CN1338943A - 利用vegf－c或vegf－d基因或蛋白预防再狭窄 - Google Patents

Abstract

本发明提供了利用血管内皮生长因子C(VEGF－C)和/或血管内皮生长因子D(VEGF－D)基因或蛋白预防血管狭窄或再狭窄的材料和方法。

Description

利用VEGF-C或VEGF-D基因或蛋白预防再狭窄

发明领域

本发明为防止血管狭窄和再狭窄提供了材料和方法，并且主要涉及心血管医学领域。

发明背景

在全世界，冠状动脉疾病一直是发病率和死亡率的主要原因，尤其是在美国和欧洲。对于这些疾病，经皮冠脉腔血管成形术(例如，带有或不带有冠脉内支架的气囊血管成形术)在当前是对这类疾病常用和成功的治疗方法，仅在美国每年就进行成百上千次。然而，通常在血管成形术后的6个月内，在三分之一到一半的这些血管再造中发生再狭窄。估计仅在美国每年用于再狭窄的经济费用为20亿美圆。[Feldman，et al.，心血管研究，32：194-207(1996)，在这里引入本文作为参考]，尸检和动脉粥样斑块旋切研究已经确定内膜增生是再狭窄损伤的主要组织学表现[Cerek et al.，Am JCardiol.，68：24C-33C(1991)]。

在外周血管中进行的血管成形术中，再狭窄仍然是临床上关注的问题。在进行用于心脏旁路治疗或用于外周缺血或间歇性跛足治疗的血管移植(例如移植静脉或移植动脉)之后，狭窄同样是临床上关注的问题，(例如上膝股-腘动脉旁路移植)。

在Mazur等，Texas心脏研究杂志，21：104-111(1994)中指出，再狭窄是动脉对损伤的主要应答，该损伤是由破坏内皮细胞内膜层和中层基底平滑肌细胞的经皮冠脉血管成形术引起。作者指出再狭窄过程的机制涉及由血小板、内皮细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞分泌的多种生长因子，并且平滑肌细胞的增殖构成了其主要致病特点。按照作者的说法，已证实这些平滑肌细胞的增殖对机械和药理治疗耐受。最近，其他人已经提出平滑肌增殖在再狭窄中是否是倒数第二重要的问题。见Libby，循环研究，82：404-406(1998)。

Narins等，循环，97：1298-1305(1998)综述了冠脉内支架在防止再狭窄方面的应用及其优缺点。Debbas等，美国心脏杂志，133：460-468(1997)中讨论了为治疗支架内再狭窄在一个支架内放置支架。

Chang和Leiden，Semin.Intervent.Cardiol.，1：185-193(1996)(在此引入本文作为参考)综述了用于治疗再狭窄的体细胞基因治疗方法。Chang和Leiden指出复制缺陷型腺病毒包括一个有前途的和安全的载体***，其直接用于再狭窄预防的基因治疗，因为这些病毒能有效地感染包括血管平滑肌在内的各种细胞；可制备高滴度的这类病毒(例如，10¹⁰-10¹²噬菌斑形成单位每毫升)；这些病毒可以接纳外源基因***，如长度大小为7-9kb的碱基；这些病毒可经标准的导管经皮传递；而且这些病毒不整合入宿主基因组。Chang与Leiden及Feldman等，出处同上，还综述了细胞毒性和细胞抑制性基因治疗方法，其被设计用来杀死血管平滑肌细胞或抑制其增殖，这些血管平滑肌细胞被认为是形成新内膜的原因，新内膜的形成是再狭窄的特点。

Riessen和Isner，J.Am.Coll.Cardiol.，23：1234-1244(1994)(在此引入本文作为参考)综述了用于血管内药物传递的装置和用于血管内基因治疗的载体。

Cerek等，美国心脏杂志，68：24C-33C(1991)提出通过抑制生长因子介导的动脉损伤复原来预防再狭窄。其中讨论了血小板衍生生长因子(PDGF)、血小板反应蛋白、***1(IGF-1)，成纤维细胞生长因子(FGF’s)、转化生长因子α(TGF-α)和β(TGF-β)，表皮生长因子(EGF)的潜在作用。

Isner和Asahara(国际专利申请公开号WO 98/19712，在此引入作为参考)建议通过分离患者的内皮始祖细胞并将其重新输还给患者，在血管成形术后治疗损伤的血管并加速内皮细胞重建。作者指出，应用血管内皮生长因子(VEGF)或基底成纤维细胞生长因子(bFGF)等血管发生促进性生长因子的效力，可以被负载VEGF或bFGF使其发挥作用的血管内皮细胞的缺乏所限制。

Martin等(国际专利申请公开号WO 98/20027，在此引入作为参考)建议利用VEGF基因或蛋白治疗或防止血管的狭窄或再狭窄。作者提出VEGF的任何有益作用来自于一种不同的作用机制，而不是VEGF活性中与内皮受损时刺激内皮细胞再建相关的VEGF活性为基础的机制。

Callow等，生长因子，10：223-228(1994)指出将血管渗透因子(又称VEGF)给被气囊血管成形术诱导形成内皮脱落的家兔静脉注射，与对照组相比，导致内皮细胞再生增加。作者还指出基底成纤维细胞生长因子(bFGF)可有效促进内皮重建，但这种内皮重建伴随着新内皮损伤范围的增加。

Asahara等，循环，94：3291-3302(12月15日，1996)指出在气囊损伤家兔中，将CMV-人-VEGF₁₆₅转基因经皮导管导入局部，加速了内皮重建，并且导致减少内膜的增厚。在相关报道中，Van Belle等，J.Am.Coll.Cardiol，29：1371-1379(5月，1997)指出通过CMV-人-VEGF₁₆₅转基因的传导可以加速支架内皮化，并且伴随着内膜增厚的减轻。

Morishita等，动脉粥样硬化和血栓形成杂志，4(3)：128-134(1998)指出肝细胞生长因子(HGF)对人类内皮细胞具有比VEGF更强的有丝***活性，并且假设HGF基因治疗对例如血管成形术后的再狭窄等心血管疾病的治疗有潜在的治疗价值。Morishita等还指出人们对仅刺激内皮细胞的生长因子了解很少，但是对血管平滑肌细胞则不是这样。

De Young和Dichek，循环研究，82：306-313(1998)指出VEGF基因传递目前不是以在人冠脉再狭窄中的应用为目的，并且两个独立的研究表明VEGF传递实际上可以使动脉内膜过度增生恶化。

Brown等，美国专利号5795898提出用PDGF、FGF、EGF或VEGF抑制剂传递信号以抑制动脉粥样硬化加速形成，其涉及血管成形术后冠脉或其它动脉的再狭窄。

上述的讨论证实对改善血管成形术的材料和/或方法，和/或辅助治疗方法以减轻再狭窄的长期需要是持续存在的。

发明概述

本发明通过提供用于预防哺乳动物血管狭窄或再狭窄的方法，致力于医药领域中的长期需要。

例如，本发明提出了用来防止血管狭窄或再狭窄的一种治疗哺乳动物主体的方法，包括给需要防止血管狭窄或再狭窄治疗的哺乳动物主体给药一种包括多核苷酸的组合物，该多核苷酸包括编码血管内皮生长因子C(VEGF-C)多肽的核苷酸序列。在一个优选实施方案中，所述主体是人。

当考虑VEGF-C多核苷酸单纯作为用来预防狭窄的预防性治疗而被给药时，在本发明的优选实施方案中，考虑在经皮腔内冠脉血管成形术之前即刻，和/或同时，和/或之后即刻给药以预防主体血管再狭窄为目的的多核苷酸。在本发明的另一优选实施方案中，在旁路手术(如冠状动脉旁路搭桥术)之前，期间，和/或之后即刻给药所述多核苷酸，来预防所移植的血管中或附近的狭窄或再狭窄，尤其是移植物本身部位的狭窄。在另一实施方案中，在血管末梢中进行血管移植以治疗末梢性缺血或间歇性跛行之前，期间和/或之后给药所述多核苷酸。狭窄或再狭窄的预防是指为减少狭窄或再狭窄的总量/严重程度，和/或彻底消除狭窄或再狭窄而进行的预防性治疗，该狭窄或再狭窄经常在这样的外科手术中发生。所述多核苷酸以有效促进VEGF-C多肽在所述哺乳动物主体中表达的量和形式包括在所述组合物中，从而防止血管的狭窄和再狭窄。

在优选实施方案中，哺乳动物主体是人。例如，主体是患有冠状动脉疾病的人，其被心脏病医生鉴定为可以从气囊血管成形术(有或没有血管内支架的***)或冠脉旁路搭桥术中受益的候选患者。还考虑了本发明方法在其它哺乳动物主体中的实施，尤其是通常用于作为证明在人中治疗效果的模型的哺乳动物(例如，灵长类动物、猪、犬或家兔)。

对于本发明方法的实践，术语“VEGF-C多肽”意指具有VEGF-C或VEGF-C类似物氨基酸序列(如本文他处更详细的定义一样)和在体内具有人VEGF-C的减轻再狭窄效应的任何多肽，该效应在此通过在家兔模型中进行的实施例证实。术语“VEGF-C多核苷酸”意指包括编码VEGF-C多肽的核苷酸序列的任何多核苷酸(如DNA或RNA，单链或双链)。由于众所周知的遗传密码的简并性，编码任何指定VEGF-C多肽的VEGF-C多核苷酸序列有多套。

在对人的治疗中，具有人VEGF-C氨基酸序列的VEGF-C多肽高度优选，包括人VEGF-C cDNA序列的多核苷酸也高度优选。“人VEGF-C”意指相应于或人VEGF-C基因的任何等位基因编码的天然蛋白(前蛋白、部分加工蛋白、或完全加工的成熟蛋白)的多肽，或指包含天然成熟蛋白的生物学活性片段的多肽。例如，人的VEGF-C包括SEQ ID NO：2所示的连续氨基酸序列，该序列足以使所述多肽结合并刺激VEGFR-2和/或VEGFR-3在表达这类受体的细胞中磷酸化。具体如包含SEQ ID NO：2的第131-211氨基酸的多肽。例如，考虑了具有包含SEQ ID NO：2的一段连续序列的多肽，该连续序列在其氨基末端具有选自SEQ ID NO：2的30-131位点中的氨基酸，在其羧基末端具有选自SEQ ID NO：2的211-419位点中的氨基酸。如本文别处更为详细的解释，VEGF-C的生物学活性的增强，尤其是那些通过VEGFR-2介导的活性，通过前肽的氨基末端和羧基末端的加工而增强。因此，优选选自SEQ ID NO：2的102-131位点中的氨基末端，尤其优选选自SEQ IDNO：2的103-131位点中的氨基末端。同样，优选选自SEQ IDNO：2的211-227位点中的羧基末端。如上所述，术语“人VEGF-C”还指包括以SEQ ID NOs：1和2所示序列为特征的人VEGF-C的等位基因变体编码的多肽。

而且，因为治疗性VEGF-C被作为重组VEGF-C施用或间接通过体细胞基因治疗而应用，制备和应用人VEGF-C的类似物(以及编码此类多肽的多核苷酸)在本领域技术范围之内，所述类似物中一个或更多的氨基酸被***、缺失或被其它的氨基酸置换，尤其是保守置换，但仍保持抗再狭窄生物学活性。保留了抗再狭窄VEGF-C生物学活性的类似物被考虑为用于本发明的VEGF-C多肽。在优选的实施方案中，考虑将具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个此类修饰并且保留了抗再狭窄VEGF-C生物学活性的类似物作为用于本发明的VEGF-C多肽。编码这些类似物的多核苷酸用传统的PCR、定点诱变和化学合成技术制备。

