CN107305205A

CN107305205A - 一种生物样品中原人参二醇及其代谢产物的提取方法

Info

Publication number: CN107305205A
Application number: CN201610247733.4A
Authority: CN
Inventors: 段更利; 李嫣; 郁颖佳; 凌今; 冯嘉楠
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2016-04-20
Filing date: 2016-04-20
Publication date: 2017-10-31

Abstract

本发明属分析化学领域，涉及一种生物样品中原人参二醇及其体内代谢产物提取方法。尤其是一种基于C8烷基修饰磁性介孔材料的大鼠血浆内原人参二醇及其代谢产物提取方法。该方法使用C8烷基修饰磁性介孔材料为载体，从生物样品中提取原人参二醇及其体内代谢产物，提取物兼容后续液质联用检测。该方法简便、环保、经济，适用于大鼠血浆内原人参二醇及其代谢产物液质联用的前处理过程。

Description

一种生物样品中原人参二醇及其代谢产物的提取方法

技术领域

本发明属分析化学领域，涉及化合物提取方法，具体涉及一种生物样品中原人参二醇及其体内代谢产物提取方法。特别涉及一种基于C8烷基修饰磁性介孔材料的大鼠血浆内原人参二醇及其代谢产物提取方法。

背景技术

本领域公知，液质联用技术是检测体内药物及其代谢产物的主要手段之一。使用液质联用技术检测生物样品时，必须首先对样品进行前处理，去除样品中的蛋白质、无机盐以及其他干扰分离和检测的杂质。目前常用的前处理方法包括：蛋白沉淀法、液液萃取法和固相萃取法等。其中，蛋白沉淀法的优点是操作简便，耗时短，但缺点是，无法去除样品中的无机盐等小分子化合物，且大幅降低样品浓度；液液萃取法的优点是所用试剂、装置廉价易得，除杂效果显著，但存在的缺点是所使用试剂高毒，且提取范围窄；固相萃取法的优点是除杂效果明显，亲环境，但存在耗材昂贵，步骤较多等缺点。因此，建立一种简便、环保、经济的生物体内药物及其代谢产物检测前处理方法，将可以为液质联用检测和药物代谢研究提供良好的实验基础。

原人参二醇是原人参二醇型人参皂苷的体外水解产物，从结构上看，它属于达玛烷型四环三萜类人参皂苷元化合物，分子式为C₃₀H₅₂O₃，分子量为460.70，熔点197.5-198.5摄氏度。前期研究显示，原人参二醇体内代谢产物以羟基化为主，极性较原药逐步加大。本发明的前期实验发现，C8基团对原人参二醇及其代谢产物均具有良好的吸附活性，基于此，本申请的发明人拟提供一种经济、快捷、环保的适用于原人参二醇及其体内代谢产物的前处理方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种经济、快捷、环保的适用于原人参二醇及其体内代谢产物液质联用检测的前处理方法。具体涉及一种生物样品中原人参二醇及其体内代谢产物提取方法，尤其涉及一种基于C8烷基修饰磁性介孔材料的大鼠血浆内原人参二醇及其代谢产物提取方法。

为实现上述目的，本发明技术方案为:

一种基于C8烷基修饰磁性介孔材料的大鼠血浆内原人参二醇及其代谢产物提取方法，使用C8烷基修饰磁性介孔材料为载体, 从生物样品中提取大鼠血浆内原人参二醇及其代谢产物，提取物兼容后续液质联用检测。

本发明中，所述C8烷基修饰磁性介孔材料为磁性材料；磁性材料可在磁铁作用下实现固液分离，免除离心操作，简便易行。

本发明中，所述生物样品为血浆；血浆是最常用的生物样品，易获得，易分析，而且结果能准确反映药物代谢过程。

本发明中，所述C8烷基修饰磁性介孔材料加入量为1 mg/100 μL生物样品；每100μL生物样品加入1 mg的C8烷基修饰磁性介孔材料可以将目标化合物完全提取。

本发明中，提取时长为10 min；提取时间10 min可以使C8烷基修饰磁性介孔材料与化合物吸附完全。

本发明中，洗脱溶剂为甲醇；甲醇与目标化合物极性相似，能高效洗脱目标化合物。

本发明中，洗脱溶剂量为50 μL；50 μL甲醇即可将目标化合物洗脱完全，且较小的洗脱体积可以浓缩目标化合物，提高检测灵敏度。仅使用微量有机溶剂更加环保。

本发明中，洗脱时长为5 min；目标化合物可在5 min内被完全洗脱。短时间操作有利于提高提取效率。

本发明技术方案的有益之处在于：

与蛋白沉淀法相比，本方法具有提取富集作用，可大幅提高检测灵敏度，适用于生物样品中痕量代谢产物的提取检测；与液液萃取法相比，本方法仅使用微量有机溶剂，更加绿色环保；与传统固相萃取法相比，本方法无需淋洗过程，更加快捷简便。此外，本方法使用磁铁即可实现固液分离，无需专业设备，适用性广。

