CN1233831C - 抑制人bc1－2基因表达的siRNA和表达质粒及其在制药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异性抑制人bcl-2基因表达的siRNA及该siRNA的表达质粒和它们在制备治疗或预防与人bcl-2基因有关的肿瘤的药物中的应用。本发明利用生物计算机信息技术从GenBank中获得一组人bcl-2基因序列，并以RNA干扰技术为基础，设计出一组能诱发RNA干扰的siRNA，通过化学法合成或质粒载体表达一定量的siRNA，从而特异性抑制人bcl-2基因的表达，达到抑制肿瘤的发生和生长的目的。该siRNA及其表达质粒可用于制备高效快速、特异性强、副作用少的抗肿瘤药。

Description

抑制人bcl-2基因表达的siRNA和表达质粒及其在制药中的应用

技术领域

本发明涉及一种siRNA，特别是涉及一种抑制人bcl-2基因表达的siRNA和表达质粒及其在制药中的应用。

背景技术

现有的肿瘤治疗药物由于毒副作用或疗效等问题，仍不能很好的控制肿瘤生长和挽救众多癌症病人的生命，目前的肿瘤基因治疗大多集中在导入外源基因对体内缺陷基因的修正，这种治疗方法还无法改变癌细胞的致癌基因。由于绝大多数肿瘤的发生都是因为某些基因的过度表达引起的，所以针对肿瘤细胞中基因过度表达的研究逐渐得到了重视，首先出现的是肿瘤的反义寡核苷酸基因治疗，但这种方法所使用的剂量较大，所以在实际临床治疗过程中就受到了限制。RNA干涉(RNA interference)技术是近两年发展起来的一种抑制基因表达的新方法，采用19-23个碱基或发夹状不同长度的双链RNA可使不同类型细胞的靶向基因表达明显降低，甚至有时用专一性抗体都检测不到靶向基因所表达的蛋白质或肽类，因此，人们形象地称用RNAi技术可使基因敲低(Knock-down)或使基因沉默(genesilencing)。这是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默(PTGS，post-transcriptional gene silencing)在哺乳动物细胞中建立RNA干涉技术，可以用于研究某些特定基因的功能，从而可以解决某些疾病的发病机制，同时对疾病尤其是对肿瘤的治疗也有一定的应用价值，并且RNA干涉技术所使用的剂量仅为反义寡核苷酸剂量的万分之一左右。另一方面，若小双链RNA中改变1个核苷酸，就可使该RNAi靶向基因沉默作用消失，这样，就有可能将这一技术用于抑制某些过度表达基因的表达，而不影响正常基因的表达。

Bcl-2是1984年Tsujimoto等从滤泡性淋巴细胞淋巴瘤中分离出来的一种癌基因，该肿瘤有14号和18号染色体的易位，t(14；18)(q32；q21)，18号染色体上的Bcl-2基因易位到14号染色体上，与免疫球蛋白重链基因串联形成融合基因，从而使Bcl-2基因在B细胞中异常表达，这种异常表达在淋巴瘤中起着重要作用。1988年，Vaux等将Bcl-2基因转入骨髓原始细胞使其在细胞中高表达，结果导致肿瘤的发生，并发现细胞的生存时间明显延长，而细胞的增殖率没见明显增加。因此目前认为bcl-2基因是一种新类型的癌基因，它不影响细胞的增殖，而是作为细胞凋亡的一个潜在抑制剂调节细胞的死亡。最近研究结果证实，bcl-2不仅在淋巴细胞***中表达，而且在一些非淋巴***组织中(如受激素调节的腺体、再生较快的组织、***后的神经细胞等)也有表达，而且发现bcl-2基因的表达可以抑制或阻断许多因素导致的细胞凋亡。这些研究结果显示，抑制bcl-2基因的表达可以被用来治疗恶性肿瘤。为了使bcl-2基因在恶性肿瘤细胞中表达降低，促进肿瘤细胞的凋亡，就必须使bcl-2基因在转录或翻译的任何一个环节被阻断，所以，通过这些合成的或表达质粒序列转录形成的小双链RNA(siRNA)可以靶向作用于bcl-2基因的mRNA，从而阻断其翻译的过程，达到使bcl-2基因表的降低的结果。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性抑制人bcl-2基因表达的siRNA。

