CN1946740A - 抗人腱生蛋白单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种抗人腱生蛋白单克隆抗体，其轻链和重链可变区序列分别是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。本发明还涉及所述单克隆抗体的能结合人腱生蛋白A (1－4)－D区域内的抗原性表位的蛋白水解片段，它的重组衍生物、缀合物及其能结合人腱生蛋白A (1－4)－D区域内的抗原性表位的相似功能性类似物。

Description

抗人腱生蛋白单克隆抗体
本发明涉及抗人腱生蛋白单克隆抗体、获得它们的方法及原料、所说抗体在表达腱生蛋白的肿瘤的诊断和治疗方法中的用途以及含有所述抗体并适于在医疗领域中应用的材料。
发明背景
肿瘤疗法的专一性通常成为决定治疗是否成功的限制因素。事实上，许多抗癌剂的毒性效果和低耐受性限制了它们的用途以及患者的生活质量。
毒性的降低与只针对癌细胞的治疗选择性直接相关。单克隆抗体是适于特异定位于肿瘤的理想工具，而且当它们与亲和素/生物素扩增体系联合时，可成为一种将活性分子定向于肿瘤位点的非常有效的方法。
腱生蛋白是一种胞外基质分子，其在胚胎发生期间、疤痕形成过程和肿瘤发生期间的成年组织中、以及新形成的血管中表达。在正常的成年组织中几乎没有腱生蛋白，而在许多实体肿瘤的基质中则有所表达，诸如胶质瘤(Burdon等，Cancer Res.，43：2796-2805，1983)、乳癌(Chiquet-Ehrisrnann等，1986)、肺癌(Natali等，Inti.J.Cancer，54：56-68，1989)、纤维肉瘤和鳞状细胞癌(Ramos，D.M.等，liltl.J.Cancer，75：680-687，1998)。腱生蛋白在胶质瘤中表达，但在相应的正常脑组织中则无表达。有关腱生蛋白的深入讨论，读者可参阅专利申请WO 92/04464，Wistar和相关文献。
基于专利申请EP 0 496 074，G.Paganelli等人已研发了一种被称为“三步预靶向”的方法用于肿瘤的全身和区域性治疗，其有关结果报道于以下文献中：Cremonesi，M.等，Eur.J.Nucl.Med.，26(2)：110-120，1999；Paganelli，G.等，Eur.J.Nucl.Med.，26(4)：348-357，1999；Paganelli，G.等，Cancer Biother.&Radiopharm.，16(3)：227-235，2001；Grana，C.等，Br.J.Cancer，86：207-212，2001。
有关此类型的癌症治疗方法的其它参考文献有：WO 94/04702和US 5,578,287。
三步预靶向治疗法，也以商标PAGRIT著称，其基础是依次静脉内施用生物素化抗腱生蛋白单克隆抗体、链霉亲和素和90Y-生物素，在施加链霉亲和素和90Y-生物素之前先分别加入亲和素和生物素化白蛋白(“追踪”步骤)，以降低抗体和链霉亲和素的循环水平。三步预靶向法的选择性是由于使用抗腱生蛋白单克隆抗体造成的。与针对于细胞表面抗原的靶向方式相比较，靶向于胞外基质分子的优势在于不受肿瘤细胞自身对抗原表达的调控的影响。为获得最佳的肿瘤对非肿瘤的生物分布比率，已确定了预靶向疗法的剂量、施用次数和“追踪”步骤。
Paganelli研究利用了获自48名成胶质细胞瘤(GBM)或恶性星细胞瘤(AA)患者的结果(Paganelli，G.，et al.，Eur.J.Nucl.Med.，26(4)：348-357，1999)，证明该疗法确实无毒性并且有初步的疗效，只是少数病例对链霉亲和素有过敏反应。事实上，治疗结束2个月后，25％的患者显现出肿瘤块缩小(全部有反应＝6％，部分反应＝11％，反应较小＝8％)，52％的患者维持稳定，总响应率为77％。
在许多预期存活期在6个月以下的这些患者中，对治疗的反应持续1年以上。
生物素化抗腱生蛋白抗体的作用是定位于肿瘤和介质中，通过生物素化的分子，亲和素和随后的90Y-生物素积聚，将放射性同位素直接导向肿瘤内部。抗腱生蛋白抗体已是以下专利和专利申请的对象：美国专利申请US 5,624,659，Duke University；JP 2219590，Rikagaku；WO 92/04464，Wistar；以及WO 03/072608，Sigma-Tau。
一种特别的抗腱生蛋白抗体被描述在下述文献中：Siri，A.等，Nucl.Acid Res.，19(3)：525-531，1991；Balza，E.，et al，FEBS 332：39-43，1993；而有关它的治疗用途可参阅：Riva，P.等，Acta Oncol.38(3)：351-9，1999；Riva，P.等，Cancer，80(12)：2733-42；1997；Riva，P.等，.Int.J.Cancer，5：7-13，1992。
在上述研究中用于产生所说抗体的克隆被命名为BC-2。申请者已证明克隆BC-2不适于工业开发，因为它产生一额外的非功能性轻链(可能来源于亲本骨髓瘤株系)，在大规模生产过程进行期间，此轻链的表达水平增加，阻碍了工业规模的抗体纯化。
因此，人们认识到需要有可在药用所需纯度水平上以工业化规模生产抗腱生蛋白单克隆抗体。
早先的专利申请WO 03/072608(申请者为Sigma Tau IndustrieFarmaceutiche Riunite S.p.A.)中描述了抗腱生蛋白抗体ST2146的产生，该抗体无额外的非功能性轻链，能识别与抗体BC-4共享的抗原性表位，所述的抗体BC-4也被非功能性轻链污染了。
本发明的对象抗体ST2485识别与BC-2所识别表位部分共享的表位，因而位于同一蛋白区域内。此区域在多种肿瘤组织中大量表达。因此，获得特异于此区域的均一单克隆抗体用于癌症诊断或靶向是非常重要的。
此外，本发明证实，除了ST2146之外，抗体ST2485也具有结合腱生蛋白的优点，因此可用于联合使用这两种抗体的预靶向方法中。
                    发明简述
现已发现抗人腱生蛋白单克隆抗体解决了上述问题，因为它没有非功能性轻链，且在与另一抗腱生蛋白抗体联合使用时具有加和的优势。此抗体及其制备方法和治疗用途都是本发明的对象，尤其是用于制备治疗诸如肿瘤等以腱生蛋白的表达为特征的疾病的产品。
本发明涉及抗体和抗体片段，其可选地包含额外标记物和诊断剂，还涉及获得所述抗体和抗体片段的方法、含有所说抗体及其片段的药物组合物和利用它们进行诊断和治疗的方法，以及用于执行所说方法的试剂盒。
本发明还涉及编码所说抗体或其片段的DNA、含有所述DNA的载体、含有所述载体的宿主细胞、由核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2编码的蛋白质、编码所述蛋白质及片段的DNA、特异互补决定区(CDR)以及含所述CDR的蛋白质。具体而言，本发明的对象还包括产生所述单克隆抗体的杂交瘤。
作为本发明对象的抗体的特征在于分别如图17和18所示的轻链和重链SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的可变区序列。为简便起见，作为本发明对象的抗体将以名称ST2485表示。
