CN1304573C - Ndrg2和ndrg4蛋白及其在诊断和抑制肿瘤中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明使用基因工程方法,大量表达N-myc下游调节基因亚型ndrg2和ndrg4所编码的NDRG2和NDRG4蛋白,研究了NDRG2和NDRG4蛋白的理化性质和它们对肿瘤细胞的生物学功能。流式细胞术结果表明NDRG2蛋白对胃癌7901细胞的影响表现在G1期延长、G2和S期缩短,对肝癌HHCC细胞的影响表现在G1和G2期缩短、S期延长;而NDRG4蛋白对胃癌7901和肝癌HHCC细胞的影响均表现在G1期延长、G2和S期缩短。裸鼠致瘤抑制等动物试验证实了NDRG2和NDRG4蛋白对肿瘤细胞的生长以及对裸鼠的肿瘤形成都具有显著的抑制作用,其中高剂量组肿瘤抑制作用明显,低剂量组作用相对较弱。
Description
技术领域
本发明涉及N-myc下游调节基因亚型2和/或4蛋白及其在诊断和抑制肿瘤中的应用。
背景技术
癌症是原癌基因的激活及/或抑癌基因的缺失或灭活的产物。癌基因是存在于细胞或病毒中,能诱导正常细胞转化并使其获得一个或多个新生物特征的基因。该基因与肿瘤的发生发展相关。在正常细胞中癌基因呈高度保守和有限表达,并对细胞的分化、增殖起重要作用。癌基因被激活后可引起细胞癌变,通常细胞中固有的癌基因称细胞癌基因(c-onc),处于非活化状态的c-onc称为原癌基因(proto-onc)。
癌基因激活的主要标志是基因扩增,它是指细胞内一些基因通过不明机制复制成多个拷贝数,从而导致其产物的增加,使细胞正常功能受到干扰而发生癌变。癌基因扩增往往与肿瘤转移、浸润及抗药性等生物学行为相关,所以癌基因扩增可用来作为分子标记追踪病情的发展,监视转移与复发,观察预后。
早在1942年,Charles等人就首先提出了抑癌基因的概念,直到现在仍没有一个单独的特点可以定义抑癌基因,但抑癌基因应符合3个基本条件:(1)该基因在恶性肿瘤的相应正常组织中必须正常表达;(2)在恶性肿瘤中该基因出现功能失活或结构改变或表达缺陷;(3)将该基因的野生型导入该基因异常的肿瘤细胞内,可部分或全部改变其恶性表型。
人的N-myc下游调节基因(human N-myc downstream regulated gene)分为以下几个亚型,即:ndrg1,ndrg2,ndrg3,ndrg4,ndrg-like和脑发育相关分子(bdrm),它们具有较高的同源性,但表达水平在组织发育阶段和分布上差异明显,具体功能还不清楚(张文红等,第四军医大学学报,2002年,23卷,8期,716-720页),ndrg基因的突变可能是遗传性运动和感觉神经疾病(HMSNL)的诱因(Kalaydjieva L等,Am J Hum Genet,2002年,67卷,1期,47-58页)。
ndrg4基因位于染色体16q21-q22.3,主要在脑和心脏中表达,其mRNA有3个异构物:NDRG4-B、NDRG4-B(var)和NDRG4-H,Northern blot和Western blot证实NDRG4-B仅在脑中表达,NDRG4-H则既在脑中又在心脏中表达(Zhou RH等,Genomics,2001年,73卷,1期,86-97页)。
ndrg2基因为我国第四军医大学首次发现,已被GenBank收录,登陆号为AFI59092(邓艳春等,生物化学与生物物理进展,2001年,28卷,1期,72-76页),该基因位于染色体14q11.2(Qu X等,Mol Cell Biochem,2002年,229卷,1-2期,35-44页)。经免疫组化研究,NDRG2蛋白存在于细胞质中,是一种胞质蛋白(张文红等,第四军医大学学报,2002年,23卷,8期,716-719页),经原位杂交实验证实,ndrg2 mRNA在正常脑组织内广泛表达,在正常脑和肺组织中的表达水平分别显著高于胶质瘤和肺癌组织(李剑等,生物化学与生物物理进展,2002年,29卷,2期,223-227页),在胃与胃癌组织中的表达无显著差异(刘新平等,生物化学与生物物理进展,2003年,30卷,1期,116-121页)。
目前,国内外己对ndrg2基因展开了功能和机理方面的初步研究,如采用RT-PCR进行mRNA水平的表达研究(李剑等,生物化学与生物物理进展,2002年,29卷,2期,223-227页),采用流式细胞术、基因转染、反义RNA或RNAi进行作用机理的研究(刘新平等,生物化学与生物物理进展,2003年,30卷,1期,116-121页),采用免疫组化技术和免疫印迹进行蛋白表达水平的研究(李剑等,生物化学与生物物理进展,2002年,29卷,2期,223-227页)等等,最新的研究证实至少在胃癌细胞系HGC-27和SGC-胃癌7901中,ndrg2基因的表达与细胞的增殖分化有关(刘新平等,生物化学与生物物理进展,2003年,30卷,1期,116-121页)。
