CN1252259C

CN1252259C - 人肝癌转移亚克隆细胞系及其建立方法

Info

Publication number: CN1252259C
Application number: CN 200410019057
Authority: CN
Inventors: 叶丽虹; 张晓东; 秦宵然; 朱惠芳; 王洪辉
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2004-04-20
Filing date: 2004-04-20
Publication date: 2006-04-19
Anticipated expiration: 2024-04-20
Also published as: CN1563376A

Abstract

本发明公开了一种人肝癌转移亚克隆细胞系及其建立方法，所述人肝癌转移亚克隆细胞系是用下述方法建立的：将人肝癌细胞H7402单细胞悬液接种于SCID鼠；确认转移部位为肺脏；原代培养；传代培养，当细胞传代到第三代以后，将培养液中的胎牛血清浓度降为10%，细胞生长良好，形态逐渐均一，即建立了一种来源于亲本人肝癌细胞H7402的肝癌转移亚克隆细胞系，并与亲本细胞形成配对关系，为肝癌细胞转移的研究提供新的实验材料；可用于筛选肝癌转移相关基因；可用于筛选肝癌转移相关蛋白；可用于筛选抗肿瘤转移药物；可用于肿瘤转移分子机理的研究；可用于进行肿瘤转移DNA疫苗的研究。

Description

人肝癌转移亚克隆细胞系及其建立方法

技术领域

本发明涉及癌细胞系的建立，属动物细胞系领域。

背景技术

肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，其侵袭转移和手术后复发是患者死亡的主要原因。肝癌转移发生早，在转移早期难以发现，目前尚缺少肝癌转移的特异性标志物。为研究肝癌转移的分子机制，诸多学者致力于获得具有高转移倾向的肝癌细胞系。其主要方法是通过应用手术切除病人的肝癌组织块反复接种裸鼠，进行筛选，进而获得具有高转移倾向的肝癌细胞系。然而，这一方法周期较长，不能获得具有不同转移能力的形成“子母关系”的配对细胞系。

严重联合免疫缺陷鼠，简称SCID鼠，成为比裸鼠更适合于人源性肿瘤细胞生长及转移的动物模型。SCID鼠几乎完全丧失T和B淋巴细胞免疫功能，缺乏体液和细胞免疫功能。SCID鼠与裸鼠相比具有以下优点：①病变与人类相似；②对于外源的肿瘤细胞没有免疫排斥反应，减少了干扰转移的因素，肿瘤移植存活率高达36.9％，而一般裸鼠为16.8％；③对于恶性肿瘤，不但转移率高，而且能广泛扩散，与人体肿瘤生物学行为极为相似；④浸润和转移与人类肿瘤自发性转移相似。

发明内容

本发明的目的是提供一种与亲本人肝癌胞系形成配对关系的人肝癌转移亚克隆细胞系。

本发明的目的是提供一种人肝癌转移亚克隆细胞系的建立方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种人肝癌转移亚克隆细胞系，它是与亲本细胞系H7402形成配对关系(H7402是常用的肝癌细胞系，可以从细胞库购买获得，本发明所使用的细胞来源于南开大学生命科学学院公共细胞室)，所述人肝癌转移亚克隆细胞系是用下述方法建立的：

(1)接种SCID鼠：(本发明使用SCID鼠是由中国医学科学院天津血液学研究所提供，军事医学科学院也能够买到)将对数生长期的人肝癌细胞H7402单细胞悬液，细胞数量为1～4×10⁷/0.2ml接种于经Cs¹³⁷γ射线照射过的SCID鼠腋背部皮下；

(2)确认转移部位：将荷瘤SCID鼠处死，对各个组织的病理切片进行显微镜下观察，确定其转移部位为肺脏；

(3)原代培养：在接种人肝癌细胞H7402后55-67天，将荷瘤SCID鼠处死，无菌解剖，取出肺脏，进行原代培养，方法如下：用pH7.2的D-Hanks生理缓冲液漂洗组织块3次，去除血液、脂肪、神经组织、***和坏死组织；将肺组织剪切成0.5-1.5mm³小块；接种于细胞培养瓶中，使瓶底向上，在37℃孵箱内，空气中含体积百分比为5％的CO₂条件下培养；2-4小时后，向培养瓶内加入8-10ml内含20％胎牛血清RPMI1640培养液(购自GIBICO公司，货号：31800-022)，静置培养，原代培养每3天换液一次，待从组织块生长出大量的贴壁细胞，去除已漂浮的组织块和残留的血细胞；