此外，ST2485的片段或其嵌合或重组衍生物可在本发明范围内产生和应用。
此外，本发明的对象还包括能与人腱生蛋白A1-4-D区域内的抗原性表位结合的所说抗体的蛋白水解片段。在描述本发明的过程中，所谓的抗体片段指能结合人腱生蛋白C的A1-4-D区域内抗原性表位的那些片段。
依照本发明，所说的抗体或蛋白水解片段优选是生物素化的。
本发明的另一对象是产生抗体ST2485的杂交瘤细胞系，被称为cST2485。
该杂交瘤细胞系在2003年11月12日根据布达佩斯条约的规定被保藏在Centro di Biotecnologie Avanzate，Largo Rossana Benzi 10，Genoa，意大利，保藏号为PD03003。
此外，本发明的对象还包括抗体ST2485的重组衍生物，它可选地是生物素化的。具体而言，所说的重组衍生物优选那些其中小鼠恒定区被它的人对应物所取代的衍生物(Ferrer，C.等，J.Biotechnol.，52：51-60，1996)，或者其中的小鼠恒定区被诸如亲和素家族成员(PenIchet ML.，Manuel，L.，etal.，J.Immunol.，163：4421-4426，1999)、可用于刺激肿瘤定向免疫学效应器的生长因子(例如GCSF、GM-CSF)等生物学活性组分所取代的衍生物，或者其中的小鼠恒定区被药用活性组分所取代的衍生物，所说的药用活性组分有诸如超抗原、毒素、细胞因子或可用于增强抗肿瘤疗效的任何其它蛋白质(DiMassimo，AM等，British J.Cancer，75(6)：822-828，1997；Parente D.等，Anticancer Research，17(6A)：4073-4074，1997)。获取所述衍生物的方法是本领域专家众所周知的。
本发明的另一对象在于抗体ST2485的缀合衍生物，可可选地是生物素化的。
具体而言，缀合衍生物优选其中生物学活性组分通过常规***方式与抗体结合的那些衍生物。生物学活性化合物的实例有亲和素家族成员、可用于刺激定向肿瘤的免疫学效应器的生长因子(例如G-CSF、GM-CSF)，或者其中的小鼠恒定区被药用活性组分所取代的那些衍生物，诸如超级抗原、毒素、细胞因子或可用于增强抗肿瘤疗效的任何其它蛋白质、抗肿瘤药物和放射性同位素。
本发明更进一步的目标在于利用所述抗体或其衍生物制备在癌症放射免疫疗法中有效的药用产品，该放射免疫疗法优选依照所谓三步预靶向方法(也以商标PAGRITO为人所知)进行，包括给患有表达腱生蛋白的癌症的患者施用抗体ST2485或其水解片段，优选经生物素化的抗体或片段。
将作为本发明目标的抗体的重组衍生物及缀合物用于癌症治疗是有优势的。因此，利用所述抗体及其片段或衍生物制备治疗表达腱生蛋白的肿瘤的药物构成本发明的又一个目标。
为了进行放射免疫治疗，描述了两种治疗用试剂盒，一种是全身性的，另一种是局部性使用的。这些试剂盒的已知商标为PAGRIT。所述的全身用试剂盒包含5个小瓶，其中小瓶1含有依照本发明的生物素化抗体或其片段或衍生物；小瓶2中含有亲和素；小瓶3中含有链霉亲和素；小瓶4中含有生物素化人白蛋白；以及小瓶5中含有生物素DOTA(或WO 02/066075中所述的生物素的衍生物)。局部用试剂盒包括3个小瓶，相当于全身用试剂盒的小瓶1、2和5。将小瓶制备成适于对待治疗的受试者、优选人受试者进行注射的形式。为了进行放射免疫治疗，描述了一种称为IART(针对放射性核素疗法的外科手术期中亲和素化作用(Intraoperative Avidination for RadionuclideTreatment))的方法，其基础是对经历外科手术切除肿块的患者辅以本发明制剂的手术期中治疗，本发明制剂可单独施用或与PAGRITX试剂盒的其它组分联合使用。
含生物素化抗体或其片段的特殊的容器，优选为适于注射的小瓶形式，也构成本发明的一个对象。
依照本发明的某一实施方案，在治疗用试剂盒中，生物素化抗体与其它抗腱生蛋白抗体组合，所述抗体优选针对于该蛋白质的类EGF区。或者，该生物素化抗体可与特异于肿瘤的其它抗体偶联。有关此类型方法的大体描述可参阅文献EP 0 496 074，European Journal ofNuclear Medicine Vol.26，No4；April，1999；348-357，US 5,968,405。
本发明的另一目标是利用单克隆抗体ST2485通过肿瘤的体内免疫定位而获取图像用于诊断目的(“成像”)。
本发明的另一目标是在测试中将单克隆抗体ST2485与第二种抗腱生蛋白抗体组合生产诊断试剂盒用于测定腱生蛋白的循环水平。
本发明的这些目标和其它目标将详述于下文，同时辅以实施例和附图加以说明。
                    附图简述
图1：人腱生蛋白C以及产生BC-2样抗体所采用策略的示意图。
图2：在还原和非还原条件下进行的抗体ST2485的SDS-PAGE(a，b)和蛋白质印迹(c，d)分析。在还原条件下，在抗体轻链水平处观察到一双重条带(b，d)。
图3：对经酶PNGaseF(来自黄杆菌属(Flavobacterium)的肽-N-糖苷酶)消化而去糖基化的抗体ST2485进行SDS-PAGE分析：观察到高分子量轻链条带消失。
图4：抗体ST2485和BC-2的羟磷灰石层析图谱。
图5：通过蛋白质印迹分析ST2485对人腱生蛋白和对Tn(A(1-4)-D)片段的结合特异性。
图6：ST2485和BC-2之间对结合腱生蛋白C(a)或结合Tn(A(1-4)-D)片段(b)的竞争性ELISA。
图7：ST2485与BC-2相比较对腱生蛋白C(a)和对Tn(A(1-4)-D)片段(b)的免疫反应性。
图8：生物素化ST2485和BC-2对腱生蛋白C(a)和对Tn(A(1-4)-D)片段(b)的免疫反应性。
图9：抗体ST2485与表达于LMM3肿瘤(小鼠乳癌)中的和表达于正常小鼠肠中的小鼠腱生蛋白的交叉反应性。
图10：在裸鼠中进行ST2485生物分布研究所采用的流程。
图11和11a：多种施用剂量下ST2485与BC-2相比较的生物分布。在所有的施用剂量下，ST2485在肿瘤中的积聚至少是BC-2的两倍。
图12和12a：与BC-2相比，ST2485的肿瘤比非肿瘤比率。在所有的施用剂量下，抗体ST2485的比率均较高。
图13：通过ELISA测试方法进行抗腱生蛋白抗体ST2485和ST2146的体外干扰(a)和加和测试(b)。
图14和14a：通过BiaCore分析进行抗体ST2485和ST2146的体外加和检验。
图15：抗体ST2485和ST2146体内加和研究所采用的方案。
图16：抗体ST2485和ST2146的体内加和作用，以每克肿瘤内定位的抗体的纳克数表示。
图17：ST2485轻链(VL)可变区的SEQ ID NO：1序列。所编码氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