被考虑作为VEGF-C多肽的还有非人类哺乳动物或鸟类VEGF-C多肽和多核苷酸。“哺乳动物VEGF-C”意指相应于任何哺乳动物VEGF-C基因的任何等位基因编码的天然蛋白(前蛋白、部分加工蛋白、完全加工的成熟蛋白)的多肽，或指包含天然成熟蛋白的生物学活性片段的多肽。术语“哺乳动物VEGF-C多肽”包括哺乳动物VEGF-C的类似物，其具有哺乳动物VEGF-C的体内减轻再狭窄的作用。应用编码人VEGF-C基因进行的转基因治疗在家兔模型中，可以有效的预防再狭窄，这个事实是VEGF-C蛋白种间治疗有效性的证据。

不管选择何种VEGF-C多肽，其优选包括与所述VEGF-C多肽序列融合在一个读码框内的编码分泌信号肽的核苷酸序列。分泌信号肽指导表达该多核苷酸的细胞分泌VEGF-C多肽，并且被细胞从分泌的VEGF-C多肽中切割下来。例如，VEGF-C多核苷酸可以编码完整的SEQ ID NO：2所示前VEGF-C蛋白序列，或者可以编码与完整加工的VEGF-C(如SEQ INNO：2的103-227氨基酸)或VEGF-C类似物编码序列融合在同一读框中的VEGF-C信号肽。而且，不要求信号肽来源于VEGF-C。信号肽序列可以是另一种分泌蛋白的信号肽序列，或者可以是可有效指导所述哺乳动物主体细胞分泌的完全由人工合成的信号肽。

在一个实施方案中，本发明的VEGF-C多核苷酸包括在下述的示范性严谨杂交条件下与互补于SEQ ID NO：1所指定的人VEGF cDNA的多核苷酸杂交的核苷酸序列，该严谨杂交条件是：在50％甲酰胺，5X SSC，20 mMNaPO₄，pH 6.8条件下42℃杂交，并用1 X SSC在55℃洗涤30分钟；并且其中的核苷酸序列编码可结合并刺激人VEGFR-2和/或VEGFR-3的多肽。应理解根据被杂交序列的长度和GC核苷酸含量可改变这些例举的条件。本领域中适合于确定适当杂交条件的标准配方参见Sambrook等，分子克隆：实验室指南(第二版，冷泉港实验室出版社，1989)§§9.47-9.51。

在优选的实施方案中，VEGF-C多核苷酸进一步包括用来促进VEGF-C基因治疗的附加序列。在一个实施方案中，将“裸”VEGF-C转基因(即没有与用来促进转染的病毒、脂质体或其它载体相连的转基因)用于基因治疗。在这个实施方案中，为了在靶哺乳动物细胞中表达，VEGF-C多肽优选包括适当的启动子和/或增强子序列(例如巨细胞病毒启动子/增强子[Lehner等，临床微生物学杂志，29：2494-2502(1991)；Boshart等，细胞，41：521-530(1985)]、Rous肉瘤病毒启动子[Davis等，人类基因治疗，4：151(1993)]、Tie启动子[Korhonen等，血液，86(5)：1828-1835(1995)]或猿病毒40启动子)，启动子可操作地连接在VEGF-C编码序列的上游(即5’端)。VEGF-C多核苷酸还优选包括可操作地连接在VEGF-C编码序列的下游(即3’端)的适当的多聚腺苷酸序列(例如，SV40或人生长激素基因多聚腺苷酸序列)。该多核苷酸可以进一步任选包括一些序列，这些序列仅用于促进所述载体在如细菌中的大规模产生，如细菌的复制起点和编码筛选标记的序列。然而，在优选的实施方案中，根据本发明的方法，这些额外序列在给人给药之前至少被部分切割。人们可以应用在文献中叙述的用于其它转基因的方法，制备并给药这些多核苷酸来实现成功的基因治疗。例如，见Isner等，循环，91：2687-2692(1995)；Isner等，人类基因治疗，7：989-1011(1996)，在此引入本文作为参考。

可用任何适当的载体介导VEGF-C转基因进入宿主细胞。已在文献中描述的载体实例包括复制缺陷型逆转录病毒(包括慢病毒载体但并不限此)[Kim等，病毒学杂志，72(1)：811-816(1998)；Kingsman和Johnson，ScripMagazine，1998，10月，43-46页]、腺伴随病毒载体[Gnatenko等，医学调查杂志，45：87-98(1997)]、腺病毒载体[例如见美国专利5792453；Quantin等，美国科学院院刊，89：2581-2584(1992)；Stratford-Perricadet等，临床调查杂志，90：626-630(1992)；Rosenfeld等，细胞，68：143-155(1992)]、Lipofectin介导的基因转移(BRL)、脂质体载体[例如见美国专利No 5631237(包含仙台病毒蛋白的脂质体)]以及其组合物。所有上述文献全文引入本文作为参考。复制缺陷型腺病毒载体组成优选的实施方案。

在应用病毒载体的实施方案中，优选的多核苷酸还包括上述适当的启动子和多聚腺苷酸序列。而且很明显，在这些实施方案中所述多核苷酸进一步包括与编码VEGF-C多肽的序列可操作地相连接的载体多核苷酸序列(例如，腺病毒多核苷酸序列)。

因此，在一个实施方案中，给药的组合物包括载体，其中该载体包括VEGF-C多核苷酸。在优选实施方案中，载体是腺病毒载体。在高度优选的实施方案中，腺病毒载体是复制缺陷型，即由于缺乏腺病毒基因组中病毒复制的必需序列，其不能在哺乳动物主体中复制。例如，发明者考虑了一种方法，其中载体包括复制缺陷型腺病毒，该腺病毒包括与启动子可操作地相连接并且在其两个末端为腺病毒多核苷酸序列的VEGF-C多核苷酸。

根据本发明的方法被给药的组合物优选(除所述多核苷酸或载体外)包括药理学上可接受的载体溶液，例如水、生理盐水、磷酸缓冲盐、葡萄糖或其它常规用于血管内给药的载体溶液。还考虑了多基因治疗，在此情况中，组合物可选择性的包括VEGF-C多核苷酸/载体和另一种用来预防再狭窄的多核苷酸/载体。用于与VEGF-C转基因共转染的候选基因实例在上面引用的文献中已经描述，包括编码细胞毒性因子、细胞抑制因子、内皮生长因子和平滑肌细胞生长/迁移抑制剂的基因。如同下面更为详细的叙述，VEGF-D转基因是用于与VEGF-C转基因共同给药的优选候选基因。还特别考虑了VEGF转基因的共同给药。

根据本方法进行的“给药”可以用任何医学上可接受的用于将药物直接或间接导入哺乳动物血管的方法进行，包括注射、口服摄入、鼻内或局部给药等，但并不限于此。在优选的实施方案中，包括VEGF-C多核苷酸的组合物的给药优选通过血管内给药进行，例如通过静脉内、动脉内或冠状动脉内注射进行。

在高度优选的实施方案中，组合物被局部给药，例如给药到血管成形术或旁路搭桥术部位。例如，所述给药包括将含转基因的组合物通过导管介导进入该哺乳动物主体的血管，尤其是进入该哺乳动物主体的冠状动脉。在Lincoff等，循环，90：2070-2084(1994)；Wilensky等，心血管医学进展，3：163-170(1993)中综述了用于局部给药的材料和方法实例，二文在此引入本文作为参考。例如，组合物的给药是用输注-灌注气囊导管(优选微孔气囊导管)进行的，所述导管如那些在文献中叙述的用于冠脉内药物注入的导管。例如见美国专利号5713860(带有注入阵列的血管内导管)、美国专利号5087244、美国专利号5653689、Wolinsky等，J.Am.Coll.Cardiol，15：475-481(1990)(Wolinsky注入导管)和Lambert等，冠状动脉疾病，4：469-475(1993)，所有这些在此引入本文作为参考。例如，在Mazur等，得克萨斯心脏研究所杂志，21；104-111(1994)中描述了用于定点体细胞基因治疗的这些导管的应用，其在此引入本文作为参考。在将VEGF-C转基因包含在腺病毒载体中给药的实施方案中，所述载体优选以10⁷-10¹³个病毒颗粒的效价包含在可药用赋形剂溶液中被给药，更优选10⁹-10¹¹个病毒颗粒的效价。腺病毒载体组合物优选在15秒到30分钟内注入，更优选1-10分钟内。

例如，在由于冠状动脉的单个或多个损伤而患有心绞痛的患者和根据初步冠脉照影结果需进行PTCA的患者中，一种治疗方案涉及进行PTCA，它是通过7F指示导管根据标准的临床操作经股动脉途径进行的。如果单独用PTCA没有获得理想的效果，则进行血管内支架移植(非理想结果定义为根据目测，及B或C型解剖，残余的狭窄大于腔径的30％)。在进行血管成形术后(但是于支架移植前)即刻用输注-灌注气囊导管在气囊膨胀部位以复制缺陷型腺病毒VEGF-C载体进行动脉基因转移。选择导管的尺寸，使之与血管照影照片中测量的动脉尺寸相匹配，例如直径在3.0-3.5F之间变化。使气囊膨胀至最佳压力，并且在10分钟内用1.15×10¹⁰效价的病毒以0.5ml/min的速率进行基因转移。

在另一实施方案中，考虑了用凝胶包被的导管进行血管内给药，这与在文献中叙述的介导其它转基因的方法一样。见美国专利号5674192(用牢固粘附的可膨胀水凝胶聚合物包被导管)、Riessen等，人类基因治疗，4：749-758(1993)、Steg等，循环，96：408-411(1997)和90：1648-1656(1994)，所有这些在此引入本文作为参考。简言之，在回体(ex vivo)实验中用DNA溶液(如VEGF-C多核苷酸)一次或数次涂抹用水凝胶聚合物(例如，Slide withHydroplus，Mansfield Boston Scientific Crop.，Waertown，MA)包被的膨胀的血管成形术导管气囊表面。Hydroplus包被是疏水聚丙烯酸聚合物，它可以与气囊交联形成与气囊紧密粘附的高分子量水凝胶。可使DNA覆盖的水凝胶在给气囊放气之前干燥。在进行血管成形术时，气囊在血管内再充气使DNA转移至血管壁。

而在另一实施方案中，使用固定在血管成形术导管气囊或支架上的或与之整合的可膨胀弹性膜或相似结构，传递VEGF-C转基因。例如见美国专利5707385，5697967，5700286，5800507，5776184，所有这些在此引入本文作为参考。

在另一变化中，在血管外给药含VEGF-C转基因的组合物，例如用一种装置来包裹或包被血管的一部分。例如见国际专利公开号WO 98/20027叙述了(如在旁路搭桥术期间)放置在动脉外侧的套环，其用来通过质粒或脂质体载体将转基因传递到动脉壁，本文在此引入作为参考。

在另一变化中，用VEGF-C转基因在回体实验中转染内皮细胞或内皮祖细胞，将转染细胞给药于哺乳动物主体。用遗传修饰的内皮细胞支持血管移植物生长的方法实例在美国专利号5785965中叙述，其在此引入本文作为参考。

