WO1999063058A1 - Milieu de culture de cellules animales et procede de production de proteines en utilisant ce milieu - Google Patents

Milieu de culture de cellules animales et procede de production de proteines en utilisant ce milieu Download PDF

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Kazushi Shibuya
Masaru Atsumi
Shigeyuki Tsunakawa
Kaneo Nogaki
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Definitions

  • the present invention relates to an animal cell culture medium and a method for producing a protein using the same.
  • the present invention relates to a medium for culturing animal cells and a method for producing a protein using the medium. Specifically, the present invention provides a medium for culturing animal cells containing a fish meat extract or an enzyme hydrolyzate of fish meat, and free of components such as proteins derived from mammals and their decomposition products, and a method for producing proteins using the same.
  • a medium for culturing animal cells containing a fish meat extract or an enzyme hydrolyzate of fish meat, and free of components such as proteins derived from mammals and their decomposition products, and a method for producing proteins using the same.
  • extracts for the propagation of the animal cells are usually derived from mammals, specifically serum such as fetal calf serum. Is added to the medium in the range of 5 to 20%.
  • mammal-derived serum has the drawback that it occupies 75 to 95% of the cost of the medium, and that stable growth cannot be obtained due to differences in quality between lots.
  • serum derived from mammals cannot be sterilized by autoclaving or the like, it may be contaminated with virus or mycoplasma, and although many of them are harmless, they are additional unknown factors in terms of stable production. sell.
  • serum contains more than 500 proteins, which complicates the isolation and purification of the desired protein, a cell product from the culture medium.
  • a method using a purified protein derived from serum such as fetuin, insulin, and transferrin instead of serum has been used.
  • a method using a medium component extracted from a mammal has been attempted.
  • mammal-derived components include mad cow disease, bovine spongiform encephalopathy (BSE), infectious spongiform encephalopathy (Transmissible Spongiform Encephalopathy: TSE), And Kreutsch There is concern about the relationship with Creutzfeld-Jakob Disease (CJD), etc., and the emergence of a culture medium for animal cells that does not contain these mammal-derived components is desired from the viewpoint of safety.
  • BSE bovine spongiform encephalopathy
  • TSE Transmissible Spongiform Encephalopathy
  • CJD Creutzfeld-Jakob Disease
  • An object of the present invention is to provide a medium for culturing animal cells that does not contain mammal-derived components without such a problem, and a method for producing protein using the medium. Disclosure of the invention
  • the present inventors have developed a conventional medium for culturing animal cells using a CH0 cell transformed with a gene encoding an antibody protein, and excluding a component derived from a mammal from a conventional medium for animal cell culture.
  • a fish meat extract or an enzyme hydrolyzate of fish meat was added. The inventor found that the intended purpose was achieved, and completed the present invention.
  • the present invention relates to a medium for culturing animal cells containing a fish meat extract or an enzyme hydrolyzate of fish meat, and a method for producing a protein using the medium.
  • Figure 1 is a graph showing the viable cell counts of CHO cells cultured in a medium containing 1% Brix and 2% Brix, and a medium containing 10 g / L of beef hydrolyzate.
  • Fig. 2 is a graph showing the cell viability (%) of CHO cells cultured in a medium containing 1% Brix and 2% Brix, and a medium containing 10 g / L of beef hydrolyzate. is there.
  • Figure 3 shows that CHO cells produced in a medium containing 1% Brix and 2% Brix containing enzyme digest of fish meat and a medium containing 10 g / L of beef hydrolyzate were produced in the medium. It is a graph which shows an antibody protein concentration (mg / L).
  • FIG. 4 shows the results of cell culture using a shaker flask cell culture device in Example 5.
  • the vertical axis indicates the number of living cells, cell viability, and the amount of antibody protein produced
  • the horizontal axis indicates the number of days of culture since the start of culture using medium B.
  • the medium of the present invention is a medium for culturing animal cells containing a fish meat extract or a fish meat enzyme digest. According to the present invention, animal cells can be satisfactorily cultured in a medium conventionally used as a medium for culturing animal cells without adding a component derived from a mammal.
  • fish meat used in the present invention examples include fish meat such as red fish such as bonito, soda gallo, tuna, mackerel, sword fish, sardine, aji, salmon, and white fish such as fish, sea bream, sea bream, butterfly, sea bream, and the like. These are bonito, soda gallo, ⁇ , mackerel, salmon, and sardine.
  • the fish meat extract used in the present invention may be prepared, for example, by cutting the above-mentioned fish meat into suitable fragments or mincing it into a paste, and solving the soluble component with hot water, for example, hot water at 90-95 ° C. It can be obtained by extracting from minutes to tens of hours. Specific examples include bonito broth during the production of bonito and cook drain during canning.
  • the enzymatically decomposed product of fish meat is, for example, as follows: boiled fish meat as it is, or minced into a paste, or by adding an appropriate amount of water to the fish meat extract obtained as described above.
  • the protein can be obtained by denaturing the protein by heating according to the above, treating with a protease, and removing the oil-insoluble material by centrifugation or filtration as appropriate.
  • Such a fish meat extract or an enzymatically decomposed fish meat is preferably used after adjusting the pH to about 7 to 7.4.
  • the proteolytic enzymes used in the present invention include proteinases and / or beptidases.