图18：ST2485重链(VH)可变区的SEQ ID NO：2序列。所编码氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
                    发明详述
本发明的发明者制备了命名为ST2485的新型抗人腱生蛋白抗体，它的轻链和重链可变区序列分别是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，该抗体是由杂交瘤细胞系cST2485产生的。所述抗体能与人腱生蛋白A(14)-D区域内的抗原性表位结合。
本发明抗体的蛋白水解片段能结合人腱生蛋白的A(14)-D区域内的抗原性表位。
本发明抗体的重组衍生物是依照本领域专家众所周知的常规方法获得的。重组衍生物优选那些小鼠恒定区被它的人对应物所取代的衍生物，或者被生物学或药用活性组分取代、或者被亲和素家族成员取代的衍生物。
依照本发明，缀合衍生物是用本领域众所周知的常规方法获得的。
优选的缀合衍生物是那些其中生物学活性部分与抗体结合的衍生物。所述的生物学活性部分的实例有：亲和素家族成员、可用于刺激定向肿瘤的免疫学效应器的生长因子(例如G-CSF、GM-CSF)；药用活性组分，诸如毒素、超级抗原、细胞因子或可用于增强抗癌效果的任何其它蛋白质；抗癌药物和放射性同位素。
有关重组和缀合衍生物制备的进一步信息，读者可参阅文献WO03/072608。
依照本发明，单克隆抗体的重组或缀合衍生物也可称为“衍生物”。
在本发明的某一优选实施方案中，抗体、其片段及衍生物可被生物素化。
依照本发明的抗体，其片段及衍生物还可方便的包含额外的标记物和诊断试剂。
本发明还包括编码上述单克隆抗体或其片段的DNA。本发明还包含含有所述DNA的载体以及含有所述载体的宿主细胞。
载体和宿主细胞是本领域所常规已知的。
本发明还包含由核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2或其片段编码的蛋白质以及编码它的DNA。
本发明还包含上述抗体的特异性CDR(互补决定区)以及含有所述CDR的蛋白质。
制备本发明抗体的过程包括以下步骤：a)用人腱生蛋白的A(14)-D片段免疫接种动物，优选小鼠；b)将所述动物的体脾细胞与不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞融合；c)挑选单克隆抗体。
单克隆抗体ST2485是由上文所确定的杂交瘤细胞系cST2485生成的。
依照本发明，可选地生物素化的抗体或其片段或其衍生物被用于制备药用产品，该药用产品被用于治疗和诊断以腱生蛋白的表达为特征的疾病。具体而言，所述的疾病是肿瘤，更具体而言包括胶质瘤、乳癌、肺癌、纤维肉瘤和鳞状细胞癌。
在某一优选的方面，上述药用产品被用于实体瘤的双阶段手术期间治疗中，该方法被描述于国际申请WO03/07268中。在这种类型的疗法中，先施用生物素化的抗体，然后施加亲和素，从而为后来真正使用的抗癌剂构建“人造受体”。在这种情况下，抗癌剂将通过生物素进行投递，生物素将被包含在适于与抗癌剂形成复合物的化学化合物(在下文中被称为生物素化合物)中，在手术后阶段全身施用。事实上，生物素将只定位于存在亲和素的部位，在此情况下我们可确保亲和素存在于我们预期治疗的区域，因为它是在手术期间早数小时(如4至72小时)由外科医生导入的。
它的优势在于大大减少了切除原发瘤和辅助治疗之间所耽误的时间。
至于本发明的工业用途方面，依照制药学领域的标准操作，本文所述的抗体适于制备药用组合物或者治疗或诊断试剂盒。
药用组合物和试剂盒完全是本领域传统的类型，而且本领域专家只基于普通的知识即可制备。药用组合物的例子参阅本发明所引用的文献。有关试剂盒的情况也是如此。尤其优选的是用于肿瘤放射免疫疗法的试剂盒，如上述文献所述的研究中：Paganelli等、专利EP 0496 074、WO 02/066075、WO03/072608和WO 03/075960。放射免疫治疗试剂盒的具体使用可利用文献WO 03/069632中所述的装置进行。
含有所述抗体或其衍生物或片段(可选地生物素化)并与至少一种药用可接受赋形剂或载体混合的药用组合物包括在本发明的范围内。
在本发明的某一具体实施方案中，试剂盒是供全身放射免疫治疗用的，尤其是三步预靶向放射免疫疗法，其中包含5个小瓶，其中小瓶1含有可选地生物素化的抗体或其片段或重组衍生物或其缀合物或类似物；小瓶2中含有亲和素；小瓶3中含有链霉亲和素；小瓶4中含有生物素化人白蛋白；以及小瓶5中含有生物素DOTA。
在本发明的另一实施方案中，所说试剂盒是供局部放射免疫治疗用的，并且包含3个小瓶，它们相当于全身用试剂盒的小瓶1、2和5。
在某一特别优选的实施方案中，在含生物素DOTA的小瓶中，所述的生物素DOTA是化学式(I)的化合物
Figure A20058000613200171
其中：Q是-(CH2)n-基团，其中n是4-12的整数，这种情况下R’不存在；或者Q选自-(CH2)a-CH(R′)b-(CH2)b-，其中a和b独立地是从0至n的整数，R′如下文所定义；或者Q是环已基、苯基，在此情况下R′是环己基或苯基环上的取代基团；R是氢或者-Λ，其中-Λ是式(II)的大环，
其中的各个Y可能是相同或不同的，并选自氢基、直链或支链C1-C4烷基、-(CH2)m-COOH，其中m是从1到3的整数，X是氢或基团-CH2-U，其中U选自甲基、乙基和对氨基苯基，或者X是基团-(CHW)o-Z，其中o是从1到5的整数，W是氢、甲基或乙基，Z是5-或6元杂环基团，其中包含一个或多个选自O、N-R1(其中R1是氢或者直链或支链C1-C4烷基)和S的杂原子；或者Z选自基团-NH2、-NH-C(＝NH)-NH2或-S-R2，其中R2是直链或支链C1-C4烷基；p数字2或3；R′选自氢、直链或支链C1-C4烷基、-(CH2)q-T，其中T选自-S-CH3、-OH、-COOH，而q是数字1或2；R″具有与R′相同的意义，条件如下：如果R是-Λ，则R″是氢；如果R是氢，则R″是-Λ，或者R和R″分别是-(CH2)r-Λ(对于R)，其中r是4至12的整数，和-Λ(对于R′)，Q是-(CH2)n-基团，其中n是从4至12的整数。
这些化合物可参阅专利文献WO 02/066075。
在特别优选的实施方案中，在含有亲和素的小瓶内，所述亲和素是其中两分子亲和素通过-NH2基团以辛二酸盐的形式结合的亲和素二聚体，或者是其中两分子亲和素通过-COOH基团借助分子量为3,400的聚乙二醇相结合的亲和素二聚体，可参阅WO 03/075960。
在依照本发明的试剂盒中，可选地生物素化的抗体、其蛋白水解片段、其衍生物可与其它抗腱生蛋白抗体、优选靶向于该蛋白质的类EGF区的抗体联合，或者与其它肿瘤特异性抗体联合。
除了用于治疗表达腱生蛋白的肿瘤之外，本发明的所有方面还可用于肿瘤诊断，尤其是肿瘤免疫定位，例如，成像。
本发明的另一目标是容器，优选处于适于注射的小瓶形式，其中包含抗体或其蛋白水解片段或其衍生物，它们可选地是被生物素化和/或放射性标记的。