(4)传代培养：将去掉组织的细胞进行细胞传代培养，具体步骤如下：移去原代培养的培养瓶内的细胞培养液，向培养瓶中加入2ml质量体积百分比为0.25％胰蛋白酶溶液，置37℃孵箱中2-3分钟，观察到细胞出现回缩、细胞间隙增大，吸除胰蛋白酶溶液，加入8-10ml内含20％胎牛血清RPMI1640培养液，使之形成细胞悬液，计数，接种于新的培养瓶，当细胞传代到第三代时，加入的RPMI1640培养液内含胎牛血清为10％，细胞生长良好，形态逐渐均一，即建立了一种来源于亲本人肝癌细胞H7402的肝癌转移亚克隆细胞系。

一种人肝癌转移亚克隆细胞系的建立方法，包括如下步骤：

(1)接种SCID鼠：将对数生长期的人肝癌细胞H7402单细胞悬液，细胞数量为1～4×10⁷/0.2ml接种于经Cs¹³⁷γ射线照射过的SCID鼠腋背部皮下；

(3)原代培养：在接种人肝癌细胞H7402后55-67天，将荷瘤SCID鼠处死，无菌解剖，取出肺脏，进行原代培养，方法如下：用pH7.2的D-Hanks生理缓冲液漂洗组织块3次，去除血液、脂肪、神经组织、***和坏死组织；将肺组织剪切成0.5-1.5mm³小块；接种细胞培养瓶中，使瓶底向上，在37℃孵箱内，空气中含体积百分比为5％的CO₂条件下培养；2-4小时后，向培养瓶内加入8-10ml内含20％胎牛血清的RPMI1640培养液，静置培养，原代培养每3天换液一次，待从组织块生长出大量的贴壁细胞，去除已漂浮的组织块和残留的血细胞；

本发明成功建立了一种人肝癌转移亚克隆细胞系，命名为M-H7402。

本发明将培养的人肝癌H7402细胞接种SCID鼠，模拟肝癌细胞在体内转移的过程，进而在小鼠的转移部位筛选出来源于亲本细胞的具有转移能力的肝癌转移亚克隆细胞，从而与亲本细胞形成了具有“子母关系”的配对细胞，是本研究的特色。

本发明的有益效果是：

1、为肝癌转移研究提供了新的实验材料；

2、通过将转移细胞与亲本细胞相比较，可用于筛选肝癌转移相关基因；

3、通过将转移亚克隆细胞与亲本细胞相比较，可用于筛选肝癌转移相关蛋白；

4、建立的肝癌转移亚克隆细胞系可用于筛选抗肿瘤转移药物；

5、可用于肿瘤转移分子机理的研究；

6、可用于进行肿瘤转移DNA疫苗的研究。

附图说明

图1SCID小鼠皮下接种人肝癌细胞H7402后，肺组织病理改变观察图；

图2人肝癌转移亚克隆细胞M-H7402与亲本细胞H7402的细胞形态学观察图

图3人肝癌转移亚克隆细胞M-H7402连续传代后染色体鉴定图；

图4人肝癌转移亚克隆细胞M-H7402与亲本细胞H7402的细胞动力学图；

图5人肝癌转移亚克隆细胞M-H7402与亲本细胞H7402的细胞周期检测图；

图6人肝癌转移亚克隆细胞M-H7402的甲胎蛋白检测图；

图7人肝癌转移亚克隆细胞M-H7402与亲本细胞H7402的肿瘤相关蛋白检测图；

图8人肝癌转移亚克隆细胞M-H7402SCID鼠成瘤实验，SCID鼠皮下原发瘤的病理组织图；

具体实施方式

实施例1

一种人肝癌转移细胞系的建立方法，包括如下步骤：

(1)接种SCID鼠：取5只SCID鼠，雌雄不限，体重分别为13.1g、14.3g、14.4g、15.2g、15.8g，鼠龄4-7周，饲养于无特殊病原体环境，将对数生长期的人肝癌细胞H7402制成0.2ml的单细胞悬液，含有1×10⁷个细胞，接种于经Cs¹³⁷γ射线照射过的SCID鼠腋背部皮下，SCID鼠由中国医学科学院天津血液学研究所提供；