本发明的另一个目的是提供上述siRNA的表达质粒。

本发明的再一个目的是提供上述siRNA或产生该siRNA的表达质粒在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的目的可以通过下列方式实现：

本发明的原理是通过构建一种质粒载体(命名为psiRNA)，这种质粒载体能产生19-23个核苷酸的小双链RNA(siRNA)，该siRNA与人bcl-2 mRNA存在互补关系，能靶向识别人bcl-2 mRNA上与其互补的序列，并能与之结合，从而影响人bcl-2 mRNA表达的活性。

据此设计，首先在基因库中寻找靶向基因人bcl-2 mRNA序列，并从起始密码后75个碱基开始寻找AA+N19+UU序列或AA+N19序列(N19为任意19个mRNA核苷酸序列)，然后计算所选择的19-23 nts mRNA碱基序列中G+C比例在30％到70％之间，再将19-23 nts mRNA序列用Blast搜寻EST基因库，确认所靶向的基因是唯一的，再设计19-23个核苷酸的反义RNA，并用SiACE-RNAi方法合成或T₇体外转录合成，形成一种特异性抑制人bcl-2基因表达的小双链RNA，它包含下列任意六种小双链RNA的其中一种或几种，它们的碱基序列及作用部位见表1。

表1：双链RNA的序列，修饰和作用部位

编号

双链RNA序列

长度

修饰

作用部位

A(SEQ ID NO.1)	5’  GCU GUC GCA GAG GGG CUA C  3’3’  CGA CAG CGU CUC CCC GAU G  5’	19nts	dTdT	97-115
					B(SEQ ID NO.2)	5’  CUG GGG GAG GAU UGU GGC C  3’3’  GAC CCC CUC CUA ACA CCG G  5’	19nts	dTdT	459-478
C(SEQ ID NO.3)	5’  CCG GGA GAU GUC GCC CCU G  3’3’  GGC CCU CUA CAG CGG GGA C  5’	19nts	dTdT	519-538
					D(SEQ ID NO.4)	5’  CAU CGC CCU GUG GAU GAC U  3’3’  GUA GCG GGA CAC CUA CUG A  5’	19nts	dTdT	547-565
E(SEQ ID NO.5)	5’  CCG GCA CCU GCA CAC CUG G  3’3’  GGC CGU GGA CGU GUG GAC C  5’	19nts	dTdT	577-595
					F(SEQ ID NO.6)	5’  CGG AGG CUG GGA UGC CUU U  3’3’  GCC UCC GAC CCU ACG GAA A  5’	19nts	dTdT	607-625

本发明的目的还可以通过下列方式实现：

所述的小双链RNA，采用合成的方式形成3’端含有2-4个dT或含有2-6个U的延伸结构的小双链RNA。

一种可以产生特异性抑制人bcl-2基因表达的小双链RNA的质粒，具有以下的基本结构：

由启动子、bcl-2编码区、终止密码、DNA序列顺序连接而成的环状双链DNA分子；

启动子＝真核基因中可启动产生小双链RNA的序列，它是启动它的下游紧邻之基因的表达的元件；

bcl-2编码区＝表达表1中所述的小双链RNA的编码区，有19-23个核苷酸形成，可采用双向结合形成或以发夹状结构在细胞内形成双链RNA；

终止密码＝采用5-6个T作为终止小双链RNA合成的终止密码序列；

DNA序列＝任何真核质粒载体和/或病毒的介于RNA编码区和启动子之间的DNA序列，含有质粒载体DNA的复制起始位点，或含有抗生素抗性基因，包括使细菌获得对抗某种抗生素的抗性的基因或使真核细胞获得某种抗生素的抗性的基因。

所述的质粒，其启动子可以是人的RNA聚合酶III的启动子或人的H1启动子。

所述的质粒，其DNA序列中所述任何真核质粒载体和/或病毒可以是pLuescript Sk，pcDNA3.0，pcDNA3.1，pRK5，pMALC-2，pLNCX，腺病毒，腺相关病毒(AAV)，仙台病毒(Sendai virus)。