在本发明的另一方面，在夹心法体外ELISA检测中，所述抗体或其片段、重组衍生物或类似物与第二种腱生蛋白特异性抗体联合使用，使用条件是其中所述的第二种抗体结合腱生蛋白上的第二个抗原性表位，其目的是测定循环的腱生蛋白水平，尤其是含A(14)-D区域的异形体。
以下实施例对本发明进行了进一步的描述。
                      实施例1
为了建立具有BC-2特异性、但不会产生非功能性轻链的新杂交瘤，用人腱生蛋白的A(14)-D片段免疫Balb/c小鼠，所述片段包含被BC-2所识别的表位(Siri，A.等，Nucl.AcidRes.，19(3)：525-531，1991；Balza，E.等，FEBS，332：39-43，1993)。人腱生蛋白C的示意图和产生BC-2样抗体所采用的策略参见图1。
依照标准方法将用Tn(A(1-4)-D)片段免疫的小鼠的脾细胞与不产生免疫球蛋白Sp2/0-Agl4的骨髓瘤细胞融合(Cianfriglia，M.等，Methods Enzymol.，121：193-210，1986)，用来自SK-Mel 28人黑素瘤细胞(ICLC HTL99010)的纯化腱生蛋白通过ELISA测试对所获得的杂交瘤群进行筛选。
将分泌抗腱生蛋白抗体的杂交瘤通过在含FCS的生长培养基中有限稀释两次，并在动物来源(无动物来源组分培养基HyClone，HyQRPerbio)的无蛋白培养基中稀释两次进行克隆。
ST2485参照物的产生是通过以下步骤完成的：即在一个两升的生物反应器中培养cST2485杂交瘤细胞；两次连续的限制性稀释亚克隆cST2485后生产细胞库(Post Production Cell Bank，PPCB)，选择到亚克隆cST2485/A3e/A12f，用于产生主细胞库(Master Cell Bank，MCB)和工作细胞库(Working Cell Bank，WCB)。
ST2485是IgG1/k亚型的小鼠免疫球蛋白。
图2显示了在还原和非还原条件下抗体ST2485的SDS-PAGE(a，b)和蛋白质印迹(c，d)分析。在还原条件下(b，d)，在抗体的轻链水平处观察到一条双带；蛋白质印迹分析证实这两条带具有如免疫球蛋白轻链一样的免疫反应性。
如图3所示，抗体ST2485的羟磷灰石层析分析通过轻微不对称的峰证实了抗体的轻度异质性。另一方面，在同一分析中，抗体BC-2呈现出明显的异质图谱，其中有三个明显的峰，只有峰1相当于完整的功能性均一抗体。
为了确定抗体ST 2485的异质性的种类，用酶PNGaseF(来自黄杆菌属的肽-N-糖苷酶)消化上述后一种样品的N-糖苷残基。在制造商所指示的条件下，用Prozyme去糖基化作用试剂盒(目录号GE51001)进行所述酶消化：将大约8μg的ST2485和5mU的酶在10μl反应混合液中37℃反应过夜。在还原条件下将消化和未消化的抗体ST2485进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶用考马斯亮兰染色。
正如图4中所述的在还原条件下进行的SDS-PAGE分析显示，消化造成了高分子量轻链条带消失。此发现表明抗体ST2485的两条轻链条带相当于同一抗体的糖基化(高分子量)和非糖基化(低分子量)变体。免疫球蛋白DNA序列资料也证实了潜在的N-糖基化位点的存在(图17)。
用已公布的cDNA扩增k轻链的可变区，所用引物是识别抗体恒定区的引物对(5′GGGAAGATGGATACA GTTGGTG(SEQ ID NO：5)、5′CAAGAGCTTCAACAGGAATGAG)(SEQ ID NO：6)，参阅文献M.Sassant等，Nucl.Ac.Res.(1994)22，1768-1769。
如图5中呈现的蛋白质印迹分析所证明的，ST2485与腱生蛋白A(1-4)-D区的结合是特异性的。所述抗体结合人腱生蛋白和A(1-4)-D片段，但不结合同一蛋白质的EGF-类片段，所述EGF-类片段包含被BC-4抗体所识别的表位。
如图6中所述的两种抗体之间的竞争性ELISA检测所显示的，抗体ST2485与人腱生蛋白在独特的表位或者部分与BC-2共享的表位相结合。以预实验中确定的浓度将生物素化抗体BC-2与浓度逐渐升高的非生物素化BC-2(曲线1)或ST2485(曲线2)分配到用抗原腱生蛋白C(a)或TnA(1-4)-D片段(b)致敏的平板上。然后加入HRP-链霉亲和素及相关的呈色底物TMB，以检测生物素化抗体的结合。抗体ST2485对BC-2与腱生蛋白C或TnA(1-4)-D片段的结合有40％的抑制作用。
如图7所示，与BC-2相比较，通过ELISA检测评估ST2485对腱生蛋白C和TnA(1-4)-D片段的免疫反应性。将浓度逐渐升高的抗体ST2485和BC-2以及正常小鼠免疫球蛋白(nMIgG)分配于用腱生蛋白C(a)或TnA(1-4)-D片段(b)致敏的平板上，加入用碱性磷酸酶标记的抗小鼠二抗和相关的呈色底物(pNPP)，可以测定抗体的剂量-反应曲线。达到1.0OD所必需的ST2485的量较BC-2的量而言，对于完整的腱生蛋白(a)大约少13倍，对于TnA(1-4)-D片段(b)大约少10倍。
通过BIAcore分析测定了抗体ST2485对腱生蛋白C和TnA(1-4)-D片段的亲和力。对于腱生蛋白C，ST2485的KD1是9.77×10-10M(ka1＝6.02×105；kd1＝5.88×10-4)，而BC-2的KD1是2.54×10-7M(ka1＝9.85×103；kd1＝2.5×10-3)。对于TnA(1-4)-D片段，ST2485的KD1是9.72×10-10M(ka1＝3.28×105；kd1＝3.19×10-4)，而BC-2的KD1是7.39×10-8M(ka1＝2.68×104；kd1＝1.93×10-3)。
在生物素化之后保持免疫反应性是抗体用于预定向的一个基本要求，因此通过ELISA和BIAcore检测法比较了生物素化ST2485(每分子结合8.3分子生物素)和生物素化BC-2(每分子结合7.6分子生物素)的表现。参见图8，将浓度逐渐升高的生物素化和未生物素化抗体ST2485和BC-2以及正常小鼠免疫球蛋白(nMIgG)分配于用腱生蛋白C(a)或TnA(1-4)-D片段(b)致敏的平板上，加入用碱性磷酸酶标记的抗小鼠二抗和相关的呈色底物(pNPP)，使得可能测定各个生物素化抗体相比较于其非生物素化抗体而言的剂量反应曲线(剩余的免疫反应性)。生物素化ST2485和BC-2对腱生蛋白C的剩余免疫反应性分别等于76％和88％。对于TnA(1-4)-D片段，生物素化ST2485和BC-2的剩余免疫反应性分别等于73％和83％。
生物素化抗体对完整腱生蛋白的BIAcore分析显示：生物素化ST2485的亲和力KD1＝2.88×10-9M(ka1＝2.8×105；kd1＝8.07×10-4)，而生物素化BC-2的亲和力KD1＝3.71×10-7M(ka1＝6.0×103；kd1＝2.23×10-3)。因此生物素化的ST2485保持了良好的免疫反应性和亲和力特征，所保持的对腱生蛋白的亲和力比生物素化的BC-2高100倍。
