CN1331468C - 一种用于治疗癌症的植物提取物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于治疗癌症的植物提取物，其可抑制肿瘤细胞，明显提高机体免疫力。本发明所述植物提取物为豆科棘豆属植物提取物苦马豆素，苦马豆素与免疫调节剂聚肌胞(poly IC)或与白细胞介素(IL-2)配合使用。
Description
一、技术领域：
本发明涉及一种用于治疗癌症的植物提取物。
二、背景技术：
我国豆科棘豆属(Oxytopis)植物资源丰富，其主要分布于我国内蒙古、宁夏、甘肃、青海、新疆、西藏、陕西、四川等省区，其中内蒙古棘豆面积326.6万公顷，棘豆面积占其草原面积4.14％，青海棘豆面积200.0万公顷，棘豆面积占其草原面积5.13％，西藏棘豆面积220.9万公顷，棘豆草面积占其草原面积2.68％，甘肃棘豆面积141.2万公顷，棘豆面积占其草原面积7.89％。据不完全统计全国分布面积超过1100万公顷，约占全国草场总面积的2.8％、西部草场面积的3.3％。有关棘豆属植物生物碱成分的研究已有80多年历史，突破性进展始于澳大利亚学者Colegate1979年用a-甘露糖甙酶作为工具酶首次从灰苦马豆中分离出吲哚兹定生物碱一苦马豆素。这是人类首次得到苦马豆素(swainsonine)，并将其正式命名。1982年美国学者Molyneux从绢毛棘豆中分离鉴定出苦马豆素和氧化氮苦马豆素(swainsonine N-oxide)。国内对棘豆化学成分的研究起步较晚。20世纪80年代初期，国内学者主要进行了草地棘豆种类、种群分布的资源调查研究。80年代中期才开始了棘豆化学成分的分离研究；至1989年，曹光荣等从我国黄花棘豆中首次分离并鉴定出其主要化学成分苦马豆素，在随后的十几年间，主要是曹光荣课题组及其培养的博士、硕士研究生围绕我国甘肃棘豆、黄花棘豆、急弯棘豆、宽苞棘豆、冰川棘豆等***地开展了其化学成分、毒理机制、脱毒利用等研究工作，并相继取得了一些突破性进展。主要有：从多种棘豆植物中分离并鉴定出苦马豆素，并测定了几种棘豆属植物中的苦马豆素含量，如甘肃棘豆为0.021％，急弯棘豆0.025％，毛瓣棘豆0.006％，冰川棘豆0.002％；找到了提取苦马豆素的新方法、新途径，改进了苦马豆素的提取工艺及其参数；***地研究了苦马豆素的化学结构与性质；基本弄清了苦马豆素导致公畜不育、母畜流产的机理。从上述研究结果可见，我国棘豆属植物具有相同的化学成分就是苦马豆素。但对于苦马豆素的医疗用途尤其是应用于癌症治疗方面尚无相关报道。
三、发明内容：
本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种用于治疗癌症的植物提取物，其可抑制肿瘤细胞，明显提高机体免疫力。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种用于治疗癌症的植物提取物，其特殊之处在于：所述植物提取物为豆科棘豆属植物提取物。
上述棘豆属植物提取物为苦马豆素。
上述苦马豆素与免疫调节剂聚肌胞(poly IC)配合使用。
上述苦马豆素与白细胞介素(IL-2)配合使用。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：
1、本发明中苦马豆素能激活动物腹腔吞噬细胞的细胞结合活性，从而可抑制肿瘤细胞。同时苦马豆素使用后动物腹腔吞噬细胞的活性比用细小棒杆菌诱发产生的活性高3倍。在动物腹腔吞噬细胞体外培养试验中，同样使用乙巯基酸盐，加苦马豆素和加脂多糖或重组γ-干扰素相比，苦马豆素比后者可诱发吞噬细胞产生高达6-8倍的活性。这些研究结果说明苦马豆素对***、感染性疾病、免疫抑制性疾病有重要意义。动物注射适量的苦马豆素可明显提高免疫力。
