CN1309698A - 用于培养动物细胞的培养基和使用该培养基生产蛋白质的方法 - Google Patents

用于培养动物细胞的培养基和使用该培养基生产蛋白质的方法 Download PDF

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Abstract

一种用于培养动物细胞的培养基,其特征在于含有鱼肉的酶促降解产物或鱼肉提取物,和一种通过使用该培养基生产所需要的蛋白质的方法。

Description

用于培养动物细胞的培养基 和使用该培养基生产蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及用于培养动物细胞的培养基，和使用该培养基生产蛋白质的方法。更具体地说，本发明涉及用于培养动物细胞的培养基，该培养基含有一种鱼肉提取物或鱼肉的酶促降解产物，但是不含有哺乳动物衍生的组分如蛋白质或它的分解产物；和使用该培养基生产蛋白质的方法。
背景技术
在培养动物细胞以获得一种由动物细胞产生的天然蛋白质，或在培养一种结合有编码所需要的蛋白质的基因的动物细胞以产生所需要的蛋白质等过程中，必需的营养物如碱、糖、氨基酸和维生素被加入到培养基中。此外，一种哺乳动物衍生的提取物，具体地说，血清如胎牛血清通常以5至20％的量加入以便使动物细胞增殖。但是，这种哺乳动物衍生的血清有许多缺点。它占培养基成本的75至95％，和由于在质量上存在的批间差异，不能获得稳定的增殖。此外，哺乳动物衍生的血清不能在高压灭菌器等中消毒，因此可能被病毒或支原体污染。尽管大多数的这些病毒或支原体是非致病的，但是从稳定生产的观点看它们会变成额外的未知因素。此外，血清含有超过500种类型的蛋白质，因此使从培养基中分离和纯化所需要的蛋白质-细胞产物复杂化。为解决这类关于稳定生产的问题，实行了用一种血清衍生的纯化的蛋白质如胎球蛋白、胰岛素或转铁蛋白代替血清的方法。从生产成本的观点看也尝试了使用从哺乳动物提取的培养基组分的方法。
近年来，人们表现出了对哺乳动物衍生的组分与疯牛病、牛的海绵状脑病(BSE)、传染性海绵状脑病(TSE)和Creutzfeld-Jakob疾病(CJD)之间关系的关注。从安全性方面来看需要开发用于培养动物细胞的培养基，该培养基不含这些哺乳动物衍生的组分。
在动物细胞的培养中，在培养的早期，不向培养基中加入上述哺乳动物衍生的组分会引起细胞存活率的显著下降和培养肉汤中活细胞计数的减少。这些事件使长期培养或大规模培养不可能进行。本发明的目的在于提供用于培养动物细胞的培养基，该培养基不含哺乳动物衍生的组分并且不存在上述问题，和使用该培养基生产蛋白质的方法。
发明的公开
为了达到上述目的，本发明的发明者们从用于培养动物细胞的常规培养基中除去哺乳动物衍生的组分。他们向形成的培养基中加入各种物质，并利用以编码抗体蛋白质的基因转化的CHO细胞进行了深入的研究。研究的目的是获得一种能刺激该CHO细胞增殖的物质，由此产生高浓度的抗体蛋白质。该研究导致发现这一目的可以通过加入一种鱼肉提取物或鱼肉的酶促降解产物来达到，并且基于这一发现，完成了本发明。
即，本发明涉及用于培养动物细胞的培养基，该培养基含有一种鱼肉提取物或鱼肉的酶促降解产物，和用该培养基生产蛋白质的方法。
附图的简要说明
图1是表示在分别含有白利(Brix)1％和白利2％的鱼肉酶促降解产物和10克/升的牛肉水解产物的培养基中培养的CHO细胞的活细胞密度的图。
图2是表示在分别含有白利1％和白利2％的鱼肉酶促降解产物和10克/升的牛肉水解产物的培养基中培养的CHO细胞的存活率(％)的图。
图3是表示在培养基中由在分别含有白利1％和2％的鱼肉酶促降解产物和10克/升的牛肉水解产物的培养基中培养的CHO细胞产生的抗体蛋白质的浓度(毫克/升)的图。
图4表示在实施例5中使用一种摇瓶式细胞培养装置进行细胞培养的结果。在图4中纵轴分别表示活细胞密度、细胞存活率和产生的抗体蛋白质的量。每个横轴代表使用培养基B开始培养后培养的天数。
实施本发明的最佳方式
本发明将通过下文进行详细说明。本文中叙述的所有文件作为参考文献将在本文中被引用。
