CN1355846A - 用于下调节白细胞介素5活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及以嗜酸性粒细胞水平提高为特征的疾病,即诸如哮喘和其它慢性***反应性疾病的治疗和预防的改进。通过实现针对IL5抗体的生成,从而减小嗜酸性粒细胞的活性水平,提供了一种用于下调节白细胞介素5(IL5)的方法。本发明还提供被修饰IL5的产生方法,该被修饰IL5用于该方法中,以及提供被修饰IL5本身。本发明还包括编码被修饰IL5的核酸片段以及掺入了这些核酸片段的载体和,用这些载体转化的宿主细胞和细胞系。本发明也提供了一种用于鉴定IL5类似物的方法,这些IL5类似物用于本发明的方法中,以及提供含有被修饰IL5或含有编码IL5类似物之核酸的组合物。本发明的优选实施方案需要使用IL5的变异体,其中引入了外源T辅助细胞表位,从而诱导产生能够与自体IL5结合的交叉反应性抗体。

Description

用于下调节白细胞介素5活性的方法
发明领域
本发明涉及以嗜酸性粒细胞水平提高为特征的疾病，即诸如哮喘和其它慢性***反应性疾病的治疗和预防的改进。更具体地，通过实现抗IL5抗体的生成从而减小嗜酸性粒细胞的活性水平，本发明提供一种用于下调节白细胞介素5(IL5)的方法。本发明还提供被修饰IL5的产生方法，该被修饰IL5用于该方法中，以及提供被修饰IL5本身。本发明还包括编码被修饰IL5的核酸片段，以及掺入了这些核酸片段的载体，和用这些载体转化的宿主细胞和细胞系。本发明也提供了一种用于鉴定IL5类似物的方法，这些IL5类似物用于本发明的方法中，以及提供含有被修饰IL5或者含有编码IL5类似物之核酸的组合物。
发明背景
哮喘是一种常见的气道疾病，侵袭着大约10％的人口。当前的治疗方法基本上是基于施用甾类化合物，这代表了一个大大超过10亿美元价值的市场。在过去的二十多年里，由于仍未知晓的原因，哮喘类疾病的发生及发病率在世界范围内提高了。今天，对涉及哮喘疾病状态免疫机制的进一步了解，结合在生物技术方面的***性发展，为开发替代性的并也许是更好的治疗策略奠定了一个新基础。
在哮喘和其它慢性***反应性疾病的发病机制中，已被证实的一般特征为嗜酸性粒细胞数量的增多，特别是在肺支气管粘膜中。嗜酸性粒细胞一旦被激活，就分泌多种介质，这些介质积极地参与了炎性气道应答。在嗜酸性粒细胞的激活中，白细胞介素5(IL5)扮演了一个重要的角色。
IL5是存在于多种哺乳类动物中的一种细胞素，其中人和鼠的IL5基因已经被克隆(Tanabe等人，1987；Campbell等人，1988)。人的IL5基因位于第5号染色体，由被三个内含子分隔的四个外显子组成，它编码一个134个氨基酸残基的前体，其中包括一个19个氨基酸的N-末端前导序列，前导序列的氨基酸序列见SEQID NO：62。翻译后的切割产生成熟的115个氨基酸残基的蛋白质(SEQ ID NO：1)。类似地，鼠的IL5(mIL5)基因编码一个133个氨基酸残基的前体，其中含有一个20个氨基酸的前导序列，该前导序列的氨基酸序列见SEQ ID NO：64。所以，经过加工的成熟mIL5的长度为113个氨基酸残基(SEQ ID NO：12)，与人IL5相比，它缺失了N-末端的两个氨基酸残基。hIL5和mIL5的氨基酸序列有70％相同，而在编码区的核昔酸水平上，它们为77％相同(Azuma等人，1986)。据报道，在灵长类人内部，相似性更高；有报道人和猕猴(Rhesus monkey)的IL5编码区核苷酸序列99％相同(Villinger等人，1995)。
人IL5的氨基酸序列有两个潜在的N-糖基化位点，而鼠的有三个位点。已知人IL5在Thr 3既可N-糖基化又可O-糖基化。对IL5的研究已证实：糖基化对于IL5的生物学活性并不是必需的，尽管去糖基化似乎会影响到IL5的稳定性(Tominaga等人，1990；Kodama等人，1993)。
IL5的结构
有活性的IL5为同二聚体，并且经X-射线晶体学研究，重组hIL5的三维结构已被确定(Milburn等人，1993)。两个单体以反平行方式组织起来并通过两个链间二硫键(44-87’和87-44’)而共价结合，因此两个单体的所有四个半胱氨酸都被占用了。
单体的二级结构中含有四个α-螺旋(A-D)，它被三个连接区(回环)分隔，三个连接区中包含两个短的β-片层伸展。这四个α-螺旋束被称为“共有的细胞素折叠”，在IL-2、IL-4、GM-CSF和M-CSF中均报道了它的存在。但是所有这些均为单体形式，而同二聚体结构(其中的D-螺旋结束反向单体的4α-螺旋基序)对于IL5来讲是独特的。
单独的天然单体本身并不显示生物学活性(综述见Callard和Gearing，1994；Takutsu等人，1997)。然而，通过在回环3中***8个另加的氨基酸残基，连接起螺旋C和D，从而产生有生物学活性的被修饰的重组体是可能的。这样就使螺旋D在一条多肽链内完成上述的4螺旋结构，从而使单体能够与其受体相互作用(Dickason和Huston，1996；Dickason等人，1996)。
IL5受体由一个α-链和一个β-链组成，主要存在于嗜酸性粒细胞上。受体的α-链专一性地针对IL5，而β-链与针对IL-3和GM-CSF的异二聚体受体共享，β-链保证结合的高亲和性以及信号的转导。受体组成成分的共享，可能是在IL5、IL3和GM-CSF之间存在交叉竞争的原因(综述见Lopez等人，1992)。然而，最近证实，IL5R的调节与IL3R和GM-CSFR的调节明显不同，这进一步地表明了IL5在调节嗜酸性粒细胞应答中高度特化的功能(Wang等人，1998)。
在与IL5R的结合中以及在生物学活性方面，IL5的C-末端部分似乎都很重要，因为如果去除的C-末端氨基酸残基数多于两个，则在IL5的生物测定中，就导致IL5对IL5R的结合亲和力以及在生物学活性方面的下降(Proudfoot等人，1996)。还发现对受体结合很重要的其它残基，诸如Glu 12参与与β-链的结合，而Arg 90和Glu 109残基参与与受体的α-链结合。一般情况下，与IL5R的结合似乎发生在螺旋A和螺旋D的重叠区，其中螺旋D主要负责与IL5R的特异α-链结合(Graber等人，1995；Takastsu等人，1997)。IL5与其它蛋白质的同源性
在同二聚体中所见到的两个4-螺旋结构域基序，正如与存在于GM-CSF和M-CSF、IL-2、IL-4以及人和猪的生长激素中的细胞素折叠相比较，具有惊人的二级结构和三级结构相似性(Milburn等人，1993)。然而，即使在内含子/外显子的组织结构以及半胱氨酸的位置方面观察到惊人的相似性(Tanabe等人，1987；Campbell等人，1988)，从而提示IL-2、IL-4和GM-CSF具有***发育方面的相关性，但是从氨基酸序列方面没有观察到IL5与任何这些或其它细胞素具有任何显著的同源性。IL5的生物学活性
IL5主要由完全分化的Th2细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞分泌(Cousins等人，1994；Takutsu等人，1997)。已发现它作用于嗜酸性粒细胞、嗜碱粒性细胞、细胞毒性T-淋巴细胞以及作用于鼠B-细胞(Callard和Gearing，1994；Takutsu等人，1997)。IL5对人B细胞的效应仍是一件具有争议的事情。已证实IL5在某些情况下可增强免疫球蛋白合成并与人的多种B细胞系结合。即使在人B-细胞中已发现hIL5R的mRNA，但在这些细胞上是否实际存在受体仍必须得到证实(Baumann和Paul，1997；Huston等人，1996)。
IL5对嗜酸性粒细胞的作用包括趋化性、对内皮细胞粘附性的增强、细胞的激活和终末分化。而且，已证实IL5可阻止成熟嗜酸性粒细胞的凋亡(Yamaguchi等人，1991)。这些发现对当前有关IL5是对嗜酸性粒细胞分化最为重要的细胞素的概念，作出了贡献(Corrigan和Kay，1996；Karlen等人，1998)。
IL5及其相关的嗜酸性粒细胞之激活，在生理学上被认为是扮演了一个抵抗蠕虫感染以及可能抵抗某些肿瘤的保护性角色，这是由于这些疾病一般伴随有外周血液嗜酸性粒细胞增多(Takutsu等人，1997；Sanderson等人，1992)。然而，在一定程度上这只是推测，因为在两项研究中，即用巴西日本原线虫(Nippostrongylusbraziliensis)或孟氏血吸虫(Schistosoma mansoni)感染小鼠，然后对这些小鼠施用抗IL5的抗体，以确定小鼠抗这些寄生物的免疫力(例如，IgE水平)后，作者无法表明除了嗜酸性粒细胞下调节之外的任何效应(Sher等人，1990；Coffman等人，1989)。IL5转基因和“剔除”动物
对表达IL5的转基因小鼠或对IL5缺陷的剔除小鼠的研究，使人们进一步地了解了IL5的生理功能。
已报道了几种IL5转基因小鼠：
据报道，在T-细胞中表达IL5基因的转基因小鼠具有提高的白血细胞水平，其特征为B220+B淋巴细胞的扩增以及极度的嗜酸性粒细胞增多。它还伴有大量的腹膜腔细胞渗出液，其中嗜酸性粒细胞占统治地位，并且嗜酸性粒细胞浸润到几乎所有的器官***中(Lee等人，1997a)。
另一种转基因小鼠，它在金属硫蛋白启动子的控制下表达IL5基因，它的特征为：血清中IgM和IgA的水平提高、在外周血液及许多其它器官中有大量的嗜酸性粒细胞，并伴有产生自体抗体的特殊的CD5+B细胞群的扩增(Tominaga等人，1991)。
第三项研究涉及到在肺中组成型地表达IL5的一种转基因小鼠。这些动物逐步出现类似人的哮喘的病理生理变化，其中包括嗜酸性粒细胞侵入支气管周围空间、表皮肥大和粘液产生的增多。而且，在抗原不存在时也逐步出现了气道的过反应性(Lee等人，1997b)。
对IL5-缺陷小鼠(“剔除”小鼠)也进行了研究。这些小鼠(C57BL/6)没有任何明显的疾病迹象并且能够生育。这些小鼠的免疫球蛋白水平以及对DNP-OVA的特异性抗体应答都是正常的。这些小鼠有基础水平的嗜酸性粒细胞产生，但比对照动物低2-3倍，表明在完全缺乏IL5时仍可产生嗜酸性粒细胞。当用科氏中殖孔绦虫(Mesocestoides corti)感染这些小鼠时，在正常情况下所见到的嗜酸性粒细胞增多消失了，而且这种嗜酸性粒细胞增多的缺失并不影响由这种寄生虫所产生的蠕虫负担(Kopf等人，1996)。
在一项由Foster等人(1996)进行的研究中，针对剔除IL5对一种常见的特异性***反应气道发炎模型的效应进行了研究。小鼠用卵清蛋白致敏化和气雾剂激发，通常情况下会导致气道嗜酸性粒细胞增多、气道对β-醋甲胆碱的过反应性以及类似于在哮喘中所见到的广泛性肺损害。在IL5缺陷的小鼠中，嗜酸性粒细胞增多、气道过反应性以及肺损害不见了。当在这些小鼠中重建IL5的表达时，该气化-过敏原所诱发的嗜酸性粒细胞增多以及气道功能异常又重新恢复了。IL5的病理生理功能
哮喘影响着世界上大约10％的人群，并且在过去的二十年多里，由于仍未知晓的原因，哮喘类疾病的发生及发病率提高了(Ortega和Busse，1997)。哮喘是一种慢性气道疾病，其特征为反复的并且经常是可逆转性的气流阻塞、发炎和过反应性(Moxam和Costello，1990)。这就产生了喘气和透不过来气这样的症状，在严重的情况下有可能是致命的。
在上面提到的动物实验中使用了在肺脏组成型地表达IL5的转基因小鼠(Lee等人，1997a)和IL5缺陷的“敲除”小鼠(Foster等人，1996)，这些实验强烈地暗示：在哮喘的发病机制中，IL5扮演了一个决定性的角色。支持这一观点的进一步证据可以从几项包括有哮喘患者在内的研究中推断出来。
在对哮喘患者的支气管肺泡灌洗液(BAL)液体以及支气管粘膜活检中，已鉴定出嗜酸性粒细胞增多，而且与疾病的严重程度相互关联。在哮喘患者的BAL液体中，已鉴定出几个嗜酸性粒细胞产物，并且外周血液中的嗜酸性粒细胞数目与哮喘的严重程度相互关联(Ortega和Busse，1997)。
与对照个体相比，发现在29个严重的慢性哮喘患者中，有15个患者的IL5血清浓度提高了(正中浓度为150pg/ml)(Alexander等人，1994)。
在另一项涉及非特异性***反应和特异性***反应的哮喘病研究中，发现用T辅助细胞增强IL5的产生，似乎会引起特异性***反应哮喘以及非特异性***反应哮喘的嗜酸性粒细胞性炎症(Mori等人，1997)。
其它研究结果也显示：IL5在其它特异性***反应疾病中具有与众不同的功能。最近表明，在患有过敏性鼻炎的个体中，过敏原诱发的***性发作是与过敏原诱发的IL5合成相互关联，而不是与IgE相互关联(Ohashi等人，1998)。特异性***反应作用的相关性，在Barata等人(1998)的一项研究中也得到证实，在这项研究中，证实了在皮肤晚期反应中T-细胞显著地表达IL5。
这些和其它的结果，引导几个研究者如Corrigan和Kay(1996)、Danzig和Cuss(1997)鉴定了IL5、并且建议在开发涉及针对嗜酸性粒细胞炎症的哮喘和特异性***反应疾病的更好的治疗药物时将IL5作为主要靶位。由寄生物感染诱发的慢性组织损害性嗜酸性粒细胞过度增多、局部性的肺嗜酸性粒细胞增多和嗜酸性粒细胞过度增多综合症都是其它致病状态的例子，它们均可通过IL5的下调节而被治疗。IL5功能的体内证实
在使用啮齿类哮喘模型的几项研究中已经表明：用抗IL5的单克隆抗体(抗-IL5mAb)处理，与没有处理的对照相比，导致对嗜酸性粒细胞增多的抑制，且抑制程度与剂量相关(Nagai等人，1993a和b；Chand等人，1992；Coeffier等人，1994；Kung等人，1995；Underwood等人，1996)。在由Nagai等人(1993a)进行的研究中，用可溶性的IL5受体α处理致敏化的Balb/c小鼠，也观察到该效应。
在用Balb/c小鼠进行的一项研究(Hamelmann等人，1997)以及用豚鼠进行的四项研究中，还另外表明：在抗原致敏化的动物中，抗-IL5 mAb能够抑制由多种物质诱发的气道过反应性(Mauser等人，1993；Akutsu等人，1995；van Oosterhout等人，1995和1993)。在一些研究中，在微观水平上也观察到用抗-IL5 mAb处理的有益效应(参见表1)(Mauser等人，1993；Akutsu等人，1995；Kung等人，1995)。重要的是，在由Kung等人(1995)进行的研究中，在用抗原激发B6D2F1小鼠几个小时前施用抗-IL5 mAb以及在用抗原激发B6D2F1小鼠后远至5天施用抗-IL5 mAb，均观察到小鼠肺脏炎症的减轻，从而表明抗-IL5 mAb对气道炎症的效应既可以是预防性的又可以是治疗性的。然而，由Underwood等人进行的研究，在抗原激发后两个小时给予豚鼠抗-IL5 mAb时，没有观察到这个效应(Underwood等人，1996)。
Mauser等人(1995)在一项使用猴子哮喘模型的研究中，报道了在抗原激发前1小时施用大鼠抗小鼠-IL5 mAb时，对抗原激发后的气道过反应性的抑制。另外，用抗体处理的动物，与没有处理的对照相比，其支气管肺泡灌洗液(BAL)中的嗜酸性粒细胞数量下降了75％。用抗-IL5 mAb处理后，发现其对嗜酸性粒细胞增多和过度应答性的效应，可长达三个月(Mauser等人，1995)。在***反应性的过度应答性方面，Nagai等人(1993a和1993b)的研究结果，没有记录任何在过度应答性方面的减轻、连同在BAL中的嗜酸性粒细胞数量的减少。
到目前为止，所提到的所有抗-IL5 mAb体内试验，都是使用大鼠-抗-小鼠单克隆抗体来做的。Egan等人(1995)报道使用人源化的大鼠-抗-人IL5单克隆抗体，称为Sch 55700，所进行的试验。这些mAb，当以0.3mg/kg的剂量施用于致敏化的猴子时，对肺脏灌洗液中的嗜酸性粒细胞增多可抑制75％。当以1mg/kg的剂量给予***反应性小鼠Sch 55700时，也观察到对气道嗜酸性粒细胞增多的抑制。当前及未来对哮喘的治疗
正如提到的，当前对哮喘的治疗是使用皮质甾类，通过其抗炎作用，它们成为最有效的药物。除此之外，β2激动剂和甲基黄嘌呤衍生物可以引起支气管扩张、disodium chromoglycate可以“稳定”肥大细胞，因而这些药物可防止介质释放，已经证明所有这些药物对哮喘患者有益(Ortega和Buss，1997)。
未来对哮喘的治疗可能象上面所讨论的那样，包括使用抗-IL5 mAb。Celltech和Schering Plough合作，在进行抗-IL5 mAb治疗哮喘的I期临床试验。然而，用单克隆抗体治疗带来了一系列的缺点。首先，开发和生产一种安全的mAB(例如，人源化的mAB)费用很高，从而导致用于终端用户的治疗产品昂贵。其次，从患者的角度来讲，mABs具有这样的不利特性，即它们必须以相当短的间隔施用。第三，从mABs的天然性质来看，它们对抗原的单一表位所显示出的特异性窄。最后，mABs(即使人源化了)具有免疫原性，从而导致所施用的抗体，随着治疗的时间进程，逐渐加快失活作用。
另外，Hybridon公司建议：将IL5的反义寡核苷酸用于反义治疗，以治疗哮喘、***反应和炎症。然而，已证实反义技术在技术上是困难的，并且事实上，还没有获得人的反义治疗可行性的结论性证据。
最后，WO 97/45448(Bresagen Limited/Medvet Science)提出使用“IL5分子之被修饰和变异并能够拮抗IL5活性的形式”，以改善、减轻或者在其它方面减小由天然的IL5或其突变形式而引起的异常效应。据报道，拮抗效应是IL5的变异形式结合到IL5R的低亲和性的α链的结果，而不是结合到高亲和性的受体；通过这种方式，变异体与IL5竞争结合IL5的受体，但是却不施加IL5的生理效应。
其它涉及到嗜酸性粒细胞增多性炎症的特异性***反应疾病，可以根据哮喘所提到的症状或者通过利用过敏原提取物获得亚致敏化，从而采用免疫治疗(IT)来处理。已知后一种类型的处理能够有效地抵抗对一种或几种抗原的***反应，而IT在治疗多重***反应中并不可行。而且，对于常规的IT，为了在临床上对治疗敏感的患者达到症状改善，需要花费的时间很长。
所以，尽管有现存的以及未来可能的对慢性***反应性疾病诸如哮喘的治疗方法，但仍然非常需要替代途径，以治疗和改善这类和其它的慢性***反应性疾病。发明的目的
本发明的目的是提供治疗以嗜酸性粒细胞增多为特征的慢性***反应性疾病(诸如哮喘)的新方法。另一个目的是开发针对IL5的自体疫苗，为的是获得对涉及慢性气道炎症的哮喘和其它病理性疾病的新治疗方法。
发明概述
正如上面所提到的，源自T-细胞的细胞素IL5在协调指挥嗜酸性粒细胞应答中具有决定性作用，影响着嗜酸性粒细胞的产生、定位和激活。由于没有另外报道过IL5在保护性的免疫应答中具有最重要的作用，所以IL5这一细胞素，在本发明者看来，是一种对治疗哮喘有吸引力的治疗靶位。
根据本发明，总的目标是：由于嗜酸性粒细胞的吸引和激活依赖IL5，所以通过下调节IL5的水平，就可以将哮喘患者气道中嗜酸性粒细胞的病理水平降下来。而气道炎症伴则随着气道粘膜中嗜酸性粒细胞数量的降低而减轻，相应地哮喘病患者的临床表现改善了。
在对气道炎症动物模型使用抗IL5单克隆抗体的研究中，已经证实这种方法的潜在效应，参见“实施例序言”。
然而，本发明利用自体疫苗概念、通过使用产生主动免疫应答的方法，将通过被动免疫所获得的结果推进了一步。就本发明者所知，这样一种方法以前还从来没有被人提出过。
与当前采用皮质甾类等治疗相比，用IL5自体疫苗治疗哮喘病的优点在于副作用的减轻和/或消除，并且在治疗持续期间很可能会具有更好的疗效。当与抗-IL5mAbs相比时，预期所诱导的多克隆Ab应答的疗效要优于被动地注射单克隆免疫球蛋白，这是由于多克隆应答的特异性更宽。预期在施用方案方面也进行改进(这是由于本文所描述的有效自体疫苗每年将最多需要施用2-6次)。
当与亚致敏化相比时，本发明有吸引力的方面是所提供的是非特异性的；当处理多重***反应患者时，这就显得特别有关系。
因而，在其最宽广和最普通的范围内，本发明涉及一种用于在动物，其中包括人的体内下调节白细胞介素5(IL5)活性的方法，该方法包括对动物的免疫***有效地呈递免疫学上有效量的：-   至少一种已配制的IL5多肽或它的亚序列，而且为了在用IL5多肽或它的亚序列免疫动物时可诱导产生抗IL5多肽的抗体，和/或-   至少一种IL5类似物，其中在IL5的氨基酸序列中引入了至少一个修饰，这样做的结果是用类似物免疫动物可诱导产生抗IL5多肽的抗体。
该方法最具吸引力的方面是，例如，通过定期地但又不是非常频繁地进行免疫就可控制哮喘，而与此相对比的一种治疗方法涉及到对与该IL5类似物具有结合亲和力的抗-IL5或分子的施用。根据本发明，预期每年用致免疫组合物注射1-4次，就足够获得所希望的效果，而其它IL5活性抑制剂需要或者将需要每日施用，或者至少每周施用。
本方面也涉及到IL5类似物以及编码这些类似物之亚类的核酸片段。另外，包含该类似物或者其核酸片段的致免疫组合物也是本发明的一部分。
本发明也涉及到一种鉴定IL5类似物的方法以及用于制备包含IL5类似物的组合物的方法。
附图说明
图1：人的成熟IL5氨基酸序列(SEG ID NO：1)。图中包括了并列对比的鼠IL5序列(SEG ID NO：12)，但只将与人的序列不同的位置显示出。图中的两个“*”表示鼠IL5所缺失的N-末端残基。N-糖基化部位用双下划线标出，人IL5的O-糖基化的苏氨酸以斜体表示，并且半胱氨酸用黑体表示。图2：人IL5二聚体和单体的结构。A：hIL5二聚体的结构。该结构仅是为残基5-112而获得的，也就是说位于Thr 3的O-糖基化位点没有包括在内。B：结构同A，但标出了螺旋(A-D和A’-D’)。
C：hIL5单体的结构，其中与mIL5不同的氨基酸残基用浅灰色表示。
图3：上下对比排列的人的成熟IL5(hIL5)和鼠的成熟IL5(mIL5)的氨基酸序列(SEG ID Nos：1和12)，图中指出了合适的替换区。4个α-螺旋A-D用实线框包围，β-片层加有双下线，两个半胱氨酸的位置用“”标出。在两个序列中相同的残基用“-”标出，不相同的残基用“*”标出。回环1跨越于螺旋A和B之间，回环2跨越于螺旋B和C之间，回环3跨越于螺旋C和D之间。准备被外源的含肽TH表位替换的氨基酸序列用黑体标出；其中的一个这样序列用虚线框包围，这是由于这些残基与在不同构建体中的那些被替换残基重叠。10个构建体的氨基酸序列(5个源自人IL5，5个源自鼠IL5)在SEG ID Nos：2-11和13-22中给出。
图4：测试两个mIL5自体DNA疫苗的DNA免疫之ELISA结果。
小鼠用编码卵清蛋白、或者mIL5wt、或者mIL5.1、或者mIL5.5的裸露的质粒DNA进行DNA接种。测定第77天获得的血清针对卵清蛋白和鼠IL5的反应性。将聚苯乙烯微滴定板(Maxisorp，Nunc)用卵清蛋白(0.1μg/孔，Sigma)或者纯化的重组的鼠IL5(0.1μg/孔，E1320)外包衣。使用山羊抗-小鼠次级抗体，可肉眼观察到加入孔中的稀释血清的反应性。将测试样品的OD490读数值减去无血样(prebleeds)的OD490读数值，然后将得到的针对每个小鼠个体的减去值以竖条表示。无血样(于1∶25稀释中)的OD490读数值在0.025-0.034这个范围。十字表示动物死了。
图5：基于鼠IL5的自体疫苗构建体之示意图。
位于顶部的图代表鼠的野生型IL5单体，其中有螺旋A-C、回环1-3和C-末端柔性区。其余的图代表不同的自体疫苗构建体，其中有破伤风类毒素的表位P2和P30在多个不同部位的内-替换(in-substitution)。各构建体在实施例中予以了详细说明。
发明详述定义
以下对用于本发明的若干术语进行了详细的定义和解释，目的是明确本发明的范围和界限。
术语“T-淋巴细胞”和“T-细胞”对于胸腺来源的淋巴细胞，可互换使用，它们负责各种细胞介导的免疫应答以及在体液免疫应答中辅助者的活性。类似地，术语“B-淋巴细胞”和“B-细胞”对于产生抗体的淋巴细胞，可互换使用。
“IL5多肽”在本文中旨在表示具有上面所讨论的源自人和小鼠的IL5蛋白质(或者其截短形式，享有显著量的带有完整IL5的B-细胞表位)之氨基酸序列的多肽，而且这样的氨基酸序列，其与从其它种类中分离到的这两个蛋白质的异源类似物的氨基酸序列相同的多肽也包括在本术语中。在原核细胞***中制备的IL5未糖基化形式，与由于使用例如，酵母或其它的非哺乳类真核细胞表达***而得到的具有不同糖基化型式的IL5一样，也包括在本术语的界限之内。然而，应该指出的是：当使用术语“IL5多肽”时，旨在表示这个正被谈论的多肽，当呈递给待处理的动物时，在正常情况下是非致免疫的。换言之，该IL5多肽是自体蛋白质或者是该自体蛋白质的异源类似物，其在正常情况下并不产生针对正被谈论的动物的IL5的免疫应答。
“IL5类似物”是IL5的一级结构被改变的IL5多肽。这种改变可以是以，例如，IL5多肽与合适的融合伙伴(即，仅仅涉及在C-和/或N-末端添加氨基酸残基的一级结构改变)融合的形式，和/或它也可以是以在IL5多肽的氨基酸序列中***和/或缺失和/或替换的形式。本术语也涵盖了IL5分子的衍生物，参见下面所讨论的IL5的修饰。
应该指出的是：当将，例如人IL5的犬类似物，作为用于人的疫苗时，可以设想其能够产生所希望的针对IL5的免疫性。正如上面所定义的，当将异源类似物如此用于免疫作用时，它也被认为是“IL5类似物”。
在本文中当使用缩写“IL5”时，是旨在表示成熟、野生型的IL5氨基酸序列(在本文中也表示为“IL5m”和“IL5wt”)。人的成熟IL5用hIL5、hIL5m或hIL5wt表示，鼠的成熟IL5用mIL5、mIL5m或mIL5wt表示。当DNA构建体包含编码前导序列或其它物质的信息时，这种情况通过上下文线索通常会是不言自明。
术语“多肽”在本文中，旨在表示2-10个氨基酸残基的短肽和11-100个氨基酸残基的寡肽，以及超过100个氨基酸残基的多肽。而且，本术语也旨在包括蛋白质，即包含至少一条多肽的功能性生物分子；当包含至少两条多肽时，这些多肽还可以形成复合物、可以共价相连或者非共价相连。蛋白质中的一条或多条多肽可被糖基化和/或脂化和/或包含辅基。
术语“亚序列”的含义为任何一段至少3个氨基酸残基的连续序列或者(如果恰当的话)至少3个核苷酸的连续序列，它分别直接源自天然存在的IL5的氨基酸序列或核酸序列。
术语“动物”在本文中，一般旨在表示一种动物种类(优选为哺乳类动物)诸如智人(Homo Sapiens)、驯养犬(Canis domesticus)等，并且不止单一种动物。但是，本术语也表示这样一种动物的一个群体，这是由于根据本发明的方法所免疫的动物个体基本上都含有相同的IL5，从而可以采用相同的一种或多种免疫原去免疫多个动物，这是重要的。例如，如果IL5的遗传变异体存在于不同的人群中，那么为了能够突破每个群体对IL5的自体耐受性，就可能需要对这些不同的群体使用不同的免疫原。本发明中的动物是具有免疫***的活生物，本领域技术人员会清楚这一点。优选的动物是脊椎动物，诸如哺乳动物。
术语“IL5活性的体内下调节”在本文中的含义为在活生物体中IL5与其受体间(或者IL5与其它可能的并在生物学上重要的IL5结合伙伴间)的相互作用的数量下降。该下调节能通过采用几种机制实现，其中通过抗体结合，单纯地干涉IL5中的活性位点是最简单的。这样的抗体结合可导致清除细胞(诸如巨噬细胞和其它的吞噬细胞)将IL5除去，这也仍然属于本发明的范围之内。
表达式“有效呈递…给免疫***”，旨在表示动物的免疫***以受控制的方式受到了免疫原的激发。正如下面所述，免疫***的这种激发可通过多种方式实现，其中最重要的是接种含有“药性疫苗(pharmaccines)”(即，为治疗或改善正在发生的疾病而施用的一种疫苗)的多肽或者接种核酸“药性疫苗”。所希望获得的重要结果是动物的免疫感受态细胞以免疫学上有效的方式遭遇抗原，但是对于支撑着本发明的发明构思来讲，达到这种结果的精确机制并不那么重要。
术语“致免疫有效量”具有本领域中其通常的含义，即能够诱发免疫应答的免疫原量，所诱发的免疫应答显著地约束致病因子，该致病因子与免疫原享有相同的免疫学特性。
表达式IL5已“被修饰”，在本文中是表示构成IL5支柱的多肽被化学修饰了。这种修饰可以是例如，在IL5序列中某些氨基酸残基的衍生化(例如，烷化、酰化、酯化等)，但是正如从下面的公开中所理解的，优选的修饰包括对IL5氨基酸序列的一级结构的多种改变(或添加)。
当讨论“对IL5的自体耐受”时，要知道，由于IL5是待接种群体中的自体蛋白质，所以群体中的正常个体并不发动对IL5的免疫应答；虽然如此，还不能排除动物群体中的个别个体可能会产生抗天然IL5的抗体，例如，作为自体免疫紊乱的一部分。无论如何，动物在正常情况下将仅耐受其自己的IL5，但不能排除从其它动物种类或从具有不同IL5表型群体来源的IL5类似物也被所述动物耐受。
“外源T-细胞表位”(或者“外源T-淋巴细胞表位”)就是能够结合到MHC分子的肽，它还可以刺激一种动物中的多个T-细胞。本发明中优选的外源T-细胞表位为“混杂的”表位，即结合到一种动物或群体中的某一特定种类MHC分子之相当一部分的表位。已经知道的这类混杂T-细胞表位的数量还非常有限，并且将在下面对它们进行详细讨论。应该指出的是，为了使根据本发明使用的免疫原能够在动物群体中尽可能多的个体中有效，也许需要：1)在同一IL5类似物中***几个外源T-细胞表位，或者2)制备几个IL5类似物，其中的每个类似物都被***了一个不同的混杂表位。还应该指出的是，外源T-细胞表位这个概念也涵盖了对的使用，隐蔽型T-细胞表位源自自体蛋白质并且只有在以被分离形式，而不是所讨论的自体蛋白质的一部分，存在时才施加致免疫行为。
“外源T辅助淋巴细胞表位”(外源TH表位)是可结合II类MHC分子的外源T细胞表位，它还能够被呈递到结合有II类MHC分子的抗原递呈细胞(APC)的表面上。
(生物)分子的“功能部分”在本文中，旨在表示该分子中负责该分子所施加的至少一种生化或生理学效应的那部分。许多酶和其它效应器分子具有由它们来负责施加效应的活性位点，这在本领域中是众所周知的。分子的其它部分可能具有稳定或增加溶解性的作用，如果这些作用在本发明的某一具体实施方案中无关紧要的话，那么就可以将分子的这些部分拿掉。例如，将某些其它细胞素用作IL5的修饰部分(参见下面的详细讨论)，在这种情况下，稳定性问题可能是无关的，这是由于与IL5的偶联提供了所需的稳定性，这些都是可能的。
术语“佐剂”具有疫苗技术领域中其通常的含义，即它是这样的物质或物质的组合物：1)本身不能够发动针对疫苗免疫原的特异免疫应答，但是2)却能够增强针对免疫原的免疫应答。或者，换言之，单独用佐剂接种不能提供针对免疫原的免疫应答，用免疫原接种也许会或者不会产生针对免疫原的免疫应答，但是用免疫原和佐剂联合接种所诱发的针对免疫原的免疫应答，强于单独用免疫原接种所诱发的针对免疫原的免疫应答。
分子的“靶向”在本文中，旨在表示这样的情形，即一旦将分子引入到动物中，它就会优先地出现在某一(些)组织或者将优先地与某些细胞或细胞类型结合。这种效果可通过多种方式实现，其中包括将分子配制于促进靶向的组合物中或者在分子中引入促进靶向的基团。这些问题将在下面予以详细讨论。
“对免疫***的刺激”，其含义为一种物质或物质的组合物所表现出的一般的、非特异性的免疫刺激效应。佐剂和假定佐剂中的许多(诸如某些细胞素)，具有刺激免疫***的能力。使用免疫刺激剂的结果是提高了免疫***的“警戒性”，这也就是说，此时或随后用免疫原诱发免疫作用，会比独立使用免疫原时，可产生更加有效的免疫应答。IL5活性下调节的优洗实施方案
优选地，在本发明的方法中被用作免疫原的IL5多肽是被修饰分子，其中在IL5的氨基酸序列中存在至少一处改变，这是由于这么做，极大地促进了突破对IL5自体耐受这个十分重要问题的机会。应该指出的是：这并不排除使用处于配制物中的这样一种被修饰IL5的可能性，其中的配制物例如，含有某些佐剂(其详细讨论在下面)的配制物，促进突破针对IL5自体免疫。
已经表明(Dalum I等人，1996，免疫学杂志(J.Immunol.)，157：4796-4804)，在正常个体中生理性地存在识别自体蛋白质的潜在性自体反应B-淋巴细胞。然而，为了使这些待诱导的B-淋巴细胞实际产生与相关自体蛋白质能够反应的抗体，还需要来自产生细胞素的T-辅助淋巴细胞(TH-细胞或TH-淋巴细胞)的帮助。正常情况下并不提供这种帮助，因为，当源自自体蛋白质的T-细胞表位被抗原呈递细胞(APCs)呈递时，T-淋巴细胞在一般情况下不能识别它。但是，通过提供“外源”因素于自体蛋白质中(即通过引入免疫学重要的修饰)，就使得识别外源因素的T-细胞，一旦识别APC(诸如，开始时，是单核细胞)上的外源表位，就被激活了。能够识别位于被修饰自体蛋白质上的自体表位的多克隆B-淋巴细胞(它们也是特化的APCs)也内化该抗原并随后呈递其中的外源T-细胞表位(单个或多个表位)，被激活的T-淋巴细胞随后给这些自体反应性多克隆B-淋巴细胞提供细胞素帮助。由于这些多克隆B-淋巴细胞所产生的抗体能够与位于被修饰多肽上的不同表位反应，其中包括在天然多肽中也存在的那些表位，所以就诱导出可与未修饰的自体蛋白质交叉反应的抗体。总之，可以对T-淋巴细胞进行引导，使其表现为似乎多克隆B-淋巴细胞群体识别了一个完完全全的外源抗原，而事实上却只有***的表位(一个或多个)对宿主而言是外源的。采用这种方法，就诱导出能够与未修饰的自体抗原交叉反应的抗体。
在本领域中，已知有几种目的为突破自体耐受的肽自体抗原之修饰方式。因此，根据本发明，修饰作用可包括：-   引入至少一个外源T-细胞表位，和/或-   引入至少一个第一组分，其影响被修饰的分子靶向抗原呈递细胞(APC)，和/或-   引入至少一个第二组分，其刺激免疫***，和/或-   引入至少一个第三个组分，其最佳化被修饰IL5多肽呈递给免疫***。
但是，在进行所有这些修饰的时候，应该在IL5中保持相当比例的原始的B-淋巴细胞表位，这是由于B-淋巴细胞对天然分子的识别会因此而增强。
在一个优选的实施方案中，侧链基团(以外源T-细胞表位的形式或者上述的第一、第二和第三组分的形式)被共价或非共价地引入。这旨在表示在不改变基本的氨基酸序列的条件下，或者至少在肽键(位于链中的各氨基酸之间)中不引入变化的条件下，将源自IL5的氨基酸残基片段衍生化。
一个替代性的并且是优选的实施方案采用了氨基酸替换和/或缺失和/或***和/或添加(这可通过重组方法或者通过肽的合成来实现；涉及到对更长氨基酸片段的修饰时还可以出现融合多肽)。该实施方案的一个特别优选的变化体是在WO95/05849中描述的技术，其中公开了一种用于下调节自体蛋白质的方法：用自体蛋白质的类似物来免疫，类似物中的若干氨基酸序列已被相应数量的氨基酸序列所替换，每个替换后的氨基酸序列包含一个外源的免疫显性T-细胞表位，而与此同时在类似物中仍保持着自体蛋白质的总体三级结构。如果修饰(可以是氨基酸的***、添加、缺失或替换)在造成外源T-细胞表位产生的同时，又保留了IL5中相当数量的B-细胞表位，那么，对于本发明的目的，它还真是足够了。但是，为了最有效地诱导免疫应答，还是要优选保持IL5的总体三级结构的被修饰分子。
下面的公式描述了本发明一般包括的IL5构建体：
(MOD1)s1(IL5e1)n1(MOD2)s2(IL5e2)n2...(MODx)sx(IL5ex)nx
其中的IL5e1-IL5ex为包含IL5亚序列的x个B-细胞表位，它们相互独立、相同或不相同，并且可以含有或者不含有外源侧链基团，x为≥3的整数，n1-nx为x个≥零的整数(至少一个为大于等于1)，MOD1-MODx为在保留的B-细胞表位间引入的x个修饰，并且s1-sx为x个≥零的整数(至少一个为≥1，如果在IL5e序列中没有引入侧链基团的话)。因而，假设对构建体的免疫原性进行一般的功能性限制，本发明仍允许对原始的IL5序列进行所有种类的变换和所有种类的修饰。所以，在本发明中包括了通过删除部分IL5序列而得到的被修饰IL5，所删除的部分例如在体内显示了不利效应或者产生了不希望的免疫学反应。
相当一部分B-淋巴细胞表位或者甚至一个已对其进行了如本文所述的修饰的蛋白质的总体三级结构的保持，可通过几种方法实现。其中的一种方法仅需制备导向IL5的多克隆抗血清(例如，在兔子中制备的抗血清)，然后将这种抗血清用作针对所产生的被修饰蛋白质的实验试剂(例如，在竞争性ELISA中)。那些与抗血清发生反应的程度，跟IL5与抗血清发生反应的程度相同的被修饰形式(类似物)，必须被认为是具有与IL5相同的总体三级结构，而与这样的抗血清表现出有限(但仍然是显著的和特异性的)反应性的类似物，被认为保持了相当一部分原始的B-细胞表位。
或者，选出能与IL5上不同的表位反应的单克隆抗体并制备这些抗体，然后将其用作测试试剂。这种方法具有的优越性为允许1)IL5的表位定位和2)在所制备的类似物中被保持表位的定位。
当然，第三种方法将需要解析IL5或者其有生物学活性的截短形式(参见上面)的三维结构，并将该三维结构与解析出的所制备类似物之三维结构进行比较。通过X-射线衍射研究和NMR-光谱学的帮助，可以解析三维结构。涉及到三级结构的进一步的信息，在一定程度上可从圆二色性研究获得，为了提供关于一个给定分子的三级结构的有用信息，它具有只需要多肽处于纯的形式这样的优点(而X-射线衍射需要提供结晶的多肽，NMR需要提供多肽的同位素变异体)。然而，为获得结论性的数据，最终还需要X-射线衍射和/或NMR，这是由于圆二色性是通过二级结构因素的信息，只能提供关于正确三维结构的间接证据。
本发明的一个优选的实施方案利用IL5的B-淋巴细胞表位的多重呈递(即，配方I，其中在两个位置中存在至少一种B-细胞表位)。这种效果可以多种方式实现，例如，仅仅制备包含结构(IL5)m(其中的m为一个≥2的整数)融合多肽，然后在IL5序列中的至少一处引入本文所讨论的修饰，或者也可以在至少两个IL5氨基酸序列之间进行***。优选地，所引入的修饰包含至少一个B-淋巴细胞表位复份和/或引入一个的半抗原。
正如上面所提到的，外源T-淋巴细胞表位的引入，可通过引入至少一个氨基酸的***、添加、缺失或替换实现。当然，在正常的情况下，在氨基酸序列中引入的变化多于一个(例如，一个完整T-细胞表位的***或用一个完整T-细胞表位替换)，但是我们要达到的重要目的是：当IL5类似物由抗原呈递细胞(APC)加工时，它将产生这样一个外源的免疫显性T-细胞表位，其被呈递于位于APC表面上的II类MHC分子中。因此，如果IL5的氨基酸序列在适当位置上包含若干这样的氨基酸残基，它也存在于在外源TH表位中，那么，通过氨基酸的***、添加、缺失和替换，就可以提供外源表位其余剩下的氨基酸，从而完成外源TH表位的引入。换言之，并不需要，通过***或替换，引入完整的TH表位。
优选地，氨基酸的***、缺失、替换或添加的数目为至少两个，诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20和25个***、替换、添加或缺失。更加优选地，氨基酸的***、替换、添加或缺失的数目不超过150，诸如最多100、最多90、最多80和最多70。特别优选地，替换、***、缺失或添加的数目不超过60，并且特别要指出的是数目不要超过50或者甚至40。最优选的数目是一个不超过30的数目。至于氨基酸的添加，应该指出的是，当所得到的构建体处于融合多肽形式时，添加的数目常常比150高许多。
本发明的优选实施方案包括引入至少一个外源的免疫显性TH表位的修饰。需要理解的是，TH表位之免疫显性这个问题取决于所讨论动物的种类。正如本文所用，术语“免疫显性”就是指这样的表位，它们在接种的个体中产生重要的免疫应答，但是一个众所周知的事实是：在一个个体中为免疫显性的TH表位，并不一定在另一个相同种类的个体中也是免疫显性的，甚至尽管它在后一个体中也许具有结合MHC-II分子的能力。
另一个要点是关于TH表位的MHC限制方面的。一般地，天然存在的TH表位是MHC限制的，即组成一个TH表位的某肽将只与II类MHC分子的一个亚类有效地结合。这就出现这样的效应：在大多数情况下，使用一种特定TH表位会造成只在部分群体中有效的免疫组成成分，所以根据那部分群体的大小，可能需要把更多的TH表位包含在同一分子中，或者也可以制备多组成成分疫苗，其中的组成成分为IL5变异体，而且由于引入到这些变异体中的TH表位有本性差别，而可将它们彼此区分。
如果完全不知道所使用T-细胞的MHC限制(例如，在不太明确被接种动物的MHC组成时的情况)，由一种特定的疫苗组合物所覆盖的动物群体的大小，可通过如下公式确定： f population = 1 - Π i = 1 n ( 1 - P i ) - - - ( II )
其中的Pi是群体中对存在于疫苗组合物中的ith外源T-细胞表位有应答的个体之频率，n是疫苗组合物中外源T-细胞表位的总数目。所以，含有3个外源T-细胞表位的疫苗组合物并且在群体中所具有的应答频率分别为0.8、0.7和0.6时，将给出：
               1-0.2×0.3×0.4＝0.976
