克隆仍保留了合成表层蛋白、形成表层结构的能力。

类似于实施例8.2所叙述的方法，将编码抗生蛋白链菌素的DNA片段***至SbsB克隆pAK407、pAK481的ApaⅠ酶切位点。

类似于实施例8.4，将编码gB抗原决定基SmaBB的DNA序列***至SbsB克隆pAK481、pAK1582的ApaⅠ酶切位点，获得重组质粒。在转化有上述重组质粒的大肠杆菌细胞内能检测到分子量大约130KD的SbsB-SmaBB融合蛋白的表达。当两拷贝的SmaBB抗原决定基编码序列首尾相连地***至DAK481的ApaⅠ位点，有可能检测到分子量大约157KD的融合蛋白的表达。通过特异性抗体可以识别该融合蛋白的SmaBB结构域。

类似于实施例8.6，在pAK407的ApaⅠ位点内***LuxAB编码序列，有可能检测到175KD的SbsB-LuxAB融合蛋白的表达。

11．在枯草芽孢杆菌中异源表达SbsA和SbsB基因

使用整合载体pX(Kim L.,Mogk A.和Schumann W.,基因，第181卷(1996年)，71-76页：一种木糖诱导性枯草芽孢杆菌整合载体及其应用)进行枯草芽孢杆菌中SbsA和SbsB的异源表达。在所获得的重组表达载体中，表层基因受xyl启动子的转录调控。染色体中整合有表层基因的枯草芽孢杆菌转化子的细胞上清中具有大量表层蛋白的表达，这种表达能被生长培养基中添加的木糖所诱导。这个结果表明，SbsA和SbsB蛋白的信号肽序列能被枯草芽孢杆菌细胞所识别。

按照类似的方法，有可能在枯草芽孢杆菌中异源表达重组型SbsA和SbsB表层基因。

序列表(1)一般信息

(ⅰ)申请人：

(A)姓名：Werner Lubitz

(B)街道：Schoenborngasse 12/7

(C)城市：Wien

(E)国家：奥地利

(F)邮编代码：1080

(A)姓名：Uwe Sleytr

(B)街道：Parhamerplatz 10

(C)城市：Wien

(E)国家：奥地利

(F)邮编代码：1170

(ⅱ)发明名称：表层蛋白的重组表达

(ⅲ)序列数：9

(ⅳ)计算机可读形式：

(A)数据携带者：Floppy disk

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作***：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：Patent In Release#1.0 Version

#1.30(EPA)(2)SEQ ID No.1信息

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：3687bp

(B)类型：核苷酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ⅵ)最初来源：

(A)生物：嗜热脂肪芽孢杆菌

(B)菌株：PV72

(ⅶ)直接来源

(B)克隆：SbsA

(ⅳ)特性：

(A)名称/要点：CDS

(B)位置：1..3684

(ⅸ)特性

(A)名称/要点：信号肽

(B)位置：1..90

(ⅸ)特性

(A)名称/要点：成熟肽

(B)位置：91..3684

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID No:1ATG GAT AGG AAA AAA GCT GTG AAA CTA GCA ACA GCA AGT GCT ATT GCA 48Met Asp Arg Lys Lys Ala Val Lys Leu Ala Thr Ala Ser Ala Ile Ala-30 -25 -20 -15GCA AGT GCA TTT GTC GCT GCA AAT CCA AAC GCT TCT GAA GCG GCT ACA 96Ala Ser Ala Phe Val Ala Ala Asn Pro Asn Ala Ser Glu Ala Ala Thr

-10 -5 1GAT GTA GCA ACA GTA GTA AGC CAA GCA AAA GCA CAG TTC AAA AAA GCA 144Asp Val Ala Thr Val Val Ser Gln Ala Lys Ala Gln Phe Lys Lys Ala

5 10 15TAC TAT ACT TAC AGC CAT ACA GTA ACG GAA ACT GGT GAA TTC CCA AAC 192Tyr Tyr Thr Tyr Ser His Thr Val Thr Glu Thr Gly Glu Phe Pro Asn

20 25 30ATT AAC GAT GTA TAT GCT GAA TAC AAC AAA GCG AAA AAA CGA TAC CGT 240Ile Asn Asp Val Tyr Ala Glu Tyr Asn Lys Ala Lys Lys Arg Tyr Arg35 40 45 50GAT GCG GTA GCA TTA GTG AAT AAA GCA GGT GGC GCG AAA AAA GAC GCT 288Asp Ala Val Ala Leu Val Asn Lys Ala Gly Gly Ala Lys Lys Asp Ala

55 60 65TAC TTA GCT GAT TTA CAA AAA GAA TAT GAA ACT TAC GTT TTC AAA GCA 336Tyr Leu Ala Asp Leu Gln Lys Glu Tyr Glu Thr Tyr Val Phe Ly6 Ala

70 75 80AAC CCT AAA TCT GGC GAA GCT CGT GTA GCA ACT TAC ATC GAT GCT TAC 384Asn Pro Lys Ser Gly Glu Ala Arg Val Ala Thr Tyr Ile Asp Ala Tyr

85 90 95AAC TAT GCA ACA AAA TTA GAC GAA ATG CGC CAA GAG CTA GAG GCT GCT 432Asn Tyr Ala Thr Lys Leu Asp Glu Met Arg Gln Glu Leu Glu Ala Ala

100 105 110GTT CAA GCA AAA GAT TTA GAA AAA GCA GAA CAA TAC TAT CAC AAA ATT 480Val Gln Ala Lys Asp Leu Glu Lys Ala Glu Gln Tyr Tyr His Lys Ile115 120 125 130CCT TAT GAA ATT AAA ACT CGC ACA GTC ATT TTA GAT CGC GTA TAT GGT 528Pro Tyr Glu Ile Lys Thr Arg Thr Val Ile Leu Asp Arg Val Tyr Gly

135 140 145AAA ACA ACT CGT GAT TTA CTT CGC TCT ACA TTT AAA GCA AAA GCA CAA 576Lys Thr Thr Arg Asp Leu Leu Arg ser Thr Phe Lys Ala Lys Ala Gln

150 155 160GAA CTT CGC GAC AGC TTA ATT TAT CAT ATT ACC GTT GCA ATG AAA GCG 624Glu Leu Arg Asp Ser Leu Ile Tyr Asp Ile Thr Val Ala Met Lys Ala

165 170 175CGC GAA GTA CAA GAC GCT GTG AAA GCA GGC AAT TTA GAC AAA GCT AAA 672Arg Glu Val Gln Asp Ala Val Lys Ala Gly Asn Leu Asp Lys Ala Lys

180 185 190GCT GCT GTT GAT CAA ATC AAT CAA TAC TTA CCA AAA GTA ACA GAT GCT 720Ala Ala Val Asp Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Pro Lys Val Thr Asp Ala195 200 205 210TTC AAA ACT GAA CTA ACA GAA GTA GCG AAA AAA GCA TTA GAT GCA GAT 768Phe Lys Thr Glu Leu Thr Glu Val Ala Lys Lys Ala Leu Asp Ala Asp

215 220 225GAA GCT GCG CTT ACT CCA AAA GTT GAA AGT GTA AGT GCG ATT AAT ACT 916Glu Ala Ala Leu Thr Pro Lys Val Glu Ser Val Ser Ala Ile Asn Thr

230 235 240CAA AAC AAA GCT GTT GAA TTA ACA GCA GTA CCA GTG AAC GGA ACA CTA 664Gln Asn Lys Ala Val Glu Leu Thr Ala Val Pro Val Asn Gly Thr Leu

245 250 255AAA TTA CAA CTT TCA GCT GCT GCA AAT GAA GAT ACA GTA AAC GTA AAT 912Lys Leu Gln Leu Ser Ala Ala Ala Asn Glu Asp Thr Val Asn Val Asn

260 265 270ACT GTA CGT ATC TAT AAA GTG GAC GGT AAC ATT CCA TTT GCC CTT AAT 960Thr Val Arg Ile Tyr Lys Val Asp Gly Asn Ile Pro Phe Ala Leu Asn275 280 285 290ACG GCA GAT GTT TCT TTA TCT ACA GAC GGA AAA ACT ATC ACT GTG GAT 1008Thr Ala Asp Val Ser Leu Ser Thr Asp Gly Lys Thr Ile Thr Val Asp