  • proteinase refers to an enzyme that hydrolyzes proteins based on protein
  • peptidase refers to peptide bond hydrolases using peptides as substrates. That is, the protease tan
  • the activity on protein substrates can be distinguished as proteinase activity, and the activity on peptide substrates can be distinguished as beptidase activity.
  • proteinase is used to catalyze the cleavage of peptide bonds from the middle due to their activity on protein substrates, and thus endopeptidases are used herein as one type of proteinase. I have.
  • enzyme of plant origin such as papain, chymopapain, promelain, and fusin
  • an enzyme of microbial origin such as mold, bacteria, and yeast, such as endopeptidase, exopeptidase, and aminopeptidase.
  • enzymes such as carboxypeptidase and dipeptidase.
  • an enzyme digest of fish meat obtained by treating with the above proteinase and then with beptidase is preferable.
  • the enzymatic treatment depends on the type of enzyme used, but is usually pH2-12, preferably pH4_8, at a temperature of 30-90 ° C, preferably 40-65 ° C, for 30 minutes-72 hours. Best practice is 3-24 hours. At this time, the enzyme is used in an amount of 0.01-10%, preferably 0.5-5%, more preferably 1-3% of the protein as a substrate.
  • the enzymatic hydrolyzate After deactivating the enzyme in the enzymatic hydrolyzate of the fish meat obtained in this way by heating, etc., the enzymatic hydrolyzate is prepared by removing the oil and insolubilized substances by appropriate centrifugation and filtration. can do.
  • each component usually used in animal cell culture medium can be appropriately used, and these include amino acids, vitamins, lipid factors, energy sources, osmotic pressure regulators, iron Source, including pH buffer.
  • these components for example, a trace metal element, a surfactant, a growth auxiliary factor, a nucleoside, and the like may be added.
  • L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-asparaginate, L-cystine, L-cystine, L-glutamine, L-glutamic acid glycine, L-histidine, L-histamine Isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-orditin, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tributofan, L-tyrosine, L-valine Etc., preferably L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-asparaginate, L-cystine, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine L-proline, L
  • Osmolarity adjusting agents such as sodium chloride; iron EDTA, iron citrate, ferrous chloride, ferric chloride, ferrous sulfate, ferric sulfate, ferric nitrate, etc., preferably salts
  • Iron sources such as ferric ferric iron, EDTA iron and iron citrate
  • pH buffers such as sodium bicarbonate, sodium salt calcium, sodium dihydrogen phosphate, HEPES, MOPS, and preferably sodium hydrogen carbonate
  • Examples of the medium include
  • trace metals such as copper sulfate, manganese sulfate, zinc sulfate, magnesium sulfate, nickel chloride, tin chloride, magnesium chloride, sodium silicate, and the like, preferably copper sulfate, zinc sulfate, and magnesium sulfate elements; Twee n 80, surfactants such as pull port nick F68; and recombinant insulin, recombinant IGF, recombinant EGF, recombinant FGF, recombinant PDGF, recombinant TGF-a, hydrochloride Ethano-Alumina, sodium selenite, retinoic acid, butrethine hydrochloride, etc., preferably, growth-promoting factors such as sodium selenite, ethanolamine hydrochloride, recombinant IGF, butrethine hydrochloride, etc .; deoxyadenosine, deoxycytidine
  • antibiotics such as streptomycin, penicillin G potassium and gentamicin, and pH indicators such as phenol red may be contained.
  • a commercially available medium for culturing animal cells for example,
  • a medium such as a BME medium, a MEM medium, a DMEM medium, an F10 medium, or an F12 medium may be prepared by adding a fish meat extract or an enzyme hydrolyzate of fish meat instead of a component derived from a mammal. .
  • a fish meat extract or an enzyme hydrolyzate of fish meat is added to the medium so that the concentration of Brix is 5% or less, preferably 0.5 to 3% of Brix, and particularly preferably about 1 to 2% of Brix in the medium.
  • concentration is a concentration using soluble solids measured by a refractometer as an index.
  • the content of other components in the culture medium was 0.05-1500 mg / L for amino acids, 0.001-10 mg / L for bisamines, 0-200 mg / L for lipid factors, and 1-120 g / L for energy sources.
  • Osmotic pressure regulator is 0.1-10000mg / L
  • iron source is 0.1-500mg / L
  • pH buffer is 1-10000mg / L
  • trace metal element is 0.00001-200mg / L
  • surfactant is 0-5000mg / L.
  • the growth co-factor ranges from 0.05 to 10000 g / L and the nucleoside ranges from 0.001 to 50 mg / L, and can be determined as appropriate depending on the type of animal cells to be cultured, the type of desired protein, and the like.
  • the pH of the medium depends on the cells to be cultured, but is generally pH 6.8 to 7.6, and in many cases pH 7.2 to 7.4.
  • the medium of the present invention can be used for suitably culturing various animal cells without any particular limitation.
  • the resulting fused cells can be cultured. Particularly, it is suitable for culturing CHO cells.
  • the medium for culturing animal cells of the present invention can also be used when culturing animal cells to obtain a natural protein produced by the animal cells. It can also be used for culturing eLa cells and the like.
  • culture conditions vary depending on the type of cells used, appropriate conditions may be determined as appropriate.
  • C0 2 concentration of 0 40% of the gas phase rather preferably has an atmosphere 2- 10%, 30- 39:, preferably at about 37 ° C, 1-14 It should be cultivated for days.