也就是统计学上，97.6％的群体将发动对疫苗的由MHC-II介导的应答。
上面的公式并不适用于这样的情况，即已经或多或少地知道了其中所使用肽的精确的MHC限制型。举个例子，如果某一多肽只结合由HIA-DR之等位基因DR1、DR3、DR5和DR7编码的人MHC-II分子，那么将这种肽与另一个与其余剩下的所有MHC-II分子(其由HLA-DR的等位基因编码)结合的肽一起使用，就会实现对所讨论群体的100％覆盖。类似地，如果第二个肽只结合DR3和DR5，那么，添加该肽根本就不会提高覆盖率。如果群体应答的计算纯粹是基于疫苗中T-细胞表位的MHC限制，那么由一种特定的疫苗组合物覆盖的群体的比例可通过如下公式来确定：
Figure A0080636700232
其中的φj为编码MHC分子的等位单元型群体中频率的总和，这里的MHC分子为可以结合疫苗中的T-细胞表位之任一并属于3个已知HLA座位(DP、DR和DQ)中的jth的MHC分子；在实践中，首先确定哪些MHC分子将识别疫苗中的每个细胞表位，然后将这些MHC分子按类型(DP、DR和DQ)列出-接着，对于每一类型，将所列出的不同等位单元型的各个频率加起来，就得到了φ1、φ2和φ3。
也许会发生公式II中的pi值超过相应的理论值πi： π i = 1 - Π j = 1 3 ( 1 - v j ) 2 - - - ( IV )
其中的vj为编码MHC分子的等位单元型群体中频率的总和，这里的MHC分子为可以结合疫苗中的ith T-细胞表位并属于3个已知HLA座位(DP、DR和DQ)中的jth的MHC分子。这就意味着，在群体的1-πi中应答个体的频率为(贴原文第29页第8行前半部分的等式)。因而，可对公式III进行调整，从而生成公式V：
其中的术语1-fresidual_i如果是负的，就设置为零。应该指出的是，公式V需要对所有的表位，针对等同的单元型套，先进行单元型定位。
所以，当选择欲引入到IL5类似物中的T-细胞表位时，将所有可得到的表位的知识都考虑到是重要的，这些知识为：1)在群体中应答个体对每一个表位的频率，2)MHC限制数据，和3)相关单元型在群体中的频率。
天然存在着若干“混杂的”T-细胞表位，它们活跃于一种动物或者一个动物群体的个体的比例大，而且优选地将这些表位引入到疫苗中，从而在同一疫苗中减小对不同IL5类似物之非常大量的需要。
根据本发明，混杂的表位可以是天然发生的人T-细胞表位诸如来自破伤风类毒素的表位(例如，P2和P30表位)、白喉类毒素、流感病毒血凝素(HA)和P.falciparum CS抗原。
在这几年中，已对若干其它的混杂型T-细胞表位予以了鉴定。特别是对能够结合大比例的由不同HLA-DR等位基因编码的HLA-DR分子的肽予以了鉴定，并且将所有这些肽作为T-细胞表位引入到根据本发明而使用的IL5类似物中是可能的。另请参见下面的参考文献中讨论的表位，此处全部引用作为参考：WO 98/23635(Frazer IH等人，授予Queensland大学)；Southwood S.等人，1998，免疫学杂志(J.Immunolo.)，160：3363-3373；Sinigaglia等人，1988，自然(Nature)，336：778-780；Chicz等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)，178：27-47；Hammer J等人，1993，细胞(Cell)，74：197-203；和Falk K等人，1994，免疫遗传学(Immunogenetics)，39：230-242。将这5篇参考文献中所列出的所有表位作为天然表位的候选物，跟与这些表位享有共同基序的表位一样，用于本发明是恰当的。
或者，表位也可以是任何能够与大部分的II类MHC分子结合的人工T-细胞表位。在本文中，在WO 95/07707以及在相应的文章Alexander J等人，免疫性(Immunity)，1：751-761(此处引用二者的公开内容作为参考)中描述的泛DR表位肽类(“PADRE”)，是依据本发明而待使用的诱人的表位候选物。应该指出的是，为了改善实施时的稳定性，在这些文章中所公开的最有效的PADRE肽类在C-和N-末端携带有D-氨基酸。然而，本发明的基本目的是将相关的表位结合起来并作为被修饰IL5的一部分，接着应该在APC的溶酶体内把它们用酶破坏，以便随后呈递于MHC-II分子中，因此在本发明中将D-氨基酸结合到表位中并不方便。
一个特别优选的PADRE肽为一个具有氨基酸序列AKFVAAWTLKAAA(SEQID NO：65)的肽或者它的一个免疫学有效的亚序列。这种肽以及具有相同MHC限制缺乏的其它表位，为优选的T-细胞表位，它们应该存在于用于本发明的方法的IL5类似物中。这样的超级混杂型表位可以最简单化本发明的实施方案，其中只将单一一种被修饰IL5呈递到接种动物的免疫***。
正如上面所提到的，IL5的修饰也可包括引入一个第一组分，其作用是将被修饰IL5靶向APC或B-淋巴细胞。例如，该第一组分可以是一个对B-淋巴细胞的特异表面抗原或者对APC的特异表面抗原特异结合的伙伴。许多这样的特异表面抗原为本领域所公知。例如，该组分可以是一个碳水化合物(例如，甘露聚糖或甘露糖)，在B-淋巴细胞上或者在APC上有一个针对它的受体。或者，第二组分可以是一个半抗原。特异性地识别APC上或淋巴细胞上的表面分子的抗体片段也可用作第一组分(表面分子可以是，例如巨噬细胞和单核细胞的FCγ受体，诸如FcγRI或者替代性地任何其它特异表面标志物诸如CD40或CTLA-4)。应该指出的是，所有这些示范性的靶向分子也可被用作佐剂的一部分，参见下面。
通过将上面提到的刺激免疫应答的第二组分包括在内，就可以提高免疫***的应答水平，这作为被修饰IL5多肽靶向某一细胞类型以实现增强的免疫应答的一种替代或补充，，是可能的。这样的第二组分的典型例子为细胞素和热休克蛋白或者分子伴侣，以及其有效部分。
依据本发明而待使用的合适的细胞素，为在正常情况下在疫苗组合物中具有佐剂功能的那些细胞素，即例如干扰素-γ(INF-γ)、Flt3L、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素13(IL-13)、白细胞介素15(IL-15)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；或者，细胞素分子的功能性部分也许就足够作为第二组分。在将这类细胞素作为佐剂物质而使用方面，参见下面的讨论。应该指出的是，如果必需使用IL-4以及IL-13的话，使用二者时要非常仔细，这是由于已知这两种分子在特异性***反应以及哮喘的病理生理学中是关键的效应器分子。
根据本发明，作为第二组分使用的合适的热休克蛋白或分子伴侣可以是HSP70、HSP90、HSC70、GRP94(也称为gp96，参见Wearsch P A等人，1998，生物化学(Biochemistry)，37：5709-19)和CRT(肌钙网蛋白)。
或者，第二组分可以是毒素，诸如李斯特菌溶胞素(LLO)、脂质A和热不稳定肠毒素。若干分枝菌来源的物质诸如MDP(胞壁酰二肽)和海藻糖二酯类TDM和TDE也具有诱人的可能性。
引入第三组分(其可增强被修饰IL5呈递给免疫***)的可能性也是本发明的一个重要的实施方案。本领域已给出了该原则的几个实施例。例如，已知布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)蛋白质OspA中的棕榈酰脂化锚钩可被用于提供自体佐剂(self-adjuvating)多肽(参见例如，WO 96/40718)。看起来脂化的蛋白质可形成带核心的微团样结构，其中的核心由多肽的脂化锚钩部分和分子的其余部分(其从分子中伸出)组成，从而导致抗原决定基的多重呈递。因而，使用了不同的脂化锚钩(例如，豆蔻基、豆蔻基、法呢基、geranyl-geranyl基、GPI-锚钩和N-脂酰甘油二酯基)的这个及相关的方法的用途是本发明的优选实施方案，这特别是由于，在重组产生的蛋白质中提供这样的脂化锚钩相当直截了当并仅仅需要使用例如天然存在的信号序列作为用于修饰IL5多肽的融合伙伴。另一个可能性是补体因子C3的C3d片段或C3本身的使用(参见，Dempsy等人，1996，科学(Science)，271：348-360；以及Lou和Kohler，1998，Nature Biotechnology，16：458-462)。
本发明的一个替代实施方案(该方案也导致多个(至少2个)拷贝的IL5重要表位区优先呈递给免疫***)是IL5、其亚序列或变异体共价或非共价偶联到某些载体分子。举例来讲，可使用聚合物，例如碳水化合物诸如葡聚糖(参见例如Lees等人，1994，疫苗(Vaccine)，12：1160-1166；Lees等人，1990，免疫学杂志(J.Immunol.)，145：3594-3600)，另外甘露糖和甘露聚糖也是可以采用的选择。来自例如大肠杆菌(E.coli)和其它细菌的整合型膜蛋白也是可以采用的偶联伙伴。传统的载体分子诸如匙孔血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素、白喉类毒素和牛血清清蛋白(BSA)也是优选的和可以采用的偶联伙伴。
据信，天然IL5的某些区域更适合于实施修饰。有人预见在1-3回环的至少一个中或者在螺旋D靠C-末端的氨基酸残基中进行修饰(所述回环和所述螺旋D与图3所示相对应)，将最大可能地产生所希望的构建体和接种结果。选择这些区域是因为考虑到：a)保留已知和预见的B-细胞表位，b)保留三级结构和四级结构等，另请参见在实施例前言中的讨论。在任何情况下，正如上面所讨论，筛选一套已在不同位点引入了T-细胞表位的被修饰IL5分子是相当容易的。
由于本发明的最优选实施方案包含人IL5的下调节，所以上面所讨论的IL5多肽优选地是人的IL5多肽。特别优选地，在该实施方案中，人的IL5多肽用至少一段等长或不等长并含有外源TH表位的氨基酸序列替换至少一段在SEQ ID NO：1中的氨基酸序列，其中被替换的氨基酸残基选自残基87-90、残基32-43、残基59-64、残基86-91和残基110-113。隐含在这样的构建体后面的基本原理将在实施例中详细讨论。IL5及被修饰IL5多肽的配制物
当通过施用IL5多肽或者被修饰IL5多肽，从而将其有效呈递给动物的免疫***时，多肽的配制物遵从本领域通常认可的原则。
包含作为活性成分的肽序列的疫苗之制备，通常为本领域所公知，正如例如美国专利4,608,251、4,601,903、4,599,231、4,599,230、4,596,792和4,578,770所示，此处全部引用作为参考。一般地，将这样的疫苗制备为可注射的液体溶液或悬浮液，也可以制备为在注射前适于溶解或悬浮于液体中的固体形式。还可以将制备物乳化。活性致免疫成分常常与药学可接受并与活性成分相容的赋形剂混合。适合的赋形剂为，例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的组合。另外，如果需要，疫苗可含有少量的辅助性物质诸如保湿剂或乳化剂、pH缓冲剂或增强疫苗效果的佐剂；参见下面对佐剂的详细讨论。
通常，疫苗是通过注射，非肠道地施用，例如皮下地、皮内地、真皮内地、真皮下地、或者肌内地。适于其它施用方式的另外的配制物包括栓剂，以及在一些情况下口、颊、舌下、腹膜内、***内、***、硬膜外、脊柱和颅内施用的配制物。对于栓剂，传统的粘合物和载体可包括例如，聚(亚烷基)二醇类和甘油三酯；含有0.5％-10％，优选地1％-2％活性成分的混合物可形成这样的栓剂。口部施用的配制物含有诸如通常使用的赋形剂例如，药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物所采用的形式为溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放配制物或粉末，并含有10-95％，优选地25-70％的活性成分。对于口部施用配制物，霍乱毒素是一个诱人的配制物伙伴(并且也是一个可能的偶联伙伴)。
多肽可以中性或盐的形式配制于疫苗中。药学可接受的盐类包括加酸盐类(与肽的游离氨基结合而形成)并且它们是通过与这样的无机酸类如(例如)盐酸或磷酸，或者与这样的有机酸类如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等结合而形成。与游离羧基结合而形成的盐类也可以是衍生自无机碱类诸如(例如)钠、钾、铵、钙或三价铁的氢氧化物和有机碱类诸如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组胺、普鲁卡因等。
疫苗以与剂量配制物相容的方式施用，其中将含有治疗有效和致免疫的量。实际所施用的量将依受治疗者而定，其中包括例如个体的免疫***发动免疫应答的能力以及希望保护的程度。合适的剂量范围为每次接种大约几百微克活性成分，而优选的范围为从大约0.1微克到2000微克(即使设计了10毫克范围的更高量)，诸如从0.5微克到1000微克，优选地在1微克到500微克，特别是在大约10微克到100微克。初始接种和加强接种的合适方案也是可变化的，但被一般化为一次初始接种、接随后的接种或其它施用。
施用的方式可以广泛变化。任何常规的疫苗施用方法都是可行的。这些方法包括在生理可接受的固体基质上或者于生理可接受的分散液中口部施用、非肠道施用、注射施用等。疫苗的剂量将取决于施用途径，并随被接种人的年龄以及抗原的配制物而变化。
有些疫苗多肽，其本身在疫苗中就有足够的致免疫性，但是对其它一些疫苗多肽，如果在疫苗中进一步地含有佐剂物质，就可增强免疫应答。
对于疫苗，实现佐剂效应的方法已知有多种。一般的原则和方法在“佐剂的理论和实际应用(The Theory and Practical Application of Adjuvants)，1995，Dunkan E.S.Stewart-Tull(编辑)John Willey & Sons Ltd，ISBN 0-471-95170-6”以及在“疫苗：新一代免疫佐剂(Vaccines：New Generation Immunological Adjuvants)，1995，等人(编辑)，Plenum Press，New York，ISBN，0-306-45283-9”中予以了详细的讨论，此处全部引用二者，作为参考。
特别优选地，使用可证实其对突破自体抗原的自体耐受之促进作用的佐剂；事实上，在未被修饰IL5在自体疫苗中被用作活性成分的情况下，这是必需的。合适佐剂的非限制性例子选自：免疫靶向佐剂，免疫调节佐剂诸如毒素、细胞素和分枝杆菌的衍生物，油性配制物，聚合物，形成微团佐剂，皂苷，免疫刺激复合物基质(ISCOM基质)，颗粒物，DDA，铝佐剂，DNA佐剂，γ-菊粉和胶囊化佐剂。总之，应该指出的是，上述涉及用作类似物中的第一、第二和第三组分的化合物和试剂之公开内容，也请参考(需在细节上作必要的修正)在本发明之疫苗的佐剂中，它们的用途。
佐剂的应用包括试剂的使用，试剂诸如氢氧化铝或磷酸(铝)(通常在缓冲盐水中用作0.05-0.1％溶液)，与合成的糖类聚合物(例如，Carbopol)(用作0.25％溶液)的混合剂，通过70-101℃分别加热处理30秒到2分钟周期使疫苗中的蛋白质凝聚，另外采用交联试剂凝聚也是可能的。凝聚也可以采用：用胃蛋白酶处理的清蛋白抗体(Fab片段)再活化，与细菌细胞诸如C.Parvum的混合物或与革蓝氏阴性细菌的内毒素类或脂多糖成分的混合物，在生理可接受的油性媒介物类诸如二缩甘露醇单油酸酯(Aracel A)中的乳化或者用用作阻断替代物的20％全氟化碳(Fluosol-DA)溶液乳化。与油类诸如角鲨烯和IFA的混合剂也是优选的。
根据本发明，DDA(双甲苯双十八烷基溴化铵)，正如DNA和γ-菊粉，是一种诱人的佐剂候选物，此外Freund氏完全和不完全佐剂以及quillaja皂苷类诸如QuilA和QS21，正如RIBI，也是诱人的佐剂。另外的可能佐剂为单磷酸脂质A(MPL)、上面提到的C3和C3d，以及胞壁酰二肽(MDP)。
已知脂质体配制物也可赋予佐剂效应，所以，根据本发明，优选脂质体佐剂。
根据本发明，免疫刺激复合物基质类型(ISCOM基质)的佐剂是优选的选择，这特别是由于：已表明这种类型的佐剂具有上调节APCs表达II类MHC的能力。ISCOM基质含有来自Quillaja saponaria的(任选地经分级分离的)皂苷类(三萜类化合物)、胆固醇、磷脂。当与致免疫蛋白质混合时，所导致的颗粒型配制物就是已知被称为ISCOM颗粒的佐剂，其中皂苷构成60-70％(重量/重量)、胆固醇和磷脂10-15％(重量/重量)以及蛋白质10-15％(重量/重量)。涉及免疫刺激复合物的组成和用途的详细情况可见于例如，上面提到的教科书中关于佐剂的部分，另外Morein B等人，1995，临床免疫治疗(Clin Immunother.)，3：461-475；以及Barr IG和Mitchell GF，1996，免疫和细胞生物学(Immunol.and Cell Biol.)，74：8-25(此处引用二者，作为参考)提供了用于制备完全免疫刺激复合物的有用指导。
实现佐剂效应的另一个高度诱人的(并因此而优选的)可能性是使用在Gosselin等人，1992中描述的技术(作为参考，此处对其引用)。简而言之，通过将抗原与抗单核细胞/巨噬细胞上的Fcγ受体的抗体(或者结合抗原的抗体片段)偶联，就可将相关抗原诸如本发明的抗原的呈递增强。特别是，抗原和抗-FcγRI间的偶联物已被证实增强了接种疫苗的免疫原性。
其它可能性包括将上面提到的靶向和免疫调节之物质(尤其是细胞素类)，在IL5的被修饰变化体中作为第一和第二组分的候选物使用。联系到这一点，细胞素类的合成诱导物如poly I：C也可能实现佐剂效应。
合适的分枝杆菌衍生物选自胞壁酰二肽、Freund氏完全佐剂、RIBI和海藻糖的二酯物诸如TDM和TDE。
合适的免疫靶向佐剂选自CD40配体和CD40抗体或者其特异结合片段(参见上面的讨论)、甘露糖、Fab片段和CTLA-4。
合适的聚合物佐剂选自碳水化合物诸如葡聚糖、PEG、淀粉、甘露聚糖和甘露糖，塑性聚合物诸如，以及乳汁诸如乳汁珠。
另另一个调节免疫应答的诱人方式是将IL5免疫原(任选地与佐剂和药学可接受的载体与媒介物一起)装入“事实上的***”(VLN)(由Immuno Therapy，Inc.，360 Lexington Avenue，New York，NY 10017-6501开发的一种专利性医疗装置)中。VLN(一种薄的管状装置)模拟***的结构和功能。将一个VLN插在皮肤下就造出一个涌动着细胞素和趋化因子的无菌炎症位点。T-和B-细胞以及APCs迅速地对危险信号予以响应，奔向发炎的位点并在VLN的多孔基质内积聚。已经表明：当使用VLN时，对抗原发动免疫应答所要求的必需抗原剂量减小了，而且使用VLN接种所赋予的免疫保护超过了使用Ribi作为佐剂的常规免疫。在Gelber C等人，1998，“使用一种称为事实上的***的新医疗装置，诱导针对少量免疫原之强健的细胞和体液免疫应答(Elicitation of Robust Celluar and Humoral ImmuneResponses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical DeviceDesignated the Virtual Lymph Node)”，在：“从实验室到临床(From the Laboratoryto the Clinic)，书摘(Book of Abstracts)，10月12-15日，1998年，Seascape Resort，Aptos，California”中，尤其对该技术予以了简要描述。
预期该疫苗应该一年施用至少一次，诸如一年至少1、2、3、4、5、6和12次。更具体地，预期一年1-12次，诸如一年1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次给需要它的个体。前已表明，使用本发明的优选自体疫苗而诱导的记忆性免疫并不是永久性的，因此，免疫***需要用该类似物定期激发。
由于遗传变异，不同的个体可能对同样的多肽显示不同强度的免疫应答。因此，为了提高免疫应答，依据本发明的疫苗可包含几种不同的多肽，也请参见上面的关于引入外源T-细胞表位之选择的讨论。该疫苗可包含两种或多种多肽，并对其中的所有多肽限定如上。
因此，该疫苗可包含3-20种不同的被修饰或未被修饰的多肽，诸如3-10种不同的多肽。然而，在正常情况下，希望多肽的种数保持最少，诸如1或2种多肽。核酸接种
作为对经典的施用基于肽疫苗的一种替代，核酸接种技术(也称为“核酸免疫”、“遗传免疫”和“基因免疫”)具有若干有吸引力的特性。
第一，与传统的疫苗方法相比，核酸接种并不要求致免疫剂的消化资源性的大规模生产(例如，以工业规模发酵微生物生产被修饰IL5的形式)。而且，也不需要对免疫原设计纯化和重折叠方案。最后，由于核酸接种依赖于被接种个体的生化器官以产生所引入核酸的表达产物，所以预期有表达产物的最佳翻译后加工存在；这对于自体接种的情况尤其重要，这是因为(正如上面所提到的)在被修饰的分子中应当保留相当比例的原始IL5 B-细胞表位，还因为B-细胞表位原则上可由任何(生物)分子(例如碳水化合物、脂质、蛋白质等)的部分组建。因此，免疫原的天然的糖基化和脂化谱对总体的免疫原性很可能是重要的，所以希望通过利用宿主产生免疫原，以确保这一点。
因此，本发明的一个优选的实施方案包括将被修饰IL5有效呈递到免疫***(通过将编码被修饰IL5的一种或多种核酸引入到动物的细胞内)，从而使引入了一种或多种核酸的细胞实现体内表达。
在该实施方案中，所引入的核酸优选地是DNA，它可以是裸露的DNA、与带电荷或不带电荷的脂质配制在一起的DNA、配制于脂质体中的DNA、包含在病毒性载体中的DNA、与转染促进蛋白质或多肽配制在一起的DNA、与靶向蛋白质或多肽配制在一起的DNA、与钙沉淀剂配制在一起的DNA、与惰性载体分子偶联的DNA、在聚合物胶囊中(例如，在PLGA(参见在WO 98/31398中描述的微胶囊化技术)中或者在壳多糖或脱乙酰壳多糖中)包着的DNA以及与佐剂配制在一起的DNA的形式。在本文中，应该指出的是，实际上所有有关佐剂在传统疫苗配制中的用途的考虑，均适用于DNA疫苗的配制。因此，本文中涉及到的佐剂在基于肽疫苗方面中的用途的所有公开内容，在细节上作必要的修正后，均适用于这些佐剂在核酸接种技术中的用途。
至于已在上面详述的基于多肽疫苗的施用途径和施用计划也都适用于本发明的核酸疫苗，并且上面的所有关于基于多肽疫苗的施用途径和施用计划的讨论，在细节上作必要的修正后，均适用于核酸。对此还要说明的是，核酸疫苗可以通过静脉内和动脉内方式予以恰当地施用。而且，在本领域中众所周知的是，通过使用所谓的基因枪可以将核酸疫苗施用，所以基因枪及其等同的施用方式也被认为是本发明的一部分。最后，已有报道VLN也被用于核酸的施用中并且产生了良好的效果，所以特别优选这种特定的施用方式。
而且，用作免疫剂的一种或多种核酸可含有编码第一、第二和/或第三组分的区域，例如，以上面描述的免疫调节物质(诸如被讨论为有用的佐剂的细胞素类)的形式。本实施方案的一个优选的变化体涵盖：使类似物的编码区和免疫调节剂的编码区处于不同的阅读框架中或者至少处于不同启动子的控制之下。这样，就避免了类似物或表位被作为免疫调节剂的融合伙伴而产生。或者，也可以使用两种不同的核酸片段，但因为要保证共表达(当使两个编码区都包含在同一分子中时)的优越性所以它就不在优选之列了。
因此，本发明也涉及用于诱导产生抗IL5抗体的组合物，该组合物包含：
- 本发明的核酸片段或载体(参见下面对载体的讨论)，和
- 正如上面所讨论的药学和免疫学可接受的媒介物和/或载体和/或佐剂。
在正常情况下，编码IL5变异体的核酸是以载体的形式被引入的，其中的表达处于病毒性启动子的控制之下。对依据本发明的载体以及DNA片段的更详细的讨论，参见下面的讨论。涉及核酸疫苗的配制及使用的详细的公开内容也是可以得到的，参见Donnelly JJ等人，1997，免疫学年鉴(Annu.Rev.Immunol.)，15：617-648和Donnelly JJ等人，1997，生命科学(Life Sciences)，60：163-172。作为参考，此处引用这两篇参考文献。活疫苗
将被修饰IL5有效呈递给免疫***的第三个选择是活疫苗技术的使用。在活疫苗接种中，对免疫***的呈递是通过对动物施用非致病性的微生物而实现的，其中的微生物已经用编码被修饰IL5的核酸片段或者用结合有这样的核酸片段的载体进行了转化。非致病性的微生物可以是任何合适的减毒微生物菌株(通过传代或者通过重组DNA技术除去致病性表达产物以实现减毒)，例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BCG.、多种链球菌(Streptococcus spp.)、大肠杆菌(E.coli.)、多种沙门氏菌(Salmonella spp.)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、志贺菌(Shigella)等。关于制备本领域当前水平的活疫苗方面的综述可以在，例如，Saliou P等人，1992，Rev.Prat.，45：1492-1496和Walker PD，1992，疫苗(Vaccine)，10：977-990中见到，此处引用二者作为参考。有关在这样的活疫苗中所使用的核酸片段和载体的详细情况，参见下面的讨论。
作为细菌活疫苗的一种替代，可将下面所讨论的本发明的核酸片段结合到无毒力的病毒性疫苗载体中，诸如一株牛痘或者任何其它合适的痘病毒。
在正常情况下，非致病性的微生物或病毒只施用给动物一次，但是在某些情况下，为了维持保护性免疫，在一生中也许需要多于一次施用微生物。甚至期望：如上面所详述的用于多肽接种的那些免疫计划，当使用活的或病毒疫苗时也将有效的。
或者，将活接种或病毒接种与先前或随后的多肽和/或核酸接种联合起来。例如，使用多肽或核酸方法，采用活接种或病毒接种，随后接加强免疫就有可能实现初次免疫。
微生物或病毒可用含有编码第一、第二和/或第三组分区的一种或多种核酸转化，例如以上面描述的免疫调节物质(诸如被认为是有用的佐剂的细胞素)的形式。本实施方案的一个优选变化体涵盖：使类似物的编码区和免疫调节子的编码区处于不同的阅读框架中或者至少处于不同启动子的控制之下。这样，就避免了类似物或表位被作为免疫调节子的融合伙伴而产生。或者，也可以将两种不同的核酸片段用作转化剂。当然，使第一和/或第二和/或第三组分处于相同的阅读框架，就能够以表达产物的形式提供本发明的类似物，而且，根据本发明特别优选这样的实施方案。本发明方法在疾病治疗中的用途
从上面的讨论中将会理解，本发明所提供的方法可控制以嗜酸性粒细胞增多为特征的疾病。在本文中，虽然哮喘是本发明方法的重要靶子，但是其它的慢性***反应性疾病诸如多重***反应和过敏性鼻炎也是治疗/改善的可行靶子。因此，本发明的用于下调节IL5活性的方法的一个重要实施方案包括治疗和/或预防和/或改善以嗜酸性粒细胞增多特征的哮喘或其它慢性***反应性疾病，该方法包括根据本发明的方法下调节IL5活性至这样一个程度，以至嗜酸性粒细胞数目显著地减少了。
在本文中，嗜酸性粒细胞数目如此显著减少的含义是与治疗前相比，嗜酸性粒细胞数目减少至少20％，但是期望减少的百分比更高，诸如至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％和甚至至少90％。这种减少可以是***性的，或者更常见地是局部性的(例如在肺中)。
嗜酸性粒细胞数目是通过本领域公知的方法确定的，一般对合适的样品(诸如BAL液体)采用显微镜术并在显微镜下手工计数嗜酸性粒细胞的数目。也可使用流式细胞仪方法或任何其它能够区分出嗜酸性粒细胞的血细胞计数仪的方便方法，对嗜酸性粒细胞的数目进行计数。本发明的肽、多肽和组合物
从上面可以明显看出，本发明是基于这样的概念：免疫个体抵抗IL5抗原，从而间接地实现嗜酸性粒细胞数目的减少。获得这种免疫的优选方法是使用IL5的被修饰变化体，从而提供本领域中以前从未公开过的分子。
本发明者相信：本文所讨论的被修饰IL5分子(就它们本身的资格而言)是发明性的，所以本发明的一个重要部分是关于源自动物IL5的IL5类似物，在动物的IL5中引入了修饰，其结果是用类似物免疫动物可诱导产生与未被修饰IL5多肽发生交叉反应的抗体。优选地，当讨论本发明方法中的各种使用了被修饰IL5的实施方案时，修饰的性质与上面描述的修饰的种类相符合。因此，本文给出的任何关于被修饰IL5的公开内容均与描述本发明的IL5类似物的目的相关，并且任何这样的公开内容，在细节上作必要的修正后，均适用于这些类似物的描述。
应该指出的是，优选的被修饰IL5分子包含这样的修饰，它产生与IL5序列或者与其亚序列(至少10个氨基酸长)具有至少70％序列相同性的多肽。优选更高的序列相同性，例如至少75％或甚至至少80％或85％。蛋白质和核酸序列的相同性可计算为(Nref-Ndif)×100/Nref，其中的Ndif为并列对比(aligned)时两个序列中不相同残基的总数，Nref为其中之一序列的残基数。因而，DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC具有75％的序列相同性(Ndif＝2和Nref＝8)。
本发明还牵涉到用于实践本发明的方法的组合物。因此，本发明也涉及一种包含致免疫有效量的IL5多肽(是动物的自体蛋白质)的致免疫组合物，此IL5多肽是与免疫学可接受的佐剂配制在一起，为的是突破动物对IL5多肽的自体耐受，该组合物进一步地包含药学和免疫学可接受的媒介物和/或载体。换言之，本发明的这部分是关于天然存在的IL5多肽的配制物，已将它们与本发明方法的实施方案联系起来予以了描述。
本发明也涉及一种包含免疫学有效量的限定如上之IL5多肽的致免疫组合物，该组合物进一步地包含药学和免疫学可接受的稀释剂和/或媒介物和/或载体和/或赋形剂和任选地佐剂。换言之，本发明的这部分是关于被修饰IL5的配制物，基本上如本文的上面所讨论。当涉及到被修饰和未被修饰IL5的配制物(它们被用于本发明的方法，下调节IL5的活性)时，佐剂、载体和媒介物的选择相应地与上面所讨论的内容相符合。
多肽是根据本领域公知的方法制备的。正常情况下，较长的多肽是通过基因重组技术方法制备的，它包括：将编码IL5类似物的核酸序列引入到合适的载体中，用载体转化合适的宿主细胞，核酸序列的表达，从宿主细胞或它们的培养上清液中回收表达产物，并随后纯化和任选地进一步修饰，例如重折叠或衍生化。
较短的肽是，优选地，通过众所周知的固相-或液相-肽合成技术的方法制备的。然而，这方面技术的最近进展已有可能通过这些方法产生全长多肽和蛋白质，所以，通过合成方法制备长构建体也是在本发明的范围内。本发明的核酸片段和载体
从上面所公开的内容将会理解，被修饰IL5多肽不仅可以通过基因重组技术方法而且可以通过化学合成或半合成的方法制备；当修饰含有与蛋白质载体(诸如KLH、白喉类毒素、破伤风类毒素和BSA)和非蛋白质的分子(诸如碳水化合物的聚合物)偶联时，并且当然还有当修饰含有将支链或者将侧链基团添加到IL5多肽链衍生的肽链时，化学合成和半合成的方法后就特别有关。
为了重组基因技术目的以及当然也为了核酸免疫目的，编码被修饰IL5的核酸片段就是重要的化学产物。因此，本发明的一个重要部分是关于编码IL5类似物(即衍生自IL5的多肽)的核酸片段，它包含天然的IL5序列并在该序列中添加或***了融合伙伴，或者优选地它含有衍生自IL5的多肽，并且通过***和/或添加，优选地通过替换和/或缺失的方法，已在该多肽中引入了外源的T-细胞表位。本发明的核酸片段为DNA或RNA片段。
在正常情况下，本发明的核酸片段被***到合适的载体中，以形成携带本发明的核酸片段的克隆或表达载体；这样的新载体也是本发明的一部分。关于构建本发明的这些载体的详细情况，将在下面的被转化的细胞和微生物中予以讨论。根据应用的目的和类型，载体可以是质粒、噬菌体、粘粒、微型染色体或病毒的形式，而且在某些细胞中只是瞬时表达的裸露DNA也是重要的载体。本发明的优选的克隆和表达载体具有自主复制能力，因而可产生高拷贝数，其目的就在于使随后的克隆高水平地表达或高水平地复制。
本发明的载体的总轮廓图按5’→3’方向包括下列特征：用于驱动本发明的核酸片段表达的启动子、任选地编码赋予多肽片段分泌(至细胞外部，或者如果适当的话，至细胞周质)能力或整合到膜内能力的前导序列的核酸序列、本发明的核酸片段以及任选地编码终止子的核酸序列，它们都处于有效连接之中。当操作带有表达载体的产生株或细胞系时，为了被转化细胞的遗传稳定性，优选这样的载体，当将其引入到宿主细胞中时，它可整合到宿主细胞的基因组中。相比之下，当操作用于在动物体内有效表达的载体时(即，当载体用于DNA接种中时)，由于安全原因，优选不能够被整合到宿主细胞基因组的载体；一般地，是使用裸露DNA或非整合型病毒性载体，这些选择为本领域的技术人员所公知。
本发明的载体被用于转化宿主细胞，以产生本发明的被修饰IL5多肽。这样的转化细胞(也是本发明的一部分)，可以是这样的培养细胞或细胞系，它们被用于本发明的核酸片段和载体的增殖或者本发明的被修饰IL5多肽的重组生成。或者，被转化细胞可以是合适的活疫苗株，其中***了核酸片段(单一或多拷贝)，为的是使被修饰IL5能够有效地分泌或整合到细菌的细胞膜或细胞壁中。
本发明优选的被转化细胞是微生物诸如细菌(诸如埃希氏属(Escherichia)中的种〖例如大肠杆菌〗、芽孢杆菌属(Bacillus)中的种〖例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis〗、沙门氏菌属(Salmonella)中的种、分枝杆菌属(Mycobacterium)中的种〖优选地非致病性的种，例如牛分枝杆菌BCG〗、酵母(诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))以及原生动物。或者，被转化的细胞源自多细胞生物体诸如真菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。最优选的被转化细胞源自人类，参见下面的对细胞系和载体的讨论。最近的结果已显示：在将商业可得到的普通果蝇(Drosophila melanogaster)细胞系(Schneider 2(S2)细胞系和载体***，可从Invitrogen获得)用于本发明的IL5类似物的重组生产方面，具有巨大的希望，因此，特别优选该表达***。
为达到克隆和/或最佳化表达目的，优选具有复制本发明核酸片段能力的被转化细胞。表达核酸片段的细胞为本发明优选的有用的实施方案；它们可被用于小规模或大规模制备被修饰IL5或者，在非致病性细菌情况下，作为活疫苗中的疫苗组成成分。
当通过被转化细胞方法产生本发明的被修饰IL5时，让表达产物分泌出来并进入到培养液中或者携带在被转化细胞的表面上会带来方便，虽然这还远不是必须的。
当已经对一个有效的产生细胞进行了鉴定后，就可在此基础上，优选建立这样的稳定细胞系，它携带本发明的载体并表达编码被修饰IL5的核酸片段。优选地，该稳定细胞系分泌或携带本发明的IL5类似物，从而促进其纯化。
一般地，含有复制子和控制序列、源自与宿主细胞相容物种的质粒载体，被用于与宿主***。载体通常携带一个复制起点，并且在被转化细胞中能够提供表型选择的多个标记序列。例如，大肠杆菌一般用pBR322转化，而pBR322是源自大肠杆菌物种的质粒(见，例如，Bolivar等人，1977)。pBR322质粒含有氨苄青霉素和四环素的抗性基因，从而为鉴定被转化细胞提供了容易的方法。pBR质粒，或者其它微生物的质粒或噬菌体还必须含有或者被修饰后含有可被原核微生物用于表达的启动子。
在原核细胞的重组DNA构建过程中最常使用的那些启动子包括：B-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖的启动子***(Chang等人，1978；Itakura等人，1977；Goeddel等人，1979)以及色氨酸(trp)启动子***(Goeddel等人，1979；EP-A-0036776)。虽然这些最为常用，但是已经发现并利用了其它的微生物启动子，有关它们的核苷酸序列的详细情况已经被发表，从而使技术人员能够将它们与质粒载体功能性地连接起来(Siebwenlist等人，1980)。来自原核细胞的某些基因可在大肠杆菌中从它们自身的启动子序列高效地表达，而无需通过人工方法添加另一个启动子。
除了原核细胞外，也可以使用真核微生物，诸如酵母培养物，而且这里的启动子也应具有驱动表达的能力。在真核微生物中最常使用的是酿酒酵母或常见的面包酵母，尽管还有若干其它菌株也常常使用。用于在酵母属(Saccharomyces)中表达的常用质粒是，例如，质粒YRp7(Stinchcomb等人，1979；Kingsman等人，1979；Tschemper等人，1980)。该质粒已含有trp1基因，它可为在色氨酸中缺乏生长能力的酵母突变株(例如，ATCC No.44076或PEP4-1)提供选择标记(Jones，1977)。作为酵母宿主细胞基因组的一个特征，损毁的trp1的存在，为酵母细胞在无色氨酸培养基中生长时，提供了一个检测转化的有效环境。
在酵母载体中，合适的启动序列包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzman等人，1980)或其它糖酵解酶类(Hess等人，1968；Holland等人，1978)，诸如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶的启动子。在构建合适的表达载体中，与这些基因相结合的终止序列被连接到表达载体中的希望表达序列的3’，以提供mRNA和终止作用的多聚腺苷酸化。
其它具有另外的优越性即由生长状态控制转录的启动子为乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相联系的降解酶类和前面提到的甘油醛-3-磷酸脱氢酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶类的启动子区。任何含有酵母相容启动子、复制起点和终止序列的质粒载体都是合适的。
除了微生物外，也可以将源自多细胞生物体的细胞培养物用作宿主。原则上，任何这样的细胞培养物，不管是来自脊椎动物还是来自无脊椎动物的培养物，都是可行的。然而，最感兴趣的还是脊椎动物细胞，而且在最近几年中，在培养液(组织培养液)中增殖脊椎动物细胞已成为常规方法(组织培养，1973)。这样的有用宿主细胞系的例子有：VERO和HeLa细胞，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞系，和W138、BHK、COS-7293、Spodoptera frugiperda(SF)细胞(作为完整的表达***，尤其可从Protein Sciences，1000 Research Parkway，Meriden，CT 06450，U.S.A.和Invitrogen商业获得)和MDCK细胞系。在本发明中，一个特别优选的细胞系为S2，它可从Invitrogen，PO box 2312，9704，CH Groningen，The Netherlands(荷兰)获得。
用于这样的细胞的表达载体通常包括(如果需要的话)：一个复制起点，一个位于待表达基因前方的启动子，与启动子在一起的任何必需的核糖体结合位点，RNA拼接位点，多聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。
用于哺乳动物细胞中的表达载体，位于其上的控制功能常常由病毒性材料提供。例如，通常使用的启动子是源自多瘤病毒、腺病毒2和猴病毒40(SV40)，后者最经常。SV40病毒的早期和晚期启动子特别有用，这是因为可从病毒中容易地得到这二者的片段形式，片段中还含有SV40的病毒性复制起点(Fiers等人，1978)。也可以使用更小或更大的SV40片段，前提是其中含有位于病毒复制起点内的一段大约250bp的序列，它从HindIII位点延伸到BglI位点。而且，利用在正常情况下与目的基因序列结合的启动子或控制序列既是可能的又是所希望的，前提是这样的控制序列与宿主细胞***相容。
通过构建包含异源起点的载体，也可以提供复制起点，它可以源自诸如SV40或其它病毒(例如，多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV)或者由宿主细胞的染色体复制机制提供复制起点。如果载体被整合到宿主细胞的染色体中，那么由宿主细胞的染色体复制机制提供复制起点常常就足够了。有用的IL5类似物的鉴定