295 300 305GCT TCA ACT CCA TTC GAA AAT AAT ACG GAG TAT AAA GTA GTA GTT AAA 1056Ala Ser Thr Pro Phe Glu Asn Asn Thr Glu Tyr Lys Val Val Val Lys

310 315 320GGT ATT AAA GAC AAA AAT GGC AAA GAA TTT AAA GAA GAT GCA TTC ACT 1104Gly Ile Lys Asp Lys Asn Gly Lys Glu Phe Lys Glu Asp Ala Phe Thr

325 330 335TTC AAG CTT CGA AAT GAT GCT GTA GTT ACT CAA GTG TTT GGA ACT AAT 1152Phe Lys Leu Arg Asn Asp Ala Val Val Thr Gln Val Phe Gly Thr Asn

340 345 350GTA ACA AAC AAC ACT TCT GTA AAC TTA GCA GCA GGT ACT TTC GAC ACT 1200Val Thr Asn Asn Thr Ser Val Asn Leu Ala Ala Gly Thr Phe Asp Thr355 360 365 370GAC GAT ACT TTA ACA GTA GTA TTT GAT AAG TTG TTA GCA CCT GAA ACT 1248Asp Asp Thr Leu Thr Val Val Phe Asp Lys Leu Leu Ala Pro Glu Thr

375 380 385GTA AAC AGC TCG AAC GTT ACT ATT ACA GAT GTT GAA ACT GGA AAA CGC 1296Val Asn Ser Ser Asn Val Thr Ile Thr Asp Val Glu Thr Gly Lys Arg

390 395 600ATT CCA GTA ATT GCA TCT ACT TCT GGT TCT ACA ATT ACT ATT ACG TTA 1344Ile Pro Val Ile Ala Ser Thr Ser Gly Ser Thr Ile Thr Ile Thr Leu

405 410 415AAA GAA GCG TTA GTA ACT GGT AAA CAA TAT AAA CTT GCT ATC AAT AAT 1392Lys Glu Ala Leu Val Thr Gly Lys Gln Tyr Lys Leu Ala Ile Asn Asn

420 425 430GTT AAA ACA TTA ACT GGT TAC AAT GCA GAA GCT TAC GAG TTA GTG TTC 1440Val Lys Thr Leu Thr Gly Tyr Asn Ala Glu Ala Tyr Glu Leu Val Phe435 440 445 450ACT GCA AAC GCA TCA GCA CCA ACT GTT GCT ACC GCT CCT ACT ACT TTA 1488Thr Ala Asn Ala Ser Ala Pro Thr Val Ala Thr Ala Pro Thr Thr Leu

455 460 465GGT GGT ACA ACT TTA TCT ACT GGT TCT CTT ACA ACA AAT GTT TGG GGT 1536Gly Gly Thr Thr Leu Ser Thr Gly Ser Leu Thr Thr Asn Val Trp Gly

470 475 480AAA TTG GCT GGT GGT GTG AAT GAA GCT GGA ACT TAT TAT CCT GGT CTT 1584Lys Leu ALa Gly Gly Val Asn Glu Ala Gly Thr Tyr Tyr Pro Gly Leu

485 490 495CAA TTC ACA ACA ACG TTT GCT ACT AAG TTA GAC GAA TCT ACT TTA GCT 1632Gln Phe Thr Thr Thr Phe Ala Thr Lys Leu Asp Glu Ser Thr Leu Ala

500 505 510GAT AAC TTT GTA TTA GTT GAA AAA GAA TCT GGT ACA GTT GTT GCT TCT 1680Asp Asn Phe Val Leu Val Glu Lys Glu Ser Gly Thr Val Val Ala Ser515 520 525 530GAA CTA AAA TAT AAT GCA GAC GCT AAA ATG GTA ACT TTA GTG CCA AAA 1728Glu Leu Lys Tyr Asn Ala Asp Ala Lys Met Val Thr Leu Val Pro Lys

535 540 545GCG GAC CTT AAA GAA AAT ACA ATC TAT CAA ATC AAA ATT AAA AAA GGC 1776Ala Asp Leu Lys Glu Asn Thr Ile Tyr Gln Ile Lys Ile Lys Lys Gly

550 555 560TTG AAG TCC GAT AAA GGT ATT GAA TTA GGC ACT GTT AAC GAG AAA ACA 1624Leu Lys Ser Asp Lys Gly Ile Glu Leu Gly Thr Val Asn Glu Lys Thr

565 570 575TAT GAG TTC AAA ACT CAA GAC TTA ACT GCT CCT ACA GTT ATT AGC GTA 1872Tyr Glu Phe Lys Thr Gln Asp Leu Thr Ala Pro Thr Val Ile Ser Val

580 585 590ACG TCT AAA AAT GGC GAC GCT GGA TTA AAA GTA ACT GAA GCT CAA GAA 1920Thr Ser Lys Asn Gly Asp Ala Gly Leu Lys Val Thr Glu Ala Gln Glu595 600 605 610TTT ACT GTG AAG TTC TCA GAG AAT TTA AAT ACA TTT AAT GCT ACA ACC 1968Phe Thr Val Lys Phe Ser Glu Asn Leu Asn Thr Phe Asn Ala Thr Thr

615 620 625GTT TCG GGT AGC ACA ATC ACA TAC GGT CAA GTT GCT GTA GTA AAA GCG 2016Val Ser Gly Ser Thr Ile Thr Tyr Gly Gln Val Ala Val Val Lys Ala

630 635 640GGT GCA AAC TTA TCT GCT CTT ACA GCA AGT GAC ATC ATT CCA GCT AGT 2064Gly Ala Asn Leu Ser Ala Leu Thr Ala Ser Asp Ile Ile Pro Ala Ser

645 650 655GTT GAA GCG GTT ACT GGT CAA GAT GGA ACA TAC AAA GTG AAA GTT GCT 2112Val Glu Ala Val Thr Gly Gln Asp Gly Thr Tyr Lys Val Lys Val Ala

660 665 670GCT AAC CAA TTA GAA CGT AAC CAA GGG TAC AAA TTA GTA GTG TTC GGT 2160Ala Asn Gln Leu Glu Arg Asn Gln Gly Tyr Lys Leu Val Val Phe Gly675 680 685 690AAA GGT GCA ACA GCT CCT GTT AAA GAT GCT GCA AAT GCA AAT ACT TTA 2208Lys Gly Ala Thr Ala Pro Val Lys Asp Ala Ala Asn Ala Asn Thr Leu

695 700 705GCA ACT AAC TAT ATC TAT ACA TTT ACA ACT GAA GGT CAA GAC GTA ACA 2256Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Thr Phe Thr Thr Glu Gly Gln Asp Val Thr

710 715 720GCA CCA ACG GTT ACA AAA GTA TTC AAA GGT GAT TCT TTA AAA GAC GCT 2304Ala Pro Thr Val Thr Lys Val Phe Lys Gly Asp Ser Leu Lys Asp Ala

725 730 735GAT GCA GTT ACT ACA CTT ACG AAC GTT GAT GCA GGT CAA AAA TTC ACT 2352Asp Ala Val Thr Thr Leu Thr Asn Val Asp Ala Gly Gln Lys Phe Thr

740 745 750ATC CAA TTT AGC GAA GAA TTA AAA ACT TCT AGT GGT TCT TTA GTG GGT 2400Ile Gln Phe Ser Glu Glu Leu Lys Thr Ser Ser Gly Ser Leu Val Gly755 760 765 770GGC AAA GTA ACT GTC GAG AAA TTA ACA AAC AAC GGA TGG GTA GAT GCT 2446Gly Lys Val Thr Val Glu Lys Leu Thr Asn Asn Gly Trp Val Asp Ala

775 780 785GGT ACT GGA ACA ACT GTA TCA GTT GCT CCT AAG ACA GAT GCA AAT GGT 2496Gly Thr Gly Thr Thr Val Ser Val Ala Pro Lys Thr Asp Ala Asn Gly