所述的质粒，其DNA序列中含有抗生素抗性基因可以是氨苄青霉素抗性基因amp，四环素抗性基因tet，卡那霉素抗性基因kan，抗生素G418抗性基因neo。

所述的小双链RNA在制备抗肿瘤的药物中的应用。

所述的质粒在制备抗肿瘤的药物中的应用。

本发明提供的抑制bcl-2表达的质粒系列是应用基因工程的方法构建的，将含有质粒复制起点，抗生素抗性基因和其它调控序列的质粒载体用适宜的限制性内切酶切成线型，然后用PCR方法克隆出启动子序列，克隆的启动子序列在经过纯化回收后，也用与酶切质粒载体的限制性内切酶相同的酶酶切，在把质粒载体和PCR产物作适当处理后，用DNA连接酶连成环状，转化细菌并扩增后，提取质粒并鉴定，即得含启动子的质粒载体；把含有启动子的质粒载体再用合适的限制性内切酶切成线型，然后把合成的抑制bcl-2基因表达的基因序列，在体外把单链合成双链，然后用DNA连接酶把合成的双链基因和切成线型的含有启动子的质粒载体连接成环状，转化细菌并扩增后，提取质粒并鉴定、纯化，即可以得到完整的可以用来抑制bcl-2基因表达的质粒DNA。最终的产物DNA，不含任何蛋白质、多糖(包括热原)。

如果将纯化的完整的质粒载体在上述多克隆位点处用适当的限制性内切酶酶解切断，即得线型的质粒。

本发明所提供的T7体外合成的小双链RNA(siRNA)，是根据发明人由GenBank中所查找到的关于人bcl-2 mRNA的序列而得到的，这些RNA序列及其所对应的人bcl-2 mRNA的作用位点见表1，这些RNA序列必须符合以下规则：从基因序列中的起始密码后75个碱基开始寻找AA+N19+UU序列或AA+N19序列，其中N19任意19个mRNA核苷酸序列。一般从中找出21个核苷酸中G+C比例为50％左右，并不高于70％或不低于30％的核苷酸序列。将符合要求的21个碱基序列在NCBI database中通过BLAST搜索小核苷酸序列同源性，以保证所靶向的目的基因是唯一的。将设计好的21个碱基的sense RNA和antisense RNA的3’端用2-4个dT或2-6个U修饰，可减少细胞内降解。两条RNA链用无RNA酶的水配成50μM，将两条RNA链引物各30μl加入15μl由100mM醋酸钾、30mM HEPES-KOH pH7.4和2mM醋酸镁配制成的5X配对缓冲液(annealing buffer)，共计75μl，用PCR仪90℃ 1分钟，37℃ 1小时，然后关掉PCR仪使之冷却到室温后，-20℃贮存，并反复冻融5次，这样dsRNA的最终浓度为20μM。设计并合成好的这些siRNA序列可以转染人癌细胞，抑制人癌细胞中bcl-2基因的表达，可以抑制肿瘤的生长和发生，能够用于制备抗肿瘤的药物。

在本发明的PsiRNA载体中以构建的pCI质粒为例，经过对两株bcl-2高表达的细胞株的体外实验，使用Lipofectamin 2000为转染载体，在转染质粒48小时后，收集细胞，并采用Western blot的蛋白检测方法，证明其能抑制bcl-2基因的表达，从而可以实现抑制肿瘤生长、促进肿瘤凋亡的目的。所以，本发明的抑制bcl-2基因表达的质粒载体是一种可以有效抑制bcl-2表达的质粒DNA，在体外实验中与对照组比较可以抑制bcl-2的表达可达到85％以上，在所有的恶性肿瘤中，约有80％以上出现bcl-2高表达的现象，因而有效的抑制bcl-2基因的表达将对于肿瘤的基因治疗和预防是具有极高的应用价值的。

本发明的优点：

本发明提供的siRNA其表达质粒可以特异性、高效地抑制人bcl-2基因的表达，从而达到抑制肿瘤的发生和生长的目的。该siRNA及其表达质粒可用于制备高效快速、特异性强、副作用少的抗肿瘤药。

