JP6108170B2

JP6108170B2 - 細胞培養用培地

Info

Publication number: JP6108170B2
Application number: JP2013157651A
Authority: JP
Inventors: 慧子眞殿; 優英城戸; 井戸垣　秀聡; 秀聡井戸垣
Original assignee: Osaka Soda Co Ltd
Current assignee: Osaka Soda Co Ltd
Priority date: 2013-07-30
Filing date: 2013-07-30
Publication date: 2017-04-05
Anticipated expiration: 2033-07-30
Also published as: JP2015027265A

Description

本発明は、疎水性Ｄ−アミノ酸を含む細胞培養用培地、および当該培地の有用物質製造のための使用に関する。

遺伝子組換え技術を利用して、タンパク質、ペプチドが人為的に生産されている。とりわけ医薬分野においては、医薬に有用なタンパク質（例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体等）が培養細胞を利用して製造されている。
細胞の培養に用いられる培地としては、古くより牛血清を添加した血清培地が主体であったが、医薬品生産においては病原体混入等のリスクもあり血清を含まない無血清培地が求められている。しかし、血清には細胞増殖にかかわる種々の増殖因子が含まれており、単純に血清を欠如したのみでは、細胞増殖やタンパク質生産性が著しく抑制される。そのため、多くの場合は、血清代替物質としてインスリンやトランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム等が使用されている。しかし、無血清培地、特に化学組成が明確な物質のみで構成される培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙｄｅｆｉｎｅｄ培地）では、従来の血清培地に比べると細胞増殖やタンパク質生産性において劣る。その改善のため、酵母や大豆加水分解物等も使用されることがあり、このようなタンパク加水分解物は細胞増殖に極めて有効に働くことが知られている（特許文献１）。しかし、タンパク加水分解物は組成未知の成分も多く存在する複合素材であるため、医薬製造に使用する原料として安全性の面から好ましいものではない。

上記課題を解決すべく、血清を用いない培地が検討されている。なお、無血清培地では、血清中に含まれる各成分の不足を補うため、必須アミノ酸や成長因子が添加されている。しかしながら、培養に用いる細胞によっては、アミノ酸濃度が好適な範囲を外れる場合やアミノ酸の代謝産物等によって、細胞増殖の阻害を引き起こすという問題があった。また、成長因子として用いられているものの多くは、動物や組み換えタンパク由来であり、細胞のウイルス汚染の問題や培地が高価となる問題があった。この問題を解決するために、特定のＬ-アミノ酸のみを培地に添加することで細胞増殖を改善する方法が報告されている。（特許文献２）

近年、Ｌ-アミノ酸とは異なる生理機能を有するＤ-アミノ酸が注目されている。Ｄ-アミノ酸は、従来は生体で代謝することができないと考えられていたため、細菌の細胞膜中のペプチドグリカンの構成成分等の極めて限られた部位にしか存在しない生体成分とされており、生体に対する有効性についてはあまり検証されていなかった。しかし近年、植物や哺乳類においてもＤ−アミノ酸が生理機能を有していることが徐々に明らかとなってきており、Ｄ−アミノ酸の生理的な機能について様々な研究が進められている。

実際に、植物細胞での紅色色素生産において、芳香族Ｄ-アミノ酸を添加することにより生産性が高まることが報告されている（特許文献３）。また、線維芽細胞の増殖を抑制するためにＬ-バリンの代わりにＤ-バリンを用いた例もある（特許文献４）。しかしながら、動物細胞培養において培地成分に特定のＤ-アミノ酸を培地添加剤として用いた効果に関する知見は乏しく、上記の培地および培養技術を動物細胞培養に応用するには十分なものとは言えない。

特表２００２−５２００１４特開２００４−２７５０４７特開平５−２４４９６１特開平７−２４１１９０

本発明は、疎水性Ｄ−アミノ酸を含む細胞培養用培地、当該培地の有用物質製造のための使用を提供することを課題とする。

本発明者らは、培地成分として特定の疎水性Ｄ−アミノ酸が細胞においてタンパク質等の有用物質の生産量を増大させることを見出し、これに基づき本発明を完成させた。
本発明は、一つの側面として、疎水性Ｄ−アミノ酸を含む細胞培養用培地を提供する。
本発明は、一つの側面として、疎水性Ｄ−アミノ酸を含む細胞培養用培地を用いて細胞を培養する行程を含む、有用物質の製造方法を提供する。

