具体实施方式
实施例1
三七总皂苷酸水解方法的建立(李云华等.超临界流体色谱法测定三七及云南白药中人参二醇和人参三醇的含量.药学学报,1991,26(10):764。杨崇仁等.三七中达玛甾烷型皂甙的热不稳定性及酸水解产物.云南植物研究,1986,8(1):87)
高效液相/电喷雾串联二级质谱测定血浆样品的第一步是三七总皂苷的酸水解,水解产率直接影响测定结果,因此我们对酸水解条件进行了优化。将水解产物中的人参三醇和人参二醇硅烷化后用气相色谱仪测定含量,以水解产率为评价指标优化了三七总皂苷酸水解条件。
1仪器、试药
1.1仪器
恒温水浴:GSY-II型,北京医疗设备厂
气相色谱仪(配有氢火焰离子检测器):HP3398A,Beckman公司。
1.2试药
衍生化试剂:双-(三甲基硅烷基)乙酰胺:BSA,迪马公司
三甲基一氯硅烷:TMCS,迪马公司
三甲基硅烷咪唑:TMSI均为分析纯,迪马公司
人参二醇:购自中国药品生物制品检定所,批号:0701-9908
人参三醇:购自中国药品生物制品检定所,批号:0702-9908
其它试剂均为国产分析纯。
2方法、结果
2.1.1样品衍生化条件:
在含有水解产物人参三醇和人参二醇的干燥试管中加入混合衍生化试剂200μl,密塞,混匀,置70℃恒温水浴中反应20分钟,取出,放至室温,即得人参三醇(pt)和人参二醇(pd)的硅烷化衍生物。混合衍生化试剂为BSA∶TMCS∶TMSI=3∶2∶1。
2.1.2气相色谱条件
填充石英毛细管柱:Bp5型,320μm×15m,膜厚0.25μm。
柱温:初始温度150℃;程序升温,最终温度300℃。
载气:高纯N2或氦气或氩气,流速2.0ml/min;
进样条件:进样室温度200-300℃,进样体积1μl;
检测器条件:氢火焰离子检测器(FID)或热导检测器,温度150-300℃,
2.1.3样品测定
定量吸取衍生化后的样品1μl,注入进样室,测定峰面积,同时以衍生化后的对照品溶液作对照,计算含量。
根据上面色谱条件测定的色谱图见图1、2、3、4。
2.2酸水解条件的探讨
根据文献,确定酸水解的基本条件,在此基础上,我们对水解的具体条件进行了优化。
2.2.1温度对水解反应产率的影响
固定反应液为5%硫酸(50%)乙醇溶液,反应时间为10小时,以100μg三七总苷为样品,调整反应温度分别为70℃、80℃、90℃、98℃(近沸腾)。通过测定反应后产物中人参三醇(pt)和人参二醇(pd)的量,来比较反应温度对产率的影响。结果见表1。
表1 温度对水解反应产率的影响(n=3)
温度(℃) |
水解产物 |
峰面积 |
相应的量(μg) |
70809098 |
人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇 |
4017375±1105217905883±2055539328964±20057212741866±5960916771265±4604469625378±6834026208502±4532214589765±293745 |
4.2148.4899.78513.6837.10210.3366.5114.928 |
2.2.2反应时间对水解反应产率的影响
固定反应液为5%硫酸(50%)乙醇溶液,反应温度为80℃,以100μg三七总皂苷为样品,调整反应时间分别为5h、7h、10h、15h。来比较反应时间对产率的影响。结果见表2。将反应介质改为5%硫酸(50%)甲醇溶液,其他条件同上,结果见表3。
表2 5%硫酸(50%)乙醇溶液中反应时间对水解反应产率的影响(n=3)
时间(h) |
水解产物 |
峰面积 |
相应的量(μg) |
571015 |
人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇 |
6388693±37693311629944±8373567460555±38794911035885±4855799328964±20057212741866±5960918114374±55177710638925±861753 |
6.70012.4887.82511.8519.78513.6838.51111.424 |
表3 5%硫酸(50%)甲醇溶液中反应时间对水解反应产率的影响(n=3)
时间(h) |
|
峰面积 |
相应的量(μg) |
571015 |
人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇 |
6346489±3363649205878±4510886667407±4533849203171±6902388153538±49736610304669±7316317924205±3882868166636±228665 |
5.9279.0646.2279.0627.61510.1477.4018.041 |
2.2.3硫酸浓度对水解反应产率的影响
固定反应时间为10小时,反应温度为80℃,以100μg三七总苷为样品,调整反应液中硫酸浓度分别为1%、5%、7%、10%。来比较反应液中硫酸浓度对产率的影响。结果见表4。
表4 反应液中硫酸浓度对水解反应产率的影响(n=3)
浓度(%) |
|
峰面积 |
相应的量(μg) |
15710 |
人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇 |
几无峰几无峰9328964±20057212741866±5960918126859±56075311998647±5639365445708±5282348376413±804136 |
----9.78513.6838.52412.8855.7128.995 |
通过以上实验,确定酸水解条件为:
三七总皂苷一定量(10mg以下)加入20ml具胶塞试管中,加入3ml 5%硫酸(50%)乙醇溶液,混匀,密塞,置80℃恒温水浴中反应10小时,60℃水浴中氮气吹至无醇味,用1ml水稀释,用水饱和的氯仿萃取三次(1.5ml/次),合并氯仿层,用氯仿饱和的水洗涤两次(1.5ml/次),将氯仿层转移至5ml具塞试管中,60℃水浴中氮气吹干,即得人参三醇(pt)和人参二醇(pd)。
实施例2
人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1的水解产率的测定
绝对加样回收率(萃取率)、Rb1和Rg1的水解产率考察
取约20μg人参二醇,加入相应溶剂,经萃取后,吹干溶剂,衍生化后测定峰面积A;取等量人参二醇,不经萃取而直接衍生化后测定峰面积B。人参三醇同样处理,测得峰面积A′、B′。根据峰面积比求得绝对加样回收率(萃取率),结果见表5。
表5 绝对加样回收率(萃取率)结果(n=5)
平均峰面积 |
人参二醇19.44μg |
人参三醇19.12μg |
萃取后直接测定回收率(%) |
18094259±41616720877188±37578986.7 |
20251031±48602523183779±39412487.35 |
分别取50μg Rb1和Rg1,按照确立的酸水解条件进行水解、萃取,衍生化后测定相应峰面积,并计算产物中人参二醇和人参三醇的量,与理论产量相比较,计算水解产率,结果见表6。
表6 Rb1和Rg1的水解产率(n=5)
|
Rb1 50μg |
Rg1 50μg |
平均峰面积测得量μg理论得量μg水解率(%) |
13626075±35427814.639529.712949.3 |
10764397±30140310.163220.758149.0 |
实施例3
人参皂苷Rg1生物体内样品“酸水解/高效液相/电喷雾串联二级质谱”测定方法的建立
1仪器、试药
1.1仪器及HPLC/MS/MS条件
恒温水浴:GSY-II型,北京市医疗设备厂。
液相色谱--质谱联用仪:API 3000,美国ABI公司
液相色谱条件:
液相色谱仪:Agilent 1100 series;
色谱柱:C18,5μm,2.1mm×5.0cm;
流动相:乙腈-甲醇-1%的醋酸水溶液(30∶45∶25);
流速0.2ml/min;定量进样体积20μl。
质谱条件:
离子源为涡流离子喷雾;喷射电压为4000V。扫描方式为多反应监测,正离子
检测,用于检测的离子为人参三醇的二级离子m/z477.4→423.4。
1.2试药
人参三醇:购自中国药品生物制品检定所,批号:0702-9908
乙腈、甲醇均为色谱纯,其它试剂均为分析纯。
2方法
2.1血浆样品的处理、测定
沉淀蛋白质:精密量取血浆样品1ml,置10ml离心管中,在涡旋状态下缓慢滴加4ml甲醇,混匀,4000r/min离心10min,将上清液尽可能完全地转移至20ml具胶塞试管(水解管)中,并用1ml甲醇将沉淀再萃取一次,上清液也并入水解管中将上清液在60℃水浴中氮气吹干;
水解:在含有样品的水解管中,加入3ml 5%硫酸(50%)乙醇溶液,混匀,密塞,置80℃恒温水浴中反应10小时;