附图说明

图1：转导siRNA 72小时后HelaB2细胞的斑点杂交图

图2：pAVU6+27质粒图谱

图3：pRK5质粒图谱

图4：pcDNA3.0质粒图谱

图5：pcDNA3.0-sense-antisense鉴定图

图6：动物致瘤性实验肿瘤重量直方图

具体实施方式

下面通过实施例结合附图对本发明作进一步的描述，但并不限制于本发明的范围。

实施例1：siACE-RNAi合成的bcl-2双链RNA抑制癌细胞HelaB2中bcl-2基因的表达

本发明所提供的以siACE-RNAi合成的小双链RNA(siRNA)，是根据发明人由GenBank中所查找到的关于人bcl-2 mRNA的序列而得到的，这些RNA序列必须符合以下原则：从基因序列中的起始密码后75个碱基开始寻找AA+N19+UU序列或AA+N19序列，其中N19任意19个mRNA核苷酸序列。一般从中找出21个核苷酸中G+C比例为50％左右，并不高于70％或不低于30％的核苷酸序列。将符合要求的21个核苷酸序列在NCBI database中通过BLAST搜索小核苷酸序列同源性，以保证所靶向的目的基因是唯一的。将设计好的21个碱基的sense RNA和antisense RNA的3’端用2-4个dT或2-6个U修饰，可减少细胞内降解。

发明人根据以上原则，设计合成了表1中的B序列(SEQ ID NO.2)，序列为

B：5’CUG GGG GAG GAU UGU GGC C  3’

   3’GAC CCC CUC CUA ACA CCG G  5’

作用于人bcl-2 mRNA的第459-478位。

序列合成后，用以下方法转导进入癌细胞HelaB2中，并进行斑点杂交，确定其对HelaB2中bcl-2基因表达的抑制效率。

一、双链RNA的细胞内转导：

HelaB2细胞来自中国医学科学院肿瘤研究所，在24孔板上用1640培养液，含6％的小牛血清和青霉素、链霉素在37℃5％CO₂细胞培养箱中培养至满瓶的50％。然后，吸去培养液，用不含青霉素、链霉素和小牛血清的1640洗1次。在转染siRNA前，加入无血清和双抗的1640 197μl/孔。接下来取20μM siRNA 3μl(终浓度为60pM)，加入40μlOpti-MEM混合稀释，另一试管加入2μl oligofectamine Reagent，用8μl Opti-MEM混合稀释。两试管在室温无菌条件下放置10分钟，两试管合并混合后室温无菌条件下放置25分钟，待溶液变稠后移入24孔板中，每孔加入53μl共计250μl/每孔培养介质，37℃5％CO₂下培养4小时，每孔再加入含2倍小牛血清和2倍青霉素、链霉素的1640培养液250μl，37℃5％CO₂下分别培养48小时和72小时。

二.斑点杂交转染siRNA后，细胞培养48小时或72小时，吸去培养介质，用Hank’s液洗一次，每孔加入50μl 1％SDS，取出细胞后，轻微超声粉碎细胞10秒，-70℃冻存。同时取出3μl用Bio-Rad DC测蛋白浓度，OD₇₅₀测吸收值，从标准曲线查出蛋白浓度。调节蛋白浓度使每个样品的的蛋白量为100μg作10％SDS-PAGE电泳，并转印到硝酸纤维素膜上，进行斑点杂交。含有样品的硝酸纤维素膜用2％脱脂奶粉配制的PBS(0.1M，pH7.0)洗30分钟，用鼠单抗(鼠抗人bcl-2基因IgG单克隆抗体，下同)按1∶250用2％脱脂奶粉—PBS稀释后，振荡反应1.5小时，用2％脱脂奶粉—PBS洗30分钟。然后用HRP-兔抗鼠二抗按1∶1000 2％脱脂奶粉—PBS稀释后反应1小时，PBS洗30分钟，DAB试剂盒显色处理(见图1)。

实施例2：T₇体外转录合成的双链RNA抑制恶性黑色素瘤A375细胞中bcl-2基因表达

一、T₇体外转录合成双链RNA

本发明所提供的以T₇体外合成的小双链RNA(siRNA)，是根据发明人由GenBank中所查找到的关于人bcl-2 mRNA的序列而得到的，这些RNA序列必须符合以下原则：从基因序列中的起始密码后75个碱基开始寻找AA+N19+UU序列或AA+N19序列，其中N19任意19个mRNA核苷酸序列。一般从中找出21个核苷酸中G+C比例为50％左右，并不高于70％或不低于30％的核苷酸序列。将符合要求的21个碱基序列在NCBI database中通过BLAST搜索小核苷酸序列同源性，以保证所靶向的目的基因是唯一的。将设计好的21个碱基的sense RNA和antisense RNA的3’端用2-4个dT或2-6个U修饰，可减少细胞内降解。