790 795 800AAA GTA ACA GCT GCT GTG GTT ACA TTA ACT GGT CTT GAC AAT AAC GAC 2544Lys Val Thr Ala Ala Val Val Thr Leu Thr Gly Leu Asp Asn Asn Asp

805 810 815AAA GAT GCG AAA TTG CGT CTG GTA GTA GAT AAG TCT TCT ACT GAT GGA 2592Lys Asp Ala Lys Leu Arg Leu Val Val Asp Lys Ser Ser Thr Asp Gly

820 825 830ATT GCT GAT GTA GCT GGT AAT GTA ATT AAG GAA AAA GAT ATT TTA ATT 2640Ile Ala Asp Val Ala Gly Asn Val Ile Lys Glu Lys Asp Ile Leu Ile835 840 845 850CGT TAC AAC AGC TGG AGA CAC ACT GTA GCT TCT GTG AAA GCT GCT GCT 2688Arg Tyr Asn Ser Trp Arg His Thr Val Ala Ser Val Lys Ala Ala Ala

855 860 865GAC AAA GAT GGT CAA AAC GCT TCT GCT GCA TTC CCA ACA AGC ACT GCA 2736Asp Lys Asp Gly Gln Asn Ala Ser Ala Ala Phe Pro Thr Ser Thr Ala

870 875 880ATT GAT ACA ACT AAG AGC TTA TTA GTT GAA TTC AAT GAA ACT GAT TTA 2784Ile Asp Thr Thr Lys Ser Leu Leu Val Glu Phe Asn Glu Thr Asp Leu

885 890 895GCG GAA GTT AAA CCT GAG AAC ATC GTT GTT AAA GAT GCA GCA GGT AAT 2832Ala Glu Val Lys Pro Glu Asn Ile Val Val Lys Asp Ala Ala Gly Asn

900 905 910GCG GTA GCT GGT ACT GTA ACA GCA TTA GAC GGT TCT ACA AAT AAA TTT 2880Ala Val Ala Gly Thr Val Thr Ala Leu Asp Gly Ser Thr Asn Lys Phe915 920 925 930GTA TTC ACT CCA TCT CAA GAA TTA AAA GCT GGT ACA GTT TAC TCT GTA 2928Val Phe Thr Pro Ser Gln Glu Leu Lys Ala Gly Thr Val Tyr Ser Val

935 940 945ACA ATT GAC GGT GTG AGA GAT AAA GTA GGT AAC ACA ATC TCT AAA TAC 2976Thr Ile Asp Gly Val Arg Asp Lye Val Gly Asn Thr Ile Ser Lys Tyr

950 955 960ATT ACT TCG TTC AAG ACT GTA TCT GCG AAT CCA ACG TTA TCT TCA ATC 3024Ile Thr Ser Phe Lys Thr Val Ser Ala Asn Pro Thr Leu Ser Ser Ile

965 970 975AGC ATT GCT GAC GGT GCA GTT AAC GTT GAC CGT TCT AAA ACA ATT ACA 3072Ser Ile Ala Asp Gly Ala Val Asn Val Asp Arg Ser Lys Thr Ile Thr

980 985 990ATT GAA TTC AGC GAT TCA GTT CCA AAC CCA ACA ATC ACT CTT AAG AAG 3120Ile Glu Phe Ser Asp Ser Val Pro Asn Pro Thr Ile Thr Leu Lys Lys995 1000 1005 1010GCT GAC GGA ACT TCA TTT ACT AAT TAC ACT TTA GTA AAT GTA AAT AAT 3168Ala Asp Gly Thr Ser Phe Thr Asn Tyr Thr Leu Val Asn Val Asn Asn

1015 1020 1025GAA AAT AAA ACA TAC AAA ATT GTA TTC CAC AAA GGT GTA ACA CTT GAC 3216Glu Asn Lys Thr Tyr Lys Ile Val Phe His Lys Gly Val Thr Leu Asp

1030 1035 1040GAG TTT ACT CAA TAT GAG TTA GCA GTT TCA AAA GAT TTT CAA ACT GGT 3264Glu Phe Thr Gln Tyr Glu Leu Ala Val Ser Lys Asp Phe Gln Thr Gly

1045 1050 1055ACT GAT ATT GAT AGC AAA GTT ACA TTC ATC ACA GGT TCT GTT GCT ACT 3312Thr Asp Ile Asp Ser Lys Val Thr Phe Ile Thr Gly Ser Val Ala Thr

1060 1065 1070GAC GAA GTA AAA CCT GCT CTAGTA GGC GTT GGT TCA TGG AAT GGA ACA 3360Asp Glu Val Lys Pro Ala Leu Val Gly Val Gly Ser Trp Asn Gly Thr1075 1080 1085 1090AGC TAT ACT CAG GAT GCT GCA GCA ACA CGA CTT CGG TCT GTA GCT GAC 3406Ser Tyr Thr Gln Asp Ala Ala Ala Thr Arg Leu Arg Ser Val Ala Asp

1095 1100 1105TTC GTT GCG GAG CCA GTT GCC CTT CAA TTC TCA GAA GGT ATC GAT TTA 3456Phe Val Ala Glu Pro Val Ala Leu Gln Phe Sar Glu Gly Ile Asp Leu

1110 1115 1120ACG AAT GCA ACT GTG ACA GTA ACA AAT ATT ACT GAT GAT AAA ACT GTT 3504Thr Asn Ala Thr Val Thr Val Thr Asn Ile Thr Asp Asp Lys Thr Val

1125 1130 1135GAA GTT ATT TCA AAA GAG AGT GTA GAC GCA GAC CAT GAT GCA GGT GCT 3552Glu Val Ile Ser Lys Glu Ser Val Asp Ala Asp His Asp Ala Gly Ala

1140 1145 1150ACT AAG GAG ACA TTA GTA ATT AAC ACA GTT ACT CCT TTA GTA CTT GAT 3600Thr Lys Glu Thr Leu Val Ile Asn Thr Val Thr Pro Leu Val Leu Asp1155 1160 1165 1170AAC AGC AAG ACT TAT AAG ATT GTT GTA AGT GGA GTT AAA GAT GCA GCA 3648Asn Ser Lys Thr Tyr Lys Ile Val Val Ser Gly Val Lys Asp Ala Ala

1175 1180 1185GGT AAT GTT GCA GAT ACT ATT ACA TTC TAT ATT AAG TAA 3687Gly Asn Val Ala Asp Thr Ile Thr Phe Tyr Ile Lys

1190 1195(2)SEQ ID No:2信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1228个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID No:2Met Asp Arg Lys Lys Ala Val Lys Leu Ala Thr Ala Ser Ala Ile Ala-30 -25 -20 -15Ala Ser Ala Phe Val Ala Ala Asn Pro Asn Ala Ser Glu Ala Ala Thr

-10 -5 1Asp Val Ala Thr Val Val Ser Gln Ala Lys Ala Gln Phe Lys Lys Ala

5 10 15Tyr Tyr Thr Tyr Ser His Thr Val Thr Glu Thr Gly Glu Phe Pro Asn

20 25 30Ile Asn Asp Val Tyr Ala Glu Tyr Asn Lys Ala Lys Lys Arg Tyr Arg35 40 45 50Asp Ala Val Ala Leu Val Asn Lys Ala Gly Gly Ala Lys Lys Asp Ala

55 60 65Tyr Leu Ala Asp Leu Gln Lys Glu Tyr Glu Thr Tyr Val Phe Lys Ala

70 75 80Ash Pro Lys Ser Gly Glu Ala Arg Val Ala Thr Tyr Ile Asp Ala Tyr

85 90 95Asn Tyr Ala Thr Lys Leu Asp Glu Met Arg Gln Glu Leu Glu Ala Ala

100 105 110Val Gln Ala Lys Asp Leu Glu Lys Ala Glu Gln Tyr Tyr His Lys Ile115 120 125 130Pro Tyr Glu Ile Lys Thr Arg Thr Val Ile Leu Asp Arg Val Tyr Gly