本発明によれば、疎水性Ｄ−アミノ酸を有効成分とする安価で安全性の高い優れた動物細胞用培地を提供することができる。本発明の疎水性Ｄ−アミノ酸を含む細胞培養用培地は、細胞の形態や種類（特に形質転換細胞）等に限定されず増殖を促進させ、有用物質の生産量を増大させる。即ち、本発明が提供する細胞培養用培地および当該培地を用いた有用物質の製造方法は、細胞における有用物質の生産量を増大させることができ、抗体を利用した臨床診断薬製造、抗体医薬生産、再生医療、細胞治療等の分野での応用が可能である。

ＣＨＯ細胞培養時における生細胞数の経時的変化を示す図である。培養３〜４日目の１細胞あたりの抗体生産速度を示す図である。培養８日目の培養液中のＩｇＧ抗体濃度を示す図である。

本発明は、疎水性Ｄ−アミノ酸を含む細胞培養用培地、疎水性Ｄ−アミノ酸を含む細胞培養用培地を用いて細胞を培養する行程を含む、有用物質の製造方法を提供する。

疎水性Ｄ−アミノ酸
本発明で用いることのできる疎水性Ｄ−アミノ酸としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンを例示することができる。なかでも、容易に入手可能な点で、疎水性Ｄ−アミノ酸のバリン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニンがより好ましく、メチオニンがさらに好ましい。また、上述した疎水性Ｄ−アミノ酸を２種以上混合して用いることも可能である。

本発明に用いることのできる疎水性Ｄ−アミノ酸は、一水塩、無水物等のいずれも含まれる。また、塩としては、塩酸塩、ナトリウム塩、酢酸塩、硫酸塩等をあげることができる。

本発明の疎水性Ｄ−アミノ酸を含む細胞培養用培地における疎水性Ｄ−アミノ酸の含有量は、本発明の効果が得られる範囲であれば特に制限されないが、例えば、０．００２％（ｗ/ｖ）以上であればよく、０．００４％（ｗ/ｖ）以上が好ましい。また、１％（ｗ/ｖ）以下であればよく、０．５％（ｗ/ｖ）以下であることが好ましい。また、培地中における疎水性Ｄ-アミノ酸の含有量は、０．００２〜１％（ｗ/ｖ）であればよく、０．００４〜０．５％（ｗ/ｖ）が好ましい。なお、疎水性Ｄ−アミノ酸を２種以上混合して用いる場合は、上記範囲であれば本発明の効果を得ることができる。

本発明の培地にＤ−バリンを添加する場合の添加量は、０．００４％（ｗ/ｖ）以上であればよく、０．０８％（ｗ/ｖ）以上が好ましい。また、１％（ｗ/ｖ）以下であればよく、０．５％（ｗ/ｖ）以下が好ましい。また、培地中におけるＤ-バリンの含有量は、０．００４〜１％（ｗ/ｖ）の範囲であればよく、０．０８〜０．５％（ｗ/ｖ）の範囲が好ましい。

本発明の培地にＤ−ロイシンを添加する場合の添加量は、０．００２％（ｗ/ｖ）以上であればよく、０．００４％（ｗ/ｖ）以上が好ましい。また、１％（ｗ/ｖ）以下であればよく、０．５％（ｗ/ｖ）以下が好ましい。また、培地中におけるＤ-ロイシンの含有量は、０．００２〜１％（ｗ/ｖ）の範囲であればよく、０．００４〜０．５％（ｗ/ｖ）の範囲が好ましい。

本発明の培地にＤ−フェニルアラニンを添加する場合の添加量は、０．００４％（ｗ/ｖ）以上であればよく、０．０８％（ｗ/ｖ）以上が好ましい。また、１％（ｗ/ｖ）以下であればよく、０．５％（ｗ/ｖ）以下が好ましい。また、培地中におけるＤ-フェニルアラニンの含有量は、０．００４〜１％（ｗ/ｖ）の範囲であればよく、０．０８〜０．５％（ｗ/ｖ）の範囲が好ましい。

本発明の培地にＤ−メチオニンを添加する場合の添加量は、０．００２％（ｗ/ｖ）以上であればよく、０．００４％（ｗ/ｖ）以上が好ましく、０．０８％（ｗ/ｖ）以上がより好ましい。また、１％（ｗ/ｖ）以下であればよく、０．５％（ｗ/ｖ）以下が好ましく、０．３％（ｗ/ｖ）以下がより好ましい。また、培地中におけるＤ-メチオニンの含有量は、０．００２〜１％（ｗ/ｖ）の範囲であればよく、０．００４〜０．５％（ｗ/ｖ）の範囲が好ましく、０．０８〜０．３％（ｗ/ｖ）の範囲がより好ましい。