对多种人肿瘤(乳癌、肺癌、胃癌、结肠癌)进行的免疫组化研究显示，ST2485在胞外基质水平的定位与文献所报道的有关BC-2的相似(Natali，PG等，Int.J.Cancer，47.811-16，1991)。这些研究还显示了ST2485与小鼠腱生蛋白、包括那些表达于正常小鼠组织中的腱生蛋白产生交叉反应的能力，这也可参见图9。将固定于***中的LMM3肿瘤(小鼠乳癌)和正常小鼠肠道切片与10μg/ml的ST2485或正常的小鼠IgG1抗体(对照)一起保温。在与生物素化抗小鼠二抗一起保温后，加入呈色底物DAB(Vector)检测与腱生蛋白结合的亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(Vectastain Elite ABC kit)。用Mayer′s苏木精进行对比。LMM3和小鼠肠切片对于ST2485显示出阳性，而对对照抗体则不显示阳性。不可能进行与BC-2比较的这些试验，因为该抗体不识别包埋于石蜡中的固定化组织切片。
ST2485识别小鼠腱生蛋白(包括正常组织所表达的那些)的能力增加了下文所述小鼠模型中抗体生物分布试验中所获得的结果的显著性。
为了评估抗体定位于肿块的能力，进行了生物素化125I-标记的ST2485和BC-2的生物分布的研究。依照图10中所示意的流程，在已植入了表达腱生蛋白的人肿瘤的裸鼠中进行这些试验。
对所述动物皮下接种溶于0.1ml无菌盐水溶液的4×106个人结肠癌HT-29细胞。15天后，当肿瘤块大小达到大约200mg后，五个动物一组接受静脉内施用125I-BC2、125I-ST2485或正常小鼠125I-免疫球蛋白(nMIg)，所有抗体均被生物素化(7-9个生物素/mol)且以5个不同的剂量注射：0.2-0.5-1-2-5μg/小鼠，溶于100μl无菌PBS中。施用抗体5天后，将动物处死并取血液、脾、肾、肝和肿瘤样品用于测定其中存在的放射性。在处死动物的24小时之前，对其静脉内施用溶于100μl无菌PBS中的亲和素，剂量较抗体高100倍(追踪)。
图11和11a所显示的结果表明，无论剂量多少(抗体的量表示为每克组织所注射剂量的百分数：％ID/gr)，BC-2和ST2485都特异性地定位于肿瘤处。此外，在所有检测的剂量上，ST2485均显示出较BC-2更多的定位于肿瘤处，通常保持较高的肿瘤比非肿瘤的比率(图12和12a)。具体而言，在1μg/小鼠的剂量上，ST2485在肿瘤内的积累等于注射剂量的16％，而BC-2的积累不超过任一被检测剂量的5％。
在1μg/小鼠的剂量上，对于ST2485而言，肿瘤：血液的比率大于20(最佳剂量)，而对于抗体BC-2而言，在任何被检测的剂量上此比率都从未超过6。在其它器官内，对于ST2485而言，在剂量1μg/小鼠时，相对于脾、肾和肝，肿瘤比非肿瘤的比率分别是9、26和43。另一方面，对于BC-2，在所有被检测的剂量处，这些比率通常都低于7。肿瘤比非肿瘤的比率参见图12和12a。
为了评估在PAGRIT和IART方法中联合使用抗腱生蛋白抗体ST2485和ST2146的可能性(ST2416针对的是该蛋白质中类EGF区内的表位(De Santis，R.等，Br.J.Cancer，88：996-1003，2003，WO 03/072608))，用这两种抗体进行了体外和体内加和实验。图13是在用腱生蛋白C致敏的平板上进行的两个ELISA测试，其结果显示了抗体ST2485和ST2146之间无表位干扰(13a)以及它们与抗原结合的加和特性(13b)。为了评估干扰作用(a)，在缺乏(1)和存在(2)饱和浓度ST2146的条件下，将浓度逐渐升高的生物素化抗体ST2485分配于用腱生蛋白C致敏的微量滴定板上：叠加曲线1和2表明两抗体之间无表位干扰，因为生物素化ST2485与腱生蛋白的结合不受ST2146存在的影响(反之亦然；数据未显示)。曲线3显示的是在非生物素化饱和ST2485(对照)存在条件下接种生物素化ST2485获得的信号。
图13b显示了加和性测试结果，其中饱和剂量的生物素化抗体ST2485和ST2146被分开或一起分配于用腱生蛋白C致敏的微量滴定板上：两种抗体的混合物产生的信号等于所述信号的总和，因此证明了这两种抗体的结合是有加和性的。
此外，还用BIACore分析检测了两种抗体的体外加和性，结果如图14和14a所示。依照文献(De SantisR.等；Br.J.Cancer，88：996-1003，2003)所述方法将腱生蛋白固定在芯片(CM5感受器芯片，Biosense)上。连续两次注射饱和浓度(10M)的第一种抗体(a中是ST2485，c中是ST2146)，然后注射第二种抗腱生蛋白抗体(a中是ST2146；c中是ST2485)。感受图谱a)和c)显示这两种抗体能以加和方式结合各自的表位，如各个单独抗体所产生的共振信号增加所显示的。感受图谱b)和d)表示了分别注射ST2485和ST2146，随后注射各自的同种型对照抗体mIgG2b和mIgG1的结果。
此外，还在前述动物模型中进行了两种抗体ST2485和ST2146的体内加和性研究。实验方案如图15中所示，而获得的结果如图16所示，以每克肿瘤中的抗体ng数表示。数据证明了所述的两种抗体在动物模型中也存在加和性。事实上，两种标记抗体的混合物在肿瘤中的积累是理论值(两种单独标记抗体的数学总和)的93％。用放射性标记抗体和第二种“冷”抗体的混合物处理对照动物组，以避免任何的干扰。
用已公布的cDNA扩增k轻链的可变区，所用引物是识别抗体轻链恒定区的引物对(5′GGGAAGATGGATACA GTTGGTG(SEQ ID NO：5)、5′CAAGAGCTTCAACAGGAATGAG)(SEQ ID NO：6)，参阅文献M.Sassant等，Nucl.Ac.Res.(1994)22，1768-1769。
用已公布的cDNA扩增γ重链的可变区，所用引物是识别抗体重链恒定区的引物对5′ATGGAGTTAGTTTGGGCAGCAG 3′(SEQ ID NO：7)、5′GCACAACCACCATACTGAGAAG 3′)(SEQ ID NO：8)，参阅文献M.Sassant等，Nucl.Ac.Res.(1994)22，1768-1769。
图17显示了ST2485轻链可变区(VL)的序列SEQ ID NO：1。
图18显示了ST2485重链可变区(VH)的序列SEQ ID NO：2。
与BC-2相比较的ST2485的有关比较性试验表明抗体ST2485具有以下特征：
-识别人腱生蛋白A(1-4)-D区域内的表位，其与BC-2的表位接近或部分重叠；
-就其轻链和重链的组成而言，它是均一的抗体，因为所观察到的异质性是由于轻链糖基化变体所造成的；
-它比BC-2具有更强的免疫反应性；
-它比BC-2具有更高的对抗原的亲和力；
-至于生物素化之后免疫反应性的维持，它与BC-2相当；
-在动物模型内肿瘤定位方面，它比BC-2优越；
-在体外和体内动物模型中，它都与抗腱生蛋白单克隆抗体ST2146以加和方式结合腱生蛋白C。
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atg gat ttt caa gtg cag att ttc agc ttc ctg cta atc agt gct tca    48