135 140 145Lys Thr Thr Arg Asp Leu Leu Arg Ser Thr Phe Lys Ala Lys Ala Gln

150 155 160Glu Leu Arg Asp Ser Leu Ile Tyr Asp Ile Thr Val Ala Met Lys Ala

165 170 175Arg Glu Val Gln Asp Ala Val Lys Ala Gly Asn Leu Asp Lys Ala Lys

180 185 190Ala Ala Val Asp Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Pro Lys Val Thr Asp Ala195 200 205 210Phe Lys Thr Glu Leu Thr Glu Val Ala Lys Lys Ala Leu Asp Ala Asp

215 220 225Glu Ala Ala Leu Thr Pro Lys Val Glu Ser VaL Ser Ala Ile Asn Thr

230 235 240Gln Asn Lys Ala Val Glu Leu Thr Ala Val Pro Val Asn Gly Thr Leu

245 250 255Lys Leu Gln Leu Ser Ala Ala Ala Asn Glu Asp Thr Val Asn Val Asn

260 265 270Thr Val Arg Ile Tyr Lys Val Asp Gly Asn Ile Pro Phe Ala Leu Asn275 280 285 290Thr Ala Asp Val Ser Leu Ser Thr Asp Gly Lys Thr Ile Thr Val Asp

295 300 305Ala Ser Thr Pro Phe Glu Asn Asn Thr Glu Tyr Lys Val Val Val Lys

310 315 320Gly Ile Lys Asp Lys Asn Gly Lys Glu Phe Lys Glu Asp Ala Phe Thr

325 330 335Phe Lys Leu Arg Asn Asp Ala Val Val Thr Gln Val Phe Gly Thr Asn

340 345 350Val Thr Asn Asn Thr Ser Val Asn Leu Ala Ala Gly Thr Phe Asp Thr355 360 365 370Asp Asp Thr Leu Thr Val Val Phe Asp Lys Leu Leu Ala Pro Glu Thr

375 380 385Val Asn Ser Ser Asn Val Thr Ile Thr Asp Val Glu Thr Gly Lys Arg

390 395 400Ile Pro Val Ile Ala Ser Thr Ser Gly Ser Thr Ile Thr Ile Thr Leu

405 410 415Lys GLu Ala Leu Val Thr Gly Lys Gln Tyr Lys Leu Ala Ile Asn Asn

420 425 430Val Lys Thr Leu Thr Gly Tyr Asn Ala Glu Ala Tyr Glu Leu Val Phe435 440 445 450Thr Ala Asn Ala Ser Ala Pro Thr Val Ala Thr Ala Pro Thr Thr Leu

455 460 465Gly Gly Thr Thr Leu ger Thr Gly Ser Leu Thr Thr Asn Val Trp Gly

470 475 480Lys Leu Ala Gly Gly Val Asn Glu Ala Gly Thr Tyr Tyr Pro Gly Leu

485 490 495Gln Phe Thr Thr Thr Phe Ala Thr Lys Leu Asp Glu Ser Thr Leu Ala

500 505 510Asp Asn Phe Val Leu Val Glu Lys Glu Ser Gly Thr Val Val Ala Ser515 520 525 530Glu Leu Lys Tyr Asn Ala Asp Ala Lys Met Val Thr Leu Val Pro Lys

535 540 545Ala Asp Leu Lys Glu Asn Thr Ile Tyr Gln Ile Lys Ile Lys Lys Gly

550 555 560Leu Lys Ser Asp Lys Gly Ile Glu Leu Gly Thr Val Asn Glu Lye Thr

565 570 575Tyr Glu Phe Lys Thr Gln Asp Leu Thr Ala Pro Thr Val Ile Ser Val

580 585 590Thr Ser Lys Asn Gly Asp Ala Gly Leu Lys Val Thr Glu Ala Gln Glu595 600 605 610Phe Thr Val Lys Phe Ser Glu Asn Leu Asn Thr Phe Asn Ala Thr Thr

615 620 625Val Ser Gly Ser Thr Ile Thr Tyr Gly Gln Val Ala Val Val Lys Ala

630 635 640Gly Ala Asn Leu Ser Ala Leu Thr Ala Ser Asp Ile Ile Pro Ala Ser

645 650 655Val Glu Ala Val Thr Gly Gln Asp Gly Thr Tyr Lys Val Lys Val Ala

660 665 670Ala Asn Gln Leu Glu Arg Asn Gln Gly Tyr Lys Leu Val Val Phe Gly675 680 685 690Lys Gly Ala Thr Ala Pro Val Ly6 Asp Ala Ala Asn Ala Asn Thr Leu

695 700 705Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Thr Phe Thr Thr Glu Gly Gln Asp Val Thr

710 715 720Ala Pro Thr Val Thr Lys Val Phe Lys Gly Asp Ser Leu Lys Asp Ala

725 730 735Asp Ala Val Thr Thr Leu Thr Asn Val Asp Ala Gly Gln Lys Phe Thr

740 745 750Ile Gln Phe Ser Glu Glu Leu Lys Thr Ser Ser Gly Ser Leu Val Gly755 760 765 770Gly Lys Val Thr Val Glu Lys Leu Thr Asn Asn Gly Trp Val Asp Ala

775 780 785Gly Thr Gly Thr Thr Val Ser Val Ala Pro Lys Thr Asp Ala Asn Gly

790 795 800Lys Val Thr Ala Ala Val Val Thr Leu Thr Gly Leu Asp Asn Asn Asp

805 810 815Lys Asp Ala Lys Leu Arg Leu Val Val Asp Lys Ser Ser Thr Asp Gly

620 825 830Ile Ala Asp Val Ala Gly Asn Val Ile Lys Glu Lys Asp Ile Leu Ile835 840 845 850Arg Tyr Asn Ser Trp Arg His Thr Val Ala Ser Val Lys Ala Ala Ala

855 860 865Asp Lys Asp Gly Gln Asn Ala Ser Ala Ala Phe Prc Thr Ser Thr Ala

870 875 880Ile Asp Thr Thr Lys Ser Leu Leu Val Glu Phe Asn Glu Thr Asp Leu

685 890 895Ala Glu Val Lys Pro Glu Asn Ile Val Val Lys Asp Ala Ala Gly Asn

900 905 910Ala Val Ala Gly Thr Val Thr Ala Leu Asp Gly Ser Thr Asn Lye Phe915 920 925 930Val Phe Thr Pro Ser Gln Glu Leu Lys Ala Gly Thr Val Tyr Ser Val

935 940 945Thr Ile Asp Gly Val Arg Asp Lys Val Gly Asn Thr Ile Ser Lys Tyr

950 955 960Ile Thr Ser Phe Lye Thr Val Ser Ala Asn Pro Thr Leu Ser Ser Ile

965 970 975Ser Ile Ala Asp Gly Ala Val Asn Val Asp Arg Ser Lys Thr Ile Thr

980 985 990Ile Glu Phe Ser Asp Ser Val Pro Asn Pro Thr Ile Thr Leu Lys Lys995 1000 1005 1010Ala Asp Gly Thr Ser Phe Thr Asn Tyr Thr Leu Val Asn Val Asn Asn

1015 1020 1025Glu Asn Lys Thr Tyr Lys Ile Val Phe His Lys Gly Val Thr Leu Asp

1030 1035 1040Glu Phe Thr Gln Tyr Glu Leu Ala Val Ser Lys Asp Phe Gln Thr Gly

1045 1050 1055Thr Asp Ile Asp Ser Lys Val Thr Phe Ile Thr Gly Ser Val Ala Thr

1060 1065 1070Asp Glu Val Lys Pro Ala Leu Val Gly Val Gly Ser Trp Asn Gly Thr1075 1080 1085 1090Ser Tyr Thr Gln Asp Ala Ala Ala Thr Arg Leu Arg Ser Val Ala Asp