2、肿瘤细胞表面的低聚糖在恶性肿瘤表型的表达方面起重要作用，已经证实肿瘤转移导致糖蛋白上天冬酰胺-低聚糖数量的增加。而苦马豆素可抑制糖基化作用或抑制天冬酰胺-低聚糖的合成，从而阻抑了肿瘤细胞的转移，反映出苦马豆素的抗肿瘤作用，且能够激活动物腹腔吞噬细胞的细胞结合活性，从而可抑制肿瘤细胞。
3、本发明中苦马豆素能有效递转致死性辐照(lerhal irradiarion)或高剂量(subletha)化疗所造成的骨髓抑制。这与饮苦马豆素水小鼠骨髓培养细胞增殖比正常高4～5倍、苦马豆素能保护小鼠防止致死性离子辐照(750拉德)的影响和可使机体免受现行癌症治疗药物的细胞毒性影响相一致。对机体应用苦马豆素能促进骨髓增殖有重要意义，这使苦马豆素在这方面的临床作用有潜在的可能性。例如，已报道文献证明，晚期恶性肿瘤的治疗效果与化疗药剂量之间有直接关系；不幸的是，化疗或放疗的剂量受到严重的骨髓以致及随后发生的嗜中性白细胞减少症的限制，而苦马豆素恰能缓解这些副作用的发生。进一步研究，苦马豆素和放疗或化疗同时应用可避免骨髓抑制和白细胞减少等副作用的效果及机理；苦马豆素治疗恶性肿瘤，免疫失调的作用效果及机理等。这一研究将探索苦马豆素大量的、奥妙的生物学信息及其药用价值。苦马豆素作为一种新的天然抗肿瘤药物越来越受到重视。
四、附图说明
附图为SW对S180细胞生长的影响示意图。
五、具体实施方式：
本发明中植物提取物为豆科棘豆属植物提取物苦马豆素。苦马豆素可与免疫调节剂聚肌胞(poly IC)白细胞介素(IL-2)或配合使用。
(一)、苦马豆素抗肿瘤活性
1、苦马豆素对携带肿瘤动物生存时间的影响
用苦马豆素治疗癌症中的一个重要问题是肿瘤转移受到抑制能否延长宿主的生存时间。用苦马豆素结合免疫调节剂聚肌胞(poly IC)或白细胞介素(IL-2)进行过试验。当苦马豆素单独持续使用时，在注射B16-BL16黑色素瘤细胞的动物和未治疗动物之间没有明显差异。但苦马豆素结合poly IC或IL-2使用时，其生存时间明显不同。例如，在注射瘤细胞后65d时，未治疗动物或单独使用苦马豆素的动物100％死亡，poly IC治疗动物75％死亡，poly IC和苦马豆素结合治疗15％死亡，单独使用IL-2者20％死亡，IL-2和苦马豆素同时治疗的动物没有死亡。
对携带小鼠缺乏效果，是由于许多因素如干扰T-细胞。例如，用高剂量环磷酰胺处理有皮下肿瘤的小鼠，以消灭这种细胞群，接着用苦马豆素进行治疗，则大大增加了存活。这个发现认为苦马豆素在治疗动物肿瘤中可能有用，虽然仍需要进行更多的研究以便确定使用的限度以及是否有抗大多数肿瘤或不同瘤型的作用。
2、苦马豆素对人肿瘤在无胸腺小鼠上生长的影响
苦马豆素能抑制人类肿瘤的生长，苦马豆素单用或结合α-干扰素能抑制体内生长的HT29结肠癌；对组织培养中的人类瘤细胞，如SM12直肠癌和A375黑色素瘤也有抗增殖活性。苦马豆素抑制无胸腺裸鼠皮下异源性皮移植的生长和人***癌在肺上的转移可达到50～80％。经静脉注射瘤细胞的实验性诱发导致的肺转移，在动物保持饮苦马豆素水时则转移明显降低。例如，对照组71％的小鼠肺转移不小于50％，而在饮苦马豆素水的动物中有相似肺病变的在25％以下。事实上，治疗组大约有12％的动物未检查出瘤转移。相比之下，苦马豆素对人工培养生长的各种瘤细胞系的增殖没有影响，从而认为在体内的这种生长抑制不是药物对瘤细胞的直接影响。发现苦马豆素能抑制已转移瘤的生长是重要的，因为抗损伤前制剂的活性在临床上最有用；苦马豆素有抗原发性肿瘤和已转移肿瘤生长的能力。发现抗肿瘤转移有效剂是迫在眉睫的任务，这是因为恶性肿瘤的转移是临床治疗学中失败的主要原因。