尽管目前的研究已经认为人的myc家族基因中的下游调节基因(human N-mycdownstream regulated gene,hNDRG)N-myc可能和肿瘤的发生相关,并将它列为抑癌候选基因(Deng YC等,Shengwu Huaxue Yu Shengwu Wuli Jinzhan,2001年,28卷,1期,72-76页),与神经***和呼吸***肿瘤的发生发展相关,但上述研究只是针对离体细胞系进行的,迄今为止并没有关于NDGR2和NDRG4蛋白抑制动物体或人体中肿瘤细胞生长和肿瘤形成的报道。
发明内容
本发明使用基因工程方法,大量表达N-myc下游调节基因亚型ndrg2和ndrg4所编码的NDRG2和NDRG4蛋白,研究了NDRG2和NDRG4蛋白的理化性质和它们对肿瘤细胞的生物学功能,并通过流式细胞术、裸鼠致瘤抑制等动物试验证实了NDRG2和NDRG4蛋白对肿瘤细胞的生长以及对裸鼠的肿瘤形成都具有显著的抑制作用。
因此,本发明的一个方面是提供分离的人N-myc下游调节基因亚型ndrg2和ndrg4,具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
本发明的另一方面是提供分离的人NDRG2和NDRG4蛋白多肽,具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
本发明的再一方面是提供NDRG2和NDRG4蛋白在制备诊断和/或抑制消化***肿瘤的药物中的应用,特别是在制备诊断和/或抑制胃癌和肝癌的药物中的应用,其中的蛋白多肽可与制药学上容许的稀释剂或载体进行组合。
附图说明
图1NDRG2表达载体的BamHI+HindIII双酶切电泳结果。
1.pQE30/NDRG2;2.pQE30/NDRG2的BamHI+HindIII双酶切;
3.DL15000Marker;4.DL2000Marker
图2NDRG4表达载体的BamHI+HindIII双酶切电泳结果。
1.DL15000Marker;2.DL2000Marker;3.pQE30/NDRG4
4.pQE30/NDRG4的BamHI+HindIII双酶切
图3NDRG2蛋白诱导表达结果。
1.分子量Marker(LMW);2.IPTG诱导后;3.IPTG诱导前
图4NDRG4蛋白诱导表达结果。
1.IPTG诱导后;2.IPTG诱导前;3.分子量Marker(LMW)
图5NDRG2和NDRG4蛋白对胃癌7901和肝癌HHCC细胞生长的影响。
图5-1 40h时不加样品的胃癌7901细胞;
图5-2 40h时NDRG2蛋白对胃癌7901细胞的作用;
图5-3 40h时NDRG4蛋白对胃癌7901细胞的作用;
图5-4 30h时不加样品的肝癌HHCC细胞;
图5-5 30h时NDRG2蛋白对肝癌HHCC细胞的作用;
图5-6 30h时NDRG4蛋白对肝癌HHCC细胞的作用。
图6不同浓度NDRG2蛋白对肿瘤细胞胃癌7901的抑制作用。
a:蛋白变性对照 b:空白对照; c:NDRG2蛋白
图7不同浓度NDRG2蛋白对肿瘤细胞肝癌HHCC的抑制作用。
a:蛋白变性对照 b:空白对照; c:NDRG2蛋白
图8不同浓度NDRG4蛋白对胃癌7901肿瘤细胞的抑制作用。
a:空白对照;b:NDRG4蛋白
图9不同浓度NDRG4蛋白对肝癌HHCC肿瘤细胞的抑制作用。
a:空白对照;b:NDRG4蛋白
图10流式细胞术考察NDRG2蛋白对胃癌7901肿瘤细胞细胞周期的影响。
图11流式细胞术考察NDRG2蛋白对肝癌HHCC肿瘤细胞细胞周期的影响。
图12流式细胞术考察NDRG4蛋白对胃癌7901肿瘤细胞细胞周期的影响。
图13流式细胞术考察NDRG4蛋白对肝癌HHCC肿瘤细胞细胞周期的影响。
图14NDRG2和NDRG4蛋白对裸鼠的肿瘤生长抑制实验结果。
图14-1阳性对照组(环磷酰胺);
图14-2空白模型对照组;
图14-3低剂量组(20μg/ml);
图14-4高剂量组(100μg/ml)。
图15NDRG2和NDRG4蛋白对裸鼠肿瘤生长抑制作用柱形图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1:ndrg2和ndrg4基因的克隆及测序
1、目的片段双酶切位点的改造
将含有目的片段的质粒pMD18-T(大连宝生物公司产品)转化宿主菌JF1125(上海医科大学提供),目的片段的双酶切位点为5’端BamHI和3’端EcoRI,若使用表达载体pQE30(QIAGEN公司产品),需将其酶切位点改造为5’端BamHI和3’端HindIII,设计PCR引物为:
正向:5’-CG
GGATCCGCGGAGCTGCAGGAGGT-3’
反向:5’-CC
AAGCTTTTAACAGGAGACCTCCATGGTG-3’
PCR扩增反应体系为:
10×pfuDNA聚合酶反应buffer 5ul
正向引物(25pmol/ul) 1ul
反向引物(25pmol/ul) 1ul
dNTPs(10Mm) 1ul
DNA模板 3ul
pfuDNA聚合酶(promega公司产品) 0.5ul
补加ddH2O至 50ul
PCR条件为:
94℃变性2分钟;94℃30S、59℃55S、74℃2分钟,共30个循环;74℃延伸5分钟。
2、BamHI和HindIII双酶切
将PCR产物及pQE30进行双酶切,酶切条件为:
BamHI(大连宝生物公司产品) 3ul
HindIII(大连宝生物公司产品) 3ul
10×Kbuffer 6ul
DNA 3ug
补加ddH2O至 60ul
30℃酶切2h后,将酶切产物用1.5%琼脂糖电泳分离后,挖取相应片段,参照玻璃奶试剂盒说明书(宝泰克公司产品)进行胶回收,各取5ul回收片段用琼脂糖电泳进行鉴定。
3、定向克隆
用DNA连接试剂盒(大连宝生物公司产品)连接做定向克隆,连接条件为:
pQE30 1ul
***DNA 10ul
Solution I 11ul
16℃反应30分钟。
4、M15感受态细胞(QIAGEN公司产品)的制备
取250ml培养至OD600为0.6的M15细胞,2500g离心10min,取沉淀加入80ml的4℃预冷的TB buffer(10mM Pipes,1,4-哌嗪二乙磺酸;55mM,MnCl2;15mM,CaCl2;250mM,KCl。加入MnCl2前用5N KOH调pH值为6.7,高压灭菌),轻轻重悬,4℃10min,2500g离心10min,将沉淀重悬在4℃预冷的20ml TB buffer中,加入1.5ml DMSO,4℃10min后,分装保存。
5、转化M15宿主细胞
将连接产物10ul转化进M15感受态细胞100ul,加LB培养基200ul,37℃30min,涂布氨苄抗性LB固体培养基平板,37℃培养16小时。
6、阳性克隆的鉴定
挑选若干阳性克隆在5ml带有氨苄抗性LB液体培养基中,37℃下200rpm培养16小时,提取质粒鉴定。质粒提取方法参见质粒小提试剂盒说明书(promega公司产品)。将上述质粒进行BamHI和HindIII双酶切,并与DL1500和DL2000分子量maker及未进行双酶切的质粒同时进行琼脂糖凝胶电泳。
琼脂糖凝胶电泳的结果表明质粒构建完全正确,ndrg2和ndrg4的片段大小分别为1000bp左右(附图1和2)。
7、阳性克隆的DNA测序
将鉴定正确的阳性克隆进行DNA测序,测序工作在北京塞百盛基因技术有限公司完成。
测序结果表明ndrg2和ndrg4分别具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列,ndrg2和ndrg4的大小分别为1,074bp和1,020bp。
实施例2:NDRG2和NDRG4蛋白的制备和纯化
1、表达量的考察
将pQE30/M15阳性克隆接入5ml氨苄抗性LB液体培养基,37℃下200rpm培养16小时后,取5ml传入300ml氨苄抗性LB液体培养基中,在1000ml三角瓶中37℃摇瓶培养约3小时,至培养液OD值为0.5时,取出1ml在5000rpm离心10min,取沉淀作为空白对照;在三角瓶中加入IPTG至终浓度为1.5mmol/L,NDRG2于37℃继续培养5小时,NDRG4于39℃继续培养4小时,取出5000rpm离心10min,取沉淀,考察表达量。
诱导表达的结果显示NDRG2的表达量为42.85%,分子量为39977Da;NDRG4的表达量为20.98%,分子量为38856Da(附图3和4)。
2、诱导表达条件的优化
采用正交实验设计[L9(34)]考察NDRG2和NDRG4蛋白适宜的诱导剂IPTG浓度、表达培养温度、诱导表达时间和起始诱导菌液浓度。
表1正交实验因素水平设计表
结果显示对NDRG2蛋白较适宜的诱导培养条件为:诱导剂IPTG浓度为1.5mmol/L、表达培养温度为37℃、诱导表达时间为5hr、起始诱导菌液浓度OD值为0.5;对NDRG4蛋白较适宜的诱导培养条件为:诱导剂IPTG浓度为1.5mmol/L、表达培养温度为39℃、诱导表达时间为4hr、起始诱导菌液浓度OD值为0.5。分别采用上述诱导培养条件对NDRG2和NDRG4蛋白进行大量制备。
3、最佳超声破菌时间的考察