1095 1100 1105Phe Val Ala Glu Pro Val Ala Leu Gln Phe Ser Glu Gly Ile Asp Leu

1110 1115 1120Thr Asn Ala Thr Val Thr Val Thr Asn Ile Thr Asp Asp Lys Thr Val

1125 1130 1135Glu Val lle Ser Lys Glu Ser Val Asp Ala Asp His Asp Ala Gly Ala

1140 1145 1150Thr Lys Glu Thr Leu Val Ile Asn Thr Val Thr Pro Leu Val Leu Asp1155 1160 1165 1170Asn Ser Lys Thr Tyr Lys Ile Val Val Ser Gly Val Lys Asp Ala Ala

1175 1180 1185Gly Asn Val Ala Asp Thr Ile Thr Phe Tyr Ile Lys

1190 1195(2)SEQ ID No:3信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID No:3TTAATCGATT CTAGATGGAT AGGAAAAAAG CTG 33(2)SEQ ID No:4信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：37个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID No:4ATACCCGGGG GTACGGATCC GATACAGATTTGAGCAA 37(2)SEQ ID No:5信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：2766个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ⅰ)最初来源

(A)生物：嗜热脂肪芽孢杆菌

(B)菌株：PV72

(ⅶ)直接来源：

(B)克隆：SbsB

(ⅸ)特征：

(A)名称/要点：CDS

(B)位置：1..2763

(ⅸ)特征：

(A)名称/要点：信号肽

(B)位置：1..93

(ⅸ)特征：

(A)名称/要点：成熟肽

(B)位置：94..2763

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID No:5ATG GCT TAT CAA CCT AAG TCT TTT CGC AAG TTT GTT GCG ACA ACT GCA 48Met Ala Tyr Gln Pro Lys Ser Phe Ars Lys Phe Val Ala Thr Thr Ala-31 -30 -25 -20ACA GCT GCC ATT GTA GCA TCT GCG GTA GCT CCT GTA GTA TCT GCA GCA 96Thr Ala Ala Ile Val Ala Ser Ala Val Ala Pro Val Val Ser Ala Ala-15 -10 -5 1AGC TTC ACA GAT GTT GCG CCG CAA TAT AAA GAT GCG ATC GAT TTC TTA 144Ser Phe Thr Asp Val Ala Pro Gln Tyr Lys Asp Ala Ile Asp Phe Leu

5 10 15GTA TCA ACT GGT GCA ACA AAA GGT AAA ACA GAA ACA AAA TTC GGC GTT 192Val Ser Thr Gly Ala Thr Lys Gly Lys Thr Glu Thr Lys Phe Gly Val

20 25 30TAC GAT GAA ATC ACT CGT CTA GAT GCG GCA GTT ATT CTT GCA AGA GTA 240Tyr Asp Glu Ile Thr Arg Leu Asp Ala Ala Val lle Leu Ala Arg Val

35 40 45TTA AAA CTA GAC GTT GAC AAC GCA AAA GAC GCA GGC TTC ACA GAT GTG 286Leu Lys Leu Asp Val Asp Asn Ala Lys Asp Ala Gly Phe Thr Asp Val50 55 60 65CCA AAA GAC CGT GCA AAA TAC GTC AAC GCG CTT GTA GAA GCT GGC GTA 336Pro Lys Asp Arg Ala Lys Tyr Val Asn Ala Leu Val Glu Ala Gly Val

70 75 60TTA AAC GGT AAA GCA CCT GGC AAA TTT GGT GCA TAC GAC CCA TTA ACT 384Leu Asn Gly Lys Ala Pro Gly Lys Phe Gly Ala Tyr Asp Pro Leu Thr

85 90 95CGC GTT GAA ATG GCA AAA ATC ATC GCG AAC CGT TAC AAA TTA AAA GCT 432Arg Val Glu Met Ala Lys Ile Ile Ala Asn Arg Tyr Lys Leu Lys Ala

100 105 110GAC GAT GTA AAA CTT CCA TTC ACT GAT GIA AAC GAT ACA TGG GCA CCA 480Asp Asp Val Lys Leu Pro Phe Thr Asp Val Asn Asp Thr Trp Ala Pro

115 120 125TAC GTA AAA GCG CTT TAT AAA TAC GAA GTA ACC AAA AGG TTA AAA CAC 528Tyr Val Lys Ala Leu Tyr Lys Tyr Glu Val Thr Lys Arg Leu Lys His130 135 140 145CAA CAA GCT TCG GTG CAT ACC AAA AAC ATC ACT CTG CGT GAC TTT GCG 576Gln Gln Ala Ser Val His Thr Lys Asn Ile Thr Leu Arg Asp Phe Ala

150 155 160CAA TTT GTA TAT AGA GCG GTG AAT ATT AAT GCA GTG CCA GAA ATA GTT 624Gln Phe Val Tyr Arg Ala Val Asn Ile Asn Ala Val Pro Glu Ile Val

165 170 175GAA GTA ACT GCG GTT AAT TCG ACT ACA GTG AAA GTA ACA TTC AAT ACG 672Glu Val Thr Ala Val Asn Ser Thr Thr Val Lys Val Thr Phe Asn Thr

180 185 190CAA ATT GCT GAT GTT GAT TTC ACA AAT TTT GCT ATC GAT AAC GGT TTA 720Gln Ile Ala Asp Val Asp Phe Thr Asn Phe Ala Ile Asp Asn Gly Leu

195 200 205ACT GTT ACT AAA GCA ACT CTT TCT CGT GAT AAA AAA TCC GTA GAG GTT 768Thr Val Thr Lys Ala Thr Leu Ser Arg Asp Lys Lys Ser Val Glu Val210 215 220 225GTG GTA AAT AAA CCG TTT ACT CGT AAT CAG GAA TAT ACA ATT ACA GCG 816Val Val Asn Lys Pro Phe Thr Arg Asn Gln Glu Tyr Thr Ile Thr Ala

230 235 240ACA GGC ATT AAA AAT TTA AAA GGC GAG ACC GCT AAG GAA TTA ACT GGT 864Thr Gly Ile Lys Asn Leu Lys Gly Glu Thr Ala Lys Glu Leu Thr Gly

245 250 255AAG TTT GIT TGG TCT GTT CAA GAT GCG GTA ACT GTT GCA CTA AAT AAT 912Lys Phe Val Trp Ser Val Gln Asp Ala Val Thr Val Ala Leu Asn Asn

260 265 270AGT TCG CTT AAA GTT GGA GAG GAA TCT GGT TTA ACT GTA AAA GAT CAG 960Ser Ser Leu Lys Val Gly Glu Glu Ser Gly Leu Thr Val Lys Asp Gln

275 280 285GAT GGC AAA GAT GTT GTA GGT GCT AAA GTA GAA CTT ACT TCT TCT AAT 1008Asp Gly Lys Asp Val Val Gly Ala Lys Val Glu Leu Thr Ser Ser Asn290 295 300 305ACT AAT ATT GTT GTA GTT TCA AGT GGC GAA GTA TCA GTA TCT GCT GCT 1056Thr Asn Ile Val Val Val Ser Ser Gly Glu Val Ser Val Ser Ala Ala

310 315 320AAA GTT ACA GCT GTA AAA CCG GGA ACA GCT GAT GTT ACT GCA AAA GTT 1104Lys Val Thr Ala Val Lys Pro Gly Thr Ala Asp Val Thr Ala Lys Val

325 330 335ACA TTA CCA GAT GGT GIT GTA CIA ACA AAT ACA TTT AAA GTG ACA GTT 1152Thr Leu Pro Asp Gly Val Val Leu Thr Asn Thr Phe Lys Val Thr Val

340 345 350ACA GAA GTG CCT GTT CAA GTC CAA AAT CAA GGA TTT ACT TTA GTT GAT 1200Thr Glu Val Pro Val Gln Val Gln Asn Gln Gly Phe Thr Leu Val Asp

355 360 365AAT CTT TCT AAT GCT CCA CAG AAT ACA GTT GCA TTT AAC AAA GCT GAG 1248Asn Leu Ser Asn Ala Pro Gln Asn Thr Val Ala Phe Asn Lys Ala Glu370 375 380 385AAA GTA ACT TCA ATG TTT GCT GGA GAA ACT AAA ACA GTT GCA ATG TAT 1296Lys Val Thr Ser Met Phe Ala Gly Glu Thr Lys Thr Val Ala Met Tyr