本发明的培养基是一种用于培养动物细胞的培养基，该培养基含有鱼肉提取物或鱼肉的酶促降解产物。根据本发明，动物细胞能被令人满意地进行培养而不需向培养基(通常已用作动物细胞培养的培养基)中添加哺乳动物衍生的组分。
用于本发明的鱼肉的实例有红肉鱼的鱼肉如狐鲣、护卫鲭、金枪鱼、鲭鱼、太平洋竹刀鱼、沙丁鱼、马鲭、和鲑鱼的鱼肉，及白肉鱼如鳕鱼、日本海刺鳍鱼、右眼鲜鱼、左眼鲜鱼和海鲷科鱼的鱼肉。优选的实例是狐鲣、护卫鲭、鳕鱼、鲭鱼、鲑鱼和沙丁鱼。
用于本发明的鱼肉提取物可通过将鱼肉切成适当的小块或将鱼肉切碎成糊状，并用热水，例如90至95℃的热水，提取肉块或肉糊的可溶性组分几十分钟至几十小时来获得。具体的实例是由用于生产干燥狐鲣的煮过的狐鲣制得的原液和在生产罐装食品过程中的烹调残液。
鱼肉的酶促降解产物可通过，例如加入适量的水至蒸煮的鱼肉本身，或切碎成糊状的鱼肉，或上述鱼肉提取物中，接着，如果必需，经加热使蛋白质变性，然后用蛋白酶处理该物料，和按照需要将处理过的物料进行离心或过滤以除去油和不溶物来制得。将产生的鱼肉提取物或鱼肉的酶促降解产物按需要调节至pH7至7.4备用。
用于本发明的蛋白酶是，例如，蛋白水解酶和/或肽酶。在本发明中，术语蛋白水解酶是指一种可将蛋白质作为底物水解的酶，而术语肽酶是指一种将肽作为底物的肽键水解酶。即，蛋白酶对蛋白质底物的活性能被识别为蛋白水解酶活性，而蛋白酶对肽底物的活性能被识别为肽酶活性。当催化裂解肽键链时，在其中间的部位，根据蛋白酶对蛋白质底物的活性，使用术语蛋白水解酶。因此，在本文中内肽酶被用作一种蛋白水解酶。
所用的酶的实例是植物来源的酶，如木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶，和来自微生物的酶，如霉菌、细菌和酵母。它们包括内肽酶、外肽酶、氨基肽酶、羧基肽酶和二肽酶。这些酶可以单独使用或结合使用。当它们结合使用时，它们可以同时加入，或逐渐地加入。
在本发明中鱼肉的酶促降解产物优选的是用蛋白水解酶处理，接着用肽酶处理得到的鱼肉的酶促降解产物。
用酶处理的条件依照所用酶的类型而不同。通常，酶处理在pH2至12，优选pH4至8下进行30分钟至72小时，优选3至24小时，温度为30至90℃，优选40至65℃。所用的酶是以大约0.01％至10％的比例，优选0.5％至5％，更优选1％至3％，按作为底物的蛋白质量计算。
在形成的鱼肉的酶促降解产物中的酶用加热等方法失活，和按需要进行离心或过滤，以除去油和不溶物，如此可制得酶促降解产物。
作为本发明的培养基的其它组分，通常在动物细胞的培养基中所用的各种组分可以按需要来使用。它们包括氨基酸、维生素、脂质因子，能源、渗透压调节剂，铁源和pH调节剂。除这些组分外，痕量金属元素、表面活性剂、生长辅助因子和核苷也可加入。
实例是氨基酸，如L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胖氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸，优选L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸；维生素，如i-肌醇，生物素、叶酸、硫辛酸、烟酰胺、烟酸、对氨基苯甲酸、泛酸钙、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12和抗坏血酸，优选生物素、叶酸、硫辛酸、烟酰胺、泛酸钙、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺。维生素B12和抗坏血酸；脂质因子，如氯化胆碱、胆碱酒石酸盐、亚油酸、油酸和胆甾醇、优选氯化胆碱；能源，如葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖，优选葡萄糖；渗透压调节剂如氯化钠、氯化钾和硝酸钾，优选氯化钠；铁源、如铁EDTA、柠檬酸铁、氯化亚铁、氯化铁、硫酸铁、硫酸亚铁和硝酸铁，优选氯化铁、铁EDTA和柠檬酸铁；和pH调节剂，如碳酸氢钠、氯化钙、一碱价磷酸钠、HEPES和MOPS，优选碳酸氢钠。含有这些组分的任意成员的培养基可被引用作为实例。