发明人根据以上原则，设计合成了A序列(SEQ IDNO.1)，序列为：

A：5’GCU GUC GCA GAG GGG CUA C  3’

   3’CGA CAG CGU CUC CCC GAU G  5’

作用于人bcl-2 mRNA的第97-115位。

具体合成过程如下：

1、把合成的2 OD sense(正义链，下同)和antisense(反义链，下同)溶解于100μl 0.2％DEPC处理的去离子水中，摇匀，-20℃保存备用。

2、按以下方法把sense和antisense分别与T₇ promoter合成双链：

3μl T₇ promoter

3μl antisense或sense

44μl TE(10mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA pH8.0)

95℃2分钟，逐步冷却至4℃，-20℃保存备用。

3、T₇体外转录

0.4M Tris-HCl pH7.9                5μl

60mM MgCl₂                        5μl

0.1M DTT                           5μl

0.1M NaCl                          5μl

20mM Spermi dine                   5μl

10mM rNTP                          5μl

100U/ml Yeast pyrophosphatase      1μl

40U/μl Rnase Inhibitor            1μl

20U/μl T₇ RNA polymerase         5μl

合成的双链DNA                0.4μl

0.2％DEPC处理的去离子水      12.6μl

                             (总体积为50μl)

37℃2小时，然后加入5U/μl的DNase I(RNase free)1μl，37℃15分钟，-20℃保存备用。

4、按以下方法把合成的sense链和antisense链合成双链

50μl  sense-T₇ promoter转录液

50μl  antisense-T₇ promoter转录液

混匀，95℃ 5分钟，37℃1小时，逐步冷却至室温。

5、sense-antisense配成双链后的沉淀纯化

上述100μl  sense-antisense的双链RNA溶液，加入22μl 3M pH5.2的醋酸钠溶液，然后加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30分钟后，14000rpm，4℃离心15分钟，弃上清，沉淀用70％乙醇洗一次，弃上清，沉淀吹干，以0.2％DEPC处理的去离子水50μl溶解，-20℃保存备用。

二、双链RNA的细胞内转导：

A375细胞来自中科院上海细胞所，在24孔板上用1640培养液，含6％的小牛血清和青霉素、链霉素在37℃ 5％CO₂细胞培养箱中培养至满瓶的50％。然后，吸去培养液，用不含青霉素、链霉素和小牛血清的1640洗1次。在转染siRNA前，加入无血清和青霉素、链霉素的1640  197μl/孔。接下来取20μM siRNA 3μl(终浓度为60pM)，加入40μlOpti-MEM混合稀释，另一试管加入2μl oligofectamine Reagent，用8μl Opti-MEM混合稀释。两试管在室温无菌条件下放置10分钟，两试管合并混合后室温无菌条件下放置25分钟，待溶液变稠后移入24孔板中，每孔加入53μl共计250μl/每孔培养介质，37℃5％CO₂下培养4小时，每孔再加入含2倍小牛血清和2倍青霉素、链霉素的1640培养液250μl，37℃5％CO₂下分别培养48小时和72小时。

三.斑点杂交：转染siRNA后，细胞培养48小时或72小时，吸去培养介质，用Hank’s液洗一次，每孔加入50μl 1％SDS，取出细胞后，轻微超声粉碎细胞10秒，-70℃冻存。同时取出3μl用Bio-Rad DC测蛋白浓度，OD₇₅₀测吸收值，从标准曲线查出蛋白浓度。调节蛋白浓度使每个样品的的蛋白量为100μg作10％SDS-PAGE电泳，并转印到硝酸纤维素膜上，进行斑点杂交。含有样品的硝酸纤维素膜用2％脱脂奶粉配制的PBS(0.1M，pH7.0)洗30分钟，用鼠单抗按1∶250用2％脱脂奶粉—PBS稀释后，振荡反应1.5小时，用2％脱脂奶粉一PBS洗30分钟。然后用HRP-兔抗鼠二抗按1∶1000 2％脱脂奶粉—PBS稀释后反应1小时，PBS洗30分钟，DAB试剂盒显色处理。