  • various culture devices for culturing animal cells include a fermenter tank culture device, an air lift culture device, a culture flask culture device, a spinner flask culture device, a microcarrier culture device, and a fluidized bed culture device.
  • the culture can be performed using a device, a Holof-Iver type culture device, a roller bottle type culture device, a filling tank type culture device, or the like.
  • proteins produced by animal cells can be obtained in the medium.
  • the production of protein from animal cells includes those that only require culturing the protein and those that require special operations. These operations or conditions may be appropriately determined depending on the animal cells to be cultured. For example, in a CHO cell transformed by a vector containing a gene encoding a mouse-human chimeric antibody by genetic engineering, culturing under the above-described conditions is preferable for 114 days. Can obtain the desired protein in the medium in about 7 to 10 days.
  • Recombinant antibodies such as anti-human IL-6 receptor antibody, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocytes Genetically modified proteins such as macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), erythropoietin, inuichiferon, interleukins such as IL-1 and IL-6, t-PA, perokinase, serum albumin, and blood coagulation factor I Can be manufactured.
  • the medium for culturing animal cells according to the present invention contains a fish meat extract or an enzyme hydrolyzate of fish meat, so that animal cells can be stably used without using expensive and highly variable proteins such as fetal bovine serum. Can be cultured. Furthermore, by culturing animal cells in a cell culture medium containing the fish meat extract or the enzyme digest of fish meat of the present invention, contamination by abnormal prions or viruses, which have recently become a problem, can be prevented. The danger has been eliminated and safe biopharmaceuticals can be manufactured and provided.
  • a medium obtained by removing thymidine and hypoxanthine from a commercially available DMEM / F12 medium (GIBCO BRL Products and Reference Guide, p.357-358) and adding the following components (hereinafter In this case, the medium A was used).
  • Example 4 Effect on antibody production
  • U.S. Patent Application Publication No. US Pat. No. 5,049,086 discloses the use of the humanelongation factor I promoter described in Example 10 of International Patent Application Publication No.
  • the test was performed using a CHO cell line that produces a humanized PM-1 antibody (anti-human IL-16 receptor antibody) prepared according to the method described in Reference Example 2.
  • the above-mentioned CHO cells (1.5xl0 5 cell / ml) were added to the medium A containing the final concentration of Brix 1% or Brix 2% with the enzyme digest of fish meat prepared in Example 2 of the present specification.
  • the cells were cultured for 10 days under the incubator conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 using a cell culture device.
  • the production was measured using reversed-phase high performance liquid chromatography.
  • a medium containing 10 g / L of beef hydrolyzate (Primatone TM: manufactured by Quest, USA) was prepared in place of the enzyme hydrolyzate of Example 2, and CHO cells were cultured in the same manner. The results obtained are shown in FIG. Compared to the control, CHO cells cultured in a medium containing Brixl% of the enzyme digest of bonito showed cell growth equivalent to the control. In addition, CHO cells cultured in a medium containing 2% Brix, an enzyme hydrolyzate of bonito, produced more antibody protein than control.
  • Example 5 Effect of medium using various enzyme digests of fish meat on antibody production Amount of enzyme digest of fish meat using bonito, sardine, salmon, soda katsuo, ⁇ , and mackerel as raw materials was converted to a non-mammalian animal-derived medium. The amount of antibody protein produced was examined by the addition.
  • An enzyme digest of fish meat was prepared using the method described in Example 2. That is, fish meat was cut into minced fish, and enzyme digestion was performed with papain, which is a plant-derived endopeptidase. Next, the enzyme was further decomposed with mold-derived exopeptidase and heated to inactivate the enzyme. Insoluble matter and oil were removed by centrifugation and filtration, and concentrated to prepare enzymatically decomposed fish meat.
  • the dhfr (1) CHO cells transformed with the gene encoding the humanized PM-1 antibody (anti-human IL-16 receptor antibody) protein and the dhfr selection marker gene described in Example 4 were subjected to bonito and sardine.
  • Salmon, soda katsuo, ⁇ , and mackerel are added to medium B containing a final concentration of 10 g / L (Brix 1%) or 15 g / L (Brix 1.5%), and the mixture is shaken using a shaker flask cell culture device. ° C, and cultured for 10 days in 5% C0 2 incubator conditions. The viable cell count, cell viability, and antibody protein production were measured.
  • the components of medium B are shown below.
  • Fig. 4 shows the obtained results.
  • the final concentration of enzymatic hydrolyzate of fish meat is 1% Brix (I0g / L)
  • the sequence of bonito> soudagasso> ⁇ > salmon> mackerel> sardine is in descending order of production.
  • the final concentration of the enzyme digest of fish meat is 1.5% Brix (I5g / L) added, then bonito> soda gallo> ⁇ > mackerel> salmon> sardine.