萃取:将反应液在60℃水浴中氮气吹至无醇味,用1ml水稀释,用水饱和的氯仿萃取三次(1.5ml/次),合并氯仿,用氯仿饱和的水洗涤两次(1.5ml/次),将氯仿层转移至5ml具塞试管中,60℃水浴中氮气吹干,即得含有人参三醇的水解产物。
测定:用100μl流动相溶解萃取后吹干的水解产物,进样20μl,以人参三醇的二级离子m/z477.4→423.4为检测信号,测定峰面积,代入标准曲线计算人参三醇的量。
2.2标准曲线建立
配制系列浓度的人参三醇标准甲醇溶液:7.8ng/ml、15.6ng/ml、31.2ng/ml、62.5ng/ml、125.0ng/ml、250.0ng/ml;分别精密量取每个浓度的标准液各100μl分别加入含有1ml空白犬血浆的10ml离心管中,混匀,相当于血浆中人参三醇浓度为0.78ng/ml、1.56ng/ml、3.12ng/ml、6.25ng/ml、12.50ng/ml、25.00ng/ml;以下处理同“血浆样品的沉淀蛋白质、水解(仅仅加入相应溶剂,不水浴)、萃取、测定方法”中的步骤。测定峰面积,以峰面积为纵坐标,血浆中人参三醇的浓度为横坐标,绘制标准曲线,并拟合直线回归方程。
2.3测定方法的考察
2.3.1日内和日间精密度考察
取标准曲线项下,相当于血浆浓度分别为0.78ng/ml、6.25ng/ml、25.00ng/ml的三个样品,一日内测定5次,计算日内精密度;连续5日每日测定一次,计算日间精密度。
2.3.2相对回收率(方法回收率)、绝对回收率(萃取率)考察
取空白犬血浆1ml,分别定量加入人参三醇0.78ng、6.25ng、12.50ng,按照“血浆样品的沉淀蛋白质、水解(仅仅加入相应溶剂,不水浴)、萃取、测定方法”中的步骤,测定峰面积;并将相同量的人参三醇直接测定峰面积。平行测定三份,根据测得结果计算相对回收率和绝对回收率:
相对回收率=(萃取后测得量/加入量)×100%
绝对回收率=(萃取后测得峰面积/直接测定的峰面积)×100%
2.3.3 Rg1水解产率的考察
取空白犬血浆1ml,分别定量加入Rg1 50ng、100ng、150ng,按照“血浆样品的沉淀蛋白质、水解、萃取、测定”方法中的步骤,测定峰面积,代入标准曲线计算人参三醇的量。平行测定三份,通过与理论产量的比较,计算水解产率。
人参三醇理论得量=Rg1的量×476/801
Rg1水解率(%)=(人参三醇测得量/理论得量)×100%
3结果
3.1根据确定的质谱条件,测得人参三醇对照品的二级扫描质谱图。
3.2按照确定的色谱条件测得的空白血浆、人参三醇对照品、血浆样品色谱图见图5、6、7。
由图5、6、7、可以看出,人参三醇对照品保留时间为3min,空白样品在此处无杂峰干扰,血浆样品峰形良好。
3.3人参三醇的标准曲线结果见图9。
对标准曲线进行直线回归,回归方程为:S=488+2.41×103C r=0.9935 n=6线性范围0.78ng/ml~25.00ng/ml,最低检测限0.5ng/ml(S/N=3)。
3.4方法考察的日内精密度和日间精密度结果,见表7、8。
表7 日内精密度测定结果(峰面积)
浓度ng/ml |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
平均 |
SD |
RSD(%) |
0.786.2525.00 |
21131583053019 |
24171521354561 |
25281499054667 |
23941607257381 |
26321625455464 |
24171567255018 |
1955481590 |
8.13.52.9 |
表8 日间精密度测定结果(峰面积)
浓度ng/ml |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
平均 |
SD |
RSD(%) |
0.786.2525.00 |
21131583053019 |
23541448354493 |
27231704357391 |
23701532855498 |
26101697053174 |
24341593154715 |
23910941808 |
9.86.93.3 |
由表6、7可以看出,日内精密度RSD%在3.1%~7.8%之间,日间精密度RSD%在5.2%~13.3%之间。即精密度均小于15%。
3.5人参三醇的加样回收率:相对回收率和绝对回收率结果,见表9。