并不是天然IL5的所有变异体，或修饰都具有在动物中诱发的，与天然形式的IL5有交叉反应的抗体的能力，本领域技术人员对这一点是清楚的。但是，建立一个有效的针对被修饰IL5的标准筛选方法并不困难，同时这也是对本文所讨论的免疫反应的最低要求。因此，本发明的另一部分是关于用于鉴定被修饰IL5多肽的方法，其中的被修饰IL5多肽具有在一种动物中诱导抗未被修饰IL5多肽的抗体的能力，在这种动物中未被修饰IL5多肽是一种自体蛋白质，该方法包括：-  通过多肽合成或通过分子生物学方法，制备一组互不相同的被修饰IL5多肽，其中对这种动物IL5多肽的氨基酸序列进行了氨基酸的添加、***、删除或替换，因而在这组多肽中产生了氨基酸序列，它们含有该种动物的T-细胞表位以及对该种动物来讲是外源的T-细胞表位，或者制备一套(组)核酸片段，它们编码那组互不相同的被修饰IL5多肽。-  测试组中成员诱导该种动物产生抗未被修饰IL5抗体的能力，并且-  鉴定以及任选地分离组中显著地诱导该种动物产生抗未被修饰IL5抗体的成员，或者鉴定以及任选地分离由核酸片段组中成员编码的多肽表达产物，其中的核酸片段显著地诱导动物产生抗未被修饰IL5多肽的抗体。
在本文中，该“一组互不相同的被修饰IL5多肽”为互不不相同的被修饰IL5多肽的一个集合物，它是根据上面讨论的标准而选择出来的(例如，与圆二色性、NMR光谱和/或X-射线衍射谱的研究联合起来)。组中可以仅仅包含几个成员，但是期望组中也许含有几百个成员。类似地，一组核酸片段为互不相同的核酸片段的一个集合物，其中的每个成员编码一个用相同方式选择出的被修饰IL5多肽。
组中成员的测试可最终在体内进行，但也可采用若干体外测试，从而缩小符合本发明目的的被修饰分子的数目。
由于引入外源T-细胞表位的目的就是支持通过T-细胞帮助的B-细胞应答，所以，一个前提条件就是T-细胞的增殖是由被修饰IL5诱导的。T-细胞的增殖可通过体外标准化的增殖测定法测试。简言之，从一名受治疗者获得一份T-细胞富集的样品，并随后将其保存于培养液中。将培养的T-细胞与该受治疗者的APCs接触，该受治疗者先前已经接受了被修饰的分子并对其加工以呈递其中的T-细胞表位。监视T-细胞的增殖并与一个合适的对照(例如，培养液中的T-细胞，这些T-细胞与加工过完整、天然的IL5的APCs接触)比较。或者，通过确定由T-细胞释放的相关细胞素的浓度也可测定增殖，而T-细胞释放相关细胞素是为了应答它们对外源T-细胞的识别。
由于组中至少一种被修饰IL5具有诱导产生抗IL5抗体的能力(这已是高度有希望的)，所以有可能制备一种致免疫组合物，其中含有至少一种被修饰IL5多肽，该IL5多肽具有在一种动物中诱导抗未被修饰IL5抗体的能力，而在这种动物中未被修饰IL5多肽是一种自体蛋白质，制备方法包括：混合套中显著地诱导此种动物产生抗体的一个或多个成员，并且这些成员所产生的抗体可与IL5反应，而该IL5又是与药学和免疫学可接受的载体和/或媒介物和/或稀释剂和/或赋形剂，以及任选地与至少一种药学和免疫学可接受的佐剂在一起。
类似地，这也是可能的：制备一种致免疫组合物，其作为一种免疫原含有一种编码致免疫的IL5类似物的核酸片段，参见上面对核酸接种的讨论。
本发明的上述多方面内容，通过这些步骤可方便地实现：首先制备本发明的若干互不相同的核酸序列或载体，并将其***到合适的表达载体中，接着用载体转化合适的宿主细胞，并表达本发明的核酸序列。在这些步骤之后可以接表达产物的分离。优选地，通过采用包括分子扩增技术诸如PCR或者核酸合成在内的方法，制备核酸序列和/或载体。
实施例前言疫苗的设计
用于IL5自体疫苗的示范性候选物是根据AutovacTM概念(在WO 95/05849中有详细描述)，将已知的混杂型T-细胞表位替换到人IL5的野生型蛋白质中而构建的。该替换是肽替换，其中所***的肽与野生型序列中被删除的肽相比，可以是相同或不相同的长度。
为了通过体内测试和筛选获从而获得概念的初步证据，决定在鼠IL5序列中制备构建体。以实施例的方式，将破伤风类毒素表位P2(SEQ ID NO：23)和P30(SEQ ID NO：24)用作替换肽，但是根据本发明，也可使用任何其它含有或组成混杂型TH表位的合适的肽。
应该强调的是，与替换物的大小(对于P2和P30分别是15或21个残基)相比，分子的大小(115个残基)强烈地限制不破坏结构的***体的可能位点。由于二硫键对二聚体化是重要的但不是绝对必需的，所以有些变异体在制造时被成对+/-消除了半胱氨酸。
在候选物分子的构建中，考虑到两个基本参数。第一，试图保留最大部分的野生型hIL5的三维结构，从而保留全部天然的B-细胞表位。Dickason等人(1994)支持这一点，他证实：已知是中性化(neutralising)的IL5 B-细胞表位，是构象性的(conformational)。通过在结构上“中性的”位点处，诸如回环或分开的片段，引入修饰就实现了所追求的三级结构的保留。N-末端的螺旋“A”与螺旋“B”和“C”一起，能够与第二个分子折叠成一个四级结构，这样一个事实就表明这三个螺旋组成了一个稳定的折叠架。
第二，考虑与疫苗概念相关的生物学活性。一般是优选无活性的构建体，目的是减小推定的分子毒性效应以及一般地为了评价免疫应答。另一方面，最佳中和抗体在理论上应该表现出对与IL5R相互作用的那部分IL5具有特异性。这一点最可能通过用活性变异体免疫来实现。最后，IL5对免疫***的生物学效应也许能作为免疫应答的一种增强剂，从而提高总效应，这也并不是不可能的。然而，基于本发明申请者以前对其它分子的经验，预期绝大部分“理论上可能有活性的”构建体仅具有低的或者根本没有活性。
所以，被建议的所有变异体都有潜在活性，但是，如果希望的话，通过阻止活性二聚体的形成或者通过改变参与了受体结合/激活的“A”-和“D”-螺旋区，就能够相对容易地使其无活性。
总之，上面的对结构保留和生物学活性的考虑，将靶区限定为回环1-3中的任一以及C-末端的柔性区。
回环3被选作主要靶区，这是由于它在结构上与假定的三螺旋折叠架是分开的。而且由于通过延长回环3，可能产生有生物学活性的单体(Dickason等人，1996)，所以该区具有用于产生所有类型(单体/二聚体以及活性的/未激活的)变异体的可能性。
回环1是一个次级区，其中含有一个可用于替换的合适长度的非螺旋伸展结构。只要能够形成二聚体，该区变异体在理论上将是有活性的，但由于野生型回环的长度使得它具有相当的柔性，所以预期替换后的IL5仍具有正确的蛋白质折叠是有道理的。
在“回环2”区含有替换的变异体，也是在成为二聚体时才有活性。与***体相比，该区可被替换的部分短并且该区在假定的折叠架中有一个中心部位，回环2的这两个特性有可能阻碍替换后的蛋白质进行正确折叠。另一方面，回环2的位置与与IL5R相互作用的区相对，所以，如果被修饰的蛋白质正确折叠的话，将导致所预期的野生型中和性表位的最佳呈递。
最后，建议在紧随“螺旋D”后的C-末端柔性区中进行***。从蛋白质结构的观点来看，这个概念是相当安全的，但是在该区中的修饰有可能会影响到二聚体化以及生物学活性(如果被修饰的蛋白质已经二聚体化的话)，这是由于C-末端位于受体结合区以及二聚体的交界面中。
根据上面的考虑而最初构建的10个变异体的氨基酸序列，被陈列于SEQ IDNOs：2-11和13-22。后来又构建的变异体陈列于SEQ ID NOs：27-59(既包括DNA核酸序列又包括氨基酸序列)。
应该指出的是，在制备所有的***体(但不包括根据实施例2的***体)时，都把从hIL5到mIL5均为保守的侧翼氨基酸残基包括在内，为的是促进阳性构建体从小鼠到人的成功转移这个过程。
在下面的实施例中，替换的位置是根据鼠的氨基酸残基序列号标出的；人的相应位置在括号中给出。
实施例1
    在回环3中带有P2替换位置但保留了Cys84(86)的变异体
将P2表位(SEQ ID NO：23)替换到回环3中，但同时避免消除Cys84(86)。变异体SEQ ID NOs：2和28(人)中的氨基酸87-90或者88-91被替换，变异体SEQ ID NOs：13和46(鼠)中的氨基酸85-88或者86-89被替换，所有这些变异体作为单体(由于回环3的延长)以及作为二聚体都具有潜在活性。SEQ ID NOs：28和46也分别被表示为hIL5.1和mIL5.1。
实施例2
    在回环1中带有P2替换位置但保留了Cys42(44)的变异体
将P2表位(SEQ ID NO：23)替换到回环1中，但同时避免消除Cys42(44)。变异体SEQ ID NOs：3和36(人)中的氨基酸32-43或者33-43被替换，变异体SEQ ID NOs：14和56(鼠)中的氨基酸30-41或者31-41被替换，所有这些变异体仅在作为二聚体时才具有潜在活性。SEQ ID NOs：36和56也分别被表示为hIL5.5和mIL5.5。
实施例3
           在回环2中带有P2替换位置的变异体
将P2表位(SEQ ID NO：23)替换到回环2中。变异体SEQ ID NOs：4和34(人)中的氨基酸59-64被替换，变异体SEQ ID NOs：15和50(鼠)中的氨基酸57-62被替换，所有这些变异体仅在作为二聚体时才具有潜在活性。SEQ ID NOs：34和50也分别被表示为hIL5.4和mIL5.4。
实施例4
        在回环3中带有P2替换位置并消除了Cys84(86)的变异体
将P2表位(SEQ ID NO：23)替换到回环3中，并同时消除Cys84(86)。变异体SEQ ID NOs：5和38(人)中的氨基酸86-91被替换，变异体SEQ ID NOs：16和54(鼠)中的氨基酸84-89被替换，所有这些变异体大体上与1#型变异体(SEQ ID NOs：2和28和13和46)类似，但是，通过抑制二硫键的形成以及调整回环3的长度，促进了单体产物的生成。SEQ ID NOs：38和54也分别被表示为hIL5.6和mIL5.6。
实施例4
        在C-末端108-111(110-113)带有P2替换位置的变异体
将P2表位(SEQ ID NO：23)替换到螺旋D后的C-末端区中。这些变异体(SEQID NOs：6和17)仅在作为二聚体时才具有潜在活性。
实施例6
         在回环3中带有P30替换位置但保留了Cys84(86)的变异体
将P30表位(SEQ ID NO：24)替换到回环3中，并避免消除Cys84(86)。变异体SEQ ID NOs：7和40(人)中的氨基酸88-91或者87-90被替换，变异体SEQ ID NOs：18和58(鼠)中的氨基酸85-88或者86-89被替换，所有这些变异体作为单体(由于回环3的延长)以及作为二聚体都具有潜在活性。SEQ ID NOs：40和58也分别被表示为hIL5.7和mIL5.7。
实施例7
     在回环1中带有P30替换位置但保留了Cys42(44)的变异体
将P30表位(SEQ ID NO：24)替换到回环1中，并避免消除Cys42(44)。变异体SEQ ID NOs：8和30(人)中的氨基酸32-43被替换，变异体SEQ ID NOs：19和48(鼠)中的氨基酸30-41被替换，所有这些变异体仅在作为二聚体时才具有潜在活性。SEQ ID NOs：30和48也分别被表示为hIL5.2和mIL5.2。
实施例8
           在回环2中带有P30替换位置的变异体
将P30表位(SEQ ID NO：24)替换到回环2中。这些变异体(SEQ ID NOs：9和20，其中的氨基酸59-64和57-62分别被替换)仅在作为二聚体时才具有潜在活性。
实施例9
         在C-末端带有P30替换位置的变异体
将P30表位(SEQ ID NO：24)替换到螺旋D后的C-末端区中。这些变异体(SEQ ID NOs：10和21，其中的氨基酸110-113和108-111分别被替换)仅在作为二聚体时才具有潜在活性。
实施例10
     带有P2替换位置84-89(86-91)和P30替换位置110-113的变异体
将P2表位(SEQ ID NO：23)替换到回环3中并消除Cys84(86)，并将P30表位(SEQ ID NO：24)替换到螺旋D后的C-末端区中。唯有这些变异体(SEQ IDNOs：11和22)以及类型#12的变异体是含有两个表位的变异体，并且是具有潜在活性的单体。
实施例11
  在回环3中带有P30替换位置并消除了Cys84(86)的变异体
将P2表位(SEQ ID NO：24)替换到回环3中，并同时消除Cys84(86)。变异体SEQ ID NOs：42(人)中的氨基酸86-91被替换，变异体SEQ ID NOs：58(鼠)中的氨基酸84-89被替换，所有这些变异体大体上与6#型变异体(SEQ IDNOs：2和28和13和46)类似，但是，通过抑制二硫键的形成以及调整回环3的长度，促进了单体产物的生成。SEQ ID NOs：42和58也分别被表示为hIL5.12和mIL5.12。
实施例12
           在回环3中带有P2和P30替换位置的变异体
将P2表位(SEQ ID NO：23)和P30表位(SEQ ID NO：24)替换到回环3中，并同时保留Cys84(86)。这些变异体(SEQ ID NOs：44和60，其中的氨基酸88-91和86-89分别被替换)含有两个表位，并且是具有潜在活性的单体。SEQID NOs：44和60也分别被表示为hIL5.13和mIL5.13。
实施例13
                      表达***的选择
已经将重组IL5在若干不同的表达***包括酵母、昆虫细胞和CHO细胞中表达(Tavernier等人，1989)。
根据本发明，大肠杆菌是一种合适的表达***，因为以前已有研究报道使用该宿主产生hIL5(Proudfoot等人，1990；Graber等人，1993)。重组蛋白质以包涵体的形式被表达，在经纯化和重折叠(例如，使用在US 5739281中公开的一般适用的重折叠方法)后转换为有生物学活性的二聚体。大肠杆菌表达的快速和简单性，使得在准备好遗传构建体后可以立即启动蛋白质的生产，从而促进了原料的快速生成，以建立IL5自体疫苗概念的体内证据。
如果由于某一原因发现使用大肠杆菌的可行性低(例如，重折叠后的得率低，产物不稳定或者与糖基化相关的药物动力学参数的改善)，那么，在进一步开发自体疫苗时，可以考虑在酵母中生产。
最近，使用了S2细胞(可从Invitrogen得到)的普通果蝇表达***，获得了有希望的结果，目前该表达***是用于本发明的IL5类似物表达的优选实施方案。
IL5变异体是从稳定表达IL5构建体的S2果蝇细胞中生产的。在对几个不同的转染方法进行了试验后，选择了Ca2PO4方法和脂质转染方法。我们使用了S2细胞的两个不同亚克隆，分别用Ca2PO4方法和Lipofectin方法对其进行了转染。这两个克隆分别是从ATCC和哥本哈根大学(University of Copenhagen)的LarsSndergaard得到的。使用这两种方法，对合适的稳定细胞系进行了选择，它们表达mIL5和mIL5.1蛋白质的浓度在2-10mg/L范围内。材料和方法：
S2细胞生长和维持在含有5-10％胎牛血清(FCS)、0.1％pluronic F68(Sigma)、青霉素/链霉素(Life Technologies)的Schneider’s培养液(Sigma)中，25℃和120转/分钟在摇瓶中生长。
Lipofectin转染是在250ml或1L的摇瓶中进行的。将S2细胞稀释成2.5-3×106个/ml，加到没有抗生素的50ml Ex-cell 420(JRH Biosciences)中，并在250ml的摇瓶中生长过夜。第二天上午，制备Lipofectin试剂：管1)在15-45ml的血清和无补充剂培养液中，加入含目的基因的质粒DNA 300-1200μg和潮霉素选择质粒pCoHYGRO 15-60μg(质粒之比为20∶1)；管2)将1ml Lipofectin加入到5ml的血清和无补充培养液中。在室温1下小时后，将管1和管2混合，并在室温下静置15分钟，然后缓和地加入到S2细胞中。在细胞生长过夜后，加入含有全补充剂及150-300μg/ml潮霉素的新培养液。
在无血清Ex-cell 420培养液(JRH Biosciences)中，将瞬时和稳定细胞系用500μM硫酸铜或10μM氯化镉诱导48-72小时。结果：
Ca2PO4方法得到了33个稳定细胞系，Lipofectin方法得到了23个。表达产率高低不等，从检测不到至11mg/L。下面的表格对用于蛋白质生产的几个细胞系进行了总结。
            最佳mIL5 S2细胞转染的表达结果总结
 质粒        构建体        S2细胞      转染方法     产率
p612    IL5/His15/mIL5wt    ATCC         Ca2PO4   3.5mg/L
p767    Bip/His15/mIL5wt    LS           Lipofectin 11mg/L
p613    IL5/His15/mIL5.1wt  ATCC         Ca2PO4   2.6mg/L
p768    Bip/His15/mIL5.1wt  ATCC         Ca2PO4   0*
p614    IL5/His15/mIL5.5wt  LS           Lipofectin  0* *表达质粒含有序列突变
因此，S2细胞可采用磷酸钙沉淀或者Lipofectin转染。由于质粒p612和p767之间表达水平的不同，在S2细胞中似乎Bip信号肽是一个比内源性mIL5前导序列更有效的前导序列。实施例14
                  被修饰分子的筛选和选择
对表达后的重组蛋白质进行了纯化和表征。自体疫苗候选物的表征将包括使用分析色谱，等电聚焦(IEF)、SDS-PAGE、氨基酸组成分析、N-末端序列分析、质谱分析、低角度激光散射、标准光谱学和圆二色性方法，达到对所限定的目标蛋白质产物的相关参数进行精确记录这样一个程度。
直到最近，才使用了一种两步法对His加尾蛋白质进行纯化。然而，在最后的螯合步骤之后，得率和纯度都不如预期的那么高。因此，一个新的一步法纯化方案被提出来，它具有三个主要优点：最终产物之更高的得率、更高的生产量和更高的纯度。还建立了除去His尾的切割条件。纯化IL5的两步法
在培养液中加入金属离子，诱导蛋白质的表达。但是，在将蛋白质上于螯合柱之前，必须将这些金属离子除去。因此，为复合金属离子，总共加入了20mMEDTA，然后再将上清液通过一个SP-sepharose柱，以捕获该蛋白质。在冲洗除去未结合蛋白质后，结合蛋白质用NaCl不连续梯度洗脱。该步骤具有两个目的：浓缩减小体积(30倍)和缓冲液置换。
将相关的分部收集部分，通过SDS-PAGE确定汇集起来，然后在金属螯合柱上进一步纯化。
将蛋白质上于荷有Ni2+的螯合柱，未结合蛋白质被冲洗掉。然后用嘧唑梯度洗脱结合蛋白质。接着，将柱子的所有收集部分、流过液以及EDTA冲洗液用SDS-PAGE以及斑点印迹(dot-blot)检测。
正如通过SDS-PAGE和斑点印迹确定那样，将相关的分部收集部分汇集起来，并对10倍体积的PBS透析两次，pH调至6.9。
过滤后，将被透析物浓缩，直至达到合适的浓度(优选地1mg/ml)。最后，将蛋白质等量分装并保存于-20℃。
已使用过下面的具体方法：
1)所得到的上清液离心，2500g×15分钟(如果已发生感染，就需要在22000g离心30分钟，接着先使用0.45μm滤器、然后再使用0.22μm滤器过滤上清液(有时需要首先滤过5μm滤器))。随后，将上清液与含有40mM EDTA的缓冲液A按1∶1混合(见步骤2)，所得缓冲液的最终组成为：0.2M NaH2PO4、10％甘油、20mM EDTA，pH6.0
2)过滤后的上清液上缓冲液A平衡的SP-Sepharose柱。对一个80ml的柱子，总共可上1-2L上清液(这要取决于蛋白质的浓度，上面的上清液中含有1-10mg IL5/L)。上样时的流速为1-2ml/min(通常过夜)，收集流过液并备以后分析用。上样后，柱子用2-3倍柱体积(CV)的A-缓冲液冲洗，直至基线稳定为止。使用不连续梯度：0-100-500-1000mM NaCl洗脱结合蛋白质，每管收集10ml，流速为10ml/min。纯化过程于5℃进行。
每次走完柱子后，用2个CV的1M NaOH，流速5ml/min，清洗柱子，并在缓冲液A中再平衡。缓冲液A：0.2M NaH2PO4，10％甘油，pH6.0缓冲液B：0.2M NaH2PO4，1M NaCl，40mM嘧唑，10％甘油，pH6.0
该方法被用于野生型以及变异体。
在斑点印迹以及SDS-PAGE中测试所有分部收集部分、起始材料以及流过液。将含有IL5的分部收集部分汇集起来，然后用螯合柱进一步纯化。纯化IL5的一步法
将上清液直接上于荷有ZnCl2的70-ml螯合柱。在通过冲洗除去未结合蛋白质后，通过加载一个嘧唑梯度将结合蛋白质(IL5和污染物)洗脱下来。这个方法充分利用His尾，从而给出一个高纯度终产物(＞95％)的一步纯化方法。汇集相关的分部收集部分(正如由SDS-PAGE和斑点印迹确定)，然后对10倍体积的PBS透析两次，pH调整到6.9，NaCl的浓度调整到400mM。
过滤后，将被透析物浓缩，直至达到合适的浓度(优选地1mg/ml)。最后，将蛋白质等量分装并保存于-20℃。
具体方法见下面步骤：
1)上清液过滤通过一个0.45μm滤器以除去杂质，然后与缓冲液A按1∶1混合。将一个70-ml的Fast Flow螯合柱用5个CV的水轻洗，然后用10个CV的10mM ZnCl2 pH7负荷。柱子在用5个CV的A-缓冲液平衡后，用泵加载样品(流速10ml/min)。收集流过液并备以后分析用。使用一个从0至250mM的嘧唑梯度(使用了30个CV)洗脱结合蛋白质。最后，用5个CV的缓冲液C将柱子中的所有结合物洗掉。
每管收集10ml。缓冲液：A：20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，10％甘油，pH7.0。B：20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，10％甘油，pH7，0.25M嘧唑。C：20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，0.1M EDTA pH7.0。
  在SDS-PAGE中测试所有分部收集部分、流过液以及起始材料。
1)收集含有IL5的最纯的分部收集部分(正如由SDS-PAGE确定)(留下50
  μl备以后分析用)，然后对10倍体积的PBS，pH调整到6.9，在6℃透析
  两次，MWCO 12-14kDa。将透析液滤过0.22μm滤器(留下50μl备以后
  分析用)，然后以透析缓冲液(滤过0.45μm)为对照测量A280。对透析前
  后的体积予以测量，留下在透析/浓缩步骤中出现的样品备以后SDS-PAGE
  分析用(在第3步骤之后)。
2)将NaCl加入到透析后的蛋白质中，直至总浓度为400mM，接着使用Amicon
  装置(对于体积大于50ml)或者Vivaspin浓缩仪(对于10-50ml)进行浓
  缩。在所有两种情况下，在加载样品之前，将膜用10ml PBS-缓冲液饱和。
  样品应浓缩至浓度达到优选地1mg/ml(通过A280测量)。将透析后的浓缩
  样品滤过0.22μm滤器，然后作上E-nr标记。A280的测量以流过液作为
  对照。
用SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色，分析来自透析和浓缩步骤的所有样品。将纯化的蛋白质等量分装后冻存，并将描述样品的单子作成文件放在“IL5-蛋白质”-文件夹中。
采用上面描述的方法所得到的蛋白质的纯度为大约90-95％，并仍然含有His尾。
当测序时，IL5wt以及变异体IL5.1均给出了包含His尾的预期N-末端序列。
上面提到的纯化方法已经在下面的具体方案中予以实施：
1)来自SP-sepharose柱的汇集的分部收集部分滤过0.45μm滤器，以除去杂质。用15ml水轻洗一个5-ml的HiTrap螯合柱(用注射器)，接着用15ml 0.1M NiSO4负荷和用15ml水冲洗。将柱子与kta-***连接，然后用2-3个CV的A-缓冲液平衡。使用环孔(loop)或者泵(取决于体积大小)加样(流速4ml/min)，收集流过液并留下备以后分析用。使用一个从0至500mM的嘧唑梯度(使用了20个CV)洗脱结合蛋白质。最后，用5个CV的缓冲液B2将柱子中的所有结合物洗掉。
缓冲液A：0.2M M NaH2PO4，0.5M NaCl，10％甘油，pH5.0。
缓冲液B1：0.2M NaH2PO4，0.5M NaCl，0.5M嘧唑，10％甘油，pH5.0。
缓冲液B2：50mM乙酸钠，0.5M NaCl，0.1M EDTA，10％甘油，pH4.5。
在斑点印迹中测试所有分部收集部分、流过液以及起始材料，在SDS-PAGE中测试所有相关的分部收集部分。
2)集含有IL5的最纯的分部收集部分(正如由SDS-PAGE确定)(留下50μl
  备以后分析用)，然后对10倍体积的PBS，pH调整到6.9，在6℃透析两
  次，MWCO 12-14kDa。将透析液滤过0.22μm滤器(留下50μl备以后分
  析用)，然后测量A280(以透析后的透析缓冲液为对照)。对透析前后的体
  积予以测量，留下在透析/浓缩步骤中出现的样品备以后SDS-PAGE分析用
  (在第3步骤之后)。
3)另加NaCl至总浓度为400mM后，使用Amicon装置(对于体积大于50ml)
  或者Vivaspin浓缩仪(对于10-50ml)对透析后的蛋白质进行浓缩。在所有
  两种情况下，在加载样品之前，将膜用10ml PBS缓冲液饱和。样品应浓缩
  至浓度达到优选地1mg/ml(正如通过A280测量)。A280的测量以流过液为
  对照。将透析后的浓缩样品滤过0.22μm滤器，然后作上E-nr标记。
用SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色，分析来自透析和浓缩步骤的所有样品。将纯化的蛋白质等量分装后冻存。已评价过的其它纯化方法有：
Zn2+-螯合纯化：已证明使用升高的嘧唑梯度洗脱蛋白质是非常有效的，这是由于野生型蛋白质强烈地结合到柱子上。可将果蝇上清液直接加载到柱子上，并且在冲洗后可以用嘧唑将IL5wt洗脱下来。柱子用10个CV的10mM ZnCl2负荷，然后用水冲洗。结合和洗脱缓冲液的pH必须高于6.5，否则ZnCl2会沉淀。
ConA亲和色谱正处于研究之中。将存在于IL5上的糖基化用作亲和尾(affinity-tag)，然后通过加载一个单糖-类似物洗脱，这种可能性是诱人的，这是由于也可将它应用到非-His加尾的构建体。His尾的去除：
根据供应商(Unizyme)的说明，进行15个His氨基酸尾(SEQ ID NO：25)的去除：
  顺序加入两种酶，DAP1和谷氨酰胺环转移酶(Glutamine cyclotransferase)，
  将纯化的以及透析后的/浓缩的His加尾IL5去His加尾。DAP1从游离的N-
  末端除去两个氨基酸，而同时QCT
  首先需要激活该酶：
  9μl HT-DAP1与9μl 20mM半胱胺-HCl混合。在室温温育5分钟后，加入
  总共108μl HP-GCT(100U/ml)和54μl TAGZyme缓冲液。必须在15分钟
  之内使用它。
  该部分将消化1mg His加尾蛋白质。
  将His加尾蛋白质与150μl激活的酶混合，并在37℃温育120分钟。在0、
  10、30、60和120分钟后取样(10μl)进行SDS-PAGE分析。将样品置于
  冰上以终止消化。
  缓冲液：
1.GZyme缓冲液：20mM NaPO4缓冲液，pH7.5；150mM NaCl
2. 0mM半胱胺-HCl
将消化后的蛋白质(正如从SDS-PAGE分析或N-末端测序确定)加载到一个在PBS中平衡的1ml Ni-螯合柱。收集所有液体。
将来自加载的流过液留下备以后分析用。加入3个CV的PBS洗脱柱子，分部收集，每管0.5ml。用2个CV的0.5M嘧唑冲洗以清洗柱子，留下分部收集部分用于分析。
在SDS-PAGE中测试所有的分部收集部分，汇集含有IL5的分部收集部分并以PBS为对照测量A280。最后使用Vivaspin浓缩仪浓缩蛋白质，直到浓度达到1mg/ml。
已在小规模实验(0.1-1mg)中进行了His尾的去除，但还没有放大规模。应该指出的是，只有在N-末端没有被封阻和没有被修饰的情况下，才能将尾去除。
将His加尾蛋白质与两种酶(一次除去两个氨基酸的二肽氨基肽酶和催化谷氨酸转变为焦谷氨酸的谷氨酸环转移酶)温育。谷氨酸转变为焦谷氨酸封阻了二肽氨基肽酶的进一步降解。接着将降解混合物通过螯合柱，它应该将这些酶(它们被His加尾)、结合到柱子上的污染蛋白质和未被降解或部分被降解的蛋白质持留。去尾的蛋白质通过柱子并被收集于流过液中。在用一种去除焦谷氨酸的酶进行第二次消化后，将蛋白质再次通过一个螯合柱，以除去这第二种酶。预计在该最后阶段，需要对蛋白质进行浓缩。一般观察：
UniHis-IL5wt的pI是9.5，该蛋白质的最佳pH值似乎为6.5-7.0(还没有彻底地研究)。似乎400mM浓度的NaCl在浓缩时可稳定该蛋白质。
实施例15
                           体外筛选
体外筛选将主要以酶联免疫吸附测定(ELISA)的形式进行：针对野生型IL5的竞争性ELISA可以在将被修饰IL5的构建体引入动物之前，对其中的相关B-细胞表位的量进行估计。
常规的ELISA测定可用于测量接种动物的血清中自体抗体的滴度。抗人以及抗鼠的IL5抗体(单特异性的以及单克隆的)可从R&D Systems，614 McKinley PlaceNE，Minneapolis，MN 55413，USA商业获得。
该产物的生物学活性和/或被诱导的自体抗体的中和能力，可使用IL5的生物测定法进行测定。以前报道过的这样的生物测定法的例子有：IL5诱导的TF1细胞的增殖测定(对人IL5)和IL5诱导的BCL1细胞或B13细胞的增殖测定(对鼠IL5)(Callard和Gearing，1994； Dickason等人，1994)。
自体疫苗对气道反应性的效应也可在体外测定法中进行测定，其中接种小鼠的气管被移开并置于器官浴中。对组胺刺激后的气管张力进行了测量(van Oosterhout等人，1995)。
因而，为了能够确定重组mIL5(以及mIL5 AutoVac)蛋白质样品的生物学活性，正在建立用于鼠IL5的细胞生物活性测定法。该测定法基于B-细胞淋巴瘤细胞系BCL1的增殖(为应答加入到培养液中的mIL5)能力。从ATCC得到了两个不同的BCL1克隆，BCL1克隆5B1b(ATCC CRL-1669)和BCL1克隆CW13.20.3B3(ATCC TIB-197)。
在一个典型的BCL1增殖实验中，将细胞接种于微滴定板上补充有胎牛血清(FCS)的完全RPMI培养液中，并与鼠mIL5的系列稀释液温育。通过氚标记胸苷的掺入，测量BCL1细胞的增殖。将所购买的重组mIL5(R&D Systems)在进行系列稀释后用于刺激，使用这样的mIL5进行了几个最佳化实验。可变参数包括：温育间隔期，3H-胸苷脉冲间隔期，每孔接入的细胞数量，胎牛血清(FCS)浓度和所加入的mIL5浓度。已经实现了BCL1细胞的剂量依赖性增殖，其中最大增殖为大约3倍于背景(没有加入mIL5的BCL1细胞)。
BCL1测定法已被用于确定下列样品的生物学活性(这些样品表达自果蝇S2细胞，并按上面所述予以纯化)：HIS-mIL5.1wt材料(E1320)，HIS-mIL5.1wt材料(E1422)，HIS-mIL5.1材料(E1396)和“S2-背景-制备物”(E0016)。对HIS-mIL5.1wt(E1320)制备物的应答性增殖显著地高于对S2-背景-制备物的应答性增殖，而mIL5.1变异体和一种野生型的制备物(E1422)经确定没有生物学活性。
正在进行的工作包括：抗-mIL5对BCL1增殖的抑制，并且抗-mIL5单克隆抗体TRFK5被用于最佳化研究。做这些工作的目的是使用该测定法，以确定来自被免疫小鼠的抗-mIL5抗血清抑制mIL5的生物学活性的能力。
实施例16
                          体内模型
已知有多个众所周知的哮喘动物模型，被用于测定自体疫苗的体内效应。正常情况下，用化合物(过敏原/抗原)致敏化动物，在用气雾化的化合物刺激后，使用躯体体积描记器测量支气管缩小(气道传导)。对BAL液体中的嗜酸性粒细胞计数也进行了测定。
在小鼠中已成功地进行了几项抗-IL5 mAb的效应的研究。那些反对使用鼠模型的人表述了这样的事实，即该IL5作为一种B-细胞生长因子，可能会干预鼠的抗体应答。但是，正如在一项使用了IL5剔除动物的研究中所表明的，T-细胞依赖的针对卵清蛋白的抗体应答以及细胞毒性T-细胞的发育均表现正常(Kopf等人，1996)。由于与豚鼠或猴子相比，小鼠也是最实用和最经济的动物模型，所以，正如被Hamelman等人(1997)所用，准备使用卵清蛋白致敏化的哮喘/气道过敏感性Bal/c小鼠模型。
但是，如果IL5在鼠模型中对B-细胞的效应最后看来有问题，则准备使用本领域公知的其它合适的动物模型。
实施例17
            编码鼠IL5及其变异体的DNA构建体的制备在pcDNA3.1+中构建变异体：
用含有表位序列的有重叠引物，通过SOE-PCR，将P2和P30表位***到野生型mIL5中。包含前导序列(SEQ ID NO：63)(其与Kozak共有序列一起，被克隆至pcDNA3.1+中，得到质粒p815)的野生型mIL5的基因被用作模板，进行PCR反应。将所得到的片段用NheI和NotI消化后，进行纯化并克隆到p815中，被用作PCR模板。将变异体克隆到带有Bip和Uni-His尾的pMT果蝇载体中：
用含有合适限制酶位点以及另外还含有编码果蝇Kozak样序列(其后接果蝇Bip前导序列，再后接编码一个Uni-His尾(SEQ ID NO：25)的序列，而该Uni-His尾序列被融合到编码成熟的mIL5序列的5’位)的mIL5特异引物，通过生成一个PCR片段，将野生型mIL5克隆到pMT果蝇表达载体系列(Invitrogen)中。野生型mIL5的cDNA序列被用作模板。将所得到的片段用EcoRI和NotI消化，随后克隆到pMT/V5-HisA载体(Invitrogen)中。所得质粒(p818)被用于将含有表位的变异体克隆到pMT中。用SacI和NotI消化在pcDNA3.1+中制造的变异体并将所得片段克隆到p818中，从而将这些变异体克隆。将变异体克隆到pAC5中：
用EcoRI和NotI消化pMT中的变异体，然后将所得片段克隆到pAC5.1/V5-HisA载体(Invitrogen)中，这样就将mIL5的野生型和变异体克隆到pAC5组成型果蝇表达载体中。
实施例18
              编码人IL5及其变异体的DNA构建体的制备
设计了5个系列的质粒，它们含有未被修饰IL5和九个IL5变异体中的所有或一些。这些系列包括：1)pCI载体适于在人细胞中表达，其中带有用于DNA接种的人IL5，2)pMT/V5/HIS载体适于在果蝇中诱导表达，其中带有人IL5，该IL5带有Bip前导序列和一个15个氨基酸的His尾(SEQ ID NO：25，从位于Hrsholm，Denmark(丹麦)的UNIZYME获得。在本文中，这个尾被称为“UNI”或“UNI-His尾”)，3)正如在2中，但是没有His尾，4)正如在3中，但带有的是鼠IL5，和5)用于在杆状病毒***中表达的pVL1393载体，其中带有人IL5，该IL5带有DAPI前导序列和15个氨基酸的HIS尾。
pCI载体中用于DNA-接种的质粒：
  名称      参考#           菌株#            表位
hIL5(pCI)    p888          MR#1237            无
hIL5.1(pCI)  p889          MR#1238           p2，回环3
hIL5.2(pCI)  p890          MR#1239           p30，回环1
hIL5.3(pCI)  p891          MR#1240           p30，回环2
hIL5.4(pCI)  p892          MR#1241           p2，回环2
hIL5.5(pCI)  p893          MR#1242           p2，回环1
hIL5.6(pCI)  p894          MR#1243           p2，回环3
hIL5.7(pCI)  p895          MR#1244           p30，回环3
hIL5.12(pCI) p896          MR#1245           p30，回环3
hIL5.13(pCI) p897          MR#1246           p2，和p30，回环3
在pMT/V5/HIS中用于在果蝇中表达人IL5的质粒，其中的IL5带有UNI-HIS尾和Bip前导序列：
   名称                       参考#     菌株#     表位hIL5m-UNI-Bip(pMT/V5-HisA)         p899    MR#1247     无hIL5.1m-UNI-Bip(pMT/V5-HisA)       p900    MR#1248  p2，回环3hIL5.2m-UNI-Bip(pMT/V5-HisA)       p901    MR#1249  p30，回环1hIL5.3m-UNI-Bip(pMT/V5-HisA)       p929    MR#1277  p30，回环2hIL5.4m-UNI-Bip(pMT/V5-HisA)       p902    MR#1250  p2，回环2hIL5.5m-UNI-Bip(pMT/V5-HisA)       p903    MR#1251  p2，回环1hIL5.6m-UNI-Bip(pMT/V5-HisA)       p904    MR#1252  p2，回环3hIL5.7m-UNI-Bip(pMT/V5-HisA)       p905    MR#1253  p30，回环3hIL5.12m-UNI-Bip(pMT/V5-HisA)      p906    MR#1254  p30，回环3hIL5.13m-UNI-Bip(pMT/V5-HisA)      p907    MR#1255  p2，和p30，回环3
在pMT/V5/HIS中用于在果蝇中表达人IL5的质粒，其中的IL5带有Bip前导序列但没有UNI-HIS尾：
    名称                       参考#     菌株#    表位hIL5m-Bip(pMT/V5-HisA)              p908    MR#1256    无hIL5.1m-Bip(pMT/V5-HisA)            p909    MR#1257    p2，回环3hIL5.2m-Bip(pMT/V5-HisA)            p921    MR#1269    p30，回环1hIL5.3m-Bip(pMT/V5-HisA)            p922    MR#1270    p30，回环2hIL5.4m-Bip(pMT/V5-HisA)            p923    MR#1271    p2，回环2hIL5.5m-Bip(pMT/V5-HisA)            p924    MR#1272    p2，回环1hIL5.6m-Bip(pMT/V5-HisA)            p925    MR#1273    p2，回环3hIL5.7m-Bip(pMT/V5-HisA)            p926    MR#1274    p30，回环3hIL5.12m-Bip(pMT/V5-HisA)           p927    MR#1275    p30，回环3hIL5.13m-Bip(pMT/V5-HisA)    p928    MR#1276   p2和p30，回环3
在pMT/V5/HIS中用于在果蝇中表达鼠IL5的质粒，其中的IL5带有Bip前导序列但没有15个氨基酸的His尾：
    名称                  参考#      菌株#    表位hIL5m-Bip(pMT/V5-HisA)         p918     MR#1266    无hIL5.1m-Bip(pMT/V5-HisA)       p919     MR#1267    p2，回环3hIL5.2m-Bip(pMT/V5-HisA)       p920     MR#1268    p30，回环1