3、苦马豆素对胃癌生长及浸润转移抑制作用
研究证明，给胃癌裸鼠饮用含SW3μg/ml水溶液，饮2天间隔2天，8周后处死实验动物，发现SW组肿瘤体积明显小于对照组，抑瘤率达73.8％；SW组肝及腹膜转移率均明显低于对照组，抑制率分别达到75.0％和66.7％。SW饮水后，裸鼠脾细胞总数明显增加，外周血淋巴细胞NK活性明显升高，脾细胞NK活性亦明显升高。表明SW可增加机体抗肿瘤免疫，从而抑制肿瘤生长和转移。
4、苦马豆素对小鼠移植性肿瘤S180、ARS的抑制作用
苦马豆素饮水(3μg/ml)或配合皮下注射(4～12mg/kg/d)对小鼠移植性肿瘤S180的抑制率为30.57％～40.76％，苦马豆素饮水兼皮下注射并配合干扰素(15000IU/kg)或聚肌胞(100μg/只)对S180的抑制率为59.24％～69.43％，实验认为苦马豆素饮水兼皮下注射并配合聚肌胞是抑制S180较为理想的组合；苦马豆素单独使用或与干扰素或聚肌胞联用对小白鼠移植肿瘤ARS的生命延长率为2.35％～23.53％
5、免疫增强作用
通过给兔子腹腔内注射苦马豆素(每次20mg，每日2次，1-4天)的研究表明，苦马豆素能激活注射兔子腹腔吞噬细胞的细胞结合活性。同时证明，腹腔吞噬细胞的活性比用细胞棒杆菌诱发产生的活性高3倍。在兔子腹腔吞噬细胞体外培养实验中，同样使用乙疏基酸盐，加苦马豆素和加脂多糖或重组γ-干扰素相比，苦马豆素比后者诱发吞噬细胞产生高达6-8倍的活性。据此可以认为苦马豆素是恶性肿瘤的光谱抑制剂和免疫激活剂。
6、棘豆属植物有效部位对肿瘤的抑制作用
采用黄花棘豆、甘肃棘豆的醇提物，先后对移植性肿瘤S180、小鼠肉瘤37(S37)和腹水型肝癌(H22)进行了抑制试验，结果表明，肿瘤抑制率分别为37.58-64.93％、39.63-39.88％和37.38-51.02％。
苦马豆素抑制肿瘤效果反映表：
| 小鼠肿瘤 | 肿瘤名称 | 抑制效果 |
| B16鼠黑色素瘤细胞 | 单层培养时用苦马豆素处理24～48h，完全抑制。 | |
| B16-F10鼠黑色素瘤细胞 | 在苦马豆素(3μg/ml)中亚融合培养24h，转移抑制率大于80％。 | |
| S180腹水瘤 | 给小鼠接种后注射苦马豆素30～100mg/kg.d，连续5d，完全抑制。 | |
| 小鼠B16-BL16 | 小鼠饮水加苦马豆素，(3μg/ml)抑制自发率达88％。 | |
| 小鼠M5076网状肉瘤 | 小鼠饮水加苦马豆素，(3μg/ml)转移抑制率95％。 | |
| 人类肿瘤 | HT29结肠癌 | 苦马豆素单用或结合γ-干扰素使用，能有效制备体内生长的人HT29结肠癌。 |
二、苦马豆素的抗肿瘤作用机理
研究结果表明，两种不同的苦马豆素处理方法可用于抑制肿瘤的转移或恶性肿瘤的扩散。最初在体外处理瘤细胞，然后静脉注射给动物，由于高尔基体的α-甘露糖甘酶II受到抑制，引起细胞表面低聚糖结构发生变化，从而改变了特殊膜糖蛋白的表达。但给宿主机体应用苦马豆素可能是通过免疫调节机理间接发挥作用的。
两种处理方法经不同机理抑制肿瘤转移，首先，苦马豆素可使机体内源性免疫抑制因子诱发的鼠淋巴细胞增殖减少恢复过来；第二，苦马豆素抑制肿瘤转移的情形与NK细胞激活的动力学变化一致；第三，机体停止使用苦马豆素后抗肿瘤转移的时间(5～7d)也与宿主增强细胞免疫效应机理一致。通过对小鼠接种8×104个B16-BL16瘤细胞经苦马豆素治疗后抑制率达71～80％；而NK细胞缺陷型同源小鼠接种该瘤细胞后经苦马豆素治疗则完全无效。从上述研究和饮苦马豆素水小鼠的脾细胞制备物中NK细胞增殖2～3倍来看，在限制肿瘤转移中还涉及免疫效应细胞。