将诱导表达的培养液100ml在5000rpm离心10分钟,保留上清,取沉淀加入20倍体积的破菌液(Tris缓冲液30mmol/L,pH8.5),超声破菌,功率为200W,超声时间分别5、10、15、20分钟,每次均保留上清,取沉淀同上法加入破菌液处理,每次均吸取1ml上清和沉淀的溶解液,在5000rpm离心10分钟,取沉淀进行SDS-PAGE凝胶电泳以考察最佳超声时间。
结果显示超声时间为5分钟时上清中已含有菌体蛋白,因此5分钟的超声时间已足够破菌。
4、包涵体溶解液的确定
取沉淀加入10倍体积的洗涤液(Tris缓冲液30mmol/L+1%Triton+1M尿素+1M NaCl,pH8.5),充分搅匀后震荡洗涤,5000rpm离心15min,取沉淀加入5倍体积溶解液。溶解液为分别含有6M盐酸胍或6M尿素的pH值分别8.5、7.5、5.0、4.0的Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、枸橼酸缓冲液、醋酸钠缓冲液。最终确定的适宜溶解液为含6M尿素的30mM Tris缓冲液(pH8.5)。
5、NDRG2和NDRG4蛋白包涵体复溶方法研究
(1)透析复溶方法研究
取溶解后的NDRG2、NDRG4包涵体溶液5ml,装入透析袋中,置入500ml透析外液(即降低相应尿素浓度为2M的溶解液),在磁力搅拌器上每搅拌2小时,更换透析外液使其尿素浓度降低2M,至尿素浓度降至2M时,更换为不含尿素的透析外液,4℃透析过夜。
(2)稀释复溶方法研究
方法一:取溶解后的NDRG2、NDRG4包涵体溶液5ml,缓慢滴加复溶液1(30mM Tris缓冲液,pH8.5),复溶液2(30mM Tris缓冲液,pH8.0)和复溶液3(30mM Tris缓冲液,pH7.5)。
方法二:取溶解后的NDRG2、NDRG4包涵体溶液5ml,迅速加入10倍体积复溶液1(30mM Tris缓冲液,pH8.5),复溶液2(30mM Tris缓冲液,pH8.0)和复溶液3(30mM Tris缓冲液,pH7.5)。
由于采用透析复溶方法和第一种稀释复溶方法时,NDRG2和NDRG4蛋白的溶解液中均出现不同程度的絮状沉淀,而采用第二种稀释复溶方法时,当采用复溶液1和2时,NDRG2和NDRG4蛋白的溶解液仍保持澄清,因此采用第二种稀释复溶方法对NDRG2和NDRG4蛋白进行包涵体复溶,所选复溶液为复溶液1和2,并进一步计算NDRG2和NDRG4蛋白的复溶率分别为69%和78%。
6、复溶后包涵体溶液过滤
将复溶后的NDRG2、NDRG4包涵体溶液在5000rpm离心20分钟,取上清用0.45um滤膜(millipore公司产品)过滤。
7、复溶后包涵体溶液的浓缩方法研究
取经过过滤的复溶包涵体溶液分别用以下方法浓缩,考察收率。
(1)超滤:取50ml复溶包涵体溶液用超滤杯(millipore公司产品)超滤,超滤膜分子截留量为75000,最终浓缩为5ml。
(2)PEG浓缩:取50ml复溶包涵体溶液装入分子截留量为75000的透析袋,用PEG 20000粉末掩没,浓缩至5ml。
(3)硫酸铵沉淀:取50ml复溶包涵体溶液,加入25g(NH4)2SO4,5000rpm离心20分钟,弃上清,取沉淀加复溶液5ml溶解。
(4)冷冻干燥:取10ml复溶包涵体溶液,分装进5个冻干瓶中,在-70℃冰冻后,在冻干机中冻干,至总体积约2ml。
结果显示,硫酸铵沉淀的浓缩液中含有较多的盐需要透析除去,回收率低而又耗时,超滤成本较高,冷冻干燥操作繁琐而且浓缩液中的盐也需要透析除去,因此考虑收率兼顾方便性,最终采用PEG浓缩方式对复溶后的包涵体溶液进行浓缩。
8、纯化方法研究
(1)脱盐:
脱盐柱(Hitrap Desalting,26×20),流速:8ml/min,流动相:Tris缓冲液30mmol/L,检测波长280nm。
(2)离子交换纯化研究:
分别采用Q Sepharose FF、DEAE Sepharose FF、QXL Sepharose FF、ANX Sepharose FF、Source 30Q作为填料,考察合适的填料。
平衡液采用pH7.5、pH8.0、pH8.5的30mmol/L Tris缓冲液,洗脱液采用30mmol/L Tris缓冲液+2M NaCl。
流速:1ml/min,检测波长:280nm,上样量:500ul,上样方式:进样环,色谱条件:上样后平衡5个柱床,0~50%洗脱液梯度洗脱20个柱床。
(3)亲和层析
取离子交换纯化出的蛋白溶液采用CHELATING SEPHAROSE FAST FLOW亲和层析填料纯化,上样液为:pH8.5的Tris缓冲液30mmol/L+30mmol/L的咪唑,洗脱液为:pH8.5的Tris缓冲液30mmol/L+500mmol/L的咪唑。