在pVL1393中用于在杆状病毒***中表达人IL5的质粒，其中的IL5带有UNI-HIS尾和DAP1前导序列：
  名称                    参考#       菌株#    表位hIL5m-UNI-DAP1(pVL1393)        p916     MR#1264     无hIL5.1m-UNI-DAP1(pVL1393)      p917     MR#1265     p2，回环3
实施例19
                    DNA免疫研究用于DNA接种实验、编码带有Kozak序列的mIL5wt、mIL5.1和mIL5.5的载体之生成：
将编码包括天然的前导序列(SEQ ID NO：63)在内的mIL5wt、mIL5.1和mIL5.5的DNA片段，***到pcDNA3.1中，从而生成新质粒p521、p522和p523。为了增强cDNA在哺乳动物细胞中的表达，使用PCR技术，将Kozak共有序列***到编码序列的上游。使用p521、p522和p523作为模板以及一个编码Kozak序列的前向引物，进行PCR反应。该序列紧靠mIL5前导序列起始密码的上游。使用限制性内切酶BamHI和NotI，将纯化的PCR产物克隆到pcDNA3.1+载体中。对所得到的质粒，分别为p815、p816和p817，采用DNA测序进行验证。用于DNA接种实验的所有其它质粒都是以p521质粒为起始材料而进行构建的。DNA接种质粒的体外翻译，使用Promega试剂盒：
以前在我们的实验室中，成功地使用了一种兔网织红细胞提取物的商业试剂盒，体外生成质粒DNA的翻译蛋白质产物，以实现对来自pcDNA质粒编码例如卵清蛋白cDNA的蛋白质表达的监测。根据标准方法，将鼠IL5 DNA接种质粒加入到试剂盒试剂中。几次尝试在放射自显影照片上检测被表达的mIL5物质，不幸都以失败告终，而阳性对照却可以。来自COS细胞转染和DNA接种的结果表明，基因产物已被表达，所以我们没有进一步地研究这些技术问题。用DNA接种质粒瞬时转染COS细胞，以确定表达水平：
为了监测用于DNA接种实验的质粒的转染/表达效率，建立了一种使用COS细胞的瞬时转染测定法。COS细胞经胰蛋白酶作用后，接种于补充有10％FCS的DMEM培养液，于T25培养瓶中。第2天使用Dotcap试剂盒(Roche Diagnostics)转染细胞，并在第5天收获细胞。对培养上清液、完整细胞裂解物以及膜富集制备物，采用Western印迹检测可与抗-mIL5反应的表达产物。在细胞制备物中，与抗-mIL5反应的产物在SDS-PAGE上始终以2-3条分开的21-28kD带迁移，而在杆状病毒中表达，R&D Systems的用作标准的mIL5单体的MW仅为15-18kD。在非变性条件下，21-28kD物质会形成二聚体，所以我们相信该物质就是mIL5，并可能有几种不同的糖基化形式。DNA接种结果(见下面)明确地支持该结论。小鼠的DNA接种，使用鼠IL5 AutoVac构建体：
为了研究对鼠IL5特异的抗体应答是否可通过采用裸露的，编码8种不同的鼠IL5突变体的质粒DNA免疫小鼠来诱导，进行了一项DNA接种研究。由于以前已报道IL5在B细胞的分化中扮演了一个角色，所以必须证实：抗-mIL5自体抗体可在小鼠中生成以及B细胞对mIL5的耐受可被突破。
DNA接种实验的一般方案：使用C3H/Hen小鼠(H-2k)或Balb/cA小鼠(H-2d)，6-8周大小，分组，每组5只。在第0、14、28、42、62、和76天采用皮下注射睡眠/休眠剂将小鼠麻醉，并用编码卵清蛋白(对照)、mIL5wt(野生型)或待测试的mIL5变异体的表达质粒注射。使用无内源的(endofree)Gigaprep试剂盒(Qiagen)制备DNA材料，然后将其以1μg/ml溶于0.15M NaCl或含有0.1％bupivacaine的0.15M NaCl中。将100μl材料按上面的方式，于下后背分两个注射位点注射到每只小鼠中。注射前血样于注射前两天获取，测试血样于第3、5、8和11周获取。通过离心分离血清，并保存于-20℃，直至ELISA测试其对纯化的卵清蛋白和mIL5蛋白质的反应性。
DNA接种实验的一个典型结果见图4。根据上述的一般方案，用卵清蛋白对照质粒、编码mIL5wt质粒或编码mIL5 AutoVac的变异体mIL5.1或mIL5.5的质粒免疫40只Balb/cA小鼠。在这个实验中，用编码卵清蛋白的质粒免疫的9只小鼠全部出现了抗-卵清蛋白抗体，而在接受编码mIL5野生型或mIL5变异体的DNA的小鼠中，没有诱导出抗-卵清蛋白应答。注射编码mIL5wt质粒并不产生抗-卵清蛋白应答，而在用mIL5.1质粒免疫的10只小鼠中有4只、在用编码mIL5.5的质粒DNA免疫的9只小鼠中有7只，突破了B细胞对mIL5的耐受。
全部系列的DNA接种实验的主要结果，总结于下面的表中。每个免疫组中应答个体的数量，在不同的mIL5 AutoVac构建体间是不同的，并且取决于小鼠的品系。很明显，mIL5.2 AutoVac优于其它变异体，它在两个小鼠品系中均诱导出抗-mIL5抗体应答，外显率达到了100％。在COS转染测定法中该质粒(p820)还给出了最高表达水平。
另一个要强调的例子是当用编码mIL5.4的质粒DNA作为免疫原时，所见到的表观MHC限制。10只Balb/cA小鼠中有9只为应答个体，但是只有1/10的C3H/Hen小鼠对DNA接种有应答。在使用mIL5.6构建体时见到了相反的现象(尽管不是特别象所表明的那样)。但是，mIL5.2 DNA疫苗似乎是混杂型致免疫原。OVAwt-pVax     mIL5wt-pcDNA    mIL5.1-pcDNA  mIL5.2-pcDNA   mIL5.4-pcDNABalb/cA 28/28      0/28            4/10          9/10          9/10C3H/Hen 29/29      0/30            3/10          10/10         10/10mIL5.5wt-pcDNA mIL5.6-pcDNA    mIL5.7-pcDNA  mIL5.12-pcDNAmIL5.13-pcDNABalb/cA 7/9        0/28            2/10          0/10          0/10C3H/Hen 5/10       6/10            2/10          2/10          2/10
280只小鼠的DNA接种结果总结。6只小鼠死于实验过程中，死亡原因与DNA接种效应无关。应答个体(具有高或中等的抗-mIL5滴度)的数量与每一个免疫组中小鼠的总数量同时显示，以示对比。*)在第55天获得的血样。所有其它血样在第77天获得。
另一个要提到的特性是这样一个趋势：带有外源T辅助细胞表位，被***到mIL5的回环1中的mIL5变异体，与带有T辅助细胞表位，被***到回环3中的变异体相比，是更强的DNA接种免疫原。这可能是相对高的表达水平的缘故。正如上面所提到的，作为所测试的唯一的回环2变异体，mIL5.4-pcDNA在Balb/cA品系中只是一个强免疫原。对DNA接种诱导的抗体应答的进一步表征：
为了确定是否可在抗-mIL5阳性小鼠中检测到特异性地针对***的T辅助细胞表位的抗体，建立了ELISA实验。对于每一个免疫组，将来自抗-mIL5阳性小鼠的血清汇集起来，然后测试其对P2或P30肽的反应性。这些肽已被固定于AquaBind微滴定板中。在两个品系小鼠中，由DNA接种诱导的针对mIL5.2的抗血清均明确含有针对所***的P30的反应性，而其它抗血清中却没有一个可与P2或P30反应。这很可能与更高的抗体滴度和外显率相关，而更高的抗体滴度和外显率一般可在使用mIL5.2 DNA接种构建体时观察到。应该指出的是，使用该ELISA方法，我们就能够在所诱导的抗mIL5.1抗血清中检测抗-P2反应性。
对来自DNA接种小鼠的抗-mIL5阳性抗血清汇集物，还通过竞争性ELISA，测试它们抑制天然的可溶性鼠IL5与单克隆抗体TRFK4或TRFK5(它们都是中和性抗体)之间的相互作用的能力。将抗-mIL5抗血清汇集物的系列稀释物与天然的可溶性mIL5预温育，然后将该样品加入到已用捕获抗体TRFK5外包被的ELISA板中。下一步，使用生物素化的TRFK4层以及随后的辣根过氧化物酶标记的链亲和素层，就可肉眼观察到结合的鼠IL5(它没有被抗血清吸附)。并不是由DNA接种诱导的所有抗-mIL5阳性抗血清都可以抑制可溶性mIL5与TRFK4或TRFK5间的相互作用。具有最高TRFK4/5抑制能力的抗血清，是来自用编码mIL5.2的DNA免疫的C3H/Hen小鼠。对所观察到的抑制上差别，还没有测试它是不是滴度差别的直接结果，还是与不同抗血清的精细特异性有关。它最可能是这两个因素的组合。在mIL5 AutoVac DNA免疫的小鼠中，嗜酸性粒细胞增多动物模型：
为了在嗜酸性粒细胞增多动物模型中进行测试，选出40只DNA接种的小鼠：10只为用mIL5wtDNA免疫的Balb/cA小鼠，10只为用mIL5.2DNA免疫的Balb/cA小鼠，10只为用mIL5wt DNA免疫的C3H/Hen小鼠和10只为用mIL5.2 DNA免疫的C3H/Hen小鼠。对每一只选出的小鼠，实施卵清蛋白诱导的嗜酸性粒细胞增多致敏化/激发方案。采用皮下每周注射一次于0.9％盐水中的卵清蛋白(OVA)50μg(与Adjuphos按1∶1混合)、共注射三周，致敏化小鼠。在最后一次OVA致敏化后的第4天，开始用OVA(于0.9％盐水中)12.5μg于鼻内激发小鼠，每隔一天一次，共激发3次。在最后一次致敏化的一天后，通过气管插管和用1ml PBS冲洗气道腔，收集支气管肺泡灌洗液液体(BALF)。
通过旋转离心，1500转/分钟、20分钟，使大约30000-60000个BALF细胞甩到载物片上。将载物片过夜干燥，然后用May-Grunwald染料(Sigma)染色2.5分钟，在Tris缓冲的盐水中冲洗4分钟，再用Geimsa染料(按1∶20用ddH2O配制；Sigma)染色20-30分钟，最后用ddH2O简单轻洗。将染色后的载物片过夜干燥，然后使用光学显微镜对细胞类型进行鉴定。每个载物片大约计数100-200个细胞，每只小鼠计数3个载物片。以每100个计数细胞中嗜酸性粒细胞的数目来表达嗜酸性粒细胞计数。在mIL5.2 DNA免疫的C3H/Hen小鼠中，对肺嗜酸性粒细胞增多的诱导，与野生型mIL5wt DNA接种组相比，被显著地下调节(mIL5.2 DNA：14.6±8.9个嗜酸性粒细胞/100个细胞；mIL5wt DNA：51.1±9.9个嗜酸性粒细胞/100个细胞)。但是，在Balb/cA品系，免疫组之间在嗜酸性粒细胞计数方面没有重要差别(mIL5.2 DNA：13.3±6.8个嗜酸性粒细胞/100个细胞；mIL5wt DNA：27.7±9.3个嗜酸性粒细胞/100个细胞)。对此，一个可能的解释是Balb/cA小鼠对该模型仅是微弱敏感。这种解释被抗-卵清蛋白ELISA数据支持：在收集BALF前的一周，来自Balb/cA小鼠的血清中抗-卵清蛋白的滴度比来自C3H/Hen小鼠的血清中的低。据报道，Balb/cJ亚系对OVA致敏化/激发模型敏感。
实施例20
                      蛋白质接种研究
Balb/c J小鼠用鼠IL5(mIL5)蛋白质免疫并实施卵清蛋白鼻内模型，后者在被处理小鼠的肺中诱导嗜酸性粒细胞。UniHis-mIL5和UniHis-mIL5.1两种蛋白质均诱导可与mIL-5(在sf9细胞中制造，来自R&D Systems)交叉反应的抗体。嗜酸性粒细胞增多模型在OVA对照组以及UniHis-mIL5.1组中诱导高数目的嗜酸性粒细胞，而在PBS组以及UniHis-mIL5组中嗜酸性粒细胞的数目均减小了。该结果引导我们相信：组与组也许已经相互混杂了。材料和方法：
UniHis-mIL-5：      E1320和E01397
UniHis-mIL-5.1：    E01337和E01396免疫：
将6-8周大小的Balb/c J小鼠用处于Freund氏完全佐剂(CFA；Sigma)中的下列之一免疫：1)无任何物质，2)PBS，3)UniHis-mIL，或者4)UniHis-mIL-5.1，以三周为间隔期用处于Freund氏不完全佐剂(CFA；Sigma)中的抗原加强注射3次。每次加强注射后10天，收集血清并在ELISA中测试。ELISA：抗-UniHis-mIL5 ELISA：
分别在第2和3次免疫后的32天(血样1)和54天(血样2)获取血清。将聚苯乙烯微滴定板(Maxisorp，Nunc)用纯化的HIS-mIL5wt(0.1μg/孔，E1320)外包被。使用山羊抗-小鼠次级抗体，可肉眼观察到加入孔中的稀释血清的反应性。将测试样品的OD490读数，减去来自PBS(于Freund氏佐剂中)免疫小鼠的对照血清的OD490读数。抗-mIL5 ELISA：
在第75天获取血清(血样3)。将聚苯乙烯微滴定板(Maxisorp，Nunc)用购买的mIL5(0.1μg/孔，R&D货号405-ML)外包被。使用山羊抗-小鼠次级抗体，可肉眼观察到加入孔中的1∶1000稀释血清的反应性。使用兔抗-大鼠次级抗体，可肉眼观察到TRFK5(2μg/ml)的反应性。竞争性ELISA：
将稀释血清与可溶性IL5预温育1小时，然后加入到用捕获抗体TRFK5外包被的聚苯乙烯微滴定板(Maxisorp，Nunc)中。使用生物素化的TRFK4和一种HRP标记的山羊抗-小鼠次级抗体，可肉眼观察到结合的mIL5。抗-P2 ELISA：
在ELISA中，测试来自HIS-mIL5wt、HIS-mIL5.1或PBS免疫小鼠的抗血清汇集物针对P2表位肽的反应性。特化的微滴定板(AquaBind，M&E Biotech)用合成的P2肽外包被，0.5μg/孔。使用一种HRP标记的山羊抗-小鼠次级抗体(1∶2000，Dako)，可肉眼观察到加入孔中的稀释血清的反应性。抗-UniHis ELISA：
在ELISA中，测试来自HIS-mIL5wt、HIS-mIL5.1或PBS免疫小鼠的抗血清汇集物针对His-尾肽(UNIZYME)的反应性。特化的微滴定板(AquaBind，M&EBiotech)用合成的His-尾肽外包被，0.5μg/孔。使用一种HRP标记的山羊抗-小鼠次级抗体(1∶2000，Dako)，可肉眼观察到加入孔中的稀释血清的反应性。抗-S2背景蛋自质ELISA：
在ELISA中，测试来自HIS-mIL5wt、HIS-mIL5.1或PBS免疫小鼠的抗血清汇集物针对S2背景制备物的反应性。聚苯乙烯微滴定板(Maxisorp，Nunc)用S2背景制备物外包被，0.1μg/孔。使用一种HRP标记的山羊抗-小鼠次级抗体(1∶2000，Dako)，可肉眼观察到加入孔中的稀释血清的反应性。抗-BSA ELISA：
在ELISA中，测试来自HIS-mIL5wt、HIS-mIL5.1或PBS免疫小鼠的抗血清汇集物针对BSA的反应性。将聚苯乙烯微滴定板(Maxisorp，Nunc)用BSA(Intergen)外包被，10μg/孔。使用一种HRP标记的山羊抗-小鼠次级抗体(1∶2000，Dako)，可肉眼观察到加入孔中的稀释血清的反应性。嗜酸性粒细胞增多模型：
采用皮下注射处于0.9％盐水中的卵清蛋白(OVA)50μg(与Adjuphos(为明矾佐剂)按1∶1混合)，致敏化Balb/c J小鼠。OVA免疫每周重复一次，持续4周。在最后一次OVA免疫的一周后，开始用OVA(于0.9％盐水中)12.5μg于鼻内激发小鼠，每隔一天一次，共激发3次。在最后一次致敏化的一天后，通过气管插管和用1ml 0.9％盐水或PBS冲洗气道腔，收集支气管肺泡灌洗液液体(BALF)。BAL染色：
通过旋转离心，1500转/分钟、20分钟，使大约30000-60000个BALF细胞甩到载物片上。将载物片过夜干燥，然后用May-Grunwald染料(Sigma)染色2.5分钟，在TBS中冲洗4分钟，再用Geimsa染料(按1∶20用ddH2O配制；Sigma)染色20-30分钟，最后用ddH2O简单轻洗。将染色后的载物片过夜干燥，然后使用光学显微镜对细胞类型进行鉴定。每个载物片大约计数100-200个细胞，每只小鼠计数3个载物片。结果：抗-mIL5抗体的检测：
为了研究在用HIS-mIL5wt和HIS-mIL5.1蛋白质材料免疫的小鼠中，是否诱导了对鼠IL5特异的抗体应答，进行了一系列的ELISA实验。第一，确定了针对HIS-mIL5wt免疫物的抗体，是否是在HIS-mIL5wt材料外包被的ELISA板上测试个体小鼠的抗血清稀释物时诱导的。已发现：到血样1时，所有的小鼠已经产生了针对HIS-mIL5wt免疫物(E1320，从果蝇S2细胞表达和纯化，估计纯度为大约95％)的高滴度抗体应答。
这个结果对该抗血清与鼠IL5交叉反应，并不是一个强有力的证实。在这个方法中，针对来自果蝇S2细胞、该S2培养液(其中含有例如来自胎牛血清的BSA、HIS-尾以及变性的mIL5 B细胞表位)的杂质的反应性也可能会被检测到。为了证实所诱导的抗体含有针对天然的鼠IL5的反应性，用mIL5(购自R&D Systems)外包被的ELISA平板测试血清。该mIL5(R&D货号405-ML)具有生物学活性，不含有HIS-尾，来自杆状病毒Sf21表达***，纯度也非常高(97％)，并且可购买到无载体蛋白质(BSA)的mIL5。来自所有两个免疫组的汇集血清，可与购买的mIL5(已外包被于ELISA板上)反应，而来自PBS免疫小鼠的血清却不反应。这是在测试第75天(即第4次免疫后的第11天)获取的血样3的血清时显示出来的，但是来自血样1和血样2的血清也可与购买的mIL5以相似的方式反应。为了排除与BSA载体交叉反应而产生的信号，购买无载体的mIL5材料和无BSA的ELISA缓冲液并予以使用，对血样1和血样2重复该实验，仍然见到了抗-mIL5高应答。
为了进一步证实所诱导的抗血清与天然的mIL5交叉反应，建立了一个竞争性ELISA。该ELISA测试不同的抗血清抑制天然的可溶性鼠IL5与单克隆抗体TRFK4或TRFK5间相互作用的能力，此处的TRFK4和TRFK5都是中和性抗体。将抗血清汇集物的系列稀释物与天然的可溶性mIL5预温育，然后将样品加到用捕获抗体TRFK5外包被的ELISA平板。下一步，使用生物素化的TRFK4层以及随后的辣根过氧化物酶标记的链亲和素层，就可肉眼观察到结合的鼠IL5(它没有被抗血清吸附)。来自DNA接种小鼠的一个抗-mIL5阳性抗血清和一个抗-mIL5阴性抗血清，作为对照被包括在内。已证实：来自HIS-mIL5wt和HIS-mIL5.1免疫小鼠的抗血清均能够抑制可溶性mIL5与TRFK4或TRFK5间的相互作用。
基于上面所述，可以得出这样的结论：在用HIS-mIL5wt或HIS-mIL5.1蛋白质制备物免疫的小鼠中诱导出了mIL5特异的自体抗体(在100％测试小鼠中)。换言之，通过使用野生型以及Auto Vac鼠IL5的重组HIS-加尾变化体，B细胞对mIL5的耐受被突破了。对于B细胞突破对野生型蛋白质的耐受这样一个观察结果，一个似乎可能的解释是：在这些小鼠中，该HIS-尾是作为一种“外源的”致免疫T辅助细胞表位起作用的。另一个解释可能是Freund氏完全佐剂的施用突破了B细胞对mIL5的耐受。通过使用无-HIS加尾的抗原和/或替代性地，强度弱一些的佐剂诸如AdjuPhos，可对这些假设进行测试。在用mIL5 Auto Vac蛋白质免疫的小鼠中，对抗体应答的进一步表征：
为了确定是否可在来自mIL5蛋白质免疫小鼠的血清中检测到对***的T辅助细胞表位特异的抗体，建立了ELISA实验。将每一个免疫组的抗血清(血样2)汇集起来，然后测试其对合成的P2肽(已被固定于AquaBind微滴定板中)的反应性。抗-HIS-mIL5.1抗血清含有针对***的P2肽的反应性，而无论是抗-HIS-mIL5wt还是抗-PBS/CFA都不与该肽反应。
抗-HIS-mILwt抗血清和抗-HIS-mIL5.1抗血清是否也含有针对15-聚体HIS-尾(UNIZYMEHIS-尾，SEQ ID NO：25)的反应性，其已被融合到野生型以及Auto VacmIL5的蛋白质的N-末端，对此我们也进行了测试。合成该肽并共价固定于AquaBind微滴定板中，然后测试每个免疫组的抗血清汇集物(血样1、血样2和血样3)针对结合肽的反应性。经蛋白质免疫的所有小鼠的抗血清与合成的HIS-尾肽反应。
抗-HIS-mIL5wt抗血清和抗-HIS-mIL5.1抗血清是否可与来自S2果蝇细胞或培养液的组成成分反应，对此我们也进行了测试。ELISA板用BSA(一种主要的培养液组成成分)或者S2背景制备物(通过将表达Her2的果蝇S2细胞之上清液进行纯化而生成，纯化方案与mIL5的纯化方法相类似)外包被。这些分析结果证实：尽管抗-BSA应答非常低，但是与S2背景制备材料的反应是明显的。在BALF中嗜酸性粒细胞计数：
为了确定接种小鼠中的抗-IL5抗体是否可以下调节IL5的体内活性，我们在接种小鼠的肺中诱导了IL5依赖的嗜酸性粒细胞增多。采用OVA鼻内激发而致敏化的小鼠，对嗜酸性粒细胞进行了诱导。在对照OVA小鼠中以及在用Uni-HIS-mIL5.1接种的小鼠中，诱导了大量的嗜酸性粒细胞，而在Uni-HIS-mIL5或PBS接种的小鼠中，情况不是这样。对照组(OVA和PBS)与实验组(Uni-HIS-mIL5和Uni-HIS-mIL5.1)之间嗜酸性粒细胞数目的差异，以及上面所报道的来自DNA接种小鼠的阳性结果，引导我们相信组与组也许已被颠倒了。但是，还没有进行任何努力来证实组被颠倒以支持这个解释。在相同的条件下，我们正在重复蛋白质接种实验，以澄清这个争论。讨论：
对UniHIS-mIL5和UniHIS-mIL5.1这两个蛋白质诱导可与野生型的鼠IL5交叉反应的抗体的能力，予以了明确的证实。UniHIS-mIL5蛋白质绕过免疫耐受的能力，是由于那个UniHIS-尾，还是一些其它原因(例如，CFA佐剂)，仍有待澄清。令人吃惊的是发现只有UniHIS-mIL5构建体在嗜酸性粒细胞增多模型中，具有下调节内源性mIL5的体内活性的能力。产生自UniHIS-mIL5.1蛋白质接种的抗血清不具有抑制嗜酸性粒细胞增多的能力，以及这种抗血清通过DNA接种具有抑制嗜酸性粒细胞增多的能力，提示在该实验中也许已发生了技术错误。这也得到了PBS接种抑制嗜酸性粒细胞增多这个不同寻常发现的支持。对此，最可能的解释是这两个组(PBS和UniHIS-mIL5.1)被颠倒了。
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                      序列表<110>M和E生物技术公司
 Klysner，Steen<120>用于下调白细胞介素5活性的方法<130>23058 PC 1<140><141><160>65<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>115<212>PRT<213>智人<220><221>二硫化物<222>(44)<223>SEQ ID NO：1中Cys-86上的链间二硫化物键<220><221>二硫化物<222>(86)<223>SEQ ID NO：1中Cys-44上的链间二硫化物键<400>1Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                  25                  30Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
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 50                  55                  60Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp65                  70                  75                  80Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe
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    115<210>2<211>126<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗P2抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<220><221>诱变因素<222>(32)..(46)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基(SEQ ID NO：23)<220><221>相似的<222>(1)..(86)<223>与SEQ ID NO：1中的残基1-86相同<220><221>相似的<222>(102)..(126)<223>与SEQ ID NO：1中的残基91-115相同<400>2Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                  25                  30Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
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 50                  55                  60Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp65                  70                  75                  80Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile
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    115                 120                 125<210>3<211>118<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗P2抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<220><221>诱变因素<222>(32)..(46)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基(SEQ ID NO：23)<220><221>相似的<222>(1)..(31)<223>与SEQ ID NO：1中的残基1-31相同<220><221>相似的<222>(47)..(118)<223>与SEQ ID NO：1中的残基44-115相同<400>3Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Gln
         20                  25                  30Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Thr
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 50                  55                  60Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys65                  70                  75                  80Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val
             85                  90                  95Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr
        100                 105                 110Glu Trp Ile Ile Glu Ser
    115<210>4<211>124<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗P2抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<220><221>诱变因素<222>(59)..(73)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基(SEQ ID NO：23)<220><221>相似的<222>(1)..(58)<223>与SEQ ID NO：1中的残基1-58相同<220><221>相似的<222>(74)..(124)<223>与SEQ ID NO：1中的残基65-115相同<400>4Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                  25                  30Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
     35                  40                  45Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Gln Tyr Ile Lys Ala Asn
 50                  55                  60Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn65                  70                  75                  80Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly
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    115                 120<210>5<211>124<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗P2抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<220><221>诱变因素<222>(86)..(100)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基(SEQ ID NO：23)<220><221>相似的<222>(1)..(85)<223>与SEQ ID NO：1中的残基1-85相同<220><221>相似的<222>(101)..(124)<223>与SEQ ID NO：1中的残基90-115相同<400>5Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                  25                  30Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
     35                  40                  45Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr
 50                  55                  60Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp65                  70                  75                  80Gly Gln Lys Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
             85                  90                  95Ile Thr Glu Leu Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe
        100                 105                 110Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser
    115                 120<210>6<211>126<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗P2抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<220><221>诱变因素<222>(110)..(124)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基(SEQ ID NO：23)<220><221>相似的<222>(1)..(109)<223>与SEQ ID NO：1中的残基1-109相同<220><221>相似的<222>(125)..(126)<223>与SEQ ID NO：1中的残基114-115相同<400>6Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                  25                  30Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
     35                  40                  45Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr
 50                  55                  60Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp65                  70                  75                  80Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe
             85                  90                  95Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Gln Tyr Ile
        100                 105                 110Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Glu Ser
    115                 120                 125<210>7<211>132<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗P30抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<220><221>诱变因素<222>(87)..(107)<223>破伤风菌疫苗P30抗原决定基(SEQ ID NO：24)<220><221>相似的<222>(1)..(86)<223>与SEQ ID NO：1中的残基1-86相同<220><221>相似的<222>(108)..(132)<223>与SEQ ID NO：1中的残基91-115相同<400>7Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                  25                  30Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
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 50                  55                  60Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp65                  70                  75                  80Gly Gln Lys Lys Lys Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu
             85                  90                  95Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Arg Val Asn Gln
        100                 105                 110Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp
    115                 120                 125Ile Ile Glu Ser
130<210>8<211>124<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗P30抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<220><221>诱变因素<222>(32)..(52)<223>破伤风菌疫苗P30抗原决定基(SEQ ID NO：24)<220><221>相似的<222>(1)..(31)<223>与SEQ ID NO：1中的残基1-31相同<220><221>相似的<222>(53)..(124)<223>与SEQ ID NO：1中的残基44-115相同<400>8Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Phe
         20                  25                  30Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala
     35                  40                  45Ser His Leu Glu Cys Thr Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu
 50                  55                  60Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn65                  70                  75                  80Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly
             85                  90                  95Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe
        100                 105                 110Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser
    115                 120<210>9<211>130<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗P30抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<220><221>诱变因素<222>(59)..(79)<223>破伤风菌疫苗P30抗原决定基(SEQ ID NO：24)<220><221>相似的<222>(1)..(58)<223>与SEQ ID NO：1中的残基1-58相同<220><221>相似的<222>(80)..(130)<223>与SEQ ID NO：1中的残基65-115相同<400>9Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                  25                  30Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
     35                  40                  45Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Phe Asn Asn Phe Thr Val
 50                  55                  60Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Val65                  70                  75                  80Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly
             85                  90                  95Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe Leu
        100                 105                 110Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile
    115                 120                 125Glu Ser
130<210>10<211>132<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗P30抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<220><221>诱变因素<222>(110)..(130)<223>破伤风菌疫苗P30抗原决定基(SEQ ID NO：24)<220><221>相似的<222>(1)..(129)<223>与SEQ ID NO：1中的残基1-129相同<220><221>相似的<222>(131)..(132)<223>与SEQ ID NO：1中的残基114-115相同<400>10Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                   25                 30Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
     35                  40                  45Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr
 50                  55                  60Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp65                  70                  75                  80Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe
             85                  90                  95Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Phe Asn Asn
        100                 105                 110Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His
    115                 120                 125Leu Glu Glu Ser
130<210>11<211>141<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗P2和P30抗原决定基的取代
 修饰的人IL5的说明<220><221>诱变因素<222>(86)..(100)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基(SEQ ID NO：23)<220><221>诱变因素<222>(119)..(139)<223>破伤风菌疫苗P30抗原决定基(SEQ ID NO：24)<220><221>相似的<222>(1)..(85)<223>与SEQ ID NO：1中的残基1-85相同<220><221>相似的<222>(101)..(118)<223>与SEQ ID NO：1中的残基92-109相同<220><221>相似的<222>(140)..(141)<223>与SEQ ID NO：1中的残基114-115相同<400>11Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                  25                  30Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
     35                  40                  45Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr
 50                  55                  60Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp65                  70                  75                  80Gly Gln Lys Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
             85                  90                  95Ile Thr Glu Leu Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe
        100                 105                 110Leu Gly Val Met Asn Thr Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu
    115                 120                 125Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Glu Ser
130                 135                 140<210>12<211>113<212>PRT<213>Mus musculus<220><221>二硫化物<222>(42)<223>SEQ ID NO：12中Cys-84上的链间二硫化物键<220><221>二硫化物<222>(84)<223>SEQ ID NO：12中Cys-42上的链间二硫化物键<400>12Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu1               5                  10                  15Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
         20                  25                  30Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln
     35                  40                  45Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asp Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Met
 50                  55                  60Arg Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln65                  70                  75                  80Glu Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp
             85                  90                  95Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Ser Met Asn Thr Ala Ala Ile Ile Glu
        100                 105                 110Gly<210>13<211>124<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗P2抗原决定基的取代
 修饰的鼠IL5的说明<220><221>诱变因素<222>(85)..(99)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基(SEQ ID NO：23)<220><221>相似的<222>(1)..(84)<223>与SEQ ID NO：12中的残基1-84相同<220><221>相似的<222>(100)..(124)<223>与SEQ ID NO：12中的残基89-113相同<400>13Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu1               5                  10                  15Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
         20                  25                  30Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln
     35                  40                  45Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asp Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Met
 50                  55                  60Arg Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln65                  70                  75                  80Glu Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile
             85                  90                  95Thr Glu Leu Arg Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe
        100                 105                 110Leu Gly Ser Met Asn Thr Ala Ala Ile Ile Glu Gly
    115                 120<210>14<211>116<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗P2抗原决定基的取代
 修饰的鼠IL5的说明<220><221>诱变因素<222>(30)..(44)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基(SEQ ID NO：23)<220><221>相似的<222>(1)..(29)<223>与SEQ ID NO：12中的残基1-29相同<220><221>相似的<222>(45)..(116)<223>与SEQ ID NO：12中的残基42-113相同<400>14Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu1               5                  10                  15Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Gln Tyr Ile
         20                  25                  30Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Ile Gly Glu
     35                  40                  45Ile Phe Gln Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asp Gln Thr Val Arg Gly Gly
 50                  55                  60Thr Val Met Arg Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile65                  70                  75                  80Asp Arg Gln Glu Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Thr Arg Gln
             85                  90                  95Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Ser Met Asn Thr Ala Ala
        100                 105                 110Ile Ile Glu Gly
    115<210>15<211>122<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗P2抗原决定基的取代基
 修饰的鼠IL5的说明<220><221>诱变因素<222>(57)..(71)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基(SEQ ID NO：23)<220><221>相似的<222>(1)..(56)<223>与SEQ ID NO：12中的残基1-56相同<220><221>相似的<222>(72)..(122)<223>与SEQ ID NO：12中的残基63-113相同<400>15Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu1               5                  10                  15Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
         20                  25                  30Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln
     35                  40                  45Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asp Gln Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys
 50                  55                  60Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Val Met Arg Leu Phe Gln Asn Leu Ser65                  70                  75                  80Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln Glu Lys Lys Cys Gly Glu Glu
             85                  90                  95Arg Arg Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly
        100                 105                 110Ser Met Asn Thr Ala Ala Ile Ile Glu Gly
    115                 120<210>16<211>122<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗P2抗原决定基的取代基
 修饰的鼠IL5的说明<220><221>诱变因素<222>(84)..(98)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基(SEQ ID NO：23)<220><221>相似的<222>(1)..(83)<223>与SEQ ID NO：12中的残基1-83相同<220><221>相似的<222>(99)..(122)<223>与SEQ ID NO：12中的残基90-113相同<400>16Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu1               5                  10                  15Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
         20                  25                  30Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln
     35                  40                  45Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asp Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Met
 50                  55                  60Arg Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln65                  70                  75                  80Glu Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr
             85                  90                  95Glu Leu Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly
        100                 105                 110Ser Met Asn Thr Ala Ala Ile Ile Glu Gly
    115                 120<210>l7<211>124<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗P2抗原决定基的取代基
 修饰的鼠IL5的说明<220><221>诱变因素<222>(108)..(122)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基(SEQ ID NO：23)<220><221>相似的<222>(1)..(107)<223>与SEQ ID NO：12中的残基1-107相同<220><221>相似的<222>(123)..(124)<223>与SEQ ID NO：12中的残基112-113相同<400>17Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu1               5                  10                  15Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
         20                  25                  30Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln
     35                  40                  45Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asp Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Met
 50                  55                  60Arg Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln65                  70                  75                  80Glu Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp
             85                  90                  95Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Ser Met Asn Thr Gln Tyr Ile Lys Ala
        100                 105                 110Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Glu Gly
    115                 120<210>18<211>130<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗P30抗原决定基的取代
 修饰的鼠IL5的说明<220><221>诱变因素<222>(85)..(105)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基(SEQ ID NO：24)<220><221>相似的<222>(1)..(84)<223>与SEQ ID NO：12中的残基1-84相同<220><221>相似的<222>(106)..(130)<223>与SEQ ID NO：12中的残基89-113相同<400>18Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu1               5                  10                  15Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
         20                  25                  30Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln
     35                  40                  45Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asp Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Met
 50                  55                  60Arg Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln65                  70                  75                  80Glu Lys Lys Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val
             85                  90                  95Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Arg Thr Arg Gln Phe Leu
        100                 105                 110Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Ser Met Asn Thr Ala Ala Ile Ile
    115                 120                 125Glu Gly
130<210>19<211>122<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗P30抗原决定基的取代
 修饰的鼠IL5的说明<220><221>诱变因素<222>(30)..(50)<223>破伤风菌疫苗P30抗原决定基(SEQ ID NO：24)<220><221>相似的<222>(1)..(29)<223>与SEQ ID NO：12中的残基1-29相同<220><221>SIGNAL<222>(51)..(122)<223>与SEQ ID NO：12中的残基42-113相同<400>19Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu1               5                  10                  15Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Phe Asn Asn
         20                  25                  30Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His
     35                  40                  45Leu Glu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asp
 50                  55                  60Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Met Arg Leu Phe Gln Asn Leu Ser65                  70                  75                  80Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln Glu Lys Lys Cys Gly Glu Glu
             85                  90                  95Arg Arg Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly
        100                 105                 110Ser Met Asn Thr Ala Ala Ile Ile Glu Gly
    115                 120<210>20<211>128<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗P30抗原决定基的取代基
 修饰的鼠IL5的说明<220><221>诱变因素<222>(57)..(77)<223>破伤风菌疫苗P30抗原决定基(SEQ ID NO：24)<220><221>相似的<222>(1)..(56)<223>与SEQ ID NO：12中的残基1-56相同<220><221>相似的<222>(78)..(128)<223>与SEQ ID NO：12中的残基63-113相同<400>20Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu1               5                  10                  15Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
         20                  25                  30Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln
     35                  40                  45Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asp Gln Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe
 50                  55                  60Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Val Met Arg65                  70                  75                  80Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln Glu
             85                  90                  95Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr
        100                 105                 110Leu Gln Glu Phe Leu Gly Ser Met Asn Thr Ala Ala Ile Ile Glu Gly
    115                 120                 125<210>21<211>130<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗P30抗原决定基的取代基
 修饰的鼠IL5的说明<220><221>诱变因素<222>(108)..(128)<223>破伤风菌疫苗P30抗原决定基(SEQ ID NO：24)<220><221>相似的<222>(1)..(107)<223>与SEQ ID NO：12中的残基1-107相同<220><221>相似的<222>(129)..(130)<223>与SEQ ID NO：12中的残基112-113相同<400>21Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu1               5                  10                  15Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
         20                  25                  30Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln
     35                  40                  45Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asp Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Met
 50                  55                  60Arg Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln65                  70                  75                  80Glu Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp
             85                  90                  95Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Ser Met Asn Thr Phe Asn Asn Phe Thr
        100                 105                 110Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu
    115                 120                 125Glu Gly
130<210>22<211>139<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗P2和P30抗原决定基的取代基
 修饰的鼠IL5的说明<220><221>诱变因素<222>(84)..(98)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基(SEQ ID NO：23)<220><221>诱变因素<222>(117)..(137)<223>破伤风菌疫苗P30抗原决定基(SEQ ID NO：24)<220><221>相似的<222>(1)..(83)<223>与SEQ ID NO：12中的残基1-83相同<220><221>相似的<222>(99)..(116)<223>与SEQ ID NO：12中的残基90-109相同<220><221>相似的<222>(138)..(139)<223>与SEQ ID NO：12中的残基112-113相同<400>22Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu1               5                  10                  15Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
         20                  25                  30Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln
     35                  40                  45Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asp Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Met
 50                  55                  60Arg Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln65                  70                  75                  80Glu Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr
             85                  90                  95Glu Leu Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly
        100                 105                 110Ser Met Asn Thr Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val
    115                 120                 125Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Glu Gly
130                 135<210>23<211>15<212>PRT<213>破伤风杆菌<400>23Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1               5                  10                  15<210>24<211>21<212>PRT<213>破伤风杆菌<400>24Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser1               5                  10                  15Ala Ser His Leu Glu