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Description

明細書
動物細胞培養用培地およびそれを使用してタンパク質を製造する方法 技術分野
本発明は動物細胞培養用培地およびそれを使用してタンパク質を製造する方法 に関する。 詳しくは、 本発明は魚肉抽出物又は魚肉の酵素分解物を含み、 哺乳動 物由来のタンパク質やその分解物等の成分を含まない動物細胞培養用培地および それを使用してタンパク質を製造する方法に関する。 背景技術
動物細胞を培養して該動物細胞の産生する天然型タンパク質を得ようとする場 合、 あるいは所望のタンパク質をコードする遺伝子を導入した動物細胞を培養し て所望のタンパク質等を製造する場合には、 塩類、 糖類、 アミノ酸類、 およびビ 夕ミン類等の基礎栄養物のほかに、 該動物細胞の増殖のために、 通常哺乳動物由 来の抽出物、 具体的には牛胎児血清などの血清が 5〜 2 0 %の範囲で培地に添加 されている。 し力、しながら、 かかる哺乳動物由来の血清は、 培地のコストの 7 5 〜9 5 %を占めること、 品質にロット間差があるため安定した増殖が得られない という欠点がある。 また、 哺乳動物由来の血清はオートクレープ等で滅菌できな いので、 ウィルス又はマイコプラズマ汚染される可能性があり、 その多くは無害 であるものの、 安定生産という点からは付加的な未知の要因となりうる。 更に血 清には 5 0 0種以上のタンパク質が含まれており、 このため培養培地からの細胞 産物である所望のタンパク質の単離、 精製を複雑化する。 このような安定生産上 の問題を解消するために、 血清の代わりとして、 フェツイン、 インスリン、 トラ ンスフェリンなどの血清由来の純化されたタンパク質を使用する方法が行われて いる。 また、 製造コストの観点から、 哺乳動物より抽出された培地成分を使用す る方法も試みられている。
し力、し、 近年、 哺乳動物由来の成分については、 狂牛病 （mad cow disease) 、 ゥシ海綿状脳症 （Bovine Spongiform Encephalopathy： BSE) 、 感染性海綿状 脳症 （Transmissible Spongiform Encephalopathy： TSE) 、 更にはクロイツフ エルト ·ヤコブ病 （Creutzfeld- Jakob Disease： CJD) などとの関係が懸念され、 安全性の点からこれら哺乳動物由来の成分を含有しない動物細胞培養用培地の出 現が望まれている。
動物細胞を培養する際、 使用する培地中に上記のような哺乳動物由来の成分を 添加しないと、 培養の早い時期に細胞の生存率の著しい低下が生じ、 培養液中の 生細胞数が減少するため長期培養あるいは大量培養を行うことができないという 問題があった。 本発明はかかる問題のない、 哺乳動物由来の成分を含まない動物 細胞培養用培地、 およびそれを使用して夕ンパク質を製造する方法を提供するこ とを目的とするものである。 発明の開示
上記のような課題を達成するために、 本発明者らは、 抗体タンパク質をコード する遺伝子で形質転換された CH0細胞を用い、 従来の動物細胞培養用培地から 哺乳動物由来の成分を除いた培地に種々の物質を添加し、 該 CHO細胞の増殖を 促進して抗体タンパク質を高濃度に産生させるような物質を得るべく鋭意検討し た結果、 魚肉抽出物又は魚肉の酵素分解物を加えることにより所期の目的が達成 されることを見いだし、 本発明を完成するに至った。
即ち本発明は、 魚肉抽出物又は魚肉の酵素分解物を含む動物細胞培養用培地、 ならびにそれを使用してタンパク質を製造する方法に関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 魚肉酵素分解物を Brix 1%および Brix 2%含有する培地、 ならびに牛 肉加水分解物を 10g/L含有する培地中で培養した CHO細胞の生細胞数を示すグ ラフである。
図 2は、 魚肉酵素分解物を Brix 1%および Brix 2%含有する培地、 ならびに牛 肉加水分解物を 10g/L含有する培地中で培養した CHO細胞の細胞生存率 （％) を示すグラフである。
図 3は、 魚肉酵素分解物を Brix 1%および Brix 2%含有する培地、 ならびに牛 肉加水分解物を 10g/L含有する培地中で培養した CHO細胞が培地中に産生した 抗体タンパク質濃度 （mg/L) を示すグラフである。
図 4は、 実施例 5における、 シェーカーフラスコ型細胞培養装置を用いた細胞 培養結果を示す。 図中のそれぞれの縦軸は生細胞数、 細胞生存率、 抗体タンパク 質の産生量を、 横軸は培地 Bを用いて培養を開始してからの培養日数を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下本発明を詳細に説明する。 なお、 本明細書中で記載する全ての文献を参照 として本明細書中に援用する。
本発明の培地は、 魚肉抽出物又は魚肉の酵素分解物を含む動物細胞培養用培地 である。 本発明によれば、 従来動物細胞培養用培地として一般的に使用されてい る培地において哺乳動物由来の成分を添加しなくとも良好に動物細胞を培養する ことができる。