流速:1ml/min,检测波长:280nm,上样量:500ul,上样方式:进样环,色谱条件:上样后平衡3个柱床,洗脱液洗脱2个柱床。
(4)分子筛
采用Sephacryl S-100HR层析填料。上样及洗脱缓冲液为:pH8.5的Tris缓冲液30mmol/L。柱床:16×100,流速:1ml/min,检测波长:280nm,上样量:500ul,上样方式:进样环。
结果显示当采用离子交换纯化方法时Source 30Q适宜作为填料;亲和层析和分子筛为适宜的纯化方法,当分别采用上述两种方法时,NDRG2蛋白的纯度为94%和96%,NDRG4蛋白的纯度分别为92%和97%。
9、等电点测定
取上述复性后的蛋白溶液,用透析袋透析除盐后做等电聚焦,考察其等电点。NDRG2和NDRG4蛋白的等电点分别为6.3和6.2。
10、N端氨基酸序列测定
经中国医学科学院基础医学研究所中心实验室的测定结果显示NDRG2和NDRG4蛋白N端氨基酸序列分别为:
NDRG2:HHHHHH GSAELQEVQITEEKPL
NDRG4:HHHHHH GSPECWDGEHDIETPY。
实施例3NDRG2和NDRG4蛋白对肿瘤细胞胃癌7901和肝癌HHCC的抑制作用
取胃癌7901细胞和肝癌HHCC细胞用含10%血清的1640培养基稀释成7×104/ml,分别加入NDRG2和NDRG4蛋白,培养30和40小时后进行观察,同时以不加NDRG2和NDRG4蛋白的、培养30和40小时的、用含10%血清的1640培养基稀释成7×104/ml的胃癌7901细胞和肝癌HHCC细胞作为对照,考察NDRG2和NDRG4蛋白对肿瘤细胞胃癌7901和肝癌HHCC的抑制作用。
结果显示不加NDRG2和NDRG4蛋白对胃癌7901和肝癌HHCC肿瘤细胞的生长没有影响,而加入NDRG2和NDRG4蛋白分别培养30和40小时后,胃癌7901和肝癌HHCC肿瘤细胞的生长受到明显的抑制,而且随着培养时间的延长,抑制作用越明显(图5)。
取1%血清的1640培养基分别稀释胃癌7901细胞和肝癌HHCC细胞为7×104/ml,分别加入96孔板1-12孔,复孔每孔100ul,培养至细胞贴壁。用1%血清的1640培养基与NDRG2和NDRG4蛋白(2mg/ml)以5∶1混合,100ul复孔加入96孔板的第1孔,对倍稀释NDRG2蛋白至第8孔、NDRG4蛋白至第12孔,同时以缓冲液Tris(pH8.5)、变性NDRG2和NDRG4蛋白(Tris缓冲液混匀)、NDRG2和NDRG4蛋白超滤上液及下液以及用蛋白酶K 37℃处理4h的NDRG2和NDRG4蛋白的超滤下液做对照。培养72小时。
表2NDRG2对肿瘤细胞胃癌7901的抑制作用结果
变性对照(a) | 0.474 | 0.420 | 0.428 | 0.478 | 0.476 | 0.476 | 0.453 | 0.502 |
0.464 | 0.469 | 0.498 | 0.465 | 0.467 | 0.497 | 0.459 | 0.470 | |
空白对照(b) | 0.396 | 0.410 | 0.410 | 0.434 | 0.444 | 0.446 | 0.431 | 0.451 |
0.388 | 0.405 | 0.432 | 0.411 | 0.437 | 0.429 | 0.446 | 0.491 | |
样品(c) | 0.139 | 0.216 | 0.260 | 0.352 | 0.409 | 0.417 | 0.398 | 0.440 |
0.161 | 0.240 | 0.269 | 0.377 | 0.427 | 0.423 | 0.413 | 0.454 |
表3NDRG2对肿瘤细胞肝癌HHCC的抑制作用结果
变性对照(a) | 0.636 | 0.685 | 0.692 | 0.649 | 0.767 | 0.731 | 0.718 | 0.593 |
0.639 | 0.720 | 0.736 | 0.752 | 0.678 | 0.646 | 0.629 | 0.675 | |
空白对照(b) | 0.496 | 0.458 | 0.493 | 0.540 | 0.540 | 0.584 | 0.542 | 0.536 |
0.409 | 0.482 | 0.529 | 0.569 | 0.558 | 0.563 | 0.545 | 0.541 | |
样品(c) | 0.114 | 0.352 | 0.544 | 0.559 | 0.655 | 0.618 | 0.566 | 0.524 |
0.111 | 0.342 | 0.565 | 0.607 | 0.608 | 0.592 | 0.577 | 0.609 |
表4NDRG4对肿瘤细胞胃癌7901的抑制作用结果