         20<210>25<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)..(45)<220><223>人工序列：DNA编码其标记物的说明<400>25atg aaa cac caa cac caa cat caa cat caa cat caa cat caa caa    45Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln Gln1               5                  10                  15<210>26<211>15<212>PRT<213>人工序列<400>26Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln Gln1               5                  10                  15<210>27<211>381<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<220><221>CDS<222>(1)..(381)<220><221>突变<222>(262)..(306)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基<220><221>misc_feature<222>(1)..(261)<223>编码人IL5的氨基酸1-87的DNA<220><221>misc_feature<222>(307)..(378)<223>编码人IL5的氨基酸92-115的DNA<400>27atc ccc aca gaa att ccc aca agt gca ttg gtg aaa gag acc ttg gca   48Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15ctg ctt tct act cat cga act ctg ctg ata gcc aat gag act ctc cgg   96Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                  25                  30att cct gtt cct gta cat aaa aat cac caa ctg tgc act gaa gaa atc   144Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
     35                  40                  45ttt cag gga ata ggc aca ctc gag agt caa act gtg caa ggg ggt act   192Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr
 50                  55                  60gtg gaa aga cta ttc aaa aac ttg tcc tta ata aag aaa tac atc gat   240Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp65                  70                  75                  80ggc caa aaa aaa aag tgt gga cag tac atc aag gcc aac tcc aag ttc   288Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe
             85                  90                  95atc ggc atc acc gag ctg aga gta aac caa ttc cta gac tat ctg cag   336Ile Gly Ile Thr Glu Leu Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln
        100                 105                 110gag ttt ctt ggt gta atg aac acc gag tgg ata ata gaa agt tga       381Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser
    115                 120                 125<210>28<211>126<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<400>28Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                  25                  30Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
     35                  40                  45Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr
 50                  55                  60Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp65                  70                  75                  80Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe
             85                  90                  95Ile Gly Ile Thr Glu Leu Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln
        100                 105                 110Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser
    115                 120                 125<210>29<211>375<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代
 修饰的人IL5的说明<220><221>CDS<222>(1)..(375)<220><221>突变<222>(94)..(156)<223>破伤风菌疫苗P30抗原决定基<220><221>misc_feature<222>(1)..(93)<223>编码人IL5的氨基酸1-31的DNA<220><221>misc_feature<222>(157)..(372)<223>编码人IL5的氨基酸44-115的DNA<400>29atc ccc aca gaa att ccc aca agt gca ttg gtg aaa gag acc ttg gca   48Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala  1               5                  10                  15ctg ctt tct act cat cga act ctg ctg ata gcc aat gag act ctc ttc   96Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Phe
         20                  25                  30aac aac ttc acc gtg agc ttc tgg ctg cgc gtg cct aag gtg agc gcc   144Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala
     35                  40                  45agc cac ctg gag tgc act gaa gaa atc ttt cag gga ata ggc aca ctc   192Ser His Leu Glu Cys Thr Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu
 50                  55                  60gag agt caa act gtg caa ggg ggt act gtg gaa aga cta ttc aaa aac   240Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn65                  70                  75                  80ttg tcc tta ata aag aaa tac atc gat ggc caa aaa aaa aag tgt gga   288Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly
             85                  90                  95gaa gaa aga cgg aga gta aac caa ttc cta gac tat ctg cag gag ttt   336Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe
        100                 105                 110ctt ggt gta atg aac acc gag tgg ata ata gaa agt tga               375Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser
    115                 120<210>30<211>124<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<400>30Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Phe
         20                  25                  30Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala
     35                  40                  45Ser His Leu Glu Cys Thr Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu
 50                  55                  60Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn65                  70                  75                  80Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly
             85                  90                  95Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe
        100                 105                 110Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser
    115                 120<210>31<211>393<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<220><221>CDS<222>(1)..(393)<220><221>突变<222>(175)..(237)<223>破伤风菌疫苗P30抗原决定基<220><221>misc_feature<222>(1)..(174)<223>编码人IL5的氨基酸1-58的DNA<220><221>misc_feature<222>(238)..(390)<223>编码人IL5的氨基酸65-115的DNA<400>31atc ccc aca gaa att ccc aca agt gca ttg gtg aaa gag acc ttg gca   48Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15ctg ctt tct act cat cga act ctg ctg ata gcc aat gag act ctc cgg   96Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                  25                  30att cct gtt cct gta cat aaa aat cac caa ctg tgc act gaa gaa atc   144Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
     35                  40                  45ttt cag gga ata ggc aca ctc gag agt caa ttc aac aac ttc acc gtg   192Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Phe Asn Asn Phe Thr Val
 50                  55                  60agc ttc tgg ctg cgc gtg cct aag gtg agc gcc agc cac ctg gag gtg   240Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Val65                  70                  75                  80gaa aga cta ttc aaa aac ttg tcc tta ata aag aaa tac atc gat ggc   288Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly
             85                  90                  95caa aaa aaa aag tgt gga gaa gaa aga cgg aga gta aac caa ttc cta   336Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe Leu
        100                 105                 110gac tat ctg cag gag ttt ctt ggt gta atg aac acc gag tgg ata ata   384Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile
    115                 120                 125gaa agt tga                                                       393Glu Ser
130<210>32<211>130<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<400>32Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                  25                  30Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
     35                  40                  45Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Phe Asn Asn Phe Thr Val
 50                  55                  60Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Val65                  70                  75                  80Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly
             85                  90                  95Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe Leu
        100                 105                 110Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile
    115                 120                 125Glu Ser
130<210>33<211>375<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<220><221>CDS<222>(1)..(375)<220><221>突变<222>(175)..(219)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基<220><221>misc_feature<222>(1)..(174)<223>编码人IL5的氨基酸1-58的DNA<220><221>misc_feature<222>(220)..(372)<223>编码人IL5的氨基酸65-115的DNA<400>33atc ccc aca gaa att ccc aca agt gca ttg gtg aaa gag acc ttg gca   48Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15ctg ctt tct act cat cga act ctg ctg ata gcc aat gag act ctc cgg   96Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                  25                  30att cct gtt cct gta cat aaa aat cac caa ctg tgc act gaa gaa atc   144Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
     35                  40                  45ttt cag gga ata ggc aca ctc gag agt caa cag tac atc aag gcc aac   192Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Gln Tyr Ile Lys Ala Asn
 50                  55                  60tcc aag ttc atc ggc atc acc gag ctg gtg gaa aga cta ttc aaa aac   240Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn65                  70                  75                  80ttg tcc tta ata aag aaa tac atc gat ggc caa aaa aaa aag tgt gga   288Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly
             85                  90                  95gaa gaa aga cgg aga gta aac caa ttc cta gac tat ctg cag gag ttt   336Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe
        100                 105                 110ctt ggt gta atg aac acc gag tgg ata ata gaa agt tga               375Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser
    115                 120<210>34<211>124<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<400>34Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                  25                  30Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
     35                  40                  45Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Gln Tyr Ile Lys Ala Asn
 50                  55                  60Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn65                  70                  75                  80Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly
             85                  90                  95Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe
        100                 105                 110Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser
    115                 120<210>35<211>357<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<220><221>CDS<222>(1)..(357)<220><221>突变<222>(94)..(138)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基<220><221>misc_feature<222>(1)..(93)<223>编码人IL5的氨基酸1-31的DNA<220><221>misc_feature<222>(139)..(354)<223>编码人IL5的氨基酸44-115的DNA<400>35atc ccc aca gaa att ccc aca agt gca ttg gtg aaa gag acc ttg gca   48Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15ctg ctt tct act cat cga act ctg ctg ata gcc aat gag act ctc cag   96Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Gln
         20                  25                  30tac atc aag gcc aac tcc aag ttc atc ggc atc acc gag ctg tgc act   144Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Thr
     35                  40                  45gaa gaa atc ttt cag gga ata ggc aca ctc gag agt caa act gtg caa   192Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln
 50                  55                  60ggg ggt act gtg gaa aga cta ttc aaa aac ttg tcc tta ata aag aaa   240Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys65                  70                  75              80tac atc gat ggc caa aaa aaa aag tgt gga gaa gaa aga cgg aga gta   288Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val
             85                  90                  95aac caa ttc cta gac tat ctg cag gag ttt ctt ggt gta atg aac acc   336Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr
        100                 105                 110gag tgg ata ata gaa agt tga                                       357Glu Trp Ile Ile Glu Ser
    115<210>36<211>118<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<400>36Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Gln
         20                  25                  30Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Thr
     35                  40                  45Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln
 50                  55                  60Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys65                  70                  75                  80Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val
             85                  90                  95Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr
        100                 105                 110Glu Trp Ile Ile Glu Ser
    115<210>37<211>375<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<220><221>CDS<222>(1)..(375)<220><221>突变<222>(256)..(300)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基<220><221>misc_feature<222>(1)..(255)<223>编码人IL5的氨基酸1-85的DNA<220><221>misc_feature<222>(301)..(372)<223>编码人IL5的氨基酸92-115的DNA<400>37atc ccc aca gaa att ccc aca agt gca ttg gtg aaa gag acc ttg gca   48Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15ctg ctt tct act cat cga act ctg ctg ata gcc aat gag act ctc cgg   96Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                  25                  30att cct gtt cct gta cat aaa aat cac caa ctg tgc act gaa gaa atc   144Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
     35                  40                  45ttt cag gga ata ggc aca ctc gag agt caa act gtg caa ggg ggt act   192Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr
 50                  55                  60gtg gaa aga cta ttc aaa aac ttg tcc tta ata aag aaa tac atc gat   240Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp65                  70                  75                  80ggc caa aaa aaa aag cag tac atc aag gcc aac tcc aag ttc atc ggc   288Gly Gln Lys Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
             85                  90                  95atc acc gag ctg aga gta aac caa ttc cta gac tat ctg cag gag ttt   336Ile Thr Glu Leu Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe
        100                 105                 110ctt ggt gta atg aac acc gag tgg ata ata gaa agt tga               375Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser
    115                 120<210>38<211>124<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<400>38Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                  25                  30Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
     35                  40                  45Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr
 50                  55                  60Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp65                  70                  75                  80Gly Gln Lys Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
             85                  90                  95Ile Thr Glu Leu Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe
        100                 105                 110Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser
    115                 120<210>39<211>399<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<220><221>CDS<222>(1)..(399)<220><221>突变<222>(262)..(324)<223>破伤风菌疫苗P30抗原决定基<220><221>misc_feature<222>(1)..(261)<223>编码人IL5的氨基酸1-87的DNA<220><221>misc_feature<222>(325)..(396)<223>编码人IL5的氨基酸92-115的DNA<400>39atc ccc aca gaa att ccc aca agt gca ttg gtg aaa gag acc ttg gca   48Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15ctg ctt tct act cat cga act ctg ctg ata gcc aat gag act ctc cgg   96Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                  25                  30att cct gtt cct gta cat aaa aat cac caa ctg tgc act gaa gaa atc   144Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
     35                  40                  45ttt cag gga ata ggc aca ctc gag agt caa act gtg caa ggg ggt act   192Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr
 50                  55                  60gtg gaa aga cta ttc aaa aac ttg tcc tta ata aag aaa tac atc gat   240Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp65                  70                  75                  80ggc caa aaa aaa aag tgt gga ttc aac aac ttc acc gtg agc ttc tgg   288Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp
             85                  90                  95ctg cgc gtg cct aag gtg agc gcc agc cac ctg gag aga gta aac caa   336Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Val Asn Gln
        100                 105                 110ttc cta gac tat ctg cag gag ttt ctt ggt gta atg aac acc gag tgg   384Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp
    115                 120                 125ata ata gaa agt tga                                               399Ile Ile Glu Ser
130<210>40<211>132<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代
 修饰的人IL5的说明<400>40Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                  25                  30Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
     35                 40                   45Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr
 50                  55                  60Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp65                  70                  75                  80Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp
             85                  90                  95Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Val Asn Gln
        100                 105                 110Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp
    115                 120                 125Ile Ile Glu Ser