(2)确认转移部位：将荷瘤SCID鼠引颈处死，对各个组织的病理切片进行显微镜下观察，确定其转移部位为肺脏；

(3)原代培养：在接种人肝癌细胞H7402后第66天时，将荷瘤SCID鼠引颈处死，无菌解剖，取出肺脏，进行原代培养，方法如下：用pH7.2的D-Hanks生理缓冲液漂洗组织块3次，去除血液、脂肪、神经组织、***和坏死组织；用剪刀将肺组织剪切成大小约1mm³小块；将剪切好的组织块用接种针送入培养瓶，并均匀摆置，间隔0.5cm，盖好瓶盖；轻轻翻转培养瓶，使瓶底向上，在37℃孵箱内空气中含5％CO₂条件下培养；3小时后，将培养瓶慢慢翻转平放，向瓶内加入10ml RPMI1640培养液，其中含有20％胎牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素，静置培养；原代培养每3天换液一次，去除已漂浮的组织块和残留的血细胞。

(4)传代培养：在细胞从组织块周围长出后，待细胞布满培养瓶底部时，将组织块去掉，进行细胞传代，具体步骤如下：移去原代培养的培养瓶内的细胞培养液，向细胞培养瓶中加入2ml质量体积百分比为0.25％胰蛋白酶溶液消化细胞，放置在37℃孵箱中2分钟，观察到细胞出现回缩、细胞间隙增大，吸除胰蛋白酶溶液，用磷酸缓冲液洗去培养瓶内残留的胰蛋白酶溶液；加入10ml内含20％胎牛血清的RPMI1640培养液，用吸管轻轻吹打瓶底部细胞，使之脱离瓶底部形成细胞悬液，计数，分别接种于新的培养瓶，当细胞传代到第三代以后，加入的RPMI1640培养液内含胎牛血清为10％，细胞生长良好，形态逐渐均一。

在倒置显微镜下观察，来源于肺组织的原代培养及传代培养的细胞呈上皮样，细胞形态均一，无接触抑制，并且生长迅速。应用SCID鼠筛选后，从SCID鼠肺组织经原代培养成功地建立了一种来源于亲本人肝癌细胞H7402的肝癌转移亚克隆细胞系。

一种人肝癌转移亚克隆细胞系M-H7402，

其生物学特征是：

1)能在体外长期生长和稳定传代；

2)具有典型的上皮样形态，丧失接触性生长抑制；

3)可无限传代培养，为永生化细胞；

4)将M-H7402细胞再回接动物，可成瘤；

其遗传学特征是：

1)染色体结构畸变，分布范围在72～80之间，存在多数中央及亚中央着丝粒；

2)细胞为单体、三体和多倍体；

其形态学特征是：与亲本肿瘤细胞H7402相比，在细胞形态上相似；

其特殊转移能力特征是：与亲体细胞H7402相比，转移抑制基因nm23在M-H7402细胞中的表达水平明显下调。

本发明——M-H7402细胞的检测鉴定结果

本发明采用含有胎牛血清的RPMI1640培养液培养M-H7402细胞，使其能体外长期生长和稳定传代。经实验观察与验证，体外生长的M-H7402细胞具有典型的上皮样形态，失去接触生长抑制。遗传学研究证实该细胞为异倍体，染色体数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。M-H7402细胞系为肝癌细胞H7402的转移亚细胞克隆，与其亲本细胞系H7402形成了配对关系，是本发明的特色。该细胞可为肝癌细胞转移的研究提供新的实验材料。本研究对M-H7402细胞进行了鉴定，结果如下：

(1)病理学鉴定：将人肝癌细胞H7402皮下接种SCID鼠，在接种后66天荷瘤鼠赢弱时，将其引颈处死，取鼠的肺组织，固定包埋，制作病理切片。显微镜下观察，发现在肺组织中有早期转移生长的肿瘤组织。见图1。(箭头所示转移的瘤细胞团，100倍)

(2)细胞形态学观察：M-H7402细胞失去了接触抑制，呈恶性生长，具有重叠生长的特点，贴壁生长部分呈扁平状，以多边形为主，符合上皮样细胞的特征。与亲本细胞H7402细胞相比，在形态学上无明显区别。见图2。图中A.H7402；B.M-H7402。100倍。