空白对照(a) | 0.795 | 0.739 | 0.698 | 0.792 | 0.758 | 0.668 | 0.847 | 0.716 | 0.726 | 0.719 | 0.734 | 0.694 |
0.760 | 0.706 | 0.669 | 0.758 | 0.723 | 0.639 | 0.816 | 0.664 | 0.680 | 0.681 | 0.691 | 0.725 | |
样品(b) | 0.334 | 0.378 | 0.302 | 0.313 | 0.411 | 0.401 | 0.546 | 0.633 | 0.596 | 0.714 | 0.685 | 0.706 |
0.363 | 0.332 | 0.333 | 0.364 | 0.459 | 0.449 | 0.516 | 0.581 | 0.559 | 0.662 | 0.669 | 0.694 |
表5NDRG4对肿瘤细胞肝癌HHCC的抑制作用
空白对照(a) | 0.755 | 0.706 | 0.685 | 0.769 | 0.750 | 0.699 | 0.810 | 0.670 | 0.722 | 0.723 | 0.690 | 0.711 |
0.704 | 0.732 | 0.621 | 0.717 | 0.704 | 0.672 | 0.775 | 0.696 | 0.690 | 0.688 | 0.664 | 0.743 | |
样品(b) | 0.280 | 0.333 | 0.319 | 0.330 | 0.487 | 0.441 | 0.543 | 0.607 | 0.577 | 0.670 | 0.695 | 0.658 |
0.255 | 0.293 | 0.278 | 0.352 | 0.458 | 0.479 | 0.517 | 0.615 | 0.616 | 0.714 | 0.642 | 0.649 |
表2-表5的结果显示不加NDRG2和NDRG4蛋白时,对胃癌7901和肝癌HHCC肿瘤细胞生长没有影响,而加入NDRG2和NDRG4蛋白后胃癌7901和肝癌HHCC肿瘤细胞的生长受到明显抑制,而且随着蛋白浓度的提高,抑制作用也增强,但蛋白变性后不再发挥抑制作用(附图6-9)。
实施例4流式细胞术考察NDRG2和NDRG4蛋白对胃癌7901和肝癌HHCC肿瘤细胞周期的影响
分别向3个培养瓶中加入胃癌7901细胞和肝癌HHCC细胞各60×104共5ml,1号瓶和2号瓶分别加入NDRG2和NDRG4蛋白各300ul(2mg/ml),3号瓶加入空白缓冲液300ul,培养36小时取出,依照cycletest plus DNA reagent kit(BD公司产品)操作说明,测定细胞周期。
表6NDRG2蛋白对胃癌7901细胞周期的影响
空白组 | 样品组 | |
G1 | 66.97% | 75.4% |
G2 | 3.65% | 1.23% |
S | 29.37% | 23.37% |
表7NDRG2蛋白对肝癌HHCC细胞周期的影响
空白组 | 样品组 | |
G1 | 60.29% | 54.01% |
G2 | 5.76% | 3.05% |
S | 33.94% | 42.94% |
表6和表7结果显示,NDRG2蛋白对胃癌7901细胞的影响表现在G1期延长、G2和S期缩短。而NDRG2蛋白对肝癌HHCC细胞的影响表现在G1和G2期缩短、S期延长。说明尽管NDRG2蛋白对胃癌7901和肝癌HHCC细胞都表现出抑制作用,但作用于细胞周期的不同阶段,对胃癌7901细胞是阻滞在G1期而对肝癌HHCC细胞是停留在S期(附图10和11)。
表8NDRG4蛋白对胃癌7901细胞周期的影响
空白组 | 样品组 | |
G1 | 60.99% | 68.35% |
G2 | 4.75% | 1.39% |
S | 34.26% | 30.27% |
表9NDRG4蛋白对肝癌HHCC细胞周期的影响
空白组 | 样品组 | |
G1 | 58.73% | 68.47% |
G2 | 11.12% | 7.95% |
S | 30.15% | 23.59% |
表8和表9结果显示,NDRG4蛋白对胃癌7901和肝癌HHCC细胞影响表现在G1期延长、G2和S期缩短,均为阻滞在G1期(附图12和13)。
实施例5裸鼠致瘤抑制实验
取肝癌HHCC肿瘤细胞,用P.B.S.(1×,1%血清)稀释成6×106/ml,共6ml。取1.5ml加NDRG2和NDRG4蛋白原液1ml,得2.5ml为高剂量组。取1.5ml加NDRG2和NDRG4蛋白原液0.125ml,加0.875ml P.B.S.得2.5ml为低剂量组。取1.5ml加1ml P.B.S.得2.5ml为阴性组,取1.5ml加环磷酰胺溶液1ml得2.5ml为阳性组(环磷酰胺加P.B.S.制成21mg/ml)。取24只裸鼠,分成4组,每组6只,分别注射0.3ml,观察4周。4周后测量每只裸鼠产生肿瘤的大小,绘制NDRG2和NDRG4蛋白对裸鼠肿瘤生长抑制作用柱形图(附图15)。