上記で説明した「本発明で用いることのできる疎水性Ｄ−アミノ酸」は、細胞での有用物質の産生促進に使用することができる。産生促進は、そのメカニズムに関係なく、一定時間内に有用物質の産生量が増大すればよく、例えば、細胞増殖を促進することにより有用物質の産生を増大させてもよく、個々の細胞における有用物質の発現量を増大させることにより有用物質の産生を増大させてもよく、その両方でもよい。よって、上記で説明した「本発明で用いることのできる疎水性Ｄ−アミノ酸」は、細胞増殖促進剤として、細胞における有用物質の発現促進剤として、またはその両方として使用することができる。

上記で説明した「本発明で用いることのできる疎水性Ｄ−アミノ酸」は、細胞培養用培地に添加することにより有用物質の産生促進に使用することができる。また、好ましい実施態様において、上記で説明した「本発明で用いることのできる疎水性Ｄ−アミノ酸」は、細胞培養用培地に添加することにより、無血清下または血清の濃度を低減させた条件下（例えば、５、３または１％（ｖ/ｖ）ＦＢＳ含有条件下）で有用物質の産生を促進する。よって、上記で説明した「本発明で用いることのできる疎水性Ｄ−アミノ酸」は、単独で培地添加因子として使用できる。

また、本発明の培地には、他の有用物質の産生促進に寄与する物質を用いることができる。例えば、ビタミン類、核酸類、アミン類、糖類、有機酸、微量元素、塩類等を含有させることができる。ビタミン類としては、塩化コリン、シアノコバラミン、ニコチン酸アミド、Ｄ−パントテン酸又はその塩、塩酸ピリドキシン又は塩酸ピリドキサール、Ｄ−ビオチン、塩酸チアミン、リボフラビン、葉酸、ＤＬ−α−リポ酸、ミオ−イノシトール等が挙げられる。核酸類としては、アデニン又はその塩、チミジン等が挙げられる。アミン類としては、プトレッシン又はその塩等が挙げられる。

また、微量元素としては、亜セレン酸ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸銅、硫酸亜鉛、ケイ酸ナトリウム、バナジン酸アンモニウム、モリブデン酸アンモニウム、塩化ニッケル（II）、塩化第一スズ、硫酸マンガン等が挙げられる。また、有機酸としてはピルビン酸又はその塩等が挙げられ、糖としてはブドウ糖等が挙げられる。

また、塩類としては、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、リン酸一水素二ナトリウム等が挙げられる。

上記で説明した「本発明で用いることのできる疎水性Ｄ−アミノ酸」を添加する培地は、例えば、ＥＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ham's medium、ＲＰＭＩ１６４０、Fisher's mediumまたはそれらの混合物であってもよい。これらの培地に上記で説明した「本発明で用いることのできる疎水性Ｄ−アミノ酸」を添加することにより、有用物質の製造に有用な無血清培地を調製でき、または血清の濃度を低減させた培地（例えば、５、３または１％（ｖ/ｖ）ＦＢＳ含有培地）を調製することができる。また、増殖因子（例えば、ＥＧＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ-１、ＩＧＦ-２、ＮＧＦ、これらの類似の成長因子など）又は血清代替物質、サイトカイン（インターロイキン、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロンなど）、接着因子または細胞外マトリックス成分（例えばコラーゲン、ラミニン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよび類似物）、脂質（例えば、りん脂質、コレステロール、ウシコレステロール濃縮物、脂肪酸、スフィンゴリピッドおよび類似物）などを添加することにより、血清非含有で使用することを前提とした無血清培地、無タンパク培地またはケミカリー・ディファインド培地に添加して用いることもできる。これらの培地の例としては、ＳＡＦＣＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製のＸ-ＣＥＬＬ３０２, ＥＸ-ＣＥＬＬ３２５-ＰＦ、ＥＸ-ＣＥＬＬＣＤＣＨＯ等、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＳＦＭＩＩ、ＣＨＯ-ＩＩＩ-ＰＦＭ、ＣＤＣＨＯ等、また、ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＩＳ-ＣＨＯＣＤ、ＢａｌａｎＣＤＧｒｏｗｔｈＡＭｅｄｉｕｍ等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、このような無血清培地、無タンパク培地、またはケミカリー・ディファインド培地を任意の比率で２種以上を混合した混合培地に対しても同様に用いることができる。このような上記で説明した「本発明で用いることのできる疎水性Ｄ−アミノ酸」を含有する培地は、有用物質の製造に使用することができる。