390 395 400GAT ACT AAA AAC GGT GAT CCT GAA ACT AAA CCT GTT GAT TTC AAA GAT 1344Asp Thr Lys Asn Gly Asp Pro Glu Thr Lys Pro Val Asp Phe Lys Asp

405 410 415GCA ACT GTA CGT TCA TTA AAT CCA ATT ATT GCA ACA GCT GCT ATT AAT 1392Ala Thr Val Arg Ser Leu Asn Pro Ile Ile Ala Thr Ala Ala Ile Asn

420 425 430GGT AGT GAG CTC CTT GTC ACA GCT AAT GCT GGC CAA TCT GGA AAA GCT 1440Gly Ser Glu Leu Leu Val Thr Ala Asn Ala Gly Gln Ser Gly Lys Ala

435 440 445TCA TTT GAA GTA ACA TTA AAA GAT AAT ACA AAA AGA ACA TTT ACA GTT 1489Ser Phe Glu Val Thr Leu Lys Asp Asn Thr Lys Arg Thr Phe Thr Val450 455 460 465GAT GTA AAA AAA GAC CCT GTA TTA CAA GAT ATA AAA GTA GAT GCA ACT 1536Asp Val Lys Lys Asp Pro Val Leu Gln Asp Ile Lys Val Asp Ala Thr

470 475 480TCT GTT AAA CTT TCC GAT GAA GCT GTT GGC GGC GGG GAA GTT GAA GGA 1584Ser Val Lys Leu Ser Asp Glu Ala Val Gly Gly Gly Glu Val Glu Gly

485 490 495GTT AAC CAA AAA ACG ATT AAA GTA AGT GCA GTT GAC CAA TAC GGT AAA 1632Val Asn Gln Lys Thr Ile Lys Val Ser Ala Val Asp Gln Tyr Gly Lys

500 505 510GAA ATT AAA TTT GGT ACA AAA GGT AAA GTT ACT GTT ACA ACT AAT ACA 1690Glu Ile Lys Phe Gly Thr Lys Gly Lys Val Thr Val Thr Thr Asn Thr

515 520 525GAA GGA CTA GTT ATT AAA AAT GTA AAT AGC GAT AAT ACA ATT GAC TTT 1728Glu Gly Leu Val Ile Lys Asn Val Asn Ser Asp Asn Thr Ile Asp Phe530 535 540 545GAT AGC GGC AAT AGT GCA ACT GAC CAA TTT GTT GTC GTT GCA ACA AAA 1776Asp Ser Gly Asn Ser Ala Thr Asp Gln Phe Val Val Val Ala Thr Lys

550 555 560GAC AAA ATT GTC AAT GGT AAA GTA GAA GTT AAA TAT TTC AAA AAT GCT 1824Asp Lys Ile Val Asn Gly Lys Val Glu Val Lys Tyr Phe Lys Asn Ala

565 570 575AGT GAC ACA ACA CCA ACT TCA ACT AAA ACA ATT ACT GTT AAT GTA GTA 1972Ser Asp Thr Thr Pro Thr Ser Thr Lys Thr Ile Thr Val Asn Val Val

580 585 590AAT GTA AAA GCT GAC GCT ACA CCA GTA GGA TTA GAT ATT GTA GCA CCT 1920Aen Val Lys Ala Asp Ala Thr Pro Val Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro

595 600 605TCT AAA ATT GAT GTA AAT GCT CCA AAC ACT GCT TCT ACT GCA GAT GTT 1968Ser Lys Ile Asp Val Asn Ala Pro Asn Thr Ala Ser Thr Ala Asp Val610 615 620 625GAT TTT ATA AAT TTC GAA AGT GTT GAG ATT TAC ACA CTC GAT TCA AAT 2016Asp Phe Ile Asn Phe Glu Sar Val Glu Ile Tyr Thr Leu Asp Ser Asn

630 635 640GGT AGA CGT CAA AAA AAA GTT ACT CCA ACT GCA ACT ACA CTT GTA GGT 2064Gly Arg Arg Gln Lys Lys Val Thr Pro Thr Ala Thr Thr Leu Val Gly

645 650 655ACA AAA AAA AAA AAA AAA GTT AAT GGG AAT GTA TTA CAA TTC AAG GGG 2112Thr Lys Lys Lys Lys Lys Val Asn Gly Asn Val Leu Gln Phe Lys Gly

660 665 670AAC GAA GAA TTA ACG CTA TCA ACT TCT TCT AGT ACA GGA AAC GTA GAT 2160Asn Glu Glu Leu Thr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Thr Gly Asn Val Asp

675 680 685GGA ACA GCA GAA GGA ATG ACA AAA CGT ATT CCA GGG AAA TAT ATC AAC 2208Gly Thr Ala Glu Gly Met Thr Lys Arg Ile Pro Gly Lys Tyr Ile Asn690 695 700 705TCT GCA AGT GTA CCT GCC AGT GCA ACA GTA GCA ACA AGT CCT GTT ACT 2256Ser Ala Ser Val Pro Ala Ser Ala Thr Val Ala Thr Ser Pro Val Thr

710 715 720GTA AAG CTT AAT TCA AGT GAT AAT GAT TTA ACA TTT GAA GAA TTA ATA 2304Val Lys Leu Asn Ser Ser Asp Asn Asp Leu Thr Phe Glu Glu Leu Ile

725 730 735TTC GGT GTA ATT GAC CCT ACA CAA TTA GTC AAA GAT GAA GAC ATC AAC 2352Phe Gly Val Ile Asp Pro Thr Gln Leu Val Lys Asp Glu Asp Ile Asn

740 745 750GAA TTT ATT GCA GTT TCA AAA GCG GCT AAA AAT GAT GGA TAT TTG TAT 2400Glu Phe Ile Ala Val Ser Lys Ala Ala Lys Asn Asp Gly Tyr Leu Tyr

755 760 765AAT AAA CCG CTT GTA ACG GTT AAA GAT GCA TCA GGA AAA GTT ATT CCA 2448Asn Lys Pro Leu Val Thr Val Lys Asp Ala Ser Gly Lys Val Ile Pro770 775 780 785ACA GGT GCA AAT GTT TAC GGT CTA AAT CAT GAT GCA ACT AAC GGA AAC 2496Thr Gly Ala Asn Val Tyr Gly Leu Asn His Asp Ala Thr Asn Gly Asn

790 795 800ATT TGG TTT GAT GAG GAA CAA GCT GGC TTA GCT AAA AAA TTT AGT GAT 2544Ile Trp Phe Asp Glu Glu Gln Ala Gly Leu Ala Lys Lys Phe Ser Asp

805 810 815GTA CAT TTT GAT GTT GAT TTT TCA TTA ACT AAC GTT GTA AAA ACT GGT 2592Val His Phe Asp Val Asp Phe Ser Leu Thr Asn Val Val Lys Thr Gly

820 825 830AGC GGT ACA GTT TCT TCA TCG CCA TCA TTA TCT GAC GCA ATT CAA CTT 2640Ser Gly Thr Val Ser Ser Ser Pro Ser Leu Ser Asp Ala Ile Gln Leu

835 840 845ACT AAT TCA GGC GAT GCA GTA TCG TTT ACA TTA GTT ATC AAA TCA ATT 2688Thr Asn Ser Gly Asp Ala Val Ser Phe Thr Leu Val Ile Lys Ser Ile850 855 860 865TAT GTT AAA GGC GCA GAT AAA GAT GAT AAT AAC TTA CTT GCA GCC CCT 2736Tyr Val Lys Gly Ala Asp Lys Asp Asp Asn Asn Leu Leu Ala Ala Pro

870 875 880GTT TCT GTC AAT GTG ACT GTG ACA AAA TAA 2766Val Ser Val Asn Val Thr Val Thr Lys