结果显示阳性药组有一定肿瘤抑制作用,高剂量组肿瘤抑制作用明显,低剂量组作用相对较弱,与空白组比较证实NDRG2和NDRG4蛋白的肿瘤抑制作用明显(附图14和15)。
序列表
(1)一般信息:
(i)申请人:中国药品生物制品检定所
(ii)发明名称:NDRG2和NDRG4蛋白及其在诊断和抑制肿瘤中的应用
(iii)序列数目:4
(2)SEQ ID NO:1的信息
(i)序列特征
(A)长度:1,074bp
(B)类型:核酸
(C)链性:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:寡核苷酸
(iii)序列描述:SEQ ID NO:1:
ATGGCGGAGCTGCAGGAGGTGCAGATCACAGAGGAGAAGCCACTGTTGCCAGGACAGACGCCTG
AGGCGGCCAAGACTCACTCTGTGGAGACACCATACGGCTCTGTCACTTTCACTGTCTATGGCACCCC
CAAACCCAAACGCCCAGCGATCCTTACCTACCACGATGTGGGACTCAACTATAAATCTTGCTTCCAG
CCACTGTTTCAGTTCGAGGACATGCAGGAAATCATTCAGAACTTTGTGCGGGTTCATGTGGATGCCC
CTGGAATGGAAGAGGGAGCCCCTGTGTTCCCTTTGGGATATCAGTACCCATCTCTGGACCAGCTTGC
AGACATGATCCCTTGCGTCCTGCAGTACCTAAATTTCTCTACAATAATTGGAGTTGGTGTTGGAGCTG
GAGCCTACATCCTGGCGAGATATGCTCTTAACCACCCGGACACTGTTGAAGGTCTTGTCCTCATCAA
CATTGATCCCAATGCCAAGGGTTGGATGGATTGGGCAGCCCACAAGCTAACAGGCCTCACCTCTTCC
ATTCCGGAGATGATCCTTGGACATCTTTTCAGCCAGGAAGAGCTCTCTGGAAATTCTGAGTTGATAC
AAAAGTACAGAAATATCATTACACATGCACCCAACCTGGATAACATTGAATTGTACTGGAACAGCTA
CAACAACCGCCGAGACCTGAACTTTGAGCGTGGAGGTGATATCACCCTCAGGTGTCCTGTGATGCT
GGTGGTAGGAGACCAAGCACCTCATGAAGATGCAGTGGTGGAATGTAACTCAAAACTGGACCCCA
CCCAGACCTCGTTCCTCAAGATGGCTGACTCCGGAGGTCAGCCCCAGCTGACTCAGCCAGGCAAGC
TGACCGAGGCCTTCAAGTACTTCCTGCAAGGCATGGGCTACATGGCCTCATCCTGCATGACTCGCCT
GTCCCGGTCTCGTACAGCCTCTCTGACCAGTGCAGCATCCGTTGATGGCAACCGGTCCCGCTCTCGC
ACCCTGTCCCAGAGCAGCGAGTCTGGAACTCTTTCTTCGGGGCCCCCGGGGCACACCATGGAGGTC
TCCTGTTAA
(3)SEQ ID NO:2的信息
(i)序列特征
(A)长度:356氨基酸
(B )类型:氨基酸
(C)链性:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:氨基酸序列
(iii)序列描述:SEQ ID NO:2
AELQEVQITEEKPLLPGQTPEAAKTHSVETPYGSVTFTVYGTPKPKRPAILTYHDVGLNYKSCFQPLFQF
EDMQEIIQNFVRVHVDAPGMEEGAPVFPLGYQYPSLDQLADMIPCVLQYLNFSTIIGVGVGAGAYILAR
YALNHPDTVEGLVLINIDPNAKGWMDWAAHKLTGLTSSIPEMILGHLFSQEELSGNSELIQKYRNIITHA
PNLDNIELYWNSYNNRRDLNFERGGDITLRCPVMLVVGDQAPHEDAVVECNSKLDPTQTSFLKMADSG
GQPQLTQPGKLTEAFKYFLQGMGYMASSCMTRLSRSRTASLTSAASVDGNRSRSRTLSQSSESGTLSSG