具体的には、有用物質を産生する細胞を、上記で説明した「本発明で用いることのできる疎水性Ｄ−アミノ酸」を含む培地で培養し、細胞から産生された有用物質を単離することを含む方法により有用物質を製造できる。当該培地は、無血清培地または血清の濃度を低減させた培地（例えば、５、３または１％（ｖ/ｖ）ＦＢＳ含有培地）とすることができる。例えば、有用物質として抗体を製造する場合には、抗体産生細胞を、上記で説明した「本発明で用いることのできる疎水性Ｄ−アミノ酸」を含む培地で培養し、抗体を精製することを含む方法により抗体を製造できる。抗体の精製工程は、例えば、プロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィー、低ｐＨ処理によるウイルス不活化、その他のクロマトグラフィー工程（陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー等、ウイルス除去フィルターによる濾過、濃縮工程、最終濾過が含まれる。

本明細書において、有用物質とは、医薬、農薬、食品、その他化学工業に有用な物質であれば特に制限はない。好ましくは、抗体、酵素（ウロキナーゼ等）、ホルモン（インスリン等）、サイトカイン（インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ等）等の生理活性タンパク質、ペプチド等が挙げられる。抗体は、例えば、マウスモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体である。また、免疫グロブリンのクラスは特に限定されないが、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２等）である。有用物質は、外来遺伝子の発現産物である組み換えタンパク質であり得る。

本明細書において、細胞については組換えタンパク等の有用物質生産に使用可能な細胞であれば特に限定されず、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、rodent myeloma細胞（例えば、ＳＰ２/Ｏ細胞、ＮＳＯ細胞等のマウス骨髄腫細胞等）、ハイブリドーマ、昆虫細胞およびそれらの細胞に外来遺伝子を導入した形質転換細胞が例として挙げられる。有用物質として抗体を産生させる場合は、ＣＨＯ細胞、ＳＰ２/Ｏ細胞またはＮＳＯ細胞等を細胞融合することによって得られるハイブリドーマ等を抗体産生細胞として採用することができる。

培養温度、ＣＯ_２濃度、培養時間等の培養条件は、培養する細胞の種類にとって適宜選択することができる。一般的には、培養温度は特に限定されないが、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ_２濃度は、例えば約１〜１５％、好ましくは５〜１０％である。培養時間は、例えば約１日〜２１日間である。

本発明の培地を用いた培養方法としては、大きく回分培養法（Ｂａｔｃｈ培養法）、および流加培養法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養法）、連続培養法等を例示することができる。

回分培養法は培養のたびに培地を作成して培養途中の培地追加をしない方法である。設備的には簡素であり雑菌汚染のリスクが少ないというメリットがある。流加培養法は培養途中に培地を追加することで栄養素枯渇や有害物質蓄積による細胞増殖阻害をある程度回避できるため、回分培養と比較してより長期の培養が可能となり目的タンパクを高濃度に生産させることができる。連続培養法は新しい培地を追加すると同時に古い培地を抜き取ることにより、培養槽内で生じる有害物質の蓄積と栄養素の枯渇を回避し、連続的に細胞培養と目的タンパクの生産を行なう方法である。連続培養の応用として、膜濾過や重力による細胞沈降を用いることにより、細胞を培養槽内に残したまま古い培地成分のみを抜き取る方法もあり、これにより細胞を高密度培養して目的タンパクの生産性を向上させる方法もある。

以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１
ＩｇＧ遺伝子を導入しＩｇＧ抗体を分泌産生するＣＨＯ細胞株（ＡＴＣＣＣＲＬ−１２４４５）をＡＴＣＣより購入して用いた。このＣＨＯ細胞株を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭにて培養した後回収し、１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに懸濁し、１２wellマルチプレートに４×１０^４cells/wellとなるように播種した。下記の評価検体である疎水性Ｄ−アミノ酸を滅菌超純水に溶解し、最終濃度４０、２００、１,０００μｇ/ｍｌ（０．００４％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ））となるように各ｗｅｌｌに添加した。また、コントロールとして、検体と等量の滅菌超純水を添加した。培養温度３７℃、ＣＯ_２濃度５％で培養した。３日培養後、培養液中のＩｇＧの濃度を下記に記載の方法で測定した。結果は、コントロールｗｅｌｌの培養液中のＩｇＧ濃度（つまり滅菌超純水のみを添加したｗｅｌｌの培養液中のＩｇＧ濃度）を１００として、評価検体である各疎水性Ｄ−アミノ酸を添加したｗｅｌｌの培養液中のＩｇＧの濃度を表１に示した。下記全ての評価検体について、ＩｇＧ産生量の増加が認められた。