如果哺乳动物主体正在接受血管移植，含VEGF-C转基因的组合物可以直接应用于分离的血管片段，然后将该片段植入体内。

另一方面，本发明提供了用来防止血管狭窄或再狭窄的哺乳动物主体治疗方法，包括给需要预防狭窄或再狭窄治疗的哺乳动物主体给药组合物的步骤，该组合物包括VEGF-C多肽，用有效防止血管狭窄或再狭窄的量治疗。在优选的实施方案中，给药步骤包括在哺乳动物主体内埋植血管内支架，所述支架用所述组合物包被或充填。在上面引用的文献中叙述了用于构建药物包被或药物充填的支架的示范性材料，并且在Lincoff等，循环，90：2070-2084(1994)中进行了综述。在另一优选实施方案中，所述组合物包括由如PGLA等可生物降解的聚合物、非可降解聚合物或生物聚合物(如淀粉)组成的微粒子，这些粒子中包裹或充填了VEGF-C多肽。应用例如血管成形术灌输导管等，将这些粒子传递到血管内壁。在Wilensky等，心血管医学进展，3：163-170(1993)中(在此引入本文作为参考)综述了用于在局部获得持续的药物传递的其它技术。

还考虑了血管成形术或旁路搭桥术后通过一次或更多次静脉注射的给药。由于VEGF-C受体在增殖的内皮细胞上表达，使VEGF-C多肽定位在手术部位。重组表达融合多肽形式的VEGF-C(如Shih等，美国国家科学院院刊，87：1436-1440(1990)所述，与载脂蛋白B-100寡肽融合)进一步促进定位。还考虑了VEGF-C多核苷酸与VEGF-C多肽的联合给药。

在另一实施方案中，本发明提供了VEGF-C多核苷酸或VEGF-C多肽在制备药剂中的应用，所制备的药剂用于治疗或防止血管狭窄或再狭窄。

另一实施方案中，本发明提供了用来防止血管狭窄或再狭窄的哺乳动物主体治疗方法，包括给需要预防狭窄或再狭窄治疗的哺乳动物主体给药含多核苷酸的组合物的步骤，该多核苷酸包括编码血管内皮生长因子D(VEGF-D)多肽的核苷酸序列。除了使用编码VEGF-D的多核苷酸，这些方法的实施基本上同在此叙述的关于编码VEGF-C的多核苷酸的实施方法一样。在Achen等，美国国家科学院院刊，95(2)：548-553(1998)、国际专利公开号WO98/07832，1998年2月26日出版、Genebank中登记号AJ000185(所有这些在此引入作为参考)中给出了详细的人VEGF-D基因和蛋白的描述。前VEGF-D的cDNA和推导的氨基酸序列在SEQ ID Nos：3和4中给出。当然，由于众所周知的遗传密码的简并性，存在编码多核苷酸的多个VEGF-D序列，根据在此提出的方法可以使用其中任何一种。

与关于VEGF-C的描述一样，编码体内拥有人VEGF-D之抗再狭窄效应的VEGF-D片段、VEGF-D类似物、VEGF-D等位基因和种间变体等的多核苷酸均被视为包括在本发明中。

在另一实施方案中，本发明提供了用来防止血管狭窄或再狭窄的哺乳动物主体治疗方法，包括给需要预防狭窄或再狭窄治疗的哺乳动物主体给药组合物的步骤，该组合物包括VEGF-D多肽，用有效防止血管狭窄或再狭窄的量治疗。这些方法的实施基本上同在此叙述的关于VEGF-C多肽的

实施方法一样。

在一个相关的方面中，本发明提供了用于实施上述方法的材料和设备。

例如，被描述用于本发明方法的多核苷酸、多肽、载体、组合物等本身就被作为本发明的各个方面。

同样，本发明还提供了用于治疗循环***疾病的外科手术装置，如血管内支架、气囊导管、灌输-注入导管、血管外套环、弹性膜等等，它们通过用含VEGF-C多核苷酸、VEGF-C多肽、VEGF-D多核苷酸和/或VEGF-D多肽的组合物包被、充填、粘附或包裹而得到改善。

例如，在一个实施方案中，本发明提供了以改良为特点的血管内支架，所述改良中该支架用所述组合物包被或充填，包含至少一种选自VEGF-C多核苷酸、VEGF-C多肽、VEGF-D多核苷酸和VEGF-D多肽的抗再狭窄药剂。以这种方式改善的支架实例见美国专利号5800507和5697967(Medtronic Inc，其叙述了一种腔内支架，该支架包括纤维蛋白和能提供再狭窄治疗的可洗脱的药物)、美国专利号5776184(Medtronic Inc，其叙述了具有孔性包被的支架，孔性包被包括聚合物和与该聚合物共同形成固体或固体/溶液形式的治疗物质)、美国专利号5799384(Medtronic Inc，其叙述了用来与体腔联系的具有生物相容性聚合物表面的弹性、圆柱型、金属支架)、美国专利号5824048和5679400、和美国专利号5779729，所有这些在此特别引入本文作为参考。在传统血管成形术中移植这些支架将导致比移植传统支架更少的再狭窄。在这个意义上，该支架的生物相容性得到改善。

在另一实施方案中，本发明提供了用于将治疗药物传递到血管的以改良为特点的血管外套环，所述改良中该套管被组合物包被、充填或包封，其包含至少一种选自VEGF-C多核苷酸、VEGF-C多肽、VEGF-D多核苷酸和VEGF-D多肽的抗再狭窄药剂。在国际专利公开号WO98/20027(Eurogene，所述套环含有沿血管***密封并限定可容纳抗再狭窄药剂之空间的环体)中叙述了以这种方式改良的套管实例，其在此引入作为参考。

在另一实施方案中，本发明提供了以改良为特点的用于包裹支架的多聚物膜，所述改良中该膜用组合物包被或充填，其包含至少一种选自VEGF-C多核苷酸、VEGF-C多肽、VEGF-D多核苷酸和VEGF-D多肽的抗再狭窄药剂。在美国专利号5700286和5707385(Advanced Cardiovascular SystemInc，用预防再狭窄的药物包被或充填的生物可吸收的聚合物材料制成并且可与血管内支架附着的套)中叙述了以这种方式改良的膜实例。

同样，本发明包括含有本发明的化合物或组合物的试剂盒，所述化合物或组合物以促进其在本发明方法中应用的方式包装。在最简单的实施方案中，这种试剂盒包括在此叙述的对本发明的实施有用的化合物或组合物(例如VEGF-C或VEGF-D多核苷酸或多肽)，所述化合物或组合物包装于密封的瓶子或导管等容器中，标签贴在容器上或装在包装中，该标签叙述了用来实施本发明方法的化合物或组合物的用途。优选以单位剂量的形式包装此化合物或组合物。在另一实施方案中，本发明的试剂盒同时包括VEGF-C或VEGF-D多核苷酸或多肽组合物，将它们与如支架、导管、血管外套管、聚合物膜等有助于实施本发明移植方法的物理装置一起进行包装。在另一实施方案中，本发明的试剂盒同时包括VEGF-C或VEGF-D多核苷酸或多肽组合物，将它们与在此叙述的有助于将VEGF-C/VEGF-D传递给患者的水凝胶聚合物、微粒子聚合物或其它赋形剂一起包装。

在这整个应用过程中，本发明的其它特点和变化对本领域的技术人员是明显的，而且认为这些特点属于本发明。

同样，在此叙述的本发明的特点可以与同样为本发明一方面的其它实施方案组合，不管这些特点的联合是否在上面的叙述中作为本发明的一个方面或实施方案而被具体提及。上文提及作为本发明关键的限制不能变动；不受本文所述关键点限制的本发明的变化被认为属于本发明。

除上述以外，本发明另包括在任何意义上比上述具体变化范围更小的本发明所有实施方案。虽然申请人发明了所附权利要求的全部，但其并不想包含其他人在此领域已作的工作。因此，当专利局或其他实体或个人提请申请人注意某项权利要求包括了法定的现有技术时，申请人保留根据专利法进行修改的权利，以重新定义该权利要求的主体，使之特别排除上述法定现有技术或使之与现有技术相比有明显改变。经这类权利要求的修改而定义的本发明改变也认为属于本发明。

附图简述

图1描绘一段血管的横切视图，该血管中***了带有保护壳的传递药物所用气囊导管，该保护壳在***和定位期间保护该气囊。

图2A描绘可膨胀膜的透视图，其具有两层，在两层的边缘相互结合之前，二者被隔开。

图2B描绘图2A的膜的透视图，其已经被卷成管状而且对边相接。

图3A和3B描绘包绕一部分血管的血管外套管示意图，3A为透视图，3B为纵切视图。

图4A描绘一段线材的剖视图，该线材包被有可容纳(如充填)药物组合物的聚合物或凝胶。

图4B描绘图4A之线材所形成的血管内支架的透视图。

发明详述

本发明基于以下发现，当对血管受创，如在传统气囊血管成形术时发生血管损伤的哺乳动物给药编码人血管内皮生长因子C(VEGF-C)的基因时，可以减轻或消除损伤血管的再狭窄。实施例1详述了一项体内控制实验，其证实VEGF-C转基因对预防再狭窄有效。实施例2提供了并列的比较研究，该研究证实VEGF-C的抗再狭窄效应好于用可比较的方式给药的VEGF的抗再狭窄效应。

1998年2月2日提交的国际专利申请PCT/US98/01973，并于1998年8月6日公开为国际公开号WO 98/33917、Joukov等，生物化学杂志，273(12)：6599-6602(1998)、Joukov等，EMBO J，16(13)：3898-3911(1997)中(所有这些全文引入本文作为参考)，详述了命名为血管内皮生长因子C(VEGF-C)的生长因子以及天然人、非人类哺乳动物和鸟类的编码VEGF-C和VEGF-C变体及类似物的多核苷酸序列。如同在这些文献中详细解释的一样，人VEGF-C在人细胞中最初产生的是419个氨基酸组成的前VEGF-C多肽。人前VEGF-C的cDNA序列和推导的氨基酸序列分别在SEQ ID Nos：1和2中给出，而且编码人VEGF-C的cDNA已根据布达佩斯条约的规定保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd，Manassas，VA 20110-2209(USA)(保藏日1995年7月24日，ATCC登记号97231)。其它物种的VEGF-C序列也被报道，例如见Genebank登记号MMU73620(Mus骨骼肌)、CCY15837(Cotumix鹌鹑)，在此引入本文作为参考。

前VEGF-C多肽经多步骤加工，产生约21-23kD(在还原条件下用SDS-PAGE估计)的成熟及活性最强的VEGF-C多肽。这类加工过程包括切割信号肽(SEQ ID NO：2，1-31个残基)；切割羧基端肽(约相应于SEQ ID NO：2的氨基酸228-419，并具有模拟Balbiani环3蛋白(BR3P)序列的间隔半胱氨酸残基模式[Dignam等，基因，88：133-40(1990)；Paulsson等，分子生物学杂志，211：331-49(1990)])，产生约29kD的部分加工肽；切割氨基端肽(主要在细胞外)(约相应于SEQ ID NO：2的氨基酸32-103)，产生约21-23kD的完全加工的成熟形式。实验证实VEGF-C的部分切割形式(如上述29kD形式)能够结合Flt4(VEGFR-3)受体，然而只有VEGF-C的完全加工形式与VEGFR-2发生高亲和力结合。这表明天然VEGF-C多肽以非二硫键形式结合成二聚体。

而且，已经证明SEQ ID NO：2的103-227氨基酸对维持VEGF-C的功能并不都是关键的。由SEQ ID NO：2的113-213氨基酸(此时缺失103-112和214-227残基)组成的多肽仍有结合并刺激VEGF-C受体的能力，而且预计从约第131个残基到约第211个残基的多肽仍保持VEGF-C的生物活性。156位的半胱氨酸残基已经表明对于结合VEGFR-2的能力是重要的。然而VEGF-CΔC₁₅₆多肽(即由于缺失或替代而缺少这个半胱氨酸的类似物)仍然是VEGFR-3的有效激活剂。如果VEGF-C的抗再狭窄作用是由VEGFR-3介导的，那么VEGF-CΔC₁₅₆多肽(以及编码它们的多核苷酸)预计可以提供抗再狭窄作用，同时使VEGFR-2介导的副作用降低到最低。SEQ ID NO：2中165位的半胱氨酸对与两类受体结合是必需的，然而缺少83位或137位半胱氨酸的类似物与天然VEGF-C竞争结合这两类受体并激活这两类受体。