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
  1               5                  10                  15
gtc ata atg tcc aga gga caa att gtt ctc tcc cag tct cca gca atc    96
Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile
             20                  25                  30
ctg tct gca tct cca ggg gag aag gtc aca atg act tgc agg gcc aac    144
Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Asn
         35                  40                  45
tca agt gta cgt ttc atg cac tgg tac cag cag aag cca gga tcc tcc    192
Ser Ser Val Arg Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser
     50                  55                  60
ccc aaa ccc tgg att tat gcc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct    240
Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
 65                  70                  75                  80
gct cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg acc tct tat tct gtc aca atc    288
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Val Thr Ile
                 85                  90                  95
agc aga gtg gag gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg    336
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
            100                 105                 110
agt agt aat tca ccc agg acg ttc ggt gga ggc acc aag gtg gaa atc    384
Ser Ser Asn Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
        115                 120                 125
aga cgg gct                                                        393
Arg Arg Ala
    130
<210>2
<211>414
<212>DNA
<213>Mus musculus
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(414)
<400>2
atg gga tgg agc tgg atc ttt ctc ttc ctc ctg tca gga act gca ggt    48
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
  1               5                  10                  15
gtc cac tct gag gtc cag ctg caa cag tct gga cct gag ctg gtg aag    96
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
             20                  25                  30
cct gga gct tca atg aag att tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc    144
Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
         35                  40                  45
act ggc tac acc atg aac tgg gtg aag cag agc cat gga aag aac ctt    192
Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu
     50                  55                  60
gaa tgg att gga ctt att aat cct cac aat ggt ggt act acc tac aac    240
Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn
 65                  70                  75                  80
cag aag ttc aag ggc aag gcc aca tta act gta gac aag tca tcc aac    288
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn
                 85                  90                  95
aca gcc tac atg gag ctc ctc agt ctg aca tct gag gac tct gca gtc    336
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
            100                 105                 110
tat tac tgt aca aga ccc ggg ggt tac tac tgg ttc ttc gat gtc tgg    384