(3)染色体鉴定：M-H7402细胞连续传代后，染色体仍保持人源性肿瘤细胞染色体的特征，表现为多倍体，染色体众数(M)集中在72～80之间，占75.0％，存在多数中央及亚中央着丝粒染色体，而SCID鼠的染色体数2n＝40，且均为顶端着丝粒，据此可与人类染色体相区别。见图3。图中A.M-H7402细胞；B.鼠染色体(参照)

(4)细胞动力学：M-H7402细胞动力学研究结果显示，与亲本细胞H7402相比，细胞生长速度无显著差别。计算细胞的群体倍增时间结果：M-H7402细胞为33.9小时，H7402细胞为36.3小时。见图4。

(5)细胞周期检测：流式细胞仪检测检测结果显示，M-H7402细胞G1期为58.1％，S期为16.8％，G2期为20.9％；H7402细胞G1期为55.9％，S期为20.6％，G2期为20.6％。根据细胞增殖指数公式PI＝(G₂M+S)÷(G₀/G₁+S+G₂M)×100％，计算结果：M-H7402细胞PI＝39.4％，H7402细胞PI＝42.2％，二者无显著差别。见图5。图中：A.H7402；B.M-H7402。

(6)甲胎蛋白(alfa fetal protein，AFP)的鉴定：RT-PCR结果显示，M-H7402细胞和H7402细胞均有AFP的表达，表明M-H7402细胞为肝癌细胞。见图6。图中，1.5％琼脂糖电泳检测AFP结果：Lane 1，DL2000 Marker；Lane 2，H7402；Lane 3，LM-H7402。

(7)肿瘤相关蛋白检测：肿瘤相关蛋白的检测结果显示，C-myc在亲本细胞H7402和M-H7402细胞中均有高水平的表达，(图7A)与亲本细胞H7402相比，肿瘤转移抑制基因nm23的表达水平在M-H7402细胞中下调，表达水平低(图7A，B)，经Bandscan软件分析，H7402细胞和M-H7402细胞中nm23相对于Tubulin灰度值的百分值分别为10.7％和3.7％。，图中肿瘤相关蛋白Western blot检测结果A.：Lane 1：H7402；Lane 2：M-H7402。B.nm23相对灰度值，1：H7402；2：M-H7402。

(8)将1×10⁷个M-H7402细胞，回接SCID鼠，方法同前。接种50天后，将荷瘤SCID鼠引颈处死，取在接种部位生长的肿瘤组织，做病理观察，为肿瘤细胞。证明M-H7402细胞具有成瘤能力。见图8。(100倍)

实施例2

一种人肝癌转移细胞系的建立方法，包括如下步骤：

(1)接种SCID鼠：取4只SCID鼠，雌雄不限，体重分别为13.4g、13.6g、14.3g、15.8g，鼠龄4-7周，饲养于无特殊病原体环境，将对数生长期的人肝癌细胞H7402制成O.2ml的单细胞悬液，含有1×10⁷个细胞，接种于经Cs¹³⁷γ射线照射过的SCID鼠腋背部皮下，SCID鼠由中国医学科学院天津血液学研究所提供；

(3)原代培养：在接种人肝癌细胞H7402后第55天时，将荷瘤SCID鼠引颈处死，无菌解剖，取出肺脏，进行原代培养，方法如下：用pH7.2的D-Hanks生理缓冲液漂洗组织块3次，去除血液、脂肪、神经组织、***和坏死组织；用剪刀将肺组织剪切成大小约1mm³小块；将剪切好的组织块用接种针送入培养瓶，并均匀摆置，间隔0.5cm，盖好瓶盖；轻轻翻转培养瓶，使瓶底向上，在37℃孵箱内空气中含5％CO₂条件下培养；2小时后，将培养瓶慢慢翻转平放，向瓶内加入8ml RPMI1640培养液，其中含有20％胎牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素，静置培养；原代培养每3天换液一次，去除已漂浮的组织块和残留的血细胞。