表9 人参三醇的加样回收率(n=3)
|
|
低浓度 |
中浓度 |
高浓度 |
加入量萃取后测定直接测定相对回收率绝对回收率 |
(ng)峰面积测得量(ng)峰面积(%)(%) |
0.7802428±1670.8053207±192103.275.7 |
6.25015310±9616.15019503±83598.478.5 |
12.50029680±124412.11336915±115896.980.4 |
由表10可知,人参三醇的相对回收率(方法回收率)在96.9%~103.2%之间,绝对回收率(萃取率)在75.7%~80.4%之间,回收率比较稳定。
3.6人参皂苷Rg1水解产率结果,见表10。
表10 Rg1水解产率结果(n=3)
|
Rg1 50ng |
Rg1 100ng |
Rg1 150ng |
平均峰面积测得量(ng)理论得量(ng)水解率(%) |
38297±179115.688429.712852.8 |
81689±391733.693859.425756.7 |
119286±620349.293889.138655.3 |
注:最后样品是用200μl流动相溶解。
由表10可知,Rg1水解产率在52.8%~56.7%之间,水解产率比较稳定。
实施例4
2.3.4三七总皂苷水解后人参三醇得率考察
取空白犬血浆1ml,分别定量加入三七总苷20.0ng、60.0ng、120.0ng,按照“血浆样品的沉淀蛋白质、水解、萃取、测定“方法中的步骤,测定峰面积,代入标准曲线计算人参三醇的量。平行测定三份,根据结果计算人参三醇的得率。
人参三醇得率(%)=(测得的人参三醇量/加入总苷的量)×100%
三七总皂苷水解后人参三醇得率结果,见表11。
表11 三七总皂苷水解后人参三醇得率(n=3)
总苷加入量(ng) |
测得量(ng) |
人参三醇的得率(%) |
平均得率(%) |
20.060.0120.0 |
2.75±0.228.39±0.5716.57±0.84 |
13.7513.9813.80 |
13.84 |
由表11可知,三七总皂苷水解后人参三醇得率为13.84%,比较稳定,可以用水解后人参三醇的量来推算三七总皂苷的量。
实施例5
犬口服三七总苷普通片的体内实验
1仪器、试药
三七总皂苷普通片,市售糖衣片:血塞通片(三七总皂苷片),云南金泰得制药
总公司,批号:010502
犬:3只,杂种,健康,体重17.2±2.4kg。
其它同前。
2方法
2.1给药、采血方法
3只犬实验前禁食24小时,口服三七总皂苷普通片,按体重给药,剂量90mg/kg。
采血时间为:服药前5min、服药后0.5、1、2、6、8、12、16、24h,从前肢采静脉血3ml,肝素抗凝,以4000r/min离心10min,分离血浆,冷冻,备用。
2.2血浆样品的测定
按照血浆样品的“沉淀蛋白质、水解、萃取、测定”方法,测定采集的血浆样品中的人参三醇含量。
2.3结果处理
2.3.1药时曲线的绘制和相关参数的计算
以血浆中人参三醇浓度为纵坐标,采血时间为横坐标,以点到点的连接方式,绘制血药浓度-时间曲线,计算峰浓度Cmax、达峰时Tmax、药时曲线下面积AUC、平均驻留时间MRT等参数。
Cmax、Tmax用非房室模型法求得,AUC用梯形法求得,MRT=AUMC/AUC,AUMC是以ct对t作图,所得的曲线下面积,用梯形法求得。
3结果
3.1以三只犬的平均血药浓度对时间作图,见图10。
3.2将每只犬的血药浓度对时间作图,采用点到点连接,得到药时曲线,计算相关药代动力学参数,3只犬血药浓度非房室模型法分析结果,见表12。
表12 3只犬血药浓度非房室模型法分析结果
|
|
1 |
2 |
3 |
平均 |
SD |
普通制剂 |
Cmax(ng/ml)Tmax(h)MRT(h)AUC0~24(h·ng/ml) |
13.94210.49190.40 |
11.1629.04132.83 |
12.6329.90117.07 |
12.5829.81146.77 |
1.3900.7338.60 |
Cmax(ng/ml)为峰浓度,Tmax(h)为达峰时,MRT(h)为平均驻留时间,AUC0~t(h·ng/ml)为0~t时间的药时曲线下面积。
3.3三七总皂苷的药时曲线
根据三七总皂苷水解后人参三醇的得率(13.84%),将3只犬的平均血药浓度折算成三七总皂苷浓度,绘制药时曲线,以推算血浆中三七总皂苷的情况,结果见图11。三七总皂苷浓度=人参三醇浓度/0.1384。