Tyr Tyr Cys Thr Arg Pro Gly Gly Tyr Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp
        115                 120                 125
ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca                            414
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
    130                 135
<210>3
<211>131
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>3
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
  1               5                  10                  15
Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile
             20                  25                  30
Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Asn
         35                  40                  45
Ser Ser Val Arg Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser
     50                  55                  60
Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
 65                  70                  75                  80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Val Thr Ile
                 85                  90                  95
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
            100                 105                 110
Ser Ser Asn Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
        115                 120                 125
Arg Arg Ala
    130
<210>4
<211>138
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>4
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
  1               5                  10                  15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
             20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
         35                  40                  45
Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu
     50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn
 65                  70                  75                  80
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn
                 85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Pro Gly Gly Tyr Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp
        115                 120                 125
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
    130                 135
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>5
gggaagatgg atacagttgg tg                                             22
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>6
caagagcttc aacaggaatg ag                                               22
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>7
atggagttag tttgggcagc ag                                               22
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>8
gcacaaccac catactgaga ag                                               22

Claims (34)

1.抗人腱生蛋白单克隆抗体，优选小鼠的，其轻链和重链可变区序列分别是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，它的能结合人腱生蛋白A(1-4)-D区域内的抗原性表位的蛋白水解片段，它的重组衍生物、缀合物和能结合人腱生蛋白A(1-4)-D区域内的抗原性表位的类似功能性类似物。
2.依照权利要求1的抗体片段，其可选地包含另外的标记物和诊断剂。
3.依照权利要求1的抗体的重组衍生物，其中的小鼠恒定区被它的人对应物取代。
4.依照权利要求1的抗体的重组衍生物，其中的小鼠恒定区被生物学活性组分所取代。