(4)传代培养：在细胞从组织块周围长出后，待细胞布满培养瓶底部时，将组织块去掉，进行细胞传代，具体步骤如下：移去原代培养的培养瓶内的细胞培养液，向细胞培养瓶中加入2ml质量体积百分比为0.25％胰蛋白酶溶液消化细胞，放置在37℃孵箱中3分钟，观察到细胞出现回缩、细胞间隙增大，吸除胰蛋白酶溶液，用磷酸缓冲液洗去培养瓶内残留的胰蛋白酶溶液；加入8ml内含20％胎牛血清RPMI1640培养液，用吸管轻轻吹打瓶底部细胞，使之脱离瓶底部形成细胞悬液，计数，分别接种于新的培养瓶，当细胞传代到第三代以后，加入的RPMI1640培养液内含胎牛血清为10％，细胞生长良好，形态逐渐均一。

实施例3

一种人肝癌转移细胞系的建立方法，包括如下步骤：

(1)接种SCID鼠：取3只SCID鼠，雌雄不限，体重14.4g、15.3g、15.7g，鼠龄4-7周，饲养于无特殊病原体环境，将对数生长期的人肝癌细胞H7402制成0.2ml的单细胞悬液，含有1×10⁷个细胞，接种于经Cs¹³⁷γ射线照射过的SCID鼠腋背部皮下，SCID鼠由中国医学科学院天津血液学研究所提供；

(3)原代培养：在接种人肝癌细胞H7402后第67天时，将荷瘤SCID鼠引颈处死，无菌解剖，取出肺脏，进行原代培养，方法如下：用pH7.2的D-Hanks生理缓冲液漂洗组织块3次，去除血液、脂肪、神经组织、***和坏死组织；用剪刀将肺组织剪切成大小约1mm³小块；将剪切好的组织块用接种针送入培养瓶，并均匀摆置，间隔0.5cm，盖好瓶盖；轻轻翻转培养瓶，使瓶底向上，在37℃孵箱内空气中含5％CO₂条件下培养；4小时后，将培养瓶慢慢翻转平放，向瓶内加入9ml RPMI1640培养液，其中含有20％胎牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素，静置培养；原代培养每3天换液一次，去除已漂浮的组织块和残留的血细胞。

(4)传代培养：在细胞从组织块周围长出后，待细胞布满培养瓶底部时，将组织块去掉，进行细胞传代，具体步骤如下：移去原代培养的培养瓶内的细胞培养液，向细胞培养瓶中加入2ml质量体积百分比为0.25％胰蛋白酶溶液消化细胞，放置在37℃孵箱中3分钟，观察到细胞出现回缩、细胞间隙增大，吸除胰蛋白酶溶液，用磷酸缓冲液洗去培养瓶内残留的胰蛋白酶溶液；加入9ml内含20％胎牛血清RPMI1640培养液，用吸管轻轻吹打瓶底部细胞，使之脱离瓶底部形成细胞悬液，计数，分别接种于新的培养瓶，当细胞传代到第三代以后，加入的RPMI1640培养液内含胎牛血清为10％，细胞生长良好，形态逐渐均一。

Claims

1.一种人肝癌转移亚克隆细胞系，其特征是所述人肝癌转移亚克隆细胞系与亲本细胞系H7402形成配对关系，所述人肝癌转移亚克隆细胞系是用下述方法建立的：

(4)传代培养：将去掉组织的细胞进行细胞传代培养，具体步骤如下：移去原代培养的培养瓶内的细胞培养液，向培养瓶中加入2ml质量体积百分比为0.25％胰蛋白酶溶液，置37℃孵箱中2-3分钟，观察到细胞出现回缩、细胞间隙增大，吸除胰蛋白酶溶液，加入8-10ml内含20％胎牛血清RPMIl640培养液，使之形成细胞悬液，计数，接种于新的培养瓶，当细胞传代到第三代时，加入的RPMI1640培养液内含胎牛血清为10％，细胞生长良好，形态逐渐均一，即建立了一种来源于亲本人肝癌细胞H7402的肝癌转移亚克隆细胞系。

2.一种人肝癌转移亚克隆细胞系的建立方法，其特征是包括如下步骤：

(1)接种SCID鼠：将对数生长期的人肝癌细胞H7402单细胞悬液，细胞数量为l～4×10⁷/0.2ml接种于经Cs¹³⁷γ射线照射过的SCID鼠腋背部皮下；