除上述组分外，可以加入痕量金属元素，如硫酸铜、硫酸锰、硫酸锌、硫酸镁、氯化镍、氯化锡、氯化镁和亚硅酸钠，优选硫酸铜、硫酸锌和硫酸镁；表面活性剂、如吐温80和Pluronic F68；生长辅助因子，如重组胰岛素、重组IGF、重组EGF、重组FGF、重组PDGF、重组TGF-α，乙醇胺盐酸盐、***钠、视黄酸和腐胺二盐酸盐，优选***钠、乙醇胺盐酸盐、重组IGF和腐胺二盐酸盐；和核苷，如脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、腺苷、胞苷、鸟苷和尿苷。在本发明优选的实施方案中，可以包含抗生素，如链霉素、青霉素-G钾和庆大霉素，和pH-指示剂，如酚红。
为具体地制备本发明的培养基，鱼肉提取物或鱼肉的酶促降解产物可以替代哺乳动物衍生的组分加入到一种可商购的用于动物细胞培养的培养基，例如，BME培养基、MEM培养基、DMEM培养基、F10培养基或F12培养基中。
在本发明中，将鱼肉提取物，或鱼肉酶促降解产物加入到培养基中使其在培养基中的浓度达到大约白利5％或更低，优选白利0.5至3％，更优选地白利1至2％。该浓度是用可溶性固体确定的浓度，作为一个指标，用糖度折光计测定的。
培养基中其它组分的量是0.05至1,500毫克/升氨基酸、0.001至10毫克/升维生素，0至200毫克/升脂质因子，1至20克/升能源，0.1至10,000毫克/升渗透压调节剂，0.1至500毫克/升铁源，1至10,000毫克/升pH缓冲剂，0.00001至200毫克/升痕量金属元素，0至5,000毫克/升表面活性剂，0.05至10,000微克/升生长辅助因子和0.001至50毫克/升核苷。需要时，它们的量可以根据所要培养的动物细胞的类型和所需要的蛋白质的类型来确定。
培养基的pH根据所要培养的细胞而不同，但在许多情况下通常为pH6.8至7.6，或pH7.2至7.4。
本发明的培养基不受任何限制，可优选地用于各种动物细胞的培养。例如，可用于培养具有通过遗传工程方法掺入的所需要的抗体或生理学活性物质的基因的COS细胞或CHO细胞，或以杂交瘤，如鼠-人，鼠-鼠或鼠-兔为代表的产生抗体的融合细胞。该培养基特别优选用于培养CHO细胞。不用说，当培养动物细胞以获得一种由该动物细胞产生的天然蛋白质时可以使用本发明的用于培养动物细胞的培养基。该培养基除用于培养上述细胞外也能用于培养BHK细胞和Hela细胞。
培养条件根据所用的细胞类型而不同，优选的条件可以按需要来确定。例如，CHO细胞通常是在CO2在气相中的浓度为0至40％，优选2至10％的气氛中，在30至39℃，优选约37℃下培养1至14天。
培养可以用各种用于动物细胞培养的培养装置来进行，例如，发酵罐式罐培养装置，气升式培养装置、培养瓶式培养装置、旋转瓶型培养装置、微载体式培养装置，流化床式培养装置、中空纤维式培养装置，滚瓶式培养装置和填充床式培养装置。
通过在本发明的用于动物细胞培养的培养基中进行培养，可以在培养基中获得一种由该动物细胞产生的蛋白质。为了从动物细胞产生蛋白质，纯粹的培养可能就足够了，或可能需要一种特殊的方法。需要时，根据将要培养的动物细胞可以确定方法、条件等。对于经遗传工程操作用含有一种编码鼠-人嵌合抗体的基因的载体转化的CHO细胞来说，例如，培养是在前述条件下进行的，由此就能在培养基中获得所需要的蛋白质，需经约1至14天，优选地约7至10天。然后，将培养基用通常的方法(见，例如，抗体工程导论，Chijin Sho Kan出版公司，第102-104页；亲合色谱原理与方法、AmershamPharmacia Bitech,第56-60页)进行分离和纯化，由此可得到所需要的蛋白质。
前述生产方法能产生基因重组蛋白质，如重组抗体诸如抗-人IL-6受体抗体(包括嵌合抗体、人源化抗体、人抗体)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、红细胞生成素、干扰素、白介素(例如，IL-1和IL-6)、t-PA、尿激酶、血清白蛋白和凝血因子Ⅷ。工业实用性