885 890(2)SEQ ID No:6信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：921个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID No:6Met Ala Tyr Gln Pro Lys Ser Phe Arg Lys Phe Val Ala Thr Thr Ala-31 -30 -25 -20Thr Ala Ala Ile Val Ala Ser Ala Val Ala Pro Val Val Ser Ala Ala-15 -10 -5 1Ser Phe Thr Asp Val Ala Pro Gln Tyr Lys Asp Ala Ile Asp Phe Leu

5 10 15Val Ser Thr Gly Ala Thr Lys Gly Lys Thr Glu Thr Lys Phe Gly Val

20 25 30Tyr Asp Glu Ile Thr Arg Leu Asp Ala Ala Val Ile Leu Ala Arg Val

35 40 45Leu Lys Leu Asp Val Asp Asn Ala Lys Asp Ala Gly Phe Thr Asp Val50 55 60 65Pro Lys Asp Arg Ala Lys Tyr Val Asn Ala Leu Val Glu Ala Gly Val

70 75 80Leu Asn Gly Lys Ala pro Gly Lya Phe Gly Ala Tyr Asp Pro Leu Thr

85 90 95Arg Val Glu Met Ala Lys Ile Ile Ala Asn Arg Tyr Lys Leu Lys Ala

100 105 110Asp Asp Val Lys Leu Pro Phe Thr Asp Val Asn Asp Thr Trp Ala Pro

ll5 120 125Tyr Val Lys Ala Leu Tyr Lya Tyr Glu Val Thr Lys Arg Leu Lys His130 135 140 145Gln Gln Ala Ser Val His Thr Lys Asn Ile Thr Leu Arg Asp Phe Ala

150 155 160Gln Phe Val Tyr Arg Ala Val Asn Ile Asn Ala Val Pro Glu Ile Val

165 170 175Glu Val Thr Ala Val Asn Ser Thr Thr Val Lys Val Thr Phe Asn Thr

180 185 190Gln Ile Ala Aap Val Asp Phe Thr Asn Phe Ala Ile Asp Asn Gly Leu

195 200 205Thr Val Thr Lys Ala Thr Leu Ser Arg Asp Lys Lys Ser Val Glu Val210 215 220 225Val Val Asn Lys Pro Phe Thr Arg Asn Gln Glu Tyr Thr Ile Thr Ala

230 235 240Thr Gly Ile Lys Asn Leu Lys Gly Glu Thr Ala Lys Glu Leu Thr Gly

245 250 255Lys Phe Val Trp Ser Val Gln Asp Ala Val Thr Val Ala Leu Asn Asn

260 265 270Ser Ser Leu Lys Val Gly Glu Glu Ser Gly Leu Thr Val Lys Asp Gln

275 280 285Asp Gly Lys Asp Val Val Gly Ala Lys Val Glu Leu Thr Ser Ser Asn290 295 300 305Thr Asn Ile Val Val Val Ser Ser Gly Glu Val Ser Val Ser Ala Ala

310 315 320Lys Val Thr Ala Val Lys Pro Gly Thr Ala Asp Val Thr Ala Lys Val

325 330 335Thr Leu Pro Asp Gly Val Val Leu Thr Asn Thr Phe Lys Val Thr Val

340 345 350Thr Glu Val Pro Val Gln Val Gln Asn Gln Gly Phe Thr Leu Val Asp

355 360 365Asn Leu Ser Asn Ala Pro Gln Asn Thr Val Ala Phe Asn Lys Ala Glu370 375 380 385Lys Val Thr Ser Met Phe Ala Gly Glu Thr Lys Thr Val Ala Met Tyr

390 395 400Asp Thr Lys Asn Gly Asp Pro Glu Thr Lys Pro Val Asp Phe Lys Asp

405 410 415Ala Thr Val Arg ser Leu Asn Pro Ile Ile Ala Thr Ala Ala Ile Asn

420 425 430Gly Ser Glu Leu Leu Val Thr Ala Asn Ala Gly Gln Ser Gly Lys Ala

435 440 445Ser Phe Glu Val Thr Leu Lys Asp Asn Thr Lys Arg Thr Phe Thr Val450 455 460 465Asp Val Lys Lys Asp Pro Val Leu Gln Asp Ile Lys Val Asp Ala Thr

470 475 480Ser Val Lys Leu Ser Asp Glu Ala Val Gly Gly Gly Glu Val Glu Gly

485 490 495Val Asn Gln Lys Thr Ile Lys Val Ser Ala Val Asp Gln Tyr Gly Lys

500 505 510Glu Ile Lys Phe Gly Thr Lys Gly Lys Val Thr Val Thr Thr Asn Thr

515 520 525Glu Gly Leu Val Ile Lys Asn Val Asn Ser Asp Asn Thr Ile Asp Phe530 535 540 545Asp Ser Gly Asn Ser Ala Thr Asp Gln Phe Val Val Val Ala Thr Lys

550 555 560Asp Lys Ile Val Asn Gly Lys Val Glu Val Lys Tyr Phe Lys Asn Ala

555 570 575Ser Asp Tnr Thr Pro Thr Ser Thr Lys Thr Ile Thr Val Asn Val Val

580 585 590Asn Val Lys Ala Asp Ala Thr Pro Val Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro

595 600 605Ser Lys Ile Asp Val Asn Ala Pro Asn Thr Ala Ser Thr Ala Asp Val610 615 620 625Asp Phe Ile Asn Phe Glu Ser Val Glu Ile Tyr Thr Leu Asp Ser Asn

630 635 640Gly Arg Arg Gln Lys Lys Val Thr Pro Thr Ala Thr Thr Leu Val Gly

645 650 655Thr Lys Lys Lys Lys Lys Val Asn Gly Asn Val Leu Gln Phe Lys Gly

660 665 670Asn Glu Glu Leu Thr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Thr Gly Asn Val Asp

675 680 685Gly Thr Ala Glu Gly Met Thr Lys Arg Ile Pro Gly Lys Tyr Ile Asn690 695 700 705Ser Ala Ser Val Pro Ala Ser Ala Thr Val Ala Thr Ser Pro Val Thr

710 715 720Val Lys Leu Asn Ser Ser Asp Asn Asp Leu Thr Phe Glu Glu Leu Ile

725 730 735Phe Gly Val Ile Asp Pro Thr Gln Leu Val Lys Asp Glu Asp Ile Asn

740 745 750Glu Phe Ile Ala Val Ser Lys Ala Ala Lys Asn Asp Gly Tyr Leu Tyr

755 760 765Asn Lys Pro Leu Val Thr Val Lys Asp Ala Ser Gly Lys Val Ile Pro770 775 780 785Thr Gly Ala Asn Val Tyr Gly Leu Asn His Asp Ala Thr Asn Gly Asn

790 795 800Ile Trp ehe Asp Glu Glu Gln Ala Gly Leu Ala Lys Lys Phe Ser Asp

805 810 8l5Val His Phe Asp Val Asp Phe Ser Leu Thr Asn Val Val Lys Thr Gly

820 825 830Ser Gly Thr Val Ser Ser Ser Pro Ser Leu Ser Asp Ala Ile Gln Leu

835 840 845Thr Asn Ser Gly Asp Ala Val Ser Phe Thr Leu Val Ile Lys Ser Ile850 855 860 865Tyr Val Lys Gly Ala Asp Lys Asp Asp Asn Asn Leu Leu Ala Ala Pro

870 875 880Val Ser Val Asn Val Thr Val Thr Lys

885 890(2)SEQ ID No:7信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：498个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：两种

(D)拓扑结构：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID No:7CCCATGGACC CGTCCAAGGA CTCCAAAGCT CAGGTTTCTG CAGCCGAAGC TGGTATCACT 60GGCACCTGGT ATAACCAACT GGGGTCGACT TTCATTGTGA CCGCTGGTGC GGACGGAGCT 120CTGACTGGCA CCTACGAATC TGCGGTTGGT AACGCAGAAT CCCGCTACGT ACTGACTGGC 180CGTTATGACT CTGCACCTGC CACCGATGGC TCTGGTACCG CTCTGGGCTG GACTGTGGCT 240TGGAAAAACA ACTATCGTAA TGCGCACAGC GCCACTACGT GGTCTGGCCA ATACGTTGGC 300GGTGCTGAGG CTCGTATCAA CACTCAGTGG CTGTTAACAT CCGGCACTAC CGAAGCGAAT 360GCATGGAAAT CGACACTAGT AGGTCATGAC ACCTTTACCA AAGTTAAGCC TTCTGCTGCT 420AGCATTGATG CTGCCAAGAA AGCAGGCGTA AACAACGGTA ACCCTCTAGA CGCTGTTCAG 480CAATAATAAG GATCCGGG 498(2)SEQ ID No:8信息