本発明で使用する魚肉としては、 鰹、 ソウダガッォ、 鮪、 鯖、 秋刀魚、 鰯、 鰺、 鮭などの赤身魚や、 鳕、 鱸、 平目、 蝶、 鯛などの白身魚などの魚肉が挙げられ、 好ましくは鰹、 ソウダガッォ、 鳕、 鯖、 鮭、 鰯である。
本発明で使用する魚肉抽出物は、 例えば、 上記魚肉を適当な断片に切断したり あるいはミンチしてペースト状にして、その可溶性成分を熱水、例えば 90— 95°C の熱水で数十分から数十時間抽出することによって得ることが出来る。 具体的に は、 鰹節製造時の鰹煮汁や缶詰製造時のクックドレン等が挙げられる。
また、 魚肉の酵素分解物は、 例えば、 魚肉を煮たものをそのまま、 あるいは、 ミンチしてペースト状にしたもの、 あるいは上記のようにして得られた魚肉抽出 物に適量の水を加え、 必要に応じて加熱してタンパク変性させた後、 タンパク質 分解酵素で処理し、 適宜遠心分離や濾過等により油分ゃ不溶化物を除去すること によって得ることができる。 かかる魚肉抽出物あるいは魚肉の酵素分解物は pH を 7— 7.4程度に調整して使用するのがよい。
本発明で使用するタンパク質分解酵素としては、 プロティナーゼ及び/又はべ プチダーゼが挙げられる。 本発明では、 プロティナ一ゼの語は、 タンパク質を基 質としてタンパク質を加水分解する酵素をいい、 ぺプチダ一ゼの語は、 ペプチド を基質とするペプチド結合加水分解酵素をいう。 すなわち、 プロテアーゼのタン パク質基質に対する活性をプロティナーゼ活性、 ペプチド基質に対する活性をべ プチダーゼ活性として区別することができる。 タンパク質基質に対するプロテア ーゼの活性によって、 ペプチド結合鎖の中程からの切断を触媒するときにはプロ ティナーゼという用語を用い、 従ってェンドぺプチダーゼは本明細書ではプロテ イナ一ゼの 1種として使用している。
具体的には、 パパイン、 キモパパイン、 プロメライン、 フイシンなどの植物起 源の酵素およびカビ、 細菌、 酵母などの微生物起源の酵素で、 エンドべプチダー ゼ、 ェキソぺプチダ一ゼ、 アミノぺプチダ一ゼ、 カルボキシぺプチダ一ゼ、 ジぺ プチダーゼなどの酵素等が挙げられる。 これらの酵素は単独あるいは併用して使 用することができる。 併用する場合は、 それらを同時に添加してもよいし、 段階 的に添加してもよい。
本発明における魚肉の酵素分解物としては、 上記のプロティナーゼで処理し、 次いでべプチダ一ゼで処理して得られる魚肉の酵素分解物が好ましい。
酵素処理は、 使用する酵素の種類によって異なるが、 通常、 pH2— 12、 好まし くは pH4_8で、 30— 90°C、 好ましくは 40— 65°Cの温度で、 30分一 72時間、 好 ましくは 3— 24時間行う。その際、酵素は基質としてのタンパク質の 0.01— 10%、 好ましくは 0.5_5%、 さらに好ましくは 1— 3%程度使用する。
このようにして得られた魚肉の酵素分解物中の酵素を加温などによって失活さ せた後、 遠心分離や濾過等を適宜行って油分ゃ不溶化物を除去することによって 酵素分解物を調製することができる。
本発明の培地の他の成分としては通常動物細胞培養培地で使用されている各成 分が適宜使用できるが、 これらにはアミノ酸、 ビタミン類、 脂質因子、 エネルギ 一源、 浸透圧調節剤、 鉄源、 pH緩衝剤を含む。 上記成分のほか、 例えば、 微量 金属元素、 界面活性剤、 増殖補助因子、 ヌクレオシドなどを添加しても良い。 具体的には、 例えば、 L-ァラニン、 L-アルギニン、 L-ァスパラギン、 L-ァスパ ラギン酸、 L-システィン、 L-シスチン、 L-グルタミン、 L-グルタミン酸、 グリシ ン、 L-ヒスチジン、 L-イソロイシン、 L-ロイシン、 L-リジン、 L-メチォニン、 L- オル二チン、 L-フエ二ルァラニン、 L-プロリン、 L-セリン、 L-スレオニン、 L-ト リブトフアン、 L-チロシン、 L-バリン等、 好ましくは L-ァラニン、 L-アルギニン、 L-ァスパラギン、 L-ァスパラギン酸、 L-シスチン、 L-グルタミン、 L-グルタミン 酸、 グリシン、 L-ヒスチジン、 L-イソロイシン、 L-ロイシン、 L-リジン、 L-メチ ォニン、 L-フエ二ルァラニン、 L-プロリン、 L-セリン、 L-スレオニン、 L-トリプ トフアン、 L-チロシン、 L-バリン等のアミノ酸類； i 一イノシトール、 ピオチン、 葉酸、 リポ酸、 ニコチンアミド、 ニコチン酸、 P-ァミノ安息香酸、 パントテン酸 カルシウム、 塩酸ピリドキサ一ル、 塩酸ピリドキシン、 リボフラビン、 塩酸チア ミン、 ビタミン B12、 ァスコルビン酸等、 好ましくはピオチン、 葉酸、 リポ酸、 ニコチン酸アミド、 パントテン酸カルシウム、 塩酸ピリドキサール、 リボフラビ ン、 塩酸チアミン、 ビタミン B12、 ァスコルビン酸等のビタミン類；塩化コリン、 酒石酸コリン、 リノール酸、 ォレイン酸、 コレステロール等、 好ましくは塩化コ リン等の脂質因子；グルコース、 ガラク I ス、 マンノース、 フルクトース等、 好ましくはグルコース等のエネルギー源；塩化ナトリウム、 塩化カリウム、 硝酸 カリウム等、 好ましくは塩化ナトリウム等の浸透圧調節剤； EDTA鉄、 クェン酸 鉄、 塩化第一鉄、 塩化第二鉄、 硫酸第一鉄、 硫酸第二鉄、 硝酸第二鉄等、 好まし くは塩ィヒ第二鉄、 EDTA鉄、 クェン酸鉄等の鉄源類；炭酸水素ナトリゥム、 塩ィ匕 カルシウム、 リン酸ニ水素ナトリゥム、 HEPES、 MOPS等、 好ましくは炭酸水 素ナトリゥム等の pH緩衝剤を含む培地を例示できる。