根据本发明的用于培养动物细胞的培养基含有一种鱼肉的提取物或鱼肉的酶促降解产物，因此使得稳定地培养动物细胞成为可能，不需要使用一种在质量上产生很大变化的昂贵的蛋白质，如胎牛血清。此外，通过在根据本发明的用于培养动物细胞的培养基，即含有一种鱼肉的提取物或鱼肉的酶促降解产物的培养基中培养动物细胞，由异常朊病毒或病毒造成污染的危险(近几年出现的问题)可被消除，并且可以生产和提供安全的生物技术产物。
实施例
进一步详细叙述本发明的实施例将在下面给出，但本发明绝不受这些实施例的限制。本领域技术人员能够进行各种改变和改良，但这些也包括在本发明的范围中。
实施例1：鱼肉(沙丁鱼)提取物的制备
将一种可商购的沙丁鱼用作鱼肉。向500克切碎的鱼肉中加入2,500克水，并将肉在95℃下提取90分钟。
然后，将提取物离心和过滤以除去不溶物和油。将剩余物浓缩得到64克的鱼肉(沙丁鱼)提取物。
实施例2：鱼肉(狐鲣)的酶促降解产物的制备
将一种可商购的狐鲣用作鱼肉。向1000克切碎的狐鲣中加入1,500克水。将混合物在50℃下于pH6与4克植物衍生的木瓜蛋白酶一起培养1小时进行酶促降解。然后，在上述条件下与4克霉菌衍生的外肽酶一起进一步进行酶促降解20小时，此后将体系在95℃下加热以使酶失去活性。接着，将体系离心和过滤以除去不溶物和油。将剩余物浓缩得到500克根据本发明的鱼肉(狐鲣)的酶促降解产物。
实施例3：培养基的制备
从一种可商购的DMEM/F12培养基(GIBCO BRL产品和参考指南，第357-358页)中除去胸苷和次黄嘌呤。向产生的培养基中加入下列组分(混合物将在下文中被描述为培养基A)，将混合物用作动物细胞培养的基础培养基。
(培养基A)
从一种可商购的DEME/F12培养基中除去胸苷和次黄嘌呤，并加入下列组分：
30毫克/升   抗坏血酸
10毫克/升   脱氧腺苷(1H2O)
10毫克/升   脱氧胞苷
10毫克/升   脱氧鸟苷
5毫克/升    腺苷
5毫克/升    胞苷
5毫克/升    鸟苷
5毫克/升    尿苷
4毫克/升    乙醇胺(HCl)
1000毫克/升 Pluronic F-68
18.9毫克/升 氯化铁(6H2O)
向上述培养基A中加入在实施例2中制备的酶促降解产物使最终浓度为白利1％或白利2％，并通过过滤将混合物灭菌。
实施例4：对产生的抗体的量的影响
利用一种产生人源化PM-1抗体(抗人IL-6受体抗体)的CHO细胞株来进行试验，该抗体是按照日本未审查的专利出版物第99902/1996号的参考实施例2中所叙述的方法使用在国际专利申请出版物第WO92/19759号的实施例10中叙述的人延伸因子Iα启动子制得的。
将上述CHO细胞(1.5×105细胞/毫升)加入到含有鱼肉的酶促降解产物，在本文实施例2中已制得的最终浓度为白利1％或白利2％的培养基A中。将该体系在培养箱条件为37℃、5％CO2下，利用摇瓶式细胞培养装置培养10天。
接着，测量活细胞密度、细胞存活率和从培养基中得到的抗体蛋白质的产生量。利用反相高效液相色谱法测量产生的量。
作为对照，制备了一种含有10克/升的牛肉水解产物(PrimatoneTM:Quest，美国)代替实施例2的酶促降解产物的培养基，并将CHO细胞以同样方法进行培养。
所得的结果示于图1。与对照相比较，在含有白利1％的狐鲣的酶促降解产物的培养基中培养的CHO细胞的生长情况与对照的细胞生长情况类似。在含有白利2％的狐鲣的酶促降解产物的培养基中培养的CHO细胞获得了比对照更大量的抗体蛋白质产量。
实施例5：使用各种鱼肉的酶促降解产物的培养基对抗体产生量的影响
将狐鲣、沙丁鱼、鲑鱼、护卫鲭、鳕鱼和鲭鱼的鱼肉酶促降解产物加入到一种非哺乳动物来源的培养基中，研究了抗体蛋白质的产生量。
鱼肉的酶促降解产物的制备
用实施例2中叙述的方法制备了上述鱼肉的酶促降解产物。即，将鱼肉切碎，用木瓜蛋白酶，一种植物衍生的内肽酶，进行酶促降解。然后，物料进一步用霉菌衍生的外肽酶进行酶促降解，此后将体系加热使酶失去活性。接着，将该体系离心和过滤以除去不溶物和油。将剩余物浓缩制得了鱼肉的酶促降解产物。