苦马豆素能促进诱发促细胞有丝***剂IL-2的产生及人外周血液淋巴细胞受体的表达。苦马豆素能使人淋巴细胞从G0过度到G1的比例增加，并在引起半刀豆蛋白进入细胞周期。苦马豆素能激活腹腔吞噬细胞的细胞结合活性以对抗癌细胞。苦马豆素使用后吞噬细胞活性比常用体内激合剂小棒状杆菌所获得的结果高3倍。在引入疏基乙酸盐的腹腔吞噬细胞体外培养中加入苦马豆素的活激水平比已知吞噬细胞激活剂(如脂多糖或重组r-干扰素)高6～8倍。这些研究不仅对***、感染性疾病、免疫以致性疾病有重要意义，而且可阐明吞噬细胞激活的机理。
总而言之，上述研究支持这样一个观点：苦马豆素体内、外处理方法抑制肿瘤生长和转移的机理不同，前者是苦马豆素诱发癌细胞表面低聚糖结构发生变化，后者是宿主体内免疫监控作用增强。
三、实验报告
(一)苦马豆素抑瘤作用初报
引言
苦马豆素(Swainsonine，SW)系从国内植物中提取的一种高尔基复合体a-甘露糖苷酶II抑制剂[1]。国外[2]的初步临床证实对头颈部恶性肿瘤和胸腹部***瘤试治六个星期后具有明显疗效。刘炳亚等[3]的试验证实SW具有抑制人胃癌在裸鼠体内生长和转移的作用，并推测这一作用可能有免疫反应参与。为进一步阐明其药效作用，我所受托对提供的样品进行了体内、体外抑瘤试验。
1、材料和方法
1.1材料
1.1.2动物与瘤株：昆明种小鼠雌雄兼有，体重(18.2±2.0g)，由本校实验动物中心提供。EMT6(鼠源性乳腺癌细胞)由本校放射医学教研室提供。瘤株S180肉瘤腹水细胞由本校实验动物中心提供。
1.1.3药品与试剂：SW纯品和粗提物均由西北农林大学童德文等提供。供小鼠灌胃用试药为粗品，临用前加生理盐水(NS)配制成不同浓度悬液；供四唑盐比色试验(MTT)的试药用纯品如上法配制后再以无菌微孔滤膜过滤，RPMI1640、噻唑蓝购自Sigma公司，胎牛血清购于华美试剂公司。氟尿嘧啶(5-Fu)为天津市氨基酸公司生产，批号020815。
1.1.4仪器：DG3022A型酶联免疫检测仪由国营华东电子管厂制造。
1.2方法
1.2.1MTT[4]实验选用EMT6细胞株，于10％胎牛血清RPMI1640完全培养液中培养至对数生长期，胰酶消化处理后制备成单细胞悬液，调整细胞浓度为6×104个·ml-1，按每孔100μl接种于96孔培养板，24h后吸弃上清，加入不同浓度药物培养液，作用24h。另配制2.5g·L-1的噻唑蓝，用完全培养液调整噻唑蓝浓度，按每孔100μl、试药终浓度为0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8mg·L-1，加入上述培养孔中，继续培养4h，吸弃上清，再加入150μl二甲基甲砜，作用3min后，在酶联检测仪上测定490nm时的吸光度值(A)，计算细胞存活率[公式：细胞存活率＝(实验组A值/对照组A值)×100％]，绘制量效曲线图，测定EC50值和完全致死剂量。