人VEGF-C与其它物种的VEGF-C的比较(用任何常用的算法进行比较)表明其中能引入修饰(如***、替代和/或缺失)的额外残基没有破坏VEGF-C的生物学活性。在两或更多物种之VEGF-C多肽的对比排列中具有不同氨基酸，尤其所含侧链不同化学特性的氨基酸的任何位置，可能是易于修饰且不伴有功能消失的位点。在PCT/US98/01973的图5中给出了人、鼠类和鹌鹑VEGF-C的对比排列。

除了上述考虑，应理解可对VEGF-C序列进行无数的保守氨基酸替代，这可能会得到仍然保持VEGF-C生物学活性的多肽，尤其在替代的氨基酸数少的情况下。“保守氨基酸替代”指用所含侧链具有相似化学特性之氨基酸进行的氨基酸替代。用于保守替代的相似氨基酸包括带酸性侧链(谷氨酸、天冬氨酸)；碱性侧链(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)；极性酰胺侧链(谷氨酰胺、天冬酰胺)；疏水脂肪族侧链(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸)；芳香族侧链(苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)；小侧链(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸)；或脂肪族羟基侧链(丝氨酸、苏氨酸)的氨基酸。还考虑在不破坏VEGF-C生物活性的前提下加入或删除一个或少数几个内部氨基酸。

并非受制于某个具体理论，据信VEGF-C预防再狭窄的效力涉及VEGF-C刺激受损血管(和/或血管内支架)的内皮重建，但并不会同时显著刺激血管中平滑肌的增生。VEGF-C还可能抑制平滑肌细胞的增生。因此，可以首先迅速筛选候选VEGF-C类似物多肽的结合并刺激已知VEGF-C受体(VEGFR-2和VEGFR-3)自我磷酸化的能力。刺激两种已知受体之一或全部的多肽可通过体外筛选多肽对培养的毛细血管内皮细胞或动脉内皮细胞的有丝***活性和/或趋化活性而快速筛选(如WO 98/33917所述)。然后如本文所述体内筛选具有有丝***活性和/或趋化活性之多肽的预防再狭窄能力。以这种方式可快速筛选天然VEGF-C蛋白的变体，从而确定它们是否具有组成本发明所用“VEGF-C多肽”必需的生物活性。

命名为血管内皮生长因子D的生长因子以及编码VEGF-D及其变体和类似物的人类编码序列详述于国际专利申请PCT/US97/14696，其于1997年8月21日提交，并于1998年2月26日公开，国际公开号为WO 98/07832；Achen等，美国国家科学院院刊，95(2)：548-553(1998)(均全文引入本文作为参考)。其中详述人VEGF-D在人细胞中最初产生的是354个氨基酸的前VEGF-D蛋白。人前VEGF-D的cDNA序列和推导的氨基酸序列分别在SEQIDNos：3和4中给出。其它物种的VEGF-C序列也被报道，例如见Genebank登记号D89628(Mus骨骼肌)和AF014827(Rattus norvegicus)，在此引入本文作为参考。

前VEGF-D多肽具有推导的21个氨基酸的信号肽，并显然以类似于加工前VEGF-C的方式被蛋白水解。缺少SEQ ID NO：4的第1-92和第202-354残基的“重组成熟的”VEGF-D多肽仍然保持激活VEGFR-2和VEGFR-3受体的能力，并且似乎以非共价键连接成二聚体。因此，优选的VEGF-D多核苷酸包括含编码SEQ ID NO：4中氨基酸93-201之核苷酸序列的多核苷酸。上述将修饰引入VEGF-C多肽但功能不变的指导方法也适用于将修饰引入VEGF-D多肽而功能不变。

本发明对再狭窄提供的治疗性或预防性处理涉及给人等哺乳动物主体给药含有VEGF-C或VEGF-D多核苷酸或多肽或其组合(本文有时“VEGF-C或VEGF-D治疗药物”)的组合物。

所述“给药”可用任何在医学上被接受的将药物直接或间接传入哺乳动物血管的方式进行，包括注射、口服摄入、鼻内或局部给药等，但不限于此。在优选的实施方案中，将含VEGF-C或VEGF-D多核苷酸或多肽组合物的组合物通过如静脉、动脉或冠状动脉注射等方式在血管内进行给药。

在高度优选的实施方案中，所述组合物局部给药于血管成形术或旁路搭桥术等部位。例如，给药包括将药用组合物用导管转移至哺乳动物血管中，尤其转移至哺乳动物主体的冠状动脉中。在Lincoff等，循环，90：2070-2084(1994)和Wilensky等，心血管医学进展，3：163-170(1993)(均引入本文作为参考)中综述了局部传递所用材料和方法的实例。例如，用文献所述用于冠状动脉药物注入等的输注-灌注气囊导管(优选微孔气囊导管)给药组合物。例见美国专利号5713860(带输注阵列的血管内导管)、美国专利号5087244、美国专利号5653689、Wolinsky等，J.Am.Coll.Cardiol.，15：475-481(1990)(Wolinsky输注导管)和Lambert等，冠状动脉疾病，4：469-475(1993)，均全文引入作为参考。这类导管在定点体细胞基因治疗中的应用如Mazur等，得克萨斯心脏研究所杂志，21：104-111(1994)中(在此引入本文作为参考)所述。

例如，在由于冠状动脉的单个或多个损伤而患有心绞痛的患者和根据初步冠脉照影结果需进行PTCA的患者中，一种治疗方案涉及进行PTCA，其通过7F指示导管根据标准临床操作经股动脉途径进行。如果单独用PTCA没有获得理想的效果，则进行血管内支架埋植。(非理想结果定义为根据目测及B或C型解剖，残余的狭窄大于腔径的30％)。在血管成形术后，支架移植前立即用输注-灌注气囊导管在气囊膨胀位点进行动脉基因转移。选择导管的尺寸，使之与照影照片中测量的动脉尺寸相符，例如直径3.0-3.5F。使气囊膨胀至最佳压力，并在10分钟内用1.15×10¹⁰效价的病毒以0.5ml/min的速率进行基因转移。

在另一实施方案中，考虑用凝胶包被的导管进行血管内给药，其如文献关于其它转基因之引入所述。见美国专利号5674192(用牢固粘附的可膨胀水凝胶聚合物包被导管)；Riessen等，人类基因治疗，4：749-758(1993)；Steg等，循环，96：408-411(1997)和90：1648-1656(1994)；均引入本文作为参考。如图1示导管10，可充气气囊12在其远端附着。所述气囊包括可膨胀水凝胶聚合物包被14，其能吸收含治疗性VEGC-C或VEGF-D药物的溶液。简言之，用DNA溶液(如VEGF-C或VEGF-D多核苷酸)一次或数次体外涂抹已包被水凝胶聚合物(如Slide with Hydroplus，Mansfield BostonScientfic Crop.，Watertown，MA)的膨胀后血管成形术导管气囊的表面。Hydroplus包被是疏水聚丙烯酸聚合物，其与气囊交联形成紧附气囊的高分子量水凝胶。可使DNA覆盖的水凝胶在给气囊放气之前干燥。在进行血管成形术时，气囊在血管内再充气使DNA转移至血管壁。故再参见图1，将附着有包被气囊的导管外套保护套20***血管18的腔16中，以使包被的气囊被放置到阻塞部位22之前减少与血管的接触。一旦该装置到达治疗部位，则撤回保护套或使导管前移以暴露气囊，气囊充气(并因此包被)而压迫血管壁，引起VEGF-C或VEGF-D药物转移到组织中，其方式类似于压缩海绵中挤出液体或通过接触将湿涂料转移到表面。

而在另一实施方案中，使用固定于血管成形术导管气囊或支架上或与之整合的可膨胀弹性膜、薄膜或相似结构，传递VEGF-C或VEGF-D治疗药物。例如见美国专利号5707385，5697967，5700286，5800507，和5776184，它们均引入本文作为参考。如图2A-2B所示，可将单层弹性膜材料30或多层弹性膜材料30、32层(图2A)通过对边粘附使之重叠或连接在一起，而卷成管状结构34(图2B)。在这种方式中，可以将所述弹性体材料包裹在导管气囊或支架四周。此膜可与治疗性VEGF-C或VEGF-D组合物应用任何合适的方法结合，包括塑料注射成型、包被、扩散和吸收技术。在图中描绘的多层的实施方案中，可将两层的边连接在一起形成防止液体渗漏的封闭体。在优选的实施方案中，首先通过拉长材料及引入大量显微孔或裂缝36加工一层材料。在各层结合在一起以后，膜层可以被拉长并通过其中一个孔或裂缝注入VEGF-C/D组合物，使之填充各层之间的腔隙。然后放松膜层，使孔关闭并将药用组合物封闭在各层之间，直到膜层再一次被拉长。这可在例如被该膜层覆盖的血管内支架或气囊在狭窄的血管腔内膨胀时发生。膨胀的支架或气囊迅速向外压迫管状膜层套的内表面38，这样就将膜层拉长，打开了微孔并将治疗药物传递到血管壁。

在另一变化中，在血管外给药含VEGF-C或VEGF-D治疗药物的组合物，例如用一种装置来包围或包被血管的一部分。例如见国际专利公开号WO 98/20027叙述了(如在旁路搭桥术期间)放置在动脉外侧的套环，其用来通过质粒或脂质体载体将转基因传递到动脉壁，其引入本文作参考。如图3A和3B所示，血管外套环40包括由壁44限定的空室42，所述壁由例如生物可降解或生物相容性材料制成。此套环在其末端50接触血管48的外壁46。血液52流过血管腔。弹性套环上的纵向裂缝54允许该套环变形并被放置在血管***，然后用诸如凝血酶胶等传统的组织胶封闭。

在另一变化中，用VEGF-C或VEGF-D转基因体外转染来自体内的内皮细胞或内皮祖细胞，将转染细胞给药于哺乳动物主体。用遗传修饰的内皮细胞支持血管移植物生长的方法实例在美国专利号5785965中叙述，其在此引入作为参考。

如果哺乳动物主体正在接受血管移植物，VEGF-C或VEGF-D治疗组合物可直接应用于分离的血管片段，然后将该片段植入体内。

在另一优选的实施方案中，给药步骤包括在哺乳动物主体内植入血管内支架，其中将该支架用VEGF-C/D基因/蛋白组合物包被或注入。用于构建药物包被或药物注入的支架的材料如上文引用的文献所述，另见Lincoff等，循环，90：2070-2084(1994)。如图4A和4B所示，将用于形成支架的金属导线或聚合物导线70用组合物72包被，组合物72是例如注入了(或可被浸泡或易于在临用前新鲜包被)VEGF-C或VEGF-D药用组合物的多孔生物可容性聚合物或凝胶。使此导线卷曲、编织或以其它方式形成支架74，其适于用常规材料或技术，如血管内血管成形术导管***术等，植入血管腔。如此改良的支架实例见美国专利号5800507和5697967(Medtronic Inc，其叙述了一种腔内支架，该支架包括纤维蛋白和能提供再狭窄治疗的可洗脱的药物)、美国专利号5776184(Medtronic Inc，其叙述了具有孔性包被的支架，孔性包被包括聚合物和与该聚合物共同形成固体或固体/溶液形式的治疗物质)、美国专利号5799384(Medtronic Inc，其叙述了用来与体腔联系的具有生物相容的聚合物表面的弹性、圆柱型、金属支架)、美国专利号5824048和5679400、和美国专利号5779729，所有均引入本文作为参考。在常规血管成形术中植入这些支架所致再狭窄比植入传统支架的程度轻。在这个意义上，该支架的生物相容性得到改善。