培养基的制备和测试方法
将用编码在实施例4中叙述的人源化PM-1抗体(抗人IL-6受体抗体)的基因和dhfr选择性标记基因转化的dhfr(-)CHO细胞加入到含有狐鲣、沙丁鱼、鲑鱼、护卫鲭、鳕鱼或鲭鱼的酶促降解产物的培养基B中，其最终浓度为10克/升(白利1％)或15克/升(白利1.5％)。将该体系在37℃、5％CO的培养箱条件下，用摇瓶式细胞培养装置培养10天。然后，测定活细胞密度、细胞存活率和抗体蛋白质的产生量。培养基B的组分如下：
(培养基B)
从一种可商购的DMEF/F12培养基中除去胸苷和次黄嘌呤，并加入下列组分：
12.5毫克升   抗坏血酸
2.5毫克/升   脱氧腺苷(1H2O)
2.5毫克/升   脱氧胞苷
2.5毫克/升   脱氧鸟苷
2.5毫克/升   腺苷
2.5毫克/升   胞苷
2.5毫克/升   鸟苷
2.5毫克/升   尿苷
0.2毫克/升   腐胺(2HCl)
0.975毫克/升 乙醇胺(HCl)
500毫克/升   Pluronic F-68
10毫克/升    柠檬酸铁
结果
所得到的结果示于图4。鱼肉水解产物所产生的抗体蛋白质的量是不同的。即，当鱼肉的酶促降解产物以白利1％(10克/升)的最终浓度加入时，产生量，按逐渐下降的次序，如下：狐鲣＞护卫鲭＞鳕鱼＞鲑鱼＞鲭鱼＞沙丁鱼。当鱼肉的酶促降解产物以白利1.5％(15克/升)的最终浓度加入时，产生量，按逐渐下降的次序，如下：狐鲣＞护卫鲭＞鳕鱼＞鲭鱼＞鲑鱼＞沙丁鱼。
前述试验表明，根据所用的鱼肉类型，鱼肉的酶促降解产物表现出对抗体蛋白质产生量的不同影响，但是，对用编码抗体蛋白质的基因和dhfr选择性标记基因转化的dhfr(-)CHO细胞的生长是有效的，和对抗体蛋白质的产生也是有效的。

Claims (13)

1．一种用于动物细胞培养的培养基，其特征在于含有鱼肉的酶促降解产物或鱼肉提取物。
2．如权利要求1所要求的用于动物细胞培养的培养基，它是通过培养动物细胞生产所需要的蛋白质的培养基，该培养基含有鱼肉提取物。
3．如权利要求1所要求的用于动物细胞培养的培养基，它是通过培养动物细胞生产所需要的蛋白质的培养基，该培养基含有鱼肉的酶促降解产物。
4．如权利要求3所要求的用于动物细胞培养的培养基、其中鱼肉的酶促降解产物已经通过用蛋白酶处理鱼肉或鱼肉提取物制得。
5．如权利要求4所要求的用于动物细胞培养的培养基，其中蛋白酶是蛋白水解酶和/或肽酶。
6．如权利要求4所要求的用于动物细胞培养的培养基，其中鱼肉的酶促降解产物已经通过用蛋白水解酶和接着用肽酶处理鱼肉或鱼肉提取物制得。
7．如权利要求1至6中任一项所要求的用于动物细胞培养的培养基，它是一种不合从哺乳动物衍生的组分的培养基。
8．如权利要求1至7中任一项所要求的用于动物细胞培养的培养基，它含有氨基酸、维生素、脂质因子、能源、渗透压调节剂，铁源和pH调节剂。
9．如权利要求1至8中任一项所要求的用于动物细胞培养的培养基，其中的动物细胞是已向其中转导了一种编码所需要的蛋白质的基因的动物细胞。
10．如权利要求9所要求的用于动物细胞培养的培养基，其中所需要的蛋白质是抗体或生理学活性物质。
11．如权利要求1至10中任一项所要求的用于动物细胞培养的培养基，其中动物细胞是CHO细胞。
12．如权利要求1至11中任一项所要求的用于动物细胞培养的培养基，其中鱼肉是从选自包括狐鲣、护卫鲭、鳕鱼、鲭鱼、鲑鱼和沙丁鱼中的组中的一个或多个成员衍生的。
13．一种通过培养动物细胞生产所需要的蛋白质的方法，其中培养是通过使用用于培养动物细胞的培养基来实施的，该培养基的特征在于含有鱼肉的酶促降解产物或鱼肉提取物。
CNB998085766A 1998-06-01 1999-06-01 用于培养动物细胞的培养基和使用该培养基生产蛋白质的方法 Expired - Lifetime CN1187441C (zh)

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