1.2.2体内抑瘤及辐射增敏试验①荷瘤动物模型复制：分别取传代6～7d的S180、EMT6带瘤小鼠，无菌抽取腹水，0.05％台盼兰染色镜检细胞活力在95％以上。以灭菌生理盐水分别稀释瘤液至6×107个·ml-1、1×107·mL-1的细胞悬液，每只小鼠右后腿外侧皮下接种0.2ml，接种6d后随机分组并开始灌胃(ig)给药(5-Fu为腹腔注射ip)，实验分组：阳性对照组(5-Fu)、SW4、8、16mg·kg-1剂量治疗组及NS对照组。②放射增敏试验：S180带瘤动物的移植和接种方法同①，接种6d后小鼠随机分为4组：I为NS对照组动物不照射；II为单照射组，同时ig等量NS；III为辐射增效组进行照射，同时ig 4mg·kg-1SW；Ⅳ为阳性对照组进行照射，同时ip22.5mg·kg-1 5-Fu。照射条件：60Co-γ射线照射源，源距170cm，剂量率为1.240Gy·min-1，总剂量为5GY，一次性全身照射，照射时间为4.03min。③观察指标：称量给药(12d)前后体重、瘤重、脾脏重量；放射增敏试验后观察外周血白细胞数。
1.2.3统计处理 所有数据均采用SPLM3.0版统计软件进行分析处理。
2.1MTT结果EMT6细胞株对SW敏感，SW体外完全致死剂量为6.4mg·L-1，低于0.1mg·L-1抑瘤作用明显(P≥0.05)；其EC50为1.2mg·L-1(Tai1)。
表1SW对EMT6细胞株的抑制作用
| concentration(mg·L-1) | Case(n) | absorbency A | Cell survival rate(％) |
| 12.8 | 9 | 0.003±0.002b | 0.5 |
| 6.4 | 9 | 0.005±0.003b | 0.9 |
| 3.2 | 9 | 0.086±0.012b | 15.0 |
| 1.6 | 9 | 0.135±0.028b | 23.5 |
| 0.8 | 9 | 0.352±0.030b | 61.2 |
| 0.4 | 9 | 0.409±0.045b | 71.1 |
| 0.2 | 9 | 0.460±0.041b | 80.0 |
| 0.1 | 9 | 0.508±0.035 | 88.3 |
| 0.05 | 9 | 0.553±0.033 | 96.2 |
| 0.01 | 9 | 0.575±0.043 | 100 |
| control | 9 | 0.578±0.040 | - |
bP＜0.01vs control
2.2SW对S180及EMT6瘤株的在体抑瘤作用SW给药12d后，治疗组瘤重均低于生理盐水组，8、16mg·kg-1剂量组瘤重显著降低(P＜0.01；Tab2～3)。
表2SW对S180瘤株生长的影响(n＝12
)
| group | dosemg·kg-1 | Body weight(g) | Weight ofspleen(g) | Weight oftumor(g) | Inhibitionrate(％) | |
| before | after | |||||
| NS | - | 23.2±1.5 | 25.7±1.5 | 0.23±0.04 | 1.75±0.55 | - |
| 5-Fu | 22.5 | 24.1±2.0 | 23.0±1.6 | 0.18±0.07 | 0.77±0.40b | 56.0 |
| Large | 16 | 23.5±1.6 | 26.1±3.9 | 0.22±0.05 | 0.88±0.54b | 49.7 |
| middle | 8 | 24.2±2.2 | 26.3±3.1 | 0.22±0.06 | 0.98±0.49b | 44.0 |
| small | 4 | 23.0±1.9 | 25.5±1.8 | 0.21±0.05 | 1.21±0.53b | 30.9 |
bP＜0.01vs NS
表3SW对EMT6瘤株生长的影响(n＝12
)
| group | dosemg·kg-1 | Body weight(g) | Weight ofspleen(g) | Weight oftumor(g) | Inhibitionrate(％) | |