130<210>41<211>393<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<220><221>CDS<222>(1)..(393)<220><221>突变<222>(256)..(318)<223>破伤风菌疫苗P30抗原决定基<220><221>misc_feature<222>(1)..(255)<223>编码人IL5的氨基酸1-85的DNA<220><221>misc_feature<222>(319)..(390)<223>编码人IL5的氨基酸92-115的DNA<400>41atc ccc aca gaa att ccc aca agt gca ttg gtg aaa gag acc ttg gca   48Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15ctg ctt tct act cat cga act ctg ctg ata gcc aat gag act ctc cgg   96Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                  25                  30att cct gtt cct gta cat aaa aat cac caa ctg tgc act gaa gaa atc   144Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
     35                  40                  45ttt cag gga ata ggc aca ctc gag agt caa act gtg caa ggg ggt act   192Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr
 50                  55                  60gtg gaa aga cta ttc aaa aac ttg tcc tta ata aag aaa tac atc gat   240Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp65                  70                  75                  80ggc caa aaa aaa aag ttc aac aac ttc acc gtg agc ttc tgg ctg cgc   288Gly Gln Lys Lys Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg
             85                  90                  95gtg cct aag gtg agc gcc agc cac ctg gag aga gta aac caa ttc cta   336Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Val Asn Gln Phe Leu
        100                 105                 110gac tat ctg cag gag ttt ctt ggt gta atg aac acc gag tgg ata ata   384Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile
    115                 120                 125gaa agt tga                                                       393Glu Ser
130<210>42<211>130<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<400>42Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                  25                  30Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
     35                  40                  45Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr
 50                  55                  60Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp65                  70                  75                  80Gly Gln Lys Lys Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg
             85                  90                  95Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Val Asn Gln Phe Leu
        100                 105                 110Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile
    115                 120                 125Glu Ser
130<210>43<211>444<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<220><221>CDS<222>(1)..(444)<220><221>突变<222>(262)..(306)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基<220><221>突变<222>(307)..(369)<223>破伤风菌疫苗P30抗原决定基<220><221>misc_feature<222>(1)..(261)<223>编码人IL5的氨基酸1-87的DNA<220><221>misc_feature<222>(370)..(441)<223>编码人IL5的氨基酸92-115的DNA<400>43atc ccc aca gaa att ccc aca agt gca ttg gtg aaa gag acc ttg gca   48Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15ctg ctt tct act cat cga act ctg ctg ata gcc aat gag act ctc cgg   96Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                  25                  30att cct gtt cct gta cat aaa aat cac caa ctg tgc act gaa gaa atc   144Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
     35                  40                  45ttt cag gga ata ggc aca ctc gag agt caa act gtg caa ggg ggt act   192Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr
 50                  55                  60gtg gaa aga cta ttc aaa aac ttg tcc tta ata aag aaa tac atc gat   240Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp65                  70                  75                  80ggc caa aaa aaa aag tgt gga cag tac atc aag gcc aac tcc aag ttc   288Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe
             85                  90                  95atc ggc atc acc gag ctg ttc aac aac ttc acc gtg agc ttc tgg ctg   336Ile Gly Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu
        100                 105                 110cgc gtg cct aag gtg agc gcc agc cac ctg gag aga gta aac caa ttc   384Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Val Asn Gln Phe
    115                 120                 125cta gac tat ctg cag gag ttt ctt ggt gta atg aac acc gag tgg ata   432Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile
130                 135                 140ata gaa agt tga                                                   444Ile Glu Ser145<210>44<211>147<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的人IL5的说明<400>44Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1               5                  10                  15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg
         20                  25                  30Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile
     35                  40                  45Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr
 50                  55                  60Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp65                  70                  75                  80Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe
             85                  90                  95Ile Gly Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu
        100                 105                 110Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Val Asn Gln Phe
    115                 120                 125Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile
130                 135                 140Ile Glu Ser145<210>45<211>375<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的鼠IL5的说明<220><221>CDS<222>(1)..(375)<220><221>突变<222>(256)..(300)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基<220><221>misc_feature<222>(1)..(255)<223>编码鼠IL5的氨基酸1-85的DNA<220><221>misc_feature<222>(301)..(375)<223>编码鼠IL5的氨基酸90-113的DNA<400>45atg gag att ccc atg agc aca gtg gtg aaa gag acc ttg aca cag ctg  48Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu  1               5                  10                  15tcc gct cac cga gct ctg ttg aca agc aat gag acg atg agg ctt cct   96Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
         20                  25                  30gtc cct act cat aaa aat cac cag cta tgc att gga gag atc ttt cag   144Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln
     35                  40                  45ggg cta gac ata ctg aag aat caa act gtc cgt ggg ggt acc gtg gaa   192Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu
 50                  55                  60atg cta ttc caa aac ctg tca tta ata aag aaa tac atc gat aga caa   240Met Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln65                  70                  75                  80aaa gag aag tgt ggc cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggt   288Lys Glu Lys Cys Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
             85                  90                  95atc acc gag ctg agg acg agg cag ttc ctg gat tat ctg cag gag ttc   336Ile Thr Glu Leu Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe
        100                 105                 110ctt ggt gtg atg agt aca gag tgg gca atg gaa ggc taa               375Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu Gly
    115                 120<210>46<211>124<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的鼠IL5的说明<400>46Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu1               5                  10                  15Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
         20                  25                  30Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln
     35                  40                  45Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu
 50                  55                  60Met Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln65                  70                  75                  80Lys Glu Lys Cys Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
             85                  90                  95Ile Thr Glu Leu Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe
        100                 105                 110Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu Gly
    115                 120<210>47<211>369<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的鼠IL5的说明<220><221>CDS<222>(1)..(369)<220><221>突变<222>(88)..(150)<223>破伤风菌疫苗P30抗原决定基<220><221>misc_feature<222>(1)..(87)<223>编码鼠IL5的氨基酸1-29的DNA<220><221>misc_feature<222>(151)..(366)<223>编码鼠IL5的氨基酸42-113的DNA<400>47atg gag att ccc atg agc aca gtg gtg aaa gag acc ttg aca cag ctg   48Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu1               5                  10                  15tcc gct cac cga gct ctg ttg aca agc aat gag acg atg ttc aac aac   96Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Phe Asn Asn
         20                  25                  30ttc acc gtg agc ttc tgg ctg cgc gtg ccc aag gtg agc gcc agc cac   144Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His
     35                  40                  45ctg gag tgc att gga gag atc ttt cag ggg cta gac ata ctg aag aat   192Leu Glu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn
 50                  55                  60caa act gtc cgt ggg ggt acc gtg gaa atg cta ttc caa aac ctg tca   240Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu Met Leu Phe Gln Asn Leu Ser65                  70                  75                  80tta ata aag aaa tac atc gat aga caa aaa gag aag tgt ggc gag gag   288Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln Lys Glu Lys Cys Gly Glu Glu
             85                  90                  95aga cgg agg acg agg cag ttc ctg gat tat ctg cag gag ttc ctt ggt   336Arg Arg Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly
        100                 105                 110gtg atg agt aca gag tgg gca atg gaa ggc taa                       369Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu Gly
    115                 120<210>48<211>122<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的鼠IL5的说明<400>48Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu1               5                  10                  15Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Phe Asn Asn
         20                  25                  30Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His
     35                  40                  45Leu Glu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn
 50                  55                  60Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu Met Leu Phe Gln Asn Leu Ser65                  70                  75                  80Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln Lys Glu Lys Cys Gly Glu Glu
             85                  90                  95Arg Arg Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly
        100                 105                 110Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu Gly
    115                 120<210>49<211>387<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的鼠IL5的说明<220><221>CDS<222>(1)..(387)<220><221>突变<222>(169)..(231)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基<220><221>misc_feature<222>(1)..(168)<223>编码鼠IL5的氨基酸1-56的DNA<220><221>misc_feature<222>(232)..(384)<223>编码鼠IL5的氨基酸63-113的DNA<400>49atg gag att ccc atg agc aca gtg gtg aaa gag acc ttg aca cag ctg   48Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu1               5                  10                  15tcc gct cac cga gct ctg ttg aca agc aat gag acg atg agg ctt cct   96Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
         20                  25                  30gtc cct act cat aaa aat cac cag cta tgc att gga gag atc ttt cag   144Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln
     35                  40                  45ggg cta gac ata ctg aag aat caa ttc aac aac ttc acc gtg agc ttc   192Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe
 50                  55                  60tgg ctg cgc gtg ccc aag gtg agc gcc agc cac ctg gag gtg gaa atg   240Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Val Glu Met65                  70                  75                  80cta ttc caa aac ctg tca tta ata aag aaa tac atc gat aga caa aaa   288Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln Lys
             85                  90                  95gag aag tgt ggc gag gag aga cgg agg acg agg cag ttc ctg gat tat   336Glu Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr
        100                 105                 110ctg cag gag ttc ctt ggt gtg atg agt aca gag tgg gca atg gaa ggc   384Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu Gly
    115                 120                 125taa                                                               387<210>50<211>128<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的鼠IL5的说明<400>50Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu1               5                  10                  15Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
         20                  25                  30Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln
     35                  40                  45Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe
 50                  55                  60Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Val Glu Met65                  70                  75                  80Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln Lys
             85                  90                  95Glu Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr
        100                 105                 110Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu Gly
    115                 120                 125<210>51<211>351<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的鼠IL5的说明<220><221>CDS<222>(1)..(351)<220><221>突变<222>(88)..(132)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基<220><221>misc_feature<222>(1)..(87)<223>编码鼠IL5的氨基酸1-29的DNA<220><221>misc_feature<222>(133)..(348)<223>编码鼠IL5的氨基酸42-113的DNA<400>51atg gag att ccc atg agc aca gtg gtg aaa gag acc ttg aca cag ctg   48Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu1               5                  10                  15tcc gct cac cga gct ctg ttg aca agc aat gag acg atg cag tac atc   96Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Gln Tyr Ile
         20                  25                  30aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggt atc acc gag ctg tgc att gga gag   144Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Ile Gly Glu
     35                  40                  45atc ttt cag ggg cta gac ata ctg aag aat caa act gtc cgt ggg ggt   192Ile Phe Gln Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln Thr Val Arg Gly Gly
 50                  55                  60acc gtg gaa atg cta ttc caa aac ctg tca tta ata aag aaa tac atc   240Thr Val Glu Met Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile65                  70                  75                  80gat aga caa aaa gag aag tgt ggc gag gag aga cgg agg acg agg cag   288Asp Arg Gln Lys Glu Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Thr Arg Gln
             85                  90                  95ttc ctg gat tat ctg cag gag ttc ctt ggt gtg atg agt aca gag tgg   336Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp
        100                 105                 110gca atg gaa ggc taa                                                351Ala Met Glu Gly
    115<210>52<211>116<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的鼠IL5的说明<400>52Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu1               5                  10                  15Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Gln Tyr Ile
         20                  25                  30Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Ile Gly Glu
     35                  40                  45Ile Phe Gln Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln Thr Val Arg Gly Gly
 50                  55                  60Thr Val Glu Met Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile65                  70                  75                  80Asp Arg Gln Lys Glu Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Thr Arg Gln
             85                  90                  95Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp
        100                 105                 110Ala Met Glu Gly
    115<210>53<211>369<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的鼠IL5的说明<220><221>CDS<222>(1)..(369)<220><221>突变<222>(250)..(294)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基<220><221>misc_feature<222>(1)..(249)<223>编码鼠IL5的氨基酸1-83的DNA<220><221>misc_feature<222>(295)..(366)<223>编码鼠IL5的氨基酸90-113的DNA<400>53atg gag att ccc atg agc aca gtg gtg aaa gag acc ttg aca cag ctg   48Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu1               5                  10                  15tcc gct cac cga gct ctg ttg aca agc aat gag acg atg agg ctt cct   96Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
         20                  25                  30gtc cct act cat aaa aat cac cag cta tgc att gga gag atc ttt cag   144Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln
     35                  40                  45ggg cta gac ata ctg aag aat caa act gtc cgt ggg ggt acc gtg gaa   192Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu
 50                  55                  60atg cta ttc caa aac ctg tca tta ata aag aaa tac atc gat aga caa   240Met Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln65                  70                  75                  80aaa gag aag cag tac atc aag gcc aac tcc aag ttc atc ggc atc acc   288Lys Glu Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr
             85                  90                  95gag ctg agg acg agg cag ttc ctg gat tat ctg cag gag ttc ctt ggt   336Glu Leu Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly
        100                 105                 110gtg atg agt aca gag tgg gca atg gaa ggc taa                       369Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu Gly
    115                 120<210>54<211>122<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的鼠IL5的说明<400>54Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu1               5                  10                  15Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
         20                  25                  30Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln
     35                  40                  45Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu
 50                  55                  60Met Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln65                  70                  75                  80Lys Glu Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr
             85                  90                  95Glu Leu Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly
        100                 105                 110Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu Gly
    115                 120<210>55<211>393<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的鼠IL5的说明<220><221>CDS<222>(1)..(393)<220><221>突变<222>(256)..(318)<223>破伤风菌疫苗P30抗原决定基<220><221>misc_feature<222>(1)..(255)<223>编码鼠IL5的氨基酸1-85的DNA<220><221>misc_feature<222>(319)..(390)<223>编码鼠IL5的氨基酸90-113的DNA<400>55atg gag att ccc atg agc aca gtg gtg aaa gag acc ttg aca cag ctg   48Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu1               5                  10                  15tcc gct cac cga gct ctg ttg aca agc aat gag acg atg agg ctt cct   96Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
         20                  25                  30gtc cct act cat aaa aat cac cag cta tgc att gga gag atc ttt cag   144Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln
     35                  40                  45ggg cta gac ata ctg aag aat caa act gtc cgt ggg ggt acc gtg gaa   192Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu
 50                  55                  60atg cta ttc caa aac ctg tca tta ata aag aaa tac atc gat aga caa   240Met Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln65                  70                  75                  80aaa gag aag tgt ggc ttc aac aac ttc acc gtg agc ttc tgg ctg cgc   288Lys Glu Lys Cys Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg
             85                  90                  95gtg ccc aag gtg agc gcc agc cac ctg gag agg acg agg cag ttc ctg   336Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Thr Arg Gln Phe Leu
        100                 105                 110gat tat ctg cag gag ttc ctt ggt gtg atg agt aca gag tgg gca atg   384Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met
    115                 120                 125gaa ggc taa                                                       393Glu Gly
130<210>56<211>130<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的鼠IL5的说明<400>56Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu1               5                  10                  15Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
         20                  25                  30Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln
     35                  40                  45Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu
 50                  55                  60Met Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln 65                  70                  75                  80Lys Glu Lys Cys Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg
             85                  90                  95Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Thr Arg Gln Phe Leu
        100                 105                 110Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met
    115                 120                 125Glu Gly
130<210>57<211>387<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的鼠IL5的说明<220><221>CDS<222>(1)..(387)<220><221>突变<222>(250)..(312)<223>破伤风菌疫苗P30抗原决定基<220><221>misc_feature<222>(1)..(249)<223>编码鼠IL5的氨基酸1-83的DNA<220><221>misc_feature<222>(313)..(384)<223>编码鼠IL5的氨基酸90-113的DNA<400>57atg gag att ccc atg agc aca gtg gtg aaa gag acc ttg aca cag ctg   48Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu1               5                  10                  15tcc gct cac cga gct ctg ttg aca agc aat gag acg atg agg ctt cct   96Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
         20                  25                  30gtc cct act cat aaa aat cac cag cta tgc att gga gag atc ttt cag   144Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln
     35                  40                  45ggg cta gac ata ctg aag aat caa act gtc cgt ggg ggt acc gtg gaa   192Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu
 50                  55                  60atg cta ttc caa aac ctg tca tta ata aag aaa tac atc gat aga caa   240Met Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln65                  70                  75                  80aaa gag aag ttc aac aac ttc acc gtg agc ttc tgg ctg cgc gtg ccc   288Lys Glu Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro
             85                  90                  95aag gtg agc gcc agc cac ctg gag agg acg agg cag ttc ctg gat tat   336Lys ValSer Ala Ser His Leu Glu Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr
       100                 105                 110ctg cag gag ttc ctt ggt gtg atg agt aca gag tgg gca atg gaa ggc   384Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu Gly
    115                 120                 125taa                                                               387<210>58<211>128<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的鼠IL5的说明<400>58Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu  1               5                  10                  15Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
         20                  25                  30Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln
     35                  40                  45Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu
 50                  55                  60Met Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln65                  70                  75                  80Lys Glu Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro
             85                  90                  95Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr
        100                 105                 110Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu Gly
    115                 120                 125<210>59<211>438<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的鼠IL5的说明<220><221>CDS<222>(1)..(438)<220><221>突变<222>(256)..(300)<223>破伤风菌疫苗P2抗原决定基<220><221>突变<222>(301)..(363)<223>破伤风菌疫苗P30抗原决定基<220><221>misc_feature<222>(1)..(255)<223>编码鼠IL5的氨基酸1-85的DNA<220><221>misc_feature<222>(364)..(435)<223>编码鼠IL5的氨基酸90-113的DNA<400>59atg gag att ccc atg agc aca gtg gtg aaa gag acc ttg aca cag ctg   48Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu1               5                  10                  15tcc gct cac cga gct ctg ttg aca agc aat gag acg atg agg ctt cct   96Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
         20                  25                  30gtc cct act cat aaa aat cac cag cta tgc att gga gag atc ttt cag   144Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln
     35                  40                  45ggg cta gac ata ctg aag aat caa act gtc cgt ggg ggt acc gtg gaa   192Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu
 50                  55                  60atg cta ttc caa aac ctg tca tta ata aag aaa tac atc gat aga caa   240Met Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln65                  70                  75                  80aaa gag aag tgt ggc cag tac atc aag gcc aac tcc aag ttc atc ggc   288Lys Glu Lys Cys Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
             85                  90                  95atc acc gag ctg ttc aac aac ttc acc gtg agc ttc tgg ctg cgc gtg   336Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val
        100                 105                 110ccc aag gtg agc gcc agc cac ctg gag agg acg agg cag ttc ctg gat   384Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp
    115                 120                 125tat ctg cag gag ttc ctt ggt gtg atg agt aca gag tgg gca atg gaa   432Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu
130                 135                 140ggc taa                                                           438Gly145<210>60<211>145<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列：被具有破伤风菌疫苗抗原决定基的取代基
 修饰的鼠IL5的说明<400>60Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu1               5                  10                  15Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro
         20                  25                  30Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln
     35                  40                  45Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu
 50                  55                  60Met Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln65                  70                  75                  80Lys Glu Lys Cys Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
             85                  90                  95Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val
        100                 105                 110Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp
    115                 120                 125Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu
130                 135                 140Gly145<210>61<211>57<212>DNA<213>智人<220><221>CDS<222>(1)..(57)<223>编码自然人IL5前导序列的DNA<400>61atg agg atg ctt ctg cat ttg agt ttg ctg gct ctt gga gct gcc tac   48Met Arg Met Leu Leu His Leu Ser Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Tyr1               5                  10                  15gtg tat gcc                                                       57Val Tyr Ala<210>62<211>19<212>PRT<213>智人<400>62Met Arg Met Leu Leu His Leu Ser Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Tyr1               5                  10                  15Val Tyr Ala<210>63<211>60<212>DNA<213>Mus musculus<220><221>CDS<222>(1)..(60)<223>编码自然鼠IL5前导序列的DNA<400>63atg aga agg atg ctt ctg cac ttg agt gtt ctg act ctc agc tgt gtc  48Met Arg Arg Met Leu Leu His Leu Ser Val Leu Thr Leu Ser Cys Val1               5                  10                  15tgg gcc act gcc                                                  60Trp Ala Thr Ala
         20<210>64<211>19<212>PRT<213>Mus musculus<400>64Met Arg Arg Met Leu Leu His Leu Ser Val Leu Thr Leu Ser Cys Val1               5                  10                  15Trp Ala Thr Ala
         20<210>65<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列：混杂T辅助性抗原决定基<400>65Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala1               5                  1023058 PC 1

Claims (68)

1.一种用于在包括人类在内的动物中体内下调节白细胞介素5(IL5)活性的方法，该方法包括对动物的免疫***有效地呈递免疫学上有效量的：-   至少一种已对其进行了配制的IL5多肽或它的亚序列，从而在用IL5多肽或它的亚序列免疫动物时可诱导产生抗IL5多肽的抗体，和/或-   至少一种IL5类似物，其中在IL5的氨基酸序列中引入了至少一个修饰，这样
做的结果是用类似物免疫动物可诱导产生抗IL5多肽的抗体。
2.根据权利要求1中所述的方法，其中呈递一种IL5类似物，该类似物带有至少一个IL5氨基酸序列的修饰。
3.根据权利要求2中所述的方法，其中修饰的结果是有显著量的IL5 B细胞表位实质片段得以保留，而且
-   引入至少一个外源T-辅助淋巴细胞表位(TH表位)，和/或
-   引入至少一个第一组分，它影响被修饰的分子靶向抗原呈递细胞(APC)
或B-淋巴细胞，和/或
-   引入至少一个第二组分，它刺激免疫***，和/或
-   引入至少一个第三个组分，它最佳化被修饰IL5多肽呈递给免疫***。
4.根据权利要求3中所述的方法，其中所述的修饰包括通过共价或非共价地结合到IL5或其亚序列中的合适的化学基团，引入外源的TH表位和/或第一和/或第二和/或第三组分作为侧链基团。
5.根据权利要求3或4中所述的方法，其中所述的修饰包括氨基酸的替换和/或缺失和/或***和/或添加。
6.根据权利要求5中所述的方法，其中所述的修饰导致一种融合多肽的供应。
7.根据权利要求5或6中所述的方法，其中氨基酸的替换和/或缺失和/或***和/或添加的引入导致IL5的总体四级结构的基本保留。
8.根据权利要求2-7中的任一所述的方法，其中所述的修饰包括至少一个IL5 B-细胞表位的重复和/或引入半抗原。
9.根据权利要求3-8中的任一所述的方法，其中所述的外源T-细胞表位在动物中是免疫显性的。
10.根据权利要求3-9中的任一所述的方法，其中所述的外源T-细胞表位是混杂型的。
11.根据权利要求10中所述的方法，其中至少一个外源T-细胞表位选自天然的混杂型T-细胞表位和人工的MHC-II结合肽序列。
12.根据权利要求11中所述的方法，其中天然的T-细胞表位选自破伤风类毒素表位诸如P2或P30、白喉类毒素表位、流感病毒血凝素表位和P.falciparum CS表位。
13.根据权利要求3-12中的任一所述的方法，其中所述的第一组分是对B-淋巴细胞特异表面抗原或对APC特异表面抗原基本上特异的结合伙伴，在B-淋巴细胞上或者在APC上有针对这样的特异表面抗原，诸如半抗原或碳水化合物的受体。
14.根据权利要求3-13中的任一所述的方法，其中所述的第二组分选自细胞素、激素和热休克蛋白质。
15.根据权利要求6中所述的方法，其中所述的细胞素选自干扰素-γ(INF-γ)、Flt3L、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素13(IL-13)、白细胞介素15(IL-15)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，以及其中的热休克蛋白质选自HSP70、HSP90、HSC70、GRP94和肌钙网蛋白(CRT)或者是上述任何热休克蛋白质的一个有效部分。
16.根据权利要求3-15中的任一所述的方法，其中所述的第三组分为脂质性质，诸如棕榈酰基、豆蔻基、法呢基、叶香基-叶香基、GPI-锚钩和N-脂酰甘油二酯基。
17.根据前述权利要求中的任一所述的方法，其中的IL5多肽在回环1-3的至少一个回环或者在螺旋D的C-末端的氨基酸残基中已被修饰，所述回环和所述螺旋D与图3中表示的人和鼠的IL5之回环和螺旋D相对应。
18.根据权利要求17中所述的方法，其中IL5多肽是人IL5多肽。
19.根据权利要求18中所述的方法，其中人IL5多肽通过用至少一个相同或不同长度的氨基酸序列替换SEQ ID NO：1中的至少一个氨基酸序列而被修饰，从而产生一个外源TH表位，其中被替换的氨基酸残基选自残基87-90、残基88-91、残基32-43、残基33-43、残基59-64、残基86-91和残基110-113。
20.根据前述权利要求中的任一所述的方法，其中将至少两个拷贝的IL5多肽、其亚序列或者被修饰IL5多肽，共价或非共价地连接到能够有效地呈递多拷贝抗原性决定基的载体分子，实现所述的呈递给免疫***。
21.根据前述权利要求中之任一所述的方法，其中所述的IL5多肽、其亚序列或者被修饰IL5多肽已与佐剂配制，该佐剂促进对自体抗原之自体耐受的突破。
22.根据权利要求21中所述的方法，其中所述的佐剂选自免疫靶向佐剂；免疫调节佐剂诸如毒素，细胞素和分枝杆菌的衍生物；油性配制物；聚合物；形成微团佐剂；皂苷；免疫刺激复合物基质(ISCOM基质)；颗粒物；DDA；铝佐剂；DNA佐剂；γ-菊粉和胶囊化佐剂。
23.根据前述权利要求中的任一所述的方法，其中所述的有效量的IL5多肽或IL5类似物是选自下列途径之一施用给动物的：非肠道途径诸如真皮内、真皮下、皮内、皮下和肌内途径；腹膜途径；口途径；颊途径；舌下途径；硬膜外途径；脊柱途径；***途径和颅内途径。
24.根据权利要求23中所述的方法，其中所述的有效量是介于0.5μg和2000μg间的IL5多肽、其亚序列或其类似物。
25.根据权利要求23或24中所述的方法，其中包括每年施用IL5的多肽或类似物至少一次，诸如每年至少2次、至少3次、至少4次、至少6次和至少12次。
26.根据权利要求23-25中的任一所述的方法，其中的IL5的多肽或类似物被装入事实上的***装置内(VLN)。
27.根据权利要求1-20中的任一所述的方法，其中将编码被修饰IL5的一种或多种核酸引入到动物细胞中，从而获得引入了一种或多种核酸的细胞的体内表达，实现将被修饰IL5呈递给免疫***。
28.根据权利要求27中所述的方法，其中所引入的一种或多种核酸是选自：裸露的DNA，与带电荷或不带电荷的脂质配制在一起的DNA，配制于脂质体中的DNA，包含在病毒性载体中的DNA，与转染促进蛋白质或多肽配制在一起的DNA，与靶向蛋白质或多肽配制在一起的DNA，与钙沉淀剂类配制在一起的DNA，与惰性载体分子偶联的DNA，用胶囊包于壳多糖或脱乙酰壳多糖中的DNA以及与佐剂诸如在权利要求22中限定的佐剂配制在一起的DNA。
29.根据权利要求27或28中所述的方法，其中所述的核酸是动脉内、静脉内施用，或者以在权利要求23中限定的方式施用。
30.根据权利要求28或29中所述的方法，其中一种或多种核酸被装入VLN装置内。
31.根据权利要求28-30中的任一所述的方法，其中包括每年施用核酸至少一次，诸如每年至少2次、至少3次、至少4次、至少6次和至少12次。
32.一种用于治疗和/或预防和/或改善以嗜酸性粒细胞增多为特征的哮喘或其它慢性***反应疾病的方法，该方法包括：根据权利要求1-31中的任一所述的方法，下调节IL5的活性至这样的程度，以至于位于病灶处的嗜酸性粒细胞的数目***性地或者局部地被显著地减小，诸如减小至少20％。
33.一种源自动物的IL5多肽的IL5类似物，其中引入了修饰，修饰的结果是用类似物免疫动物时诱导产生抗IL5多肽的抗体。
34.一种根据权利要求33中所述的IL5类似物，其中所述的修饰，正如在权利要求1-22中的任一权利要求所限定之。
35.一种致免疫组合物，它包含一种致免疫有效量的动物的自体IL5多肽，该IL5多肽与一种免疫学可接受的佐剂一起配制，突破动物对IL5多肽的自体耐受，该组合物还进一步地包含一种药学和免疫学可接受的载体和/或媒介物。
36.一种致免疫组合物，它包含一种根据权利要求33或34中所述的致免疫有效量的IL5类似物，该组合物还进一步地包含一种药学和免疫学可接受的载体和/或媒介物以及任选地一种佐剂。
37.一种根据权利要求35或36中所述的致免疫组合物，其中所述的佐剂选自权利要求22中所述的佐剂。
38.一种编码根据权利要求33或34中所述的IL5类似物的核酸片段。
39.一种携带根据权利要求38中所述的核酸片段的载体。
40.根据权利要求39中所述的载体，它具有自主复制能力。
41.根据权利要求39或40中所述的载体，它选自质粒、噬菌体、粘粒、微型染色体和病毒。
42.根据权利要求39-41中的任一所述的载体，按5’→3’方向和采用有效连接，其中包含：一个用于驱动根据权利要求38中所述的核酸片段表达的启动子，任选地一个编码赋予多肽片段分泌能力或整合到膜内能力的前导序列的核酸序列，根据权利要求38中所述的核酸片段以及任选地一个终止子。
43.根据权利要求39-42中的任一所述的载体，当将其引入到宿主细胞中时，会被整合到宿主细胞基因组中。
44.根据权利要求39-42中的任一所述的载体，当将其引入到宿主细胞中时，它不能够被整合到宿主细胞基因组中。
45.根据权利要求39-44中的任一所述的载体，其中所述的启动子驱动在真核细胞中和/或在原核细胞中的表达。
46.一种携带了权利要求39-45中的任一所述的载体的转化细胞。
47.根据权利要求46中所述的转化细胞，它具有复制根据权利要求38中所述的核酸片段的能力。
48.根据权利要求47中所述的转化细胞，它选自细菌、酵母、原生动物的微生物体，或者是源自多细胞生物体的细胞，多细胞生物体选自真菌、昆虫细胞诸如S2或SF细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。
49.根据权利要求48中所述的转化细胞，它是埃希氏菌属、芽孢杆菌属、沙门氏菌属或分枝杆菌属的细菌。
50.根据权利要求52中所述的转化细胞，它选自大肠杆菌细胞、非致病性的分枝杆菌细胞诸如牛分枝杆菌BCG。
51.根据权利要求46-50中的任一所述的转化细胞，它表达根据权利要求38中所述的核酸片段。
52.根据权利要求55中所述的转化细胞，它分泌或在其表面携带根据权利要求33或34中所述的IL5类似物。
53.根据权利要求1-20中的任一所述的方法，其中所述的呈递给免疫***是通过施用非致病性的微生物体或病毒而实现的，所施用的微生物体或病毒携带了编码并表达IL5多肽或其类似物的核酸片段。
54.根据权利要求53中所述的方法，其中所述的病毒是一种无毒力的痘病毒诸如牛痘病毒。
55.根据权利要求54中所述的方法，其中所述的微生物体是一种细菌，诸如在权利要求49或50中所限定的一种细菌。
56.根据权利要求53-55中的任一所述的方法，其中非致病性微生物体或病毒是单一一次施用于动物。
57.一种用于诱导产生抗IL5抗体的组合物，该组合物包含：
-  一种根据权利要求38所述的核酸片段或者根据权利要求39-45中的任一所
述的载体，和
-  一种药学及免疫学可接受的载体和/或媒介物和/或佐剂。
58.根据权利要求57中所述的组合物，其中所述的核酸片段是根据权利要求28或30中所述予以配制。
59.一种稳定的细胞系，它携带有根据权利要求39-45中的任一所述的载体和表达根据权利要求38中所述的核酸片段，以及任选地，分泌或运送根据权利要求33或34中所述的IL5类似物至该稳定细胞系的表面。
60.一种用于制备根据权利要求46-52中之任一所述的细胞的方法，该方法包括用根据权利要求38中所述的核酸片段或者用根据权利要求39-45中的任一所述的载体转化宿主细胞。
61.一种用于鉴定被修饰IL5多肽的方法，该IL5多肽具有在一种动物中诱导抗未修饰IL5抗体的能力，其中的未修饰IL5多肽是一种自体蛋白质，该方法包括：
-  通过肽合成或者遗传工程技术手段，制备一组互不相同的被修饰IL5多肽，
   其中已在这种动物的IL5氨基酸序列中进行了氨基酸的添加、***、删除或
   替换，从而产生成组的氨基酸序列，其中含有对这种动物是外源的T-细胞
   表位；或者制备一组编码一组互不相同的被修饰IL5多肽的核酸片段，
-  测试组中成员诱导动物产生抗未修饰IL5抗体的能力，和
-  鉴定和任选地分离组中显著地诱导动物产生抗未修饰IL5抗体的成员，或
   者鉴定和任选地分离由核酸片段组中的成员编码的多肽的表达产物，其中的核
   酸片段在动物中显著地诱导产生抗未修饰IL5的抗体。
62.一种制备致免疫组合物的方法，该组合物含有至少一种能够在一种动物中诱导抗未修饰IL5抗体的被修饰IL5多肽，其中所述的未修饰IL5多肽是一种自体蛋白质，该方法包括：
-  通过肽合成或者遗传工程手段，制备一组互不相同的被修饰IL5多肽，其
   中已在动物的IL5氨基酸序列中进行了氨基酸的添加、***、删除或替换，从
   而在组中产生这样的氨基酸序列，其中含有对于该动物是外源的T-细胞表位，
-  测试组中成员诱导该种动物产生抗未修饰IL5抗体的能力，和
-  将组中一个或多个成员混合，在动物中显著地诱导产生与IL5反应的抗体，
   所述IL5是与药学及免疫学可接受的载体和/或媒介物结合，以及任选地与至
   少一种药学及免疫学可接受的佐剂结合。
63.根据权利要求61或62中所述的方法，其中所述的组中成员的制备包括：制备互不相同的核酸序列，每种核酸序列都是根据权利要求38中所述的核酸序列，将这些核酸序列***到合适的表达载体中，用这些载体转化合适的宿主细胞以及这些核酸序列的表达，任选地随后分离表达产物。
64.根据权利要求63中所述的方法，其中所述的核酸序列和/或载体的制备是通过分子扩增技术诸如PCR的帮助或者通过核酸合成的帮助实现的。
65.IL5或其亚序列在制备一种含有佐剂的致免疫组合物中的应用，该组合物用于下调节动物中的IL5活性。
66.IL5或其亚序列在制备一种含有佐剂的致免疫组合物中的应用，该组合物用于治疗、预防或改善哮喘或其它慢性***反应性疾病。
67.IL5类似物在制备一种任选地包含佐剂的致免疫组合物中的应用，该组合物用于下调节动物中的IL5活性。
68.IL5类似物在制备一种任选地包含佐剂的致免疫组合物中的应用，该组合物用于治疗、预防或改善哮喘或其它慢性***反应性疾病。
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