PPGHTMEVSC
(4)SEQ ID NO:3的信息
(i)序列特征
(A)长度:1,020bp
(B)类型:核酸
(C)链性:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:寡核苷酸
(iii)序列描述:SEQ ID NO:3
ATGCCGGAGTGCTGGGATGGGGAACATGACATCGAGACACCCTACGGCCTTCTGCATGTAGTGATC
CGGGGCTCCCCCAAGGGGAACCGCCCAGCCATCCTCACCTACCATGATGTGGGCCTCAACCACAAA
CTATGCTTCAACACCTTCTTCAACTTCGAGGACATGCAGGAGATCACCAAGCACTTTGTGGTGTGTC
ACGTGGATGCCCCTGGACAACAGGTGGGGGCGTCGCAGTTTCCTCAGGGGTACCAGTTCCCCTCCA
TGGAGCAGCTGGCTGCCATGCTCCCCAGCGTGGTGCAGCATTTCGGGTTCAAGTATGTGATTGGCAT
CGGAGTGGGCGCCGGAGCCTATGTGCTGGCCAAGTTTGCACTCATCTTCCCCGACCTGGTGGAGGG
GCTGGTGCTGGTGAACATCGACCCCAATGGCAAAGGCTGGATAGACTGGGCTGCCACCAAGCTCTC
CGGCCTAACTAGCACTTTACCCGACACGGTGCTCTCCCACCTCTTCAGCCAGGAGGAGCTGGTGAA
CAACACAGAGTTGGTGCAGAGCTACCGGCAGCAGATTGGGAACGTGGTGAACCAGGCCAACCTGC
AGCTCTTCTGGAACATGTACAACAGCCGCAGAGACCTGGACATTAACCGGCCTGGAACGGTGCCCA
ATGCCAAGACGCTCCGCTGCCCCGTGATGCTGGTGGTTGGGGATAATGCACCCGCTGAGGACGGGG
TGGTGGAGTGCAACTCCAAACTGGACCCGACCACTACGACCTTCCTGAAGATGGCAGACTCTGGA
GGGCTGCCCCAGGTCACACAGCCAGGGAAGCTGACTGAAGCCTTCAAATACTTCCTGCAAGGCATG
GGCTACATGCCCTCAGCCAGCATGACCCGCCTGGCACGCTCCCGCACTGCATCCCTCACCAGTGCC
AGCTCGGTGGATGGCAGCCGCCCACAGGCCTGCACCCACTCAGAGAGCAGCGAGGGGCTGGGCCA
GGTCAACCACACCATGGAGGTGTCCTGTTAA
(5)SEQ ID NO:4的信息
(i)序列特征
(A)长度:338氨基酸
(B)类型:氨基酸
(C)链性:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:氨基酸序列
(iii)序列描述:SEQ ID NO:2
PECWDGEHDIETPYGLLHVVIRGSPKGNRPAILTYHDVGLNHKLCFNTFFNFEDMQEITKHFVVCHV
DAPGQQVGASQFPQGYQFPSMEQLAAMLPSVVQHFGFKYVIGIGVGAGAYVLAKFALIFPDLVEGLV
LVNIDPNGKGWIDWAATKLSGLTSTLPDTVLSHLFSQEELVNNTELVQSYRQQIGNVVNQANLQLFW
NMYNSRRDLDINRPGTVPNAKTLRCPVMLVVGDNAPAEDGVVECNSKLDPTTTTFLKMADSGGLPQ
VTQPGKLTEAFKYFLQGMGYMPSASMTRLARSRTASLTSASSVDGSRPQACTHSESSEGLGQVNHTM
EVSC
Claims (2)
1、含有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的蛋白多肽在制备诊断和/或抑制消化***肿瘤的药物中的应用,其中的蛋白多肽与制药学上容许的稀释剂或载体进行组合。
2、如权利要求1所述的应用,其特征是所述的消化***肿瘤是胃癌和肝癌。
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- 2004-01-16 CN CNB2004100007384A patent/CN1304573C/zh not_active Expired - Fee Related
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