在另一优选实施方案中，所述组合物包括由PGLA、非降解聚合物或生物聚合物(如淀粉)等生物可降解的聚合物组成的微粒子，这些粒子中包含或注入了VEGF-C或VEGF-D多肽/多核苷酸。应用例如血管成形术输注导管等可将这些粒子运送至血管内壁。能局部持续运送药物的其它技术见Wilensky等，心血管医学进展，3：163-170(1993)，其引入本文作为参考。

还考虑了血管成形术或旁路搭桥术后通过一次或更多次静脉注射给药。VEGF-C或VEGF-D多肽可因VEGF-C/D受体在增殖的内皮细胞表面的表达而定位在手术部位。定位可进一步通过将VEGF-C或VEGF-D以融合多肽(如Shih等，美国国家科学院院刊，87：1436-1440(1990)所述，与载脂蛋白B-100寡肽融合)的形式重组表达而促进。

VEGF-C多核苷酸、VEGF-C多肽、VEGF-D多核苷酸和VEGF-D多肽防止血管狭窄或再狭窄的药效，用例如以下实施例所述方法得到体内证实，其中某些为预见性的。这些实施例有助于进一步叙述本发明，但是并不意谓着以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

应用腺病毒介导的VEGF-C基因转移预防再狭窄

在家兔再狭窄模型中体内实施下述实验，证实腺病毒介导的血管内VEGF-C基因转移具有防止血管成形术后再狭窄的功效。

A材料和方法

1.腺病毒构建

如下构建腺病毒质粒，其包含编码完整的人类前VEGF-C开放读框的cDNA，以及与其可操作连接的巨细胞病毒(CMV)启动子和人生长激素多聚腺苷酸信号序列。通过用SalI酶切pcDNA3.1+载体(Invitrogen)并用Klenow酶填充5′突出端，制备含CMV启动子序列的DNA片段。用HindIII将CMV启动子(第5431-911核苷酸)从载体中酶切并分离。用HindIII和XhoI将包含SEQ ID NO：1中指出的1997 bp序列的全长人VEGF-C cDNA(及不足50个碱基的非编码序列和多接头序列)从VEGF-C pREP7表达载体(见WO98/33917)中酶切下来，并分离。用Sal I和Bam HI将人生长激素多聚腺苷酸信号序列(～860 bp)从αMHC载体中酶切下来。将CMV启动子、VEGF-C cDNA和hGH多聚腺苷酸信号片段同时连接入BamHI和Eco RV消化的pCRII载体中。连接的CMV启动子和VEGF-C cDNA序列在SEQ IDNO：17中给出。将得到的构建体用BglII切开，并用Bam HI部分消化。将全长转录单位连接入用BglII切开的pAdBglII载体。然后应用标准的同源重组技术，用这个构建体(称为pAdBgl II VEGF-C)制备含CMV-VEGF-C-hGH转录单位的重组腺病毒[Barr等，基因治疗，1：51-58(1994)]。在293细胞中制备E1-E3删除的复制缺陷型腺病毒，并且应用在文献中已知的技术，通过超离心将其浓缩[例如见Barr等，(1994)]。还应用了包含可操作连接至相同启动子的lacZ基因的对照质粒[Laitinen M等，人类基因治疗，9：1481-1486(1998)]。lacZ腺病毒具有核靶向信号，将β半乳糖苷酶表达定位于细胞核。在293细胞中制备E1-E3删除的复制缺陷型腺病毒并用超离心方法浓缩(Barr等，1994)。检测该腺病毒制剂是否不含辅助病毒和细菌污染。

2.动物模型

使用新西兰白兔进行基因转移研究。第一组家兔用0.25％胆固醇饮食饲养2周，然后进行主动脉的气囊剥离，三天后进行腺病毒介导的基因转移。第二组家兔仅进行基因转移。在基因转移2-4周后处死动物。实验组(VEGF-C)和对照组(lacZ)的动物数目均为6。

在第一组家兔中，用4.0F动脉清除术导管(Sorin Biomedical，Irvine，CA)将从主动脉弓开始的整个主动脉剥离。导管从右侧髂动脉***一直上升到主动脉弓，并进行充气，而且主动脉被剥离两次。

3.基因转移

利用3.0F管气囊局部药物传递导管(Boston Scientific Corp，MapleGrove，MA)进行基因转移。荧光屏控制，从右侧颈动脉通过5F经皮插管套(Arrow International，Reading，PA)将气囊导管定位于无分支的左侧肾动脉尾端，并且用对比培养基和生理盐水的混合物将其膨胀到6 ATM。通过测量从主动脉室口到左侧肾动脉的距离确定气囊导管的解剖位置。给每个动物给药终体积为2ml(0.9％NaCl)的病毒效价为1.15×10¹⁰噬菌斑形成单位(pfu)的病毒，并且在6 ATM压力下进行10分钟的基因转移(0.2ml/min)。在第二个实验组中，实验动物仅进行基因转移并在基因转移2周后被处死。每个实验组(仅用0.9％NaCl；lacZ基因转移；VEGF-C基因转移)的动物数目为3。所有研究均经芬兰Kuopio大学的实验动物委员会批准。

4.组织学

在处死前3小时，给动物静脉内注射溶解于40％乙醇中的50mg BrdU。处死后，取出进行了基因转移的动脉片段，用生理盐水轻轻冲洗，并将其分成相等的5段。将近侧片段在液氮中速冻并-70℃保存。下一个片段在4％聚甲醛/15％蔗糖(pH 7.4)中浸泡固定4小时，用15％蔗糖(pH 7.4)漂洗过夜，并用石蜡包埋。中间片段在4％聚甲醛/磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 7.4)中浸泡固定10分钟，在PBS中漂洗2小时，然后包埋于OCT化合物(Miles)并在-70℃中保存。将第4个片段在70％乙醇中浸泡固定并石蜡包埋。在X-GAL溶液中，37℃直接染色远侧片段的β半乳糖苷酶活性16小时，在4％聚甲醛/15％蔗糖(pH 7.4)中浸泡固定4小时，15％蔗糖漂洗过夜，并用石蜡包埋。石蜡切片用于平滑肌细胞(SMC)、巨噬细胞和内皮细胞的免疫细胞化学检测。利用OCT包埋组织的X-GAL染色评估基因转移效率。根据制造商的说明检测BrdU阳性细胞。利用图象分析软件，用苏木精-伊红染色的石蜡切片进行形态计量学检测。在不知道切片来源的情况下，由两位检测者分别检测大量切片。内膜/(血管)中层(I/M)的比值作为内膜增厚的参数使用。

B.结果

气囊剥离小鼠的组织学分析表明在基因转移2周后，lacZ转染的对照组的I/M比率为0.61，与VEGF-C转染组(I/M比率为0.40)有显著的统计学差异(p＜0.05)。在基因转染后VEGF-C组的低I/M比率的趋势持续4周。

在仅接受血管壁基因转移(没有进行内皮剥离)的第二组家兔中，lacZ组的I/M比率为0.3，而VEGF-C组为0.15。这个差异也代表VEGF-C组中新内膜的形成被显著抑制(p＜0.05)。

BrdU标记可对VEGF-C转染组与对照组(lacZ)动物的平滑肌细胞增殖进行分析。预计SMC增殖可以减少VEGF-C转染的总量。

上述资料证实在动脉剥离之后及在由无气囊剥离的基因转移导管引起血管壁损伤之后2周的时间点上，VEGF-C基因转移显著减少内膜增厚。这些资料表明VEGF-C基因转移对血管成形术后再狭窄的治疗有效。

实施例2

比较实施例证实VEGF-C的抗再狭窄作用强于VEGF

下述的实验证实腺病毒介导的血管内VEGF和VEGF-C基因转移对血管成形术后再狭窄的防止效应，并且证实与VEGF相比，VEGF-C表现出更强的治疗功效。

A材料和方法

1.腺病毒构建

应用与VEGF-C相同的启动子，并用与实施例1中相似的方法，构建VEGF腺病毒(鼠VEGF-A₁₆₄，SEQ IN NO：18)。在293T细胞中制备VEGF-A₁₆₄构建体，基本按实施例1所述进行浓缩，并测定其不含辅助病毒、脂多糖、和细菌污染物。

2.动物模型

将63只新西兰白兔分成两大组，第一组用0.25％胆固醇饮食饲养2周，并在基因转移之前进行主动脉剥离，第二组仅进行基因转移。在第一组动物动脉剥离3天之后进行基因转移，并在基因转移2-4周后处死动物。每个实验组(LacZ，VEGF，VEGF-C)在两个时间点的家兔数目均为6只。在第二实验组中，只进行基因转移，无胆固醇饮食或气囊剥离，并且在基因转移2-4周后被处死。每个实验组(0.9％生理盐水、lacZ、VEGF、VEGF-C)的家兔数目为3。

3.基因转移

按照实施例1中叙述的方法进行基因转移。

4.组织学

组织学检测基本如实施例1所述，有如下的修改：用HHF35(DAKO，1∶50稀释)检测SMC、用RAM-11(DAKO，1∶50稀释)检测巨噬细胞、用CD31(DAKO，1∶50稀释)检测内皮细胞，用MCA805(DAKO，1∶100稀释)检测T细胞。免疫染色对照包括与类特异性和种特异性免疫球蛋白一起温育以及在省略初级抗体的条件下温育。用Image-Pro Plus^TM软件和OlympusAX70显微镜(Olympus Optical，Japan)进行形态计量学和图象分析。用方差分析和改良的t检验进行统计分析。P＜0.05被视为具有统计学意义。

B结果

气囊剥离的家兔主动脉的组织学分析表明存在内膜增厚和SMC增生。在基因转移后2周，lacZ对照组出现最高I/M比率(0.57±0.04)，而VEGF-C(0.38±0.02)和VEGF(0.49±0.17)组显示内膜增厚减少。在两周的时间点上，LacZ组和VEGF-C组的I/M比值具有显著性差异(p＜0.05)，而在lacZ组和VEGF组之间没有显著性差异。在四周的时间点上，VEGF组和VEGF-C组的I/M比值较低的倾向持续存在，此时lacZ组、VEGF-C组和VEGF组的I/M比分别为0.73±0.16、0.44±0.14和0.63±0.21。发生了基因转染的动脉的苏木精-伊红染色和免疫染色表明所有动脉中的内膜增厚主要由SMC组成。

腺病毒载体的应用可引起免疫应答和炎症反应，其部分原因是高效价的腺病毒诱导NFκB表达并激活CTL应答。然而，当用巨噬细胞和T细胞免疫染色检测时，即没有发现炎症的征象，也没有泡沫细胞的聚集。另外，在发生转移的动脉中短时间接触了人类临床基因治疗级病毒，这可能有助于解释本研究中严重炎症反应的缺乏。

利用BrdU标记分析增殖细胞的百分率。虽然VEGF-C组具有增殖率较低的倾向，但是在各组间没有发现显著性差异，这与VEGF-C转导的动脉在两个时间点I/M值均较低的发现相一致。在气囊剥离2周后，lacZ组、VEGF-C组和VEGF组的增殖百分率分别为1.8±0.4、2.2±0.7和1.2±0.0，在气囊剥离4周后，lacZ组、VEGF组和VEGF-C组的的增殖百分率分别为0.3±0.1、1.2±0.5和0.3±0.1。通过在组织学切片上测量完整内皮的长度分析内皮的再生长。在各个实验组之间未发现显著性差异。