| before | After | |||||
| NS | - | 20.8±2.1 | 23.1±1.7 | 0.24±0.10 | 1.56±0.42 | - |
| 5-Fu | 22.5 | 21.4±1.6 | 20.1±2.2 | 0.19±0.09 | 0.68±0.40b | 56.4 |
| large | 16 | 20.7±1.7 | 22.9±2.1 | 0.22±0.07 | 0.79±0.45b | 49.4 |
| middle | 8 | 21.3±2.1 | 23.2±1.8 | 0.22±0.08 | 0.90±0.38b | 42.3 |
| small | 4 | 21.8±2.1 | 24.3±2.0 | 0.23±0.09 | 1.12±0.52b | 28.2 |
bP＜0.01，vs NS
2.3辐射增敏结果a体重：照射后荷EMT6瘤株的小鼠体重增长缓慢，阳性治疗组体重减轻最显著，一般状况差；而放疗组合并SW治疗组能有效抑制小鼠体重下降。b瘤重：各治疗组瘤重均显著低于NS对照组(P＜0.01)，照射合并SW治疗组抑瘤效果与阳性治疗组接近；c外周血WBC数：阳性组及单照组WBC数明显下降，说明照射能严重杀伤WBC，而SW合并照射组的WBC数则基本维持正常水平(Tab4)。
表4SW对小鼠S180瘤放疗增效作用(n＝12；
)
| group | dose/mg·kg-1 | Body weight/g | Weightofspleen/g | Weightoftumor/g | Inhibitionrate/％ | WBC/109·L-1 |
| before After | ||||||
| NS | - | 23.3 26.1±1.3 ±3.0 | 0.23±0.09 | 1.55±0.56 | - | 5.68±1.75 |
| 5-Fu | 22.5 | 22.4 18.5±2.1 ±2.7b | 0.11±0.07b | 0.70±0.44b | 54.8 | 3.22±0.66b |
| Radiotherapyalone | - | 21.8 22.3±1.9 ±2.4a | 0.14±.06b | 0.99±0.48b | 36.1 | 3.57±0.54b |
| Radiotherapyand SW | 4 | 21.4 24.5±2.0 ±3.1 | 0.18±0.05b | 0.55±0.42b | 64.5 | 6.39±1.34 |
aP＜0.05，bP＜0.01vs NS
3、结论
SW对EMT6细胞株的EC50为1.2(0.8-1.6)mg·L-1；其体外完全致死剂量为6.4mg·L-1；但剂量低于0.1mg·L-1时其抑瘤作用不明显(P≥0.05)。
本实验结果证明，SW对在体和离体S180、EMT6瘤细胞的生长具有明显抑制作用，对60Co-γ射线照射后小鼠外周血白细胞和脾脏均具有明显保护作用。
(二)苦马豆素对小鼠肉瘤180的体外抑制试验
1材料
1.1药物苦马豆素(Swainsonine，SW)，由本实验室从疯草中分离而得。
1.2细胞株小鼠肉瘤180细胞S180均由第四军医大学实验动物中心提供。
2方法与结果
2.1细胞增殖抑制试验取生长状态良好的S180细胞，经计数后用培养液稀释成1×104/ml，分别接种于5个25ml培养瓶中，每瓶为9ml细胞悬液。在其中4个培养瓶中分别加入不同浓度的SW各1ml，使其终浓度分别为100μg/ml，50μg/ml，5μg/ml，0.5μg/ml，第5瓶设为对照组。而后放入37℃，5％CO2培养箱中，于加药后的第1，2，3，4，5，7天对各种浓度的细胞进行计数，绘制生长曲线，在第3天进行一次细胞换液。结果见图1，S180细胞经这4个浓度的SW处理后均出现细胞增殖被抑制，且抑制作用随时间延长而增强。