附图说明

图1是本发明的操作示意图。

图2是使用本发明方法提取大鼠血浆中原人参二醇及其代谢产物的超高效液相串联飞行时间质谱的检测色谱图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步的详细描述。

实施例1

1.试验给药方案

1.1 PPD混悬液配制

取0.5 g羧甲基纤维素钠加入100 mL去离子水，40℃水浴加热并搅拌，直至其完全溶解，取500 mg的PPD原料药，加入上述0.5%羧甲基纤维素钠溶液100 mL，充分混匀后4℃保存待用；

1.2 给药与样品收集

取雄性S.D.大鼠10只，每只体重在250~300 g之间，适应性喂养1周后，次日上午10点按100 mg/kg体重灌胃给药1次，当日13点取静脉血，离心取血浆待用；

2. 样品前处理与分析

2.1 样品前处理

取上述大鼠血浆100 μL置于1.5 mL离心管中，加入C8烷基修饰磁性介孔材料1 mg，涡旋震荡10 min，用磁铁将C8烷基修饰磁性介孔材料吸引于离心管一侧后，弃去上清液，加入50 uL甲醇，涡旋震荡5 min，用磁铁将C8烷基修饰磁性介孔材料吸引于离心管一侧后，取上清5 μL进样（如图1所示）；

2.2 色谱分离条件

色谱柱：Agilent Eclipse plus C18 RRHD 1.8 μm， 2.1 x 50 mm；流动相：0.5%甲酸水溶液（A）、乙腈(B)梯度洗脱，流速 0.3 mL/min，柱温30℃。色谱梯度洗脱条件如下表1所示：

表1 UPLC梯度洗脱条件

Time(min)	A(%)	B(%)	Flow(mL/min)
				0	95	5	0.3
1	95	5	0.3
				1.5	75	25	0.3
6.0	25	75	0.3
				12.0	0	100	0.3
13.0	0	100	0.3
				15.0	95	5	0.3

2.3 质谱检测条件

离子源为电喷雾电离源（ESI），正离子扫描模式检测，扫描范围为10-1000 Da，源温度为120℃，电离源气体1（N₂）压力为50 psi，电离源气体2（N₂）压力为50 psi，气帘气体（N₂）压力为30 psi，离子喷射电压为5500 V，去簇电压（DP）为80 V，CE为10 eV；

本发明实验结果显示：

通过对所有大鼠血浆样品和血浆空白对照总离子色谱图的比较，两者均无明显差异，提取离子色谱具有可比性；通过对血浆样品和空白对照中提取离子色谱逐一比对，在大鼠血浆中发现原型药物PPD和8种27个代谢产物（如图2所示）；原人参二醇药物原型+H峰的m/z为461.3989，保留时间为8.742 min，其代谢产物m/z分别为445.3676、457.3676、459.3832、475.3782、477.3938、493.3887、509.3836、441.3714，保留时间介于4.620至8.219 min之间；

根据提取离子色谱图结果所示，本方法对原人参二醇原药及其代谢产物提取准确、完全，除杂作用显著，可与液质联用检测器相匹配，且具有富集浓缩作用，大幅提高检测灵敏度，目标化合物峰型良好，分离度高，响应强，无杂质干扰，仅需100 μL样品即可完成代谢产物检测。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内。

Claims

1.一种生物样品中原人参二醇及其代谢产物的提取方法，其特征在于，使用C8烷基修饰磁性介孔材料为载体, 从生物样品中提取原人参二醇及其体内代谢产物，提取物兼容后续液质联用检测：包括步骤：

1）样品前处理

取生物样品置于离心管，加入C8烷基修饰磁性介孔材料进行提取，震荡后，弃上清，加入甲醇洗脱，震荡后，取上清进样；

2）色谱分离

色谱柱：Agilent Eclipse plus C18 RRHD 1.8 μm， 2.1 x 50 mm；流动相：0.5%甲酸水溶液（A）、乙腈(B)梯度洗脱，流速 0.3 mL/min，柱温30℃。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述C8烷基修饰磁性介孔材料为磁性材料。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物样品为血浆。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述C8烷基修饰磁性介孔材料加入量为1mg/100 μL生物样品。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，提取时长为10 min。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，洗脱溶剂为甲醇。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，洗脱溶剂量为50 μL。

8.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，洗脱时长为5 min。