通过将高效价腺病毒基因转移给无气囊剥离的完整的家兔腹动脉，检测了腺病毒引起血管壁损伤和新内膜形成的效力。用0.9％生理盐水以相同的方法处理对照组家兔。基因转移导管的定位可引起内弹性层的损伤，并且在手术后中度诱导新内皮形成。在2周的时间点上，lacZ组的I/M比值为0.24±0.06，对照组为0.28±0.05，VEGF-C组为0.18±0.07，VEGF组为0.15±0.03。在4周的时间点上，lacZ组的I/M比值为0.22±0.13，VEGF-C组为0.13±0.03，VEGF组为0.23±0.11。

本研究表明了在气囊损伤之后，血管内腺病毒介导的VEGF-C基因转移对血管壁的有益治疗作用，还比较了VEGF-C和VEGF腺病毒介导的基因转移对新内膜形成的防止。虽然VEGF-C和VEGF的不同受体结合特征可能导致血管壁中不同的生物学效应，但是在基因转移2周后，两种VEGF均减少内膜增厚。因此两种VEGF均是用于局部缺血性动脉粥样硬化疾病的血管基因治疗的潜在候选药物。然而，根据本实验，在这个模型***中，VEGF-C可比VEGF更有效的预防再狭窄。VEGF-C强于VEGF的预防再狭窄的能力可能是由于VEGFR-3的表达或活性，VEGFR-3是VEGF-C和VEGF-D的受体，但不是VEGF的受体。或者，上述明显优势可归因于VEGF通过VEGFR1介导的再狭窄促进效应或是由于通过共同受体VEGFR-2介导的不同配体效应(VEGF-C对VEGF)，据报道VEGFR2在血管平滑肌中表达[见Grosskreutz等，微循环研究，58(2)：128-136](1999年9月)。

实施例3

转染的VEGFs在血管壁上的表达

利用实施例2的相同实验动物的主动脉片段，分析了在基因转移之后主动脉组织中lacZ、VEGF-C和VEGF(鼠VEGF-A₁₆₄)的mRNA表达。用Trizol试剂(Gibco-BRL)从转染的主动脉片段中提取总RNA，取2微克用于cDNA合成。为了区分内源性基因和转导的基因，通过从CMV启动子选择5′引物，从编码区选择3′引物，设计lacZ、VEGF-C和VEGF的引物。

在lacZ的扩增中，引物为：5′引物5′-TTGGAGGCCTAGGCTTTT GC-3′(SEQ ID NO：5)，3′引物5′-ATACTGTCGTCGTCCCCTCA-3′(SEQ ID NO：6)。第一个PCR循环为96℃启始温育4分钟，随后80℃3分钟，在此期间加入DNA聚合酶。随后进行30个循环，每个循环包括94℃45秒，58℃45秒，72℃50秒，最后72℃5分钟进行延伸。用5微升的第一轮PCR产物进行第二轮PCR，其引物为：5′引物5′-GGTAGAAGACCCCAAGGACTTT-3′(SEQ ID NO：7)，3′引物5′-CGCCATTCGCCATTCAG-3′(SEQ ID NO：8)。第一个PCR循环为96℃启始温育4分钟，随后80℃3分钟，然后进行32个循环，每个循环包括94℃60秒，58℃15秒，72℃90秒，最后72℃5分钟进行延伸。

在VEGF-C的扩增中，引物为：5′引物5′-CTGCTTACTGGCTTATCG-3′(SEQ ID NO：9)，3′引物  5′-CCTGTTCTCTGTTATGTTGC-3′(SEQ IDNO：10)。第一个PCR循环为96℃启始温育4分钟，随后80℃3分钟，在此期间加入DNA聚合酶。随后进行39个循环，每个循环包括94℃30秒，56℃40秒，72℃90秒，最后72℃5分钟进行延伸。用5微升的第一轮PCR产物进行第二轮PCR，其引物为：5′引物  5′-TCTCCAAAAAGCTACACCG-3′(SEQ ID NO：11)，3′引物5′-CAAGTGCATGGTGGAAGG-3′(SEQ ID NO：12)。第一个PCR循环为96℃启始温育3分钟，随后80℃3分钟，然后进行39个循环，每个循环包括94℃60秒，57℃30秒，72℃90秒，最后72℃5分钟进行延伸。

在VEGF的扩增中，引物为：5′引物5′-TCGATCCATGAACTTTCTGC-3′(SEQ ID NO：13)，3′引物5′-TTCGTTTAACTCAAGCTGCC-3′(SEQID NO：14)。第一个PCR循环为96℃启始温育4分钟，随后80℃3分钟。随后进行39个循环，每个循环包括94℃30秒，53℃40秒，72℃90秒，最后72℃5分钟进行延伸。用5微升的第一轮PCR的产物进行第二轮PCR，其引物为：5′引物5′-GACCCTGGCTTTACTGCTG-3′(SEQ ID NO：15)，3′引物5′-GGAACATTTACACGTCTGCG-3′(SEQ ID NO：16)。第一个PCR循环为96℃启始温育3分钟，随后80℃3分钟，然后进行39个循环，每个循环包括94℃60秒，54℃30秒，72℃90秒，最后72℃5分钟进行延伸。

检测主动脉壁组织中lacZ、VEGF-C和VEGF的mRNA，一直到基因转移之后4周。

在OCT包埋的组织切片中，通过检测lacZ的表达，即通过X-Gal染色分析β半乳糖苷酶活性，评估基因转移效率。在血管内导管介导的基因转移后两周和四周时的转染效率分别为：1.1％±0.5和0.3％±0.1。

实施例4

主动脉壁中VEGF受体的表达

利用实施例2中叙述的实验动物，经免疫染色和原位杂交检测主动脉组织中VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3的表达。实施免疫组化实验，用克隆sc-316(Santa Cruz Biotechnology，1∶50稀释)检测VEGFR-1，用充隆sc-6251(Santa Cruz Biotechnology，1∶500稀释)检测VEGFR-2，用克隆sc-637(Santa Cruz Biotechnology，1∶300稀释)检测VEGFR-3。免疫染色的对照包括与类(class)特异性和种特异性免疫球蛋白一起温育以及在省略初级抗体的条件下温育。用³³P-UTP标记的核探针进行VEGF受体mRNA的原位杂交。所有受体的表达均定位于内皮，VEGFR2也在新内膜SMC上表达。

实施例5

利用裸VEGF-C转基因治疗来预防再狭窄

重复实施例1或2所述步骤，有如下修改。不用腺病毒载体运送VEGF-C转基因，而是构建用于(裸露的质粒DNA的)直接基因转移的哺乳动物表达载体。VEGF-C编码序列与适当启动子如CMV启动子可操作性连接，并优选与适当的多聚腺苷酸序列如人生长激素多聚腺苷酸序列连接。通过用VEGF-C编码序列替代VEGF编码序列，可用文献中实施其它生长因子的无载体基因转移的载体构建VEGF-C载体。[例如见Isner等，循环，91：2687-2692(1995)和Isner等，人类基因治疗，7：989-1011(1996)，在此引入本文作为参考]。利用包含lacZ基因的类似构建体作为对照。

利用水凝胶包被的气囊导管(Boston Scientific)运送VEGF-C转基因，基本上按Asahara等，循环，94：3291-3302(1996年12月15日)(在此引入本文作为参考)的方法进行。简言之，通过使放气的气囊整个穿过聚四氟乙烯(teflon)保护套(Boston Scientific)前移，在回体实验中制备血管成形术导管。将气囊充气并利用常规吸管将转基因构建体(例如溶于生理盐水溶液的50-5000微克转基因)施加于包被充气气囊外表面的水凝胶聚合物。待转基因溶液干燥之后，将气囊放气，退入保护套，并且使气囊重新充气以减小流过气囊表面的血流，直至气囊在靶动脉中正确定位。

再次以内膜/中层(I/M)比率作为内膜增厚的参数。在用VEGF-C转基因包被的气囊导管处理的动物中降低的I/M比率被视为治疗有效的指征。如实施例2所述，可平行比较VEGF-C基因转移与VEGF基因转移等其它治疗的疗效。

实施例6

应用VEGF-C基因治疗在用支架进行血管成形术后预防再狭窄

重复在先实施例中的步骤，改动之处为首次气囊血管成形术的同时用传统方法植入冠状动脉支架。在植入支架的同时或之前即刻或之后即刻，基本如在先实施例所述运送VEGF-C转基因。如Van Belle等，J.Am.Coll.Cardiol.，29：1371-1379(1997年5月)(在此引入本文作为参考)所述，可预计转基因的量(与无支架的血管成形术相比)增加和转染时间延长。与用标记基因治疗的对照动物相比，在VEGF-C基因治疗组的动物中内膜增厚的减少和血栓栓塞的减少被视为VEGF-C基因治疗有效的证据。

实施例7

应用血管外套管减少血管狭窄

将例如在国际专利申请号WO 98/20027中叙述的惰性硅套管经手术植入新西兰白兔颈总动脉的周围。该套管作为诱导内膜增厚的刺激物，并且含有适合于局部传递VEGF-C转基因或蛋白药物制剂的蓄池。5天后通过向该套管中注射实施例1中叙述的VEGF-C腺病毒构建体或对照构建体10⁸-10¹¹ pfu而开始基因转移。在14天或28天后，处死动物并按实施例1中叙述的方法进行组织学检测。用内膜/中层厚度比率[Yla-Herttuala等，动脉硬化，6：230-236(1986)]作为狭窄的指征。与lacZ对照家兔相比，在VEGF-C转染的家兔组中I/M比的降低提示VEGF-C基因转移可有效预防动脉狭窄。

实施例8

应用VEGF-C多肽减少或预防再狭窄

重复实施例1所述方法，但其中实验动物不用含VEGF-C转基因或lacZ对照基因的腺病毒处理，而用在可药用载体(如含有血清白蛋白的等渗生理盐水)中包含了VEGF-C多肽的组合物处理。实验动物经动脉内输注VEGF-C多肽10、100、250、500、1000或5000μg，如实施例1所述。第二组动物7天后还注射VEGF-C多肽。处死这些动物，按实施例1所述进行组织学检测。VEGF-C处理组动物比对照组动物的I/M比值降低表明VEGF-C多肽处理的有效性。应用如上述的各种VEGF-C控释制剂和材料预计可以进一步提高VEGF-C多肽的疗效。此外，同时给药VEGF-C蛋白(以及时治疗靶血管)和VEGF-C转基因(以使治疗持续数天或数周)的治疗方案被特别视为本发明的一个变化。

实施例9

VEGF-D的抗狭窄/抗再狭窄活性

用含VEGF-D多核苷酸或VEGF-D多肽而非VEGF-C多核苷酸/多肽的组合物重复在先实施例所述步骤，以证实VEGF-D防止血管狭窄或再狭窄的能力。

本发明是以特定实施方案的方式进行叙述，应该明白本领域技术人员可对它们进行变化和改动，所有这些均被视为本发明的各个方面。因此，只有在权利要求中出现的限定才可以用于对本发明进行限定。