2.2细胞周期分析取对数生长期的S180细胞分别接种于4个25ml培养瓶中，细胞总数为5×105～106个，于37℃，5％CO2孵箱中培养24h后，加各浓度SW(设50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml三个浓度组)，同时设生理盐水对照组，于37℃，5％CO2孵箱中培养24h后，将各培养瓶中的细胞离心收集。PBS洗涤后制成单细胞悬液，加无水乙醇固定，DNAPrep Kit染色20min，350目筛网过滤，EPICS ELITE ESP流式细胞仪进行DNA含量及细胞周期分析。结果见表1。表1结果表明，加药组与对照组相比G1期细胞百分比分别增加了18.3％、16.8％、4.6％。S期细胞百分比分别降低了9.9％、12.5％、2.0％。
表1S180细胞各周期细胞百分比
| 苦马豆素浓度(Swainsonine’scentitrate)(μg/ml) | G1(％) | S(％) | G2(％) |
| 5050.5对照组(controlgroup) | 40.038.526.321.7 | 52.853.260.762.7 | 7.28.313.015.6 |
3、结论与讨论
用SW对S180的小鼠模型进行过试验，结果表明SW饮水(3μg/ml)或配合皮下注射(4～12mg/kg/d)对小鼠抑制性肿瘤S180的瘤重抑制率为30.57％～40.76％，SW饮水兼皮下注射配合干扰素(15000IU/kg)或聚肌胞(100μg/只)对S180的抑制率为59.24％～69.43％。本实验主要研究的是SW对S180细胞体外培养的影响，结果表明，SW对S180细胞的增殖具有明显的抑制作用，且具有剂量依赖性，而且随着时间延长其抑制作用增强。流式细胞仪检测结果表明，各浓度SW均可影响小鼠肉瘤180细胞的生长周期，G1期细胞明显增多，S期细胞减少。G1期又称细胞复制前期，是指细胞从有丝***到DNA复制之前，同时G1期也是药物作用的靶点[8]。G1期细胞堆积不能进入S期(即DNA复制期)，阻止DNA的复制进程，从而使肿瘤细胞增殖变缓。由此得出，SW可通过不同机制抑制小鼠肉瘤180在体内外的生长。
通过做SW对人食道癌Eca-109细胞在体外生长的抑制试验，结果显示SW对Eca-109细胞的生长有抑制作用。SW不仅可直接作用于肿瘤细胞，它还能刺激淋巴细胞增殖，激活宿主抗肿瘤免疫，刺激骨髓细胞增殖和增加抗原对T细胞的刺激，增强免疫细胞对肿瘤的杀伤活性。SW还可减少甲氨蝶呤(MTX)、5-氟脲嘧啶(5-Fu)，环磷酰胺(CPM)和阿霉素(DOX)等细胞毒抗癌药物的毒副作用[9]因此SW是一种具有前景的治癌药物。
(三)苦马豆素对人食道癌Eca-109细胞体外生长的抑制试验
1、材料
1.1药品：苦马豆素(Swainsonine)，自备；MTT(四唑盐类)由Sigma公司生产；DMSO(二甲基亚砜)由北京化工厂生产。
1.2仪器：DG5031型酶联免疫检测仪(国营华东电子管厂)；Epics ELITE ESP流式细胞仪(美国Coulter公司)。
1.3瘤源：人食道癌Eca-109细胞系由第四军医大学实验动物中心肿瘤细胞室提供。
2、方法与结果