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID No:8TTCATCGTAA ACGCCGAATT TTGTTTCTG 29(2)SEQ ID No:9信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：26个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID No:9AGGGAAATAT ATCAACTCTG CAAGTG 26

Claims

1．制备表层蛋白的方法，其中

(a)提供了一种转化有编码表层蛋白的核酸的革兰氏阴性原核宿主细胞，这种编码表层蛋白的核酸选自：

(ⅰ)含有SEQ ID No:1中第1-3684位核苷酸序列的核酸，其中可选择性地不含有信号肽编码区，

(ⅲ)含有能在严谨条件下，与(ⅰ)或/和(ⅱ)来源的核酸相互杂交的一段核苷酸序列的核酸；

(b)在能促使该核酸表达、生产由它所编码的多肽的条件下培养宿主细胞；以及

(c)从宿主细胞内分离由上述所产生的多肽。

2．按照权利要求1所述的方法，其中使用大肠杆菌宿主细胞。

3．按照权利要求1或2所述的方法，其中多肽是以装配型表层蛋白结构形式，从宿主细胞内部分离的。

4．按照权利要求1至3中任一项所述的方法，其中编码表层蛋白的核酸中包含有一个或数个***片段，这些***片段编码肽或多肽序列。

5．按照权利要求4所述的方法，其中***片段选自编码下述物质的核苷酸序列：半胱氨酸残基，含有多个带电氨基酸或酪氨酸残基的区域，DNA结合性抗原决定基，金属结合性抗原决定基，免疫原性抗原决定基，变应原性抗原决定基，抗原性抗原决定基，抗生蛋白链菌素，酶，细胞因子或抗体结合蛋白。

6．按照权利要求5所述的方法，其中***片段编码抗生蛋白链菌素。

7．按照权利要求5所述的方法，其中***片段编码来源于疤疹病毒、优选为疤疹病毒6或***病毒(foot-and-mouth diseaseFMDV)的免疫原性抗原决定基。

8．按照权利要求5所述的方法，其中***片段编码酶类，如多羟基丁酸合成酶或细菌荧光素酶。

9．按照权利要求5所述的方法，其中***片段编码细胞因子，如白细胞介素、干扰素或病毒坏死因子。

10．按照权利要求5所述的方法，其中***片段编码抗体结合蛋白，如蛋白质A或蛋白质G。

11．按照权利要求5所述的方法，其中***片段编码能结合细胞因子或内毒素的抗原性抗原决定基。

12．按照权利要求5所述的方法，其中***片段编码金属结合性抗原决定基。

13．按照权利要求1至12中任一项所述的方法，其中一段编码革兰氏阳性信号肽的核酸序列有效地连接于编码表层蛋白的核酸的5’侧。

14．按照权利要求13所述的方法，其中编码信号肽的核酸包括

(a)SEQ ID No:1所示核苷酸序列内的信号肽编码区，

(b)在遗传密码简并性范围内，与(a)中序列一致的核苷酸序列，或/和

(c)与(a)或/和(b)中序列同源性至少为80％的核苷酸序列。

15．编码重组型表层蛋白的核酸，它选自

(ⅰ)包含有SEQ ID No:1中第1-3684位核苷酸序列的核酸，其中可选择性地不含信号肽编码区，

(ⅱ)包含有在遗传密码简并性范围内，与(ⅰ)中核酸一致的核苷酸序列的核酸，和

(ⅲ)包含有能在严谨条件下，与(ⅰ)或/和(ⅱ)来源的核酸相互杂交的一段核苷酸序列的核酸，

其中该核酸在表层蛋白编码区内包含至少一个编码肽或多肽的***片段。

16．按照权利要求15所述的核酸，其中***位点位于SEQ IDNo:1所示核苷酸序列中的第582,878,917,2504或/和2649位核苷酸处。

17．载体，其中包含有至少一拷贝按照权利要求15或16所述的核酸。

18．细胞，其中转化有按照权利要求15或16所述的核酸，或按照权利要求17所述的载体。

19．按照权利要求18所述的细胞，其中该细胞为革兰氏阴性原核细胞，尤其是大肠杆菌细胞。

20．按照权利要求18或19所述的细胞，其中包含有重组型表层蛋白结构。

21．重组型表层蛋白，它由权利要求15或16所述的核酸编码。

22．重组型表层结构，它含有至少一种权利要求21所述的蛋白质作为亚基。

23．按照权利要求22所述的表层结构，其中含有另外还含有至少一种未修饰的表层蛋白作为亚基。

24．按照权利要求22或23所述的表层结构，其中含有若干层，层之间通过共价或亲和结合进行连接。

25．按照权利要求21所述的表层蛋白或按照权利要求22至24之一所述的表层结构，作为疫苗或辅助剂的应用。

26．按照权利要求25的用途，其中所述疫苗或辅助剂另外还含有细胞空胞，在这种细菌空胞膜上还可以含有其它的免疫原性抗原决定基。

27．按照权利21所述的表层蛋白或按照权利要求22至24之一所述的表层结构，作为酶反应剂的应用。

28．编码一种表层蛋白的核酸，它选自

(ⅰ)含有SEQ ID No:5中第1-2763位核苷酸的核酸，其中可选择性地不包含信号肽编码区，

(ⅱ)含有在遗传密码子简并性范围内，与(ⅰ)中核酸一致的核苷酸序列的核酸，和

29．按照权利要求28所述的核酸，其特征是在表层蛋白编码区内含有至少一种编码肽或编码多肽的***片段。

30．载体，其中包含有至少一拷贝的按照权利要求28或29所述的核酸。

31．细胞，其中转化有按照权利要求28或29所述的核酸，或按照权利要求30所述的载体。

32．按照权利要求31所述的细胞，其中包含有重组型表层结构。

33．表层蛋白，它由权利要求29所述的核酸编码。

34．重组型表层结构，它含有至少一种由权利要求29所述核酸所编码的重组型表层蛋白作为亚基。

35．按照权利要求33所述的表层蛋白，或按照权利要求34所述的表层结构，作为疫苗或辅助剂的应用。

36．按照权利要求33所述的表层蛋白，或按照权利要求34所述的表层结构，作为酶反应剂的应用。

37．制备重组型表层蛋白的方法，其中

(a)提供一种含有编码表层蛋白的核酸的宿主细胞，所说的核酸在其表层蛋白编码区含有一个编码肽或多肽的***片段，

(b)在能促使该核酸表达、生产由它所编码的多肽的条件下培养宿主细胞，以及

(c)从宿主细胞内或培养基中分离由上述所产生的多肽。

38．按照权利要求37所述的方法，其中编码重组型表层蛋白的核酸选自：

(ⅰ)含有SEQ ID No:1中第1-3684位核苷酸的核酸，其中可选择性地不包含信号肽编码区，

39．按照权利要求37所述的方法，其中编码重组型表层蛋白的核酸选自

40．按照权利要求37-39之一所述的方法，其中，在宿主细胞内，另有一个编码未修饰性表层蛋白的表层基因表达。

41．按照权利要求40所述的方法，其中未修饰性表层蛋白能够形成与重组型表层蛋白相容的表层结构。

42．按照权利要求37-39之一所述的方法，其中宿主细胞内编码能够形成与重组型表层蛋白相容的表层结构的未修饰性表层蛋白的表层基因不再表达。

43．按照权利要求37-42之一所述的方法，其中使用了原核宿主细胞。

44．按照权利要求43所述的方法，其中使用了革兰氏阳性宿主细胞。

45．按照权利要求44所述的方法，其中使用了嗜热脂肪芽孢杆菌。