上記成分のほか、 例えば、 硫酸銅、 硫酸マンガン、 硫酸亜鉛、 硫酸マグネシゥ ム、 塩化ニッケル、 塩化スズ、 塩化マグネシウム、 亜ケィ酸ナトリウム等、 好ま しくは硫酸銅、 硫酸亜鉛、 硫酸マグネシウム等の微量金属元素； Tween80、 プル 口ニック F68等の界面活性剤；および組換え型インシュリン、 組換え型 IGF、 組 換え型 EGF、 組換え型 FGF、 組換え型 PDGF、 組換え型 TGF- a、 塩酸エタノ —ルァミン、 亜セレン酸ナトリウム、 レチノイン酸、 塩酸ブトレツシン等、 好ま しくは亜セレン酸ナトリウム、 塩酸エタノールァミン、 組換え型 IGF、 塩酸ブト レツシン等の増殖補助因子；デォキシアデノシン、 デォキシシチジン、 デォキシ グアノシン、 アデノシン、 シチジン、 グアノシン、 ゥリジン等のヌクレオシドな どを添加してもよい。 なお上記本発明の好適例においては、 ストレプトマイシン、 ペニシリン Gカリウム及びゲンタマイシン等の抗生物質や、 フエノールレツド等 の pH指示薬を含んでいても良い。 本発明の培地を具体的に調製するには、 市販の動物細胞培養用培地、 例えば、
B M E培地、 M E M培地、 D M E M培地、 F 1 0培地、 F 1 2培地などの培地に、 哺乳動物由来の成分に代えて、 魚肉抽出物又は魚肉の酵素分解物を添加して調製 してもよい。
本発明においては、 培地中 Brix 5%以下、 好ましくは、 Brix 0.5-3%、 特に好ま しくは Brix 1-2%程度の濃度となるように培地に魚肉抽出物又は魚肉の酵素分解 物を添加する。 なお、 上記濃度は屈折糖度計により測定した可溶性固形分を指標 にした濃度である。
また、 培地中のその他の成分の含量は、 アミノ酸は 0.05— 1500mg/L、 ビ夕ミ ン類は 0.001— 10mg/L、 脂質因子は 0— 200mg/L、 エネルギー源は 1一 20g/L、 浸 透圧調節剤は 0.1— 10000mg/L、 鉄源は 0.1 - 500mg/L、 pH 緩衝剤は 1一 10000mg/L,微量金属元素は 0.00001— 200mg/し界面活性剤は 0— 5000mg/L、 増殖補助因子は 0.05— 10000 g/Lおよびヌクレオシドは 0.001― 50mg/Lの範囲 であり、 培養する動物細胞の種類、 所望のタンパク質の種類などにより適宜決定 できる。
培地の p Hは培養する細胞により異なるが、 一般的には p H 6 . 8〜7 . 6、 多くの場合 P H 7 . 2〜7 . 4である。
本発明の培地は特に限定されることなく種々の動物細胞を好適に培養するのに 使用できる。 例えば、 遺伝子工学的操作によって所望の抗体あるいは生理活性物 質の遺伝子を組み込んだ COS細胞や CHO細胞、 あるいは、抗体を産生するマウ ス一ヒト、 マウス一マウス、 マウス—ラット等のハイプリドーマに代表される融 合細胞を培養することが可能である。 特に、 CHO 細胞の培養に好適である。 勿 論、 本発明の動物細胞培養用培地は、 動物細胞を培養して該動物細胞の産生する 天然型タンパク質を得ようとする場合にも使用でき、 上述した細胞の他に、 B H K細胞、 H e L a細胞などの培養にも使用できる。
培養条件は使用する細胞の種類によって異なるので、 適宜好適な条件を決定す ればよい。 例えば CHO細胞であれば通常、 気相の C02濃度が 0— 40%、 好まし くは、 2— 10%の雰囲気下、 30— 39 ：、 好ましくは、 37°C程度で、 1— 14 日間培 養すればよい。 また、 動物細胞培養用の各種の培養装置としては、 例えば発酵槽型タンク培養 装置、 エアーリフト型培養装置、 カルチャーフラスコ型培養装置、 スピンナーフ ラスコ型培養装置、 マイクロキャリアー型培養装置、 流動層型培養装置、 ホロフ アイバー型培養装置、 ローラーボトル型培養装置、 充填槽型培養装置等を用いて 培養することができる。
本発明の動物細胞培養用培地中で培養を行うことにより、 動物細胞により生産 されたタンパク質を培地中に得ることができる。 動物細胞のタンパク質の生産は、 単にそれを培養するのみで良いものや、 特殊な操作を必要とするものも存在する がそれらの操作又は条件等は培養する動物細胞により適宜決定すれば良い。 例え ば遺伝子工学的操作によりマウスーヒトキメラ抗体をコードする遺伝子を含むベ クタ一でトランスフォームされた CHO細胞では、 前記のような条件下で培養を 実施することにより、 1一 14日間、 好ましくは 7— 10日間程度で所望のタンパク 質を培地中に得ることができる。 これを常法 （例えば、 抗体工学入門、 地人書館、 p.102-104； Affinity Chromatography Principles & Methods、 アマシャム フ アルマシア バイテク （株） 、 p.56-60 など参照） に従い単離、 精製することに よって、 所望のタンパク質を得ることができる。