                             序列表<110>Ludwig Institute for Cancer Research

Helsinki University Licensing Ltd.Oy

Seppo Yla-Herttuala<120>利用VEGF-C或VEGF-D基因或蛋白预防再狭窄<130>28967/35601A<140><141><150>US 60/105,587<151>1998-10-26<160>18<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1997<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(352)..(1608)<400>1cccgccccgc ctctccaaaa agctacaccg acgcggaccg cggcggcgtc ctccctcgcc 60ctcgcttcac ctcgcgggct ccgaatgcgg ggagctcgga tgtccggttt cctgtgaggc 120ttttacctga cacccgccgc ctttccccgg cactggctgg gagggcgccc tgcaaagttg 180ggaacgcgga gccccggacc cgctcccgcc gcctccggct cgcccagggg gggtcgccgg 240gaggagcccg ggggagaggg accaggaggg gcccgcggcc tcgcaggggc gcccgcgccc 300ccacccctgc ccccgccagc ggaccggtcc cccacccccg gtccttccac c atg cac  357

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    405                 410                 415agc taagattgta ctgttttcca gttcatcgat tttctattat ggaaaactgt        1658Sergttgccacag tagaactgtc tgtgaacaga gagacccttg tgggtccatg ctaacaaaga 1718caaaagtctg tctttcctga accatgtgga taactttaca gaaatggact ggagctcatc 1778tgcaaaaggc ctcttgtaaa gactggtttt ctgccaatga ccaaacagcc aagattttcc 1838tcttgtgatt tctttaaaag aatgactata taatttattt ccactaaaaa tattgtttct 1898gcattcattt ttatagcaac aacaattggt aaaactcact gtgatcaata tttttatatc 1958atgcaaaata tgtttaaaat aaaatgaaaa ttgtattat                        1997<210>2<211>419<212>PRT<213>人<400>2Met His Leu Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala Ala1               5                  10                  15Ala Leu Leu Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe

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210                 215                 220Ile Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn225                 230                 235                 240Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg Cys

            245                 250                 255Leu Ala Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser

        260                 265                 270Thr Asp Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro Ash Lys Glu Leu Asp Glu

    275                 280                 285Glu Thr Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys

290                 295                 300Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys305                 310                 315                 320Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu

            325                 330                 335Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro

        340                 345                 350Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys

    355                 360                 365Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr

370                 375                 380Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser385                 390                 395                 400Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro

            405                 410                 415Gln Met Ser<210>3<211>2029<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(411)..(1472)<400>3gttgggttcc agctttctgt agctgtaagc attggtggcc acaccacctc cttacaaagc 60aactagaacc tgcggcatac attggagaga tttttttaat tttctggaca tgaagtaaat 120ttagagtgct ttctaatttc aggtagaaga catgtccacc ttctgattat ttttggagaa 180cattttgatt tttttcatct ctctctcccc acccctaaga ttgtgcaaaa aaagcgtacc 240ttgcctaatt gaaataattt cattggattt tgatcagaac tgattatttg gttttctgtg 300tgaagttttg aggtttcaaa ctttccttct ggagaatgcc ttttgaaaca attttctcta 360gctgcctgat gtcaactgct tagtaatcag tggatattga aatattcaaa atg tac    416

                                                   Met Tyr

                                                     1aga gag tgg gta gtg gtg aat gtt ttc atg atg ttg tac gtc cag ctg   464Arg Glu Trp Val Val Val Asn Val Phe Met Met Leu Tyr Val Gln Leu

      5                  10                  15gtg cag ggc tcc agt aat gaa cat gga cca gtg aag cga tca tct cag   512Val Gln Gly Ser Ser Asn Glu His Gly Pro Val Lys Arg Ser Ser Gln

 20                  25                  30tcc aca ttg gaa cga tct gaa cag cag atc agg gct gct tct agt ttg   560Ser Thr Leu Glu Arg Ser Glu Gln Gln Ile Arg Ala Ala Ser Ser Leu35                  40                  45                  50gag gaa cta ctt cga att act cac tct gag gac tgg aag ctg tgg aga   608Glu Glu Leu Leu Arg Ile Thr His Ser Glu Asp Trp Lys Leu Trp Arg

             55                  60                  65tgc agg ctg agg ctc aaa agt ttt acc agt atg gac tct cgc tca gca   656Cys Arg Leu Arg Leu Lys Ser Phe Thr Ser Met Asp Ser Arg Ser Ala

         70                  75                  80tcc cat cgg tcc act agg ttt gcg gca act ttc tat gac att gaa aca   704Ser His Arg Ser Thr Arg Phe Ala Ala Thr Phe Tyr Asp Ile Glu Thr

     85                  90                  95cta aaa gtt ata gat gaa gaa tgg caa aga act cag tgc agc cct aga   752Leu Lys Val Ile Asp Glu Glu Trp Gln Arg Thr Gln Cys Ser Pro Arg

100                 105                 110gaa acg tgc gtg gag gtg gcc agt gag ctg ggg aag agt acc aac aca   800Glu Thr Cys Val Glu Val Ala Ser Glu Leu Gly Lys Ser Thr Asn Thr115                 120                 125                 130ttc ttc aag ccc cct tgt gtg aac gtg ttc cga tgt ggt ggc tgt tgc   848Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Asn Val Phe Arg Cys Gly Gly Cys Cys

            135             140             145aat gaa gag agc ctt atc tgt atg aac acc agc acc tcg tac att tcc   896Asn Glu Glu Ser Leu Ile Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr Ile Ser

        150                 155                 160aaa cag ctc ttt gag ata tca gtg cct ttg aca tca gta cct gaa tta   944Lys Gln Leu Phe Glu Ile Ser Val Pro Leu Thr Ser Val Pro Glu Leu

    165                 170                 175gtg cct gtt aaa gtt gcc aat cat aca ggt tgt aag tgc ttg cca aca   992Val Pro Val Lys Val Ala Asn His Thr Gly Cys Lys Cys Leu Pro Thr

180                 185                 190gcc ccc cgc cat cca tac tca att atc aga aga tcc atc cag atc cct   1040Ala Pro Arg His Pro Tyr Ser Ile Ile Arg Arg Ser Ile Gln Ile Pro195                 200                 205                 210gaa gaa gat cgc tgt tcc cat tcc aag aaa ctc tgt cct att gac atg   1088Glu Glu Asp Arg Cys Ser His Ser Lys Lys Leu Cys Pro Ile Asp Met

            215                 220                 225cta tgg gat agc aac aaa tgt aaa tgt gtt ttg cag gag gaa aat cca   1136Leu Trp Asp Ser Asn Lys Cys Lys Cys Val Leu Gln Glu Glu Asn Pro

        230                 235                 240ctt gct gga aca gaa gac cac tct cat ctc cag gaa cca gct ctc tgt   1184Leu Ala Gly Thr Glu Asp His Ser His Leu Gln Glu Pro Ala Leu Cys

    245                 250                 255ggg cca cac atg atg ttt gac gaa gat cgt tgc gag tgt gtc tgt aaa   1232Gly Pro His Met Met Phe Asp Glu Asp Arg Cys Glu Cys Val Cys Lys

260                 265                 270aca cca tgt ccc aaa gat cta atc cag cac ccc aaa aac tgc agt tgc   1280Thr Pro Cys Pro Lys Asp Leu Ile Gln His Pro Lys Asn Cys Ser Cys275                 280                 285                 290ttt gag tgc aaa gaa agt ctg gag acc tgc tgc cag aag cac aag cta   1328Phe Glu Cys Lys Glu Ser Leu Glu Thr Cys Cys Gln Lys His Lys Leu

            295                 300                 305ttt cac cca gac acc tgc agc tgt gag gac aga tgc ccc ttt cat acc   1376Phe His Pro Asp Thr Cys Ser Cys Glu Asp Arg Cys Pro Phe His Thr

        310                 315                 320aga cca tgt gca agt ggc aaa aca gca tgt gca aag cat tgc cgc ttt   1424Arg Pro Cys Ala Ser Gly Lys Thr Ala Cys Ala Lys His Cys Arg Phe

    325                 330                 335cca aag gag aaa agg gct gcc cag ggg ccc cac agc cga aag aat cct   1472Pro Lys Glu Lys Arg Ala Ala Gln Gly Pro His Ser Arg Lys Asn Pro

340                 345                 350tgattcagcgttc caagttcccc atccctgtca tttttaacag catgctgctt         1525355tgccaagttg ctgtcactgt ttttttccca ggtgttaaaa aaaaaatcca ttttacacag 1585caccacagtg aatccagacc aaccttccat tcacaccagc taaggagtcc ctggttcatt 1645gatggatgtc ttctagctgc agatgcctct gcgcaccaag gaatggagag gaggggaccc 1705atgtaatcct tttgtttagt tttgtttttg ttttttggtg aatgagaaag gtgtgctggt 1765catggaatgg caggtgtcat atgactgatt actcagagca gatgaggaaa actgtagtct 1825ctgagtcctt tgctaatcgc aactcttgtg aattattctg attctttttt atgcagaatt 1885tgattcgtat gatcagtact gactttctga ttactgtcca gcttatagtc ttccagttta 1945atgaactacc atctgatgtt tcatatttaa gtgtatttaa agaaaataaa caccattatt 2005caagccaaaa aaaaaaaaaa aaaa                                        2029<210>4<211>354<212>PRT<213>人<400>4Met Tyr Arg Glu Trp Val Val Val Asn Val Phe Met Met Leu Tyr Val1               5                  10                  15Gln Leu Val Gln Gly Ser Ser Asn Glu His Gly Pro Val Lys Arg Ser

         20                  25                  30Ser Gln Ser Thr Leu Glu Arg Ser Glu Gln Gln Ile Arg Ala Ala Ser

     35                  40                  45Ser Leu Glu Glu Leu Leu Arg Ile Thr His Ser Glu Asp Trp Lys Leu

 50                  55                  60Trp Arg Cys Arg Leu Arg Leu Lys Ser Phe Thr Ser Met Asp Ser Arg65                  70                  75                  80Ser Ala Ser His Arg Ser Thr Arg Phe Ala Ala Thr Phe Tyr Asp Ile

             85                  90                  95Glu Thr Leu Lys Val Ile Asp Glu Glu Trp Gln Arg Thr Gln Cys Ser

        100                 105                 110Pro Arg Glu Thr Cys Val Glu Val Ala Ser Glu Leu Gly Lys Ser Thr

    115                 120                 125Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Asn Val Phe Arg Cys Gly Gly

130                 135                 140Cys Cys Asn Glu Glu Ser Leu Ile Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr145                 150                 155                 160Ile Ser Lys Gln Leu Phe Glu Ile Ser Val Pro Leu Thr Ser Val Pro

            165                 170                 175Glu Leu Val Pro Val Lys Val Ala Asn His Thr Gly Cys Lys Cys Leu

        180                 185                 190Pro Thr Ala Pro Arg His Pro Tyr Ser Ile Ile Arg Arg Ser Ile Gln

    195                 200                 205Ile Pro Glu Glu Asp Arg Cys Ser His Ser Lys Lys Leu Cys Pro Ile

210                 215                 220Asp Met Leu Trp Asp Ser Asn Lys Cys Lys Cys Val Leu Gln Glu Glu225                 230                 235                 240Asn Pro Leu Ala Gly Thr Glu Asp His Ser His Leu Gln Glu Pro Ala

            245                 250                 255Leu Cys Gly Pro His Met Met Phe Asp Glu Asp Arg Cys Glu Cys Val

        260                 265                 270Cys Lys Thr Pro Cys Pro Lys Asp Leu Ile Gln His Pro Lys Asn Cys

    275                 280                 285Ser Cys Phe Glu Cys Lys Glu Ser Leu Glu Thr Cys Cys Gln Lys His

290                 295                 300Lys Leu Phe His Pro Asp Thr Cys Ser Cys Glu Asp Arg Cys Pro Phe305                 310                  315                320His Thr Arg Pro Cys Ala Ser Gly Lys Thr Ala Cys Ala Lys His Cys