評価検体：
Ｄ−バリン（和光純薬工業株式会社）；
Ｄ−ロイシン（和光純薬工業株式会社）；
Ｄ−フェニルアラニン（東京化成工業株式会社）；
Ｄ−メチオニン（ペプチド研究所株式会社）；

ＩｇＧ産生量の測定方法
ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｉｎｃ.製のｈｕｍａｎＩｇＧＥＬＩＳＡ測定キット（ＨｕｍａｎＩｇＧＥＬＩＳＡＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎＳｅｔ, ＥＬＩＳＡＳｔａｒｔｅｒＡｃｃｅｓｓｏｒｙＫｉｔ）を用い、細胞培養液中のＩｇＧ濃度を測定した。

実施例２
ＩｇＧ遺伝子を導入しＩｇＧ抗体を分泌産生するＣＨＯ細胞株（ＡＴＣＣＣＲＬ−１２４４５）をＡＴＣＣより購入して用いた。このＣＨＯ細胞株をＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＢａｌａｎＣＤＧｒｏｗｔｈＡ培地（２００ｎＭＭＴＸ）に馴化して浮遊性細胞として培養した。２５０ｍｌの三角フラスコに、上記培地を６０ｍｌ添加したものに、上記培地に評価検体であるＤ−メチオニンを滅菌超純水に溶解し、培地中の最終濃度１０００μｇ/ｍｌとなるように添加した。また、比較検体としてＬ-メチオニンを滅菌超純水に溶解し、同様に培地中の最終濃度が１０００μｇ/ｍｌとなるように添加した。また、コントロールとして検体添加量と等量の滅菌超純水を添加した。培養温度３７℃、ＣＯ_２濃度５％、攪拌１２０ｒｐｍで振盪培養した。培養０、２、３、４、７、８日目の培養液をサンプリングし、生細胞数、及びＩｇＧ抗体濃度を測定した。ＣＨＯ細胞培養時における生細胞数の経時的変化を図１に示す。また、１細胞あたりの抗体生産速度を図２及び図３に示す。培養８日目の培養液中のＩｇＧ抗体濃度を図４に示す。

図１に示すように、Ｄ−メチオニンを加えた培地では超純水添加（コントロール）の場合と同様の細胞増殖性を示したが、Ｌ−メチオニンを加えた培地では細胞増殖が阻害された。一方、図２に示すように培養中の１細胞あたりの抗体生産速度としては、超純水添加（コントロール）の値と比較してＤ−メチオニンを添加した培地で４３％、Ｌ−メチオニンを添加した培地で８１％それぞれ増加した。このことは、メチオニン添加により細胞あたりの抗体生産能力が増強されたことを意味する。また、図３に示すように培養液中に生産されるＩｇＧ抗体量は、超純水添加（コントロール）の場合と比較してＤ−メチオニンを添加した培地で７％増加し、Ｌ−メチオニンを添加した培地では６％減少した。これはＬ−メチオニンでは、細胞あたりの抗体生産速度向上効果よりも細胞増殖抑制効果が大きく働き、結果的に全体としての抗体生産量が減少してしまったためである。一方、Ｄ−メチオニンは、Ｌ−メチオニンと異なり細胞増殖阻害効果がないため培養液中に生産されるＩｇＧ抗体量を効果的に増加させることが可能である。

本発明が提供する培地、および製造方法は、細胞を用いた有用物質の生産に利用できる。

Claims

０．００４〜０．５％（Ｗ/Ｖ）の疎水性Ｄ‐アミノ酸を含有するＣＨＯ細胞用ＩｇＧ抗体産生促進培地であり、
疎水性Ｄ-アミノ酸が、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、及びメチオニンからなる群より選択される少なくとも１種である。
請求項１に記載の培地を用いてＣＨＯ細胞を培養することを含む、ＩｇＧ抗体の製造方法。