上記の製造方法によって、抗ヒト IL-6レセプ夕一抗体などの組換え抗体（キメ ラ抗体、 ヒト化抗体、 ヒト型化抗体を含む） 、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF) 、 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 （GM-CSF) 、 エリスロポエチン、 イン 夕一フエロン、 IL-1や IL-6等のインターロイキン、 t-PA、 ゥロキナーゼ、 血清 アルブミン、 血液凝固第 I因子等の遺伝子組換えタンパク質を製造 することが できる。 産業上の利用可能性
本発明の動物細胞培養用培地は、 魚肉抽出物又は魚肉の酵素分解物を含有する ことにより、 牛胎児血清等の高価で品質のばらつきが大きいタンパク質を使用す ること無く、 安定的に動物細胞を培養することが可能である。 更に本発明の魚肉 抽出物又は魚肉の酵素分解物を含有する細胞培養用培地で動物細胞を培養するこ とにより、 近年問題となっている異常プリオンあるいはウィルス等による汚染の 危険性は除去され、 安全なバイオ医薬品を製造し提供することができる。 実施例
以下に本発明を更に詳細に説明するための実施例を示すが、 本発明はこれら実 施例に限定されるものではない。 当業者にとっては種々の変更、 改変が可能であ り、 これらも本発明の範囲に含まれる。 実施例 1 ：魚肉 （鰯） 抽出物の調製
魚肉として市販の鰯を使用した。 魚肉をミンチ状にカツ卜したもの 5 0 0 gに 水 2 5 0 0 gを加え、 9 5 °Cの温度で 9 0分間抽出した。
その後遠心分離、 濾過により不溶物、 油分を除去、 濃縮し魚肉 （鰯） 抽出物 6 4 gを得た。 実施例 2 ：魚肉 （鰹） の酵素分解物の調製
魚肉として市販の鰹を使用した。 鰹をミンチ状にカットしたもの 1 0 0 0 gに 水 1 5 0 0 gを加え、 植物由来のパパイン 4 gで、 p H 6 . 0、 5 0 °Cの条件下 で 1時間インキュベートし、 酵素分解を行った。 次に、 カビ由来のェキソぺプチ ダ一ゼ 4 gでさらに上記条件下で 2 0時間酵素分解を行った後、 9 5 °Cに加熱す ることで酵素を失活させた。 その後遠心分離、 濾過により不溶物、 油分を除去、 濃縮して、 本発明の魚肉 （鰹） の酵素分解物 5 0 0 gを調製した。 実施例 3 ：培地の調製
基本となる動物細胞培養用培地として、市販の DMEM/F12培地（GIBCO BRL Products and Reference Guide, p.357-358) からチミジン、 ヒポキサンチンを除 去した培地に以下の成分を添加したもの （以下において培地 Aと記載する） を用 いた。
(培地 A)
市販の DMEM/F12培地からチミジン、 ヒポキサンチンを除去した培地に以下の 成分を添加したもの： 酸 30mg/L、
(1H20) 10mg/L、
Figure imgf000011_0001
シチジン 5mg/L、
5mg/L>
5mg/L、
エタノールァミン （HC1) 4mg/L、
プル口ニック F-68 1000mg/L,
塩化第二鉄 （6H20) 18.9mg/L
上記培地 Aに、 実施例 2で調製した酵素分解物を最終濃度 Brix 1%あるいは Brix 2%で添加し、 濾過滅菌した。 実施例 4 ：抗体産生量に及ぼす効果
国際特許出願公開番号 W〇 9 2 / 1 9 7 5 9号公報の実施例 1 0に記載された ヒトェロンゲーションファクター I プロモー夕—を利用し、 特開平 8— 9 9 9 0 2号公報の参考例 2に記載された方法に準じて作成したヒト型化 P M— 1抗体 (抗ヒト I L一 6レセプ夕—抗体） を産生する CHO細胞株を用いて試験した。 本明細書の実施例 2で調製した魚肉酵素分解物を最終濃度 Brix 1%あるいは Brix 2%含有する培地 Aに上記 CHO細胞 （1.5xl05 cell/ml) を添加し、 シェ一力 —フラスコ型細胞培養装置を用いて 37°C、 5%C02のインキュベーター条件下で 10日間培養した。
次いで生細胞数、 細胞生存率、 ならびに培地から得られた抗体タンパク質の産 生量を測定した。 産生量は逆相系高速液体クロマトグラフィーを使用して測定し た。