            325                 330                 335Arg Phe Pro Lys Glu Lys Arg Ala Ala Gln Gly Pro His Ser Arg Lys

        340                 345                 350Asn Pro<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的叙述：引物<400>5ttggaggcct aggcttttgc                                             20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的叙述：引物<400>6atactgtcgt cgtcccctca                                             20<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的叙述：引物<400>7ggtagaagac cccaaggact tt                                          22<210>8<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的叙述：引物<400>8cgccattcgc cattcag                                                17<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的叙述：引物<400>9ctgcttactg gcttatcg                                               18<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的叙述：引物<400>10cctgttctct gttatgttgc                                             20<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的叙述：引物<400>11tctccaaaaa gctacaccg                                              19<210>12<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的叙述：引物<400>12caagtgcatg gtggaagg                                               18<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的叙述：引物<400>13tcgatccatg aactttctgc                                             20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的叙述：引物<400>14ttcgtttaac tcaagctgcc                                             20<210>15<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的叙述：引物<400>15gaccctggct ttactgctg                                              19<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的叙述：引物<400>16ggaacattta cacgtctgcg                                             20<210>17<211>2679<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的叙述：人VEGF-C与CMV启动子序列相连接的嵌合序列<400>17cgttgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat 60agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg 120cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata 180gggactttcc attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta 240catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc 300gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac 360gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga 420tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg 480ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg 540caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact 600agagaaccca ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa 660gctggctagc gtttaaactt aacccgcccc gcctctccaa aaagctacac cgacgcggac 720cgcggcggcg tcctccctcg ccctcgcttc acctcgcggg ctccgaatgc ggggagctcg 780gatgtccggt ttcctgtgag gcttttacct gacacccgcc gcctttcccc ggcactggct 840gggagggcgc cctgcaaagt tgggaacgcg gagccccgga cccgctcccg ccgcctccgg 900ctcgcccagg gggggtcgcc gggaggagcc cgggggagag ggaccaggag gggcccgcgg 960cctcgcaggg gcgcccgcgc ccccacccct gcccccgcca gcggaccggt cccccacccc 1020cggtccttcc accatgcact tgctgggctt cttctctgtg gcgtgttctc tgctcgccgc 1080tgcgctgctc ccgggtcctc gcgaggcgcc cgccgccgcc gccgccttcg agtccggact 1140cgacctctcg gacgcggagc ccgacgcggg cgaggccacg gcttatgcaa gcaaagatct 1200ggaggagcag ttacggtctg tgtccagtgt agatgaactc atgactgtac tctacccaga 1260atattggaaa atgtacaagt gtcagctaag gaaaggaggc tggcaacata acagagaaca 1320ggccaacctc aactcaagga cagaagagac tataaaattt gctgcagcac attataatac 1380agagatcttg aaaagtattg ataatgagtg gagaaagact caatgcatgc cacgggaggt 1440gtgtatagat gtggggaagg agtttggagt cgcgacaaac accttcttta aacctccatg 1500tgtgtccgtc tacagatgtg ggggttgctg caatagtgag gggctgcagt gcatgaacac 1560cagcacgagc tacctcagca agacgttatt tgaaattaca gtgcctctct ctcaaggccc 1620caaaccagta acaatcagtt ttgccaatca cacttcctgc cgatgcatgt ctaaactgga 1680tgtttacaga caagttcatt ccattattag acgttccctg ccagcaacac taccacagtg 1740tcaggcagcg aacaagacct gccccaccaa ttacatgtgg aataatcaca tctgcagatg 1800cctggctcag gaagatttta tgttttcctc ggatgctgga gatgactcaa cagatggatt 1860ccatgacatc tgtggaccaa acaaggagct ggatgaagag acctgtcagt gtgtctgcag 1920agcggggctt cggcctgcca gctgtggacc ccacaaagaa ctagacagaa actcatgcca 1980gtgtgtctgt aaaaacaaac tcttccccag ccaatgtggg gccaaccgag aatttgatga 2040aaacacatgc cagtgtgtat gtaaaagaac ctgccccaga aatcaacccc taaatcctgg 2100aaaatgtgcc tgtgaatgta cagaaagtcc acagaaatgc ttgttaaaag gaaagaagtt 2160ccaccaccaa acatgcagct gttacagacg gccatgtacg aaccgccaga aggcttgtga 2220gccaggattt tcatatagtg aagaagtgtg tcgttgtgtc ccttcatatt ggaaaagacc 2280acaaatgagc taagattgta ctgttttcca gttcatcgat tttctattat ggaaaactgt 2340gttgccacag tagaactgtc tgtgaacaga gagacccttg tgggtccatg ctaacaaaga 2400caaaagtctg tctttcctga accatgtgga taactttaca gaaatggact ggagctcatc 2460tgcaaaaggc ctcttgtaaa gactggtttt ctgccaatga ccaaacagcc aagattttcc 2520tcttgtgatt tctttaaaag aatgactata taatttattt ccactaaaaa tattgtttct 2580gcattcattt ttatagcaac aacaattggt aaaactcact gtgatcaata tttttatatc 2640atgcaaaata tgtttaaaat aaaatgaaaa ttgtattat                        2679<210>18<211>2240<212>DNA<213>小鼠<400>18tgtttagaag atgaaccgta agcctaggct agaactgagg gagcctacta ctcccaccct 60tccgagggtt ggcggcagga ctgggcagct ggcctaccta cctttctgaa tgctagggta 120ggtttgaatc accatgccgg cctggcccgc ttctgccccc attggc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Claims (29)

1.一种处理哺乳动物主体以防止血管狭窄或再狭窄的的方法，包括如下步骤：

包括给需要防止血管狭窄或再狭窄处理的哺乳动物主体给药一种组合物，该组合物包含至少一种选自下组的抗狭窄药物以防止所述血管的狭窄或再狭窄，所述组合为含有编码血管内皮生长因子C(VEGF-C)多肽之核苷酸序列的多核苷酸、含有编码血管内皮生长因子D(VEGF-D)多肽之核苷酸序列的多核苷酸、VEGF-C多肽、和VEGF-D多肽。

2.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物主体是人。

3.权利要求1或2的方法，其中所述组合物包含多核苷酸，该多核苷酸包含编码哺乳动物VEGF-C多肽的核苷酸序列。

4.权利要求1至3中任何一项的方法，其中所述组合物包含多核苷酸，该多核苷酸含编码人VEGF-C多肽的核苷酸序列。

5.权利要求4的方法，其中所述VEGF-C多肽包括含SEQ ID NO：2中一段连续序列的氨基酸序列，所述连续序列在其氨基端具有选自SEQ IDNO：2的30-131位的氨基酸，在其羧基端具有选自SEQ ID NO：2的211-419位的氨基酸。

6.权利要求5的方法，其中所述多核苷酸进一步包括编码分泌信号肽的核苷酸序列，并且其中编码该分泌信号肽的序列与编码VEGF-C多肽的序列连接在同一阅读框内。

7.权利要求6的方法，其中所述多核苷酸缺少编码SEQ IN NO：2的228-419位氨基酸的核苷酸序列。

8.权利要求6或7的方法，其中所述多核苷酸缺少编码SEQ IN NO：2的32-102位氨基酸的核苷酸序列。

9.权利要求6至8中任一项的方法，其中所述多核苷酸进一步包括与编码分泌信号肽和VEGF-C多肽的序列可操作地相连的启动子序列，其中该启动子序列在哺乳动物主体的细胞中，启动编码分泌信号序列和VEGF-C多肽的序列的转录。

10.权利要求9的方法，其中所述多核苷酸进一步包括与编码VEGF-C多肽的序列可操作地连接的多聚腺苷酸序列。

11.权利要求3至10中任一项的方法，其中所述组合物包括一种基因治疗载体，该基因治疗载体包括所述多核苷酸。

12.权利要求11的方法，其中所述载体包含一种复制缺陷型腺病毒，该腺病毒包含与启动子可操作地连接并且侧翼为腺病毒多核苷酸序列的多核苷酸。

13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述组合物进一步包括可药用的载体。

14.权利要求1至13中任何一条的方法，其中所述给药包括所述化合物的至少一次血管内注射。

15.权利要求1至13中任何一条的方法，其中所述给药包括将所述组合物经导管介导而导入哺乳动物主体的血管中。

16.权利要求15的方法，其中所述导管介导的基因转移包括将导管导入哺乳动物主体的冠状动脉，并将所述组合物释放至该冠状动脉中。

17.权利要求1至16中任何一条的方法，其中所述给药在所述人体中与经皮冠状动脉腔内血管成形术共同进行。

18.权利要求1的方法，其中所述组合物含有VEGF-C多肽，其量可有效防止所述血管的狭窄或再狭窄。

19.权利要求18的方法，其中所述给药包括在所述哺乳动物主体中植入血管内支架，而且该支架用所述组合物包被或充填。

20.一种防止人的血管狭窄或再狭窄的处理方法，包括向血管传送复制缺陷型腺病毒载体，所述载体包括编码至少一种选自VEGF-C多肽或VEGF-D多肽的多肽的多核苷酸，并且进一步包括用来在该血管的细胞中启动上述至少一种多肽表达的启动子序列，从而防止血管的狭窄或再狭窄。

21.权利要求20的方法，其中所述多核苷酸编码VEGF-C多肽。

22.一种设计用于在外科手术过程中与血管表面接触以治疗血管狭窄的的医疗装置，该装置的特点是带有一种改良，其包括将可有效防止再狭窄的组合物整合进该装置，所述组合物包含至少一种选自VEGF-C多核苷酸、VEGF-C多肽、VEGF-D多核苷酸和VEGF-D多肽的抗再狭窄药物。

23.权利要求22的医疗装置，其中该装置选自血管内支架、血管内导管、血管外套管、适于覆盖血管内支架或导管的弹性膜、以及它们的组合。

24.权利要求22的医疗装置，该装置含有一种血管内支架，其外表面可与血管表面接触并带有一种组合物，所述组合物包括至少一种选自VEGF-C多核苷酸、VEGF-C多肽、VEGF-D多核苷酸和VEGF-D多肽的抗再狭窄药物。

25.权利要求22的医疗装置，该装置含有一种导管，其外表面可与血管表面接触并带有一种组合物，所述组合物包含至少一种选自VEGF-C多核苷酸、VEGF-C多肽、VEGF-D多核苷酸和VEGF-D多肽的抗再狭窄药物。

26.权利要求22的医疗装置，该装置带有一种气囊导管，其具有可装载治疗药物以便向血管内传递的空间，且该空间内装有一种组合物，所述组合物包括至少一种选自VEGF-C多核苷酸、VEGF-C多肽、VEGF-D多核苷酸和VEGF-D多肽的抗再狭窄药物。

27.一种治疗再狭窄的试剂盒，其包括装有至少一种选自VEGF-C多核苷酸、VEGF-C多肽、VEGF-D多核苷酸和VEGF-D多肽的抗再狭窄药物的容器；和贴在该容器上或与其一起包装的标签，该标签描述了该化合物的防止血管再狭窄的应用。

28.权利要求27的试剂盒，进一步包括选自血管内支架、血管内导管、血管外套管、和适于覆盖血管内支架或导管之表面的弹性膜的一种医疗装置。

29.一种组合物在制备治疗或预防血管狭窄或再狭窄之药物时的应用，所述组合物包括至少一种选自下组的抗再狭窄药物，所述组合包括含血管内皮生长因子C (VEGF-C)多肽之编码核苷酸序列的多核苷酸、血管内皮生长因子D(VEGF-D)多肽之编码核苷酸序列的多核苷酸、VEGF-C多肽和VEGF-D多肽。

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