2.1SW对肿瘤细胞的生长抑制作用：取对数生长期的Eca-109癌细胞系，用RPMI1640培养液稀释成1×104/ML，按每孔180μL接种于96孔板，于37℃，5％CO2孵箱中培养24h后，加样品SW，设10、5、2.5、1.25、0.625μg/ml 5个浓度，同时设生理盐水对照组，每组设3个平行孔，于37℃，5％CO2孵箱中培养72h后，每孔加MTT(5mg/ml)20μL，于37℃，5％CO2孵箱中培养4h，弃去孔中培养液，每孔加DMSO150μL溶解甲肷，酶标仪检测A490，按下式计算SW对Eca-109癌细胞的生长抑制率，抑制率＝(1-给药组平均OD值/对照组平均OD值)×100％。结果显示，各浓度SW对Eca-109细胞的生长抑制率分别为59.93％、57.57％、50.38％、9.43％、1.12％。由此可见SW对Eca-109细胞生长的半数抑制浓度IC50小于2.5μg/ml，具有明显的抑制作用。
2.2SW对Eca-109细胞生长周期的影响：取对数生长期的Eca-109细胞分别接种于4个25ml培养瓶中，细胞总数为5×105～106个，于37℃，5％CO2孵箱中培养24h后，加各浓度SW(设50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml三个浓度组)，同时设生理盐水对照组，于37℃，5％CO2孵箱中培养24h后，将各培养瓶中的细胞用胰酶消化下来，离心收集。PBS洗涤后制成单细胞悬液，加无水乙醇固定，DNAPrep Kit染色20min，350目筛网过滤，EPICS ELITE ESP流式细胞仪进行DNA含量及细胞周期分析。结果见下表。
食道癌Eca-109细胞各周期细胞百分比
| 苦马豆素浓度(Swainsonine’scentitrate)(μg/ml) | G1(％) | S(％) | G2(％) |
| 502510对照组(controlgroup) | 68.868.564.149.7 | 26.025.928.738.0 | 5.25.57.212.3 |
上表结果表明，加药组与对照组相比G1期细胞百分比分别增加了19.1％、18.8％、14.4％。S期细胞百分比分别降低了12％、12.1％、9.3％。
3、结论与讨论
MTT分析法以代谢还原3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)为基础，活细胞的线粒体中存在与NADP相关的脱氢酶，可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色甲肷，死细胞此酶消失，MTT不被还原，用DMSO溶解甲肷变成蓝紫色，可用酶标仪在490nm波长检测光密度，比较对照组与加药组的OD值得出抑制率。本结果表明SW对人食道癌Eca-109细胞生长具有明显的抑制作用，且具有剂量依赖性。流式细胞仪检测结果表明，各浓度SW均可影响食道癌Eca-109细胞的生长周期，G1期细胞明显增多，S期细胞减少。G1期又称细胞复制前期，是指细胞从有丝***到DNA复制之前，同时G1期也是药物作用的靶点[11]。G1期细胞堆积不能进入S期(即DNA复制期)，阻止DNA的复制进程，从而使肿瘤细胞增殖变缓。到目前为止，对SW体外抗肿瘤活性的研究很少。本试验结果表明SW可抑制人食道癌Eca-109细胞的生长，国内尚未见报道。通过本实验的研究从另一侧面揭示了SW治疗食道癌的作用机制，也为食道癌的治疗提供了实验资料。
Claims (1)
1、一种苦马豆素在制备放疗后提高白细胞水平的药物中的应用。
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