対照として実施例 2 の酵素分解物に代えて牛肉加水分解物 10g/L (Primatone™：米国、 Quest 社製） を含む培地を調製し、 同様の方法で CHO 細胞を培養した。 得られた結果を図 1に示す。 対照と比較すると、 鰹の酵素分解物 Brix l%を含 有する培地で培養した CHO細胞は対照と同等の細胞増殖を示した。 また鰹の酵 素分解物 Brix 2%を含有する培地で培養した CHO細胞は対照以上の抗体夕ンパ ク質の産生量が得られた。 実施例 5 ：種々の魚肉の酵素分解物を用いた培地の抗体産生量に及ぼす効果 鰹、 鰯、 鮭、 ソウダカツォ、 鳕、 鯖を原料とした魚肉の酵素分解物を非哺乳動 物由来培地に添加して抗体タンパク質の産生量の検討を行った。
魚肉の酵素分解物の調製
魚肉の酵素分解物を実施例 2に記載の方法を用いて調製した。 すなわち、 魚肉 をミンチ状にカツ卜し、 植物由来のエンドべプチダーゼであるパパインで酵素分 解を行った。 次にカビ由来のェキソぺプチダ一ゼでさらに酵素分解を行い加温す ることで酵素を失活させた。 遠心分離、 濾過により不溶物、 油分を除去、 濃縮し て魚肉の酵素分解物を調製した。
培地の調製及び試験方法
実施例 4で記載したヒ卜型化 P M— 1抗体 （抗ヒト I L一 6レセプター抗体） 蛋白をコードする遺伝子及び dhfr選択マーカー遺伝子で形質転換された dhfr (一） の CHO細胞を、 鰹、 鰯、 鮭、 ソウダカツォ、 鳕、 鯖の酵素分解物を最終 濃度 10g/L (Brix 1%) あるいは 15g/L (Brix 1.5%) 含有する培地 Bに添加し、 シェーカーフラスコ型細胞培養装置を用いて 37°C、 5%C02のインキュベーター 条件下で 10 日間培養した。 そして生細胞数、 細胞生存率、 抗体タンパク質の産 生量を測定した。 培地 Bの成分を以下に示す。
(培地 B)
市販の DMEM/F12培地からチミジン、 ヒポキサンチンを除去した培地に以下の 成分を添加したもの：
アスコリレビン酸 12.5mg/L、
デォキシアデノシン （1H20) 2.5mg/L、
デォキシシチジン 2.5mg/L、
2.5mg/L, 2.5mg/L、
2.5mg/L、
2.5mg/L、
5.0mg/L、
プトレツシン （2HC1) 0.2mg/L、
エタノールァミン （HC1) 0.975mg /し
プルロニック F-68 500mg/L、
クェン酸鉄 10mg/L 得られた結果を図 4に示す。 魚肉の加水分解物による抗体タンパク質の産生量 には違いが見られた。すなわち、魚肉の酵素分解物の最終濃度が Brix 1% (I0g/L) 添加の場合、 産生量が高い順に鰹 > ソウダガッォ >鳕 〉鮭 > 鯖 >鰯 で ある。また魚肉の酵素分解物の最終濃度が Brix 1.5% (I5g/L)添加の場合は鰹 > ソウダガッォ〉鳕 >鯖 >鮭 >鰯である。
以上の試験から、 使用する魚肉の種別により魚肉酵素分解物が抗体タンパク質 産生量に及ぼす効果は異なるが、抗体蛋白をコードする遺伝子及び dhfr選択マ一 力一遺伝子で形質転換された dhfr (—） の CHO細胞の増殖と抗体タンパク質の 産生にいずれも効果があることが明らかとなつた。

Claims

請求の範囲
1 . 魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物を含むことを特徴とする動物細胞培養用 培地。
2 . 動物細胞を培養して所望のタンパク質を製造するための培地であって、 該 培地が魚肉抽出物を含む請求項 1記載の動物細胞培養用培地。
3 . 動物細胞を培養して所望のタンパク質を製造するための培地であって、 該 培地が魚肉の酵素分解物を含む請求項 1記載の動物細胞培養用培地。
4 . 魚肉の酵素分解物が、 魚肉又は魚肉抽出物をタンパク質分解酵素で処理し て得られたものである請求項 3記載の動物細胞培養用培地。
5 . タンパク質分解酵素が、 プロティナーゼ及びノ又はべプチダ一ゼである請 求項 4記載の動物細胞培養用培地。
6 . 魚肉の酵素分解物が、 魚肉又は魚肉抽出物をプロティナーゼ処理し、 次い で、 ぺプチダ一ゼ処理して得られるものである請求項 4記載の動物細胞培養用培 地。
7 . 動物細胞培養用培地が、 哺乳動物由来の成分を含まない培地である請求項 1― 6のいずれかに記載の動物細胞培養用培地。
8 . 動物細胞培養用培地が、 アミノ酸、 ビタミン類、 脂質因子、 エネルギー源、 浸透圧調節剤、 鉄源および p H緩衝剤を含む請求項 1一 7のいずれかに記載の動 物細胞培養用培地。
9 . 動物細胞が、 所望のタンパク質をコードする遺伝子を導入されたものであ る請求項 1一 8のいずれかに記載の動物細胞培養用培地。
1 0 . 所望のタンパク質が、 抗体又は生理活性物質である請求項 9記載の動物細 胞培養用培地。
1 1 . 動物細胞が、 CHO細胞である請求項 1— 1 0のいずれかに記載の動物細 胞培養用培地。
1 2 . 魚肉が、 鰹、 ソウダガッォ、 鳕、 鯖、 鮭および鰯からなる群より選ばれる 1種以上である請求項 1一 1 1のいずれかに記載の動物細胞培養用培地。
1 3 . 動物細胞を培養して所望のタンパク質を製造する方法において、 該培養を 魚肉の酵素分解物又は魚肉抽出物を含むことを特徴とする動物細胞培養用培地を 使用して行う夕ンパク質の製造方法。
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