5.依照权利要求1的抗体的重组衍生物，其中的小鼠恒定区被药用活性组分所取代。
6.依照权利要求1的抗体的重组衍生物，其中的小鼠恒定区被亲和素家族成员所取代。
7.权利要求1所述的抗体的衍生物，它与生物学活性物质相缀合。
8.依照权利要求1的生物素化抗体或依照权利要求2的生物素化片段，或依照权利要求4-7的生物素化衍生物。
9.编码权利要求1的抗体或权利要求2的片段的DNA。
10.含有权利要求9的DNA的载体。
11.含有权利要求10的载体的宿主细胞。
12.由核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2编码的蛋白质或其片段。
13.编码权利要求12的蛋白质或其片段的DNA。
14.依照权利要求1的抗体的特异CDR(互补决定区)和含有所述CDR的蛋白质。
15.产生权利要求1的抗体的杂交瘤，其依照布达佩斯条约的规定于2003年11月12日保存于Centro di Biotecnologie Avanzate，LargoRossana Benzi 10，Genoa-Italy，保藏号为PD03003。
16.用于制备权利要求1的抗体的方法，包括a)用人腱生蛋白的A(1-4)-D片段免疫动物；b)将所述动物的体脾细胞与不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞融合；c)选择单克隆抗体。
17.可选地生物素化的权利要求1所述抗体或其蛋白水解片段或其重组衍生物或其缀合物或类似物，或者可选地生物素化的权利要求2所述的片段，或者依照权利要求4-7的生物素化衍生物在制备用于治疗或诊断以腱生蛋白的表达为特征的疾病的药物产品中的用途。
18.依照权利要求17的用途，其中所述的疾病是肿瘤。
19.依照权利要求18的用途，其中所述的肿瘤选自胶质瘤、乳癌、肺癌、纤维肉瘤和鳞状细胞癌。
20.可选地生物素化的权利要求1所述抗体或其蛋白水解片段或其重组衍生物或其缀合物或类似物，或者可选地生物素化的权利要求2所述片段，或者依照权利要求4-7的生物素化衍生物在制备用于实体肿瘤的两阶段手术期间治疗的药物产品中的用途。
21.含有可选地生物素化的权利要求1所述抗体或其蛋白水解片段或其重组衍生物或其缀合物或类似物、或者可选地生物素化的权利要求2的片段、或者依照权利要求4-7的生物素化衍生物并与至少一种药用可接受载体和/或赋形剂相混合的药物或诊断组合物。
22.用于全身放射免疫疗法、尤其是三步预定向放射免疫疗法的试剂盒，其由5个小瓶组成：小瓶1包含可选地生物素化的权利要求1所述抗体或其蛋白水解片段或其重组衍生物或其缀合物或类似物、或者可选地生物素化的权利要求2所述片段、或者依照权利要求4-7的生物素化衍生物；小瓶2含有亲和素；小瓶3含有链霉亲和素；小瓶4含有生物素化人白蛋白；小瓶5含有生物素DOTA。
23.用于局部放射免疫疗法的试剂盒，其包括3个小瓶；小瓶1含有可选地生物素化的权利要求1所述抗体或其蛋白水解片段或其重组衍生物或其缀合物或类似物、或者可选地生物素化的权利要求2所述片段、或者依照权利要求4-7的生物素化衍生物；小瓶2含有亲和素；小瓶3含有生物素DOTA。
24.依照权利要求22或23的试剂盒，其中分别在小瓶5或小瓶3中的生物素DOTA是化学式(I)的化合物
其中Q是-(CH2)n-基团，其中n是4-12的整数，这种情况下R’不存在；或者Q选自-(CH2)a-CH(R′)b-(CH2)b-，其中a和b独立地是从0至n的整数，R′如下文所定义；或者Q是环己基、苯基，在此情况下R′是环己基或苯基环上的取代基；R是氢或者-Λ，其中-Λ是式(II)的大环，
Figure A2005800061320004C2
其中的各个Y可能是相同或不同的，选自氢、直链或支链C1-C4烷基、-(CH2)m-COOH，其中m是从1到3的整数，X是氢或基团-CH2-U，其中U选自甲基、乙基和对氨基苯基，或者X是基团-(CHW)o-Z，其中o是从1到5的整数，W是氢、甲基或乙基，Z是5-或6-元杂环基团，其中包含一个或多个选自O、N-R1(其中R1是氢或者直链或支链C1-C4烷基)和S的杂原子；或者Z选自基团-NH2、-NH-C(＝NH)-NH2或-S-R2，其中R2是直链或支链C1-C4烷基；p是数字2或3；R′选自氢、直链或支链C1-C4烷基、-(CH2)q-T，其中T选自-S-CH3、-OH、-COOH，而q是数字1或2；R″具有与R′相同的意义，条件如下：如果R是-Λ，则R″是氢；如果R是氢，则R″是-Λ，或者R和R″分别是-(CH2)r-Λ(对于R，其中r是4至12的整数)和-Λ(对于R′)；Q是-(CH2)n-基团，其中n是从4至12的整数。
25.依照权利要求22-24中任一项的试剂盒，其中的小瓶3包含亲和素二聚体，其中两个亲和素分子通过-NH2基团以辛二酸盐(酯)的方式结合。
26.依照权利要求22-24中任一项的试剂盒，其中的小瓶3包含亲和素二聚体，其中两个亲和素分子通过-COOH基团借助分子量为3,400的聚乙二醇结合。
27.依照权利要求22或23的试剂盒，其中可选地生物素化的权利要求1所述抗体或其蛋白水解片段或其重组衍生物或其缀合物或类似物、或者可选地生物素化的权利要求2所述片段、或者依照权利要求4-7的生物素化衍生物与其它抗腱生蛋白抗体组合，优选所述其它抗体靶向于该蛋白质的类EGF区域。
28.依照权利要求22或23的试剂盒，其中可选地生物素化的权利要求1所述抗体或其蛋白水解片段或其重组衍生物或其缀合物或类似物、或者可选地生物素化的权利要求2所述片段、或者依照权利要求4-7的生物素化衍生物与其它肿瘤特异性抗体组合。
29.可选地生物素化的权利要求1所述抗体或其蛋白水解片段或其重组衍生物或其缀合物或类似物、或者可选地生物素化的权利要求2所述片段、或者依照权利要求4-7的生物素化衍生物在制备用于肿瘤免疫定位法中的组合物中的用途。
30.一种适于注射的容器，优选地处于小瓶的形式，其中含有可选地生物素化和/或放射性标记的权利要求1所述抗体或其蛋白水解片段或其重组衍生物或其缀合物或类似物、或者可选地生物素化的权利要求2所述片段、或者依照权利要求4-7的生物素化衍生物。
31.肿瘤成像方法，包括对肿瘤患者或疑似肿瘤患者施用可选地生物素化的权利要求1所述抗体或其蛋白水解片段或其重组衍生物或其缀合物或类似物、或者可选地生物素化的权利要求2所述片段、或者依照权利要求4-7的生物素化衍生物，并检测所说的肿瘤。
32.依照权利要求31的方法，其中所述抗体或其蛋白水解片段或重组衍生物或缀合物或类似物是放射性标记的。
33.含有依照权利要求1的抗体或其蛋白水解片段或其重组衍生物或其缀合物或类似物、或者依照权利要求2的片段、或者依照权利要求4-7的衍生物以及第二种腱生蛋白特异性抗体的联合。
34.依照权利要求33的联合在体外夹心ELISA检测中的应用，条件是其中所说的第二种抗体与第二个抗原性表位结合，从而测定循环的腱生蛋白水平，尤其是含A(1-4)-D区域的同工型的水平。
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