实施例3：构建的发夹状双链RNA抑制乳腺腺癌MCF-7细胞中bcl-2基因的表达

一：U6启动子(人的RNA聚合酶III的启动子)的制备

1、U6启动子PCR引物的设计和PCR的过程

引物：

3’端引物

AATCTGCAGAAAAAGCGGACCGAAGTCCGCTCTAGATGCATGCTCGAGGTCGTCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC

(SEQ ID NO.7)

5’端引物  CGCGGATCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGC

(SEQ ID NO.8)

PCR模板：pAVU6+27(见图2)

PCR的过程

94℃1分钟，57℃1分钟，72℃ 1分钟，35个循环后，72℃10分钟，4℃保存。

2.PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在280bp有一条很深很亮的条带，这就是U6启动子的条带，切下，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收凝胶上的双链DNA，取17μl回收的DNA，加10X限制性内切酶PstI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶PstI 1μl，混匀，37℃保温酶解5小时，反应后，反应体系中加入16μl 4M醋酸铵溶液，84μl无水乙醇，混合，-20℃30分钟，14000g 4℃ 15分钟离心，去上清，吹干后，加入17μl无菌水和10X限制性内切酶BamHI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶BamHI 1μl，混合，37℃保温酶解2小时。最后，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在280bp有一条很深很亮的条带，切下，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收凝胶上的双链DNA，溶解于20μl无菌水中，是为A液，-20℃保存备用。

二：pRK5质粒的酶切和与U6启动子的连接

1.取质粒pRK5(4716bp，见图3)0.5μg(0.5μl)，加10X限制性内切酶PstI缓冲液2μl，无菌水17μl和限制性内切酶PstI 1μl，混匀，37℃保温酶解5小时，反应后，反应体系中加入16μl 4M醋酸铵溶液，84μl无水乙醇，混合，-20℃30分钟，14000g4℃ 15分钟离心，去上清，吹干后，加入17μl无菌水和10X限制性内切酶BamHI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶BamHI 1μl，混合，37℃保温酶解2小时。最后，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在4500bp上方有一条带，切下，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收凝胶上的双链DNA，溶解于20μl无菌水中，是为B液，-20℃保存备用。

2.取上述的A液7μl，B液1μl，加入10μl的无菌水，2μl的10XT₄ DNA连接酶缓冲液和1μl的T₄ DNA连接酶，22℃孵育1小时。

3.在孵育液中加入100μl的感受态大肠杆菌DH5α，转化大肠杆菌，然后涂布在100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养16-18小时，随机挑取菌落于含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增细菌，抽提质粒，分别用限制性内切酶PstI和BamHI酶切，反应液在1％琼脂糖凝胶电泳分离，选择出现350bp***片段的质粒，保存备用。

三：bcl-2抑制基因的制备和连接

本发明所提供的发夹状双链RNA(siRNA)，是根据发明人由GenBank中所查找到的关于人bcl-2 mRNA的序列而得到的，这些RNA序列及其所对应的人bcl-2 mRNA的作用位点见表1，这些RNA序列必须符合以下原则：从基因序列中的起始密码后75个碱基开始寻找AA+N19+UU序列或AA+N19序列，其中N19任意19个mRNA核苷酸序列。一般从中找出21个核苷酸中G+C比例为50％左右，并不高于70％或不低于30％。将符合要求的21个碱基序列在NCBI database中通过BLAST搜索小核苷酸序列同源性，以保证所靶向的目的基因是唯一的。将设计好的21个碱基的sense RNA和antisense RNA的3’端用2-4个dT或2-6个U修饰，可减少细胞内降解。

发明人根据以上原则，设计合成了权利要求书1中的C序列，序列为：

C：5’CCG GGA GAU GUC GCC CCU G  3’

   3’GGC CCU CUA CAG CGG GGA C  5’

作用于bcl-2 mRNA的第519-538位。

两端留下SalI和XbaI的酶切位点，具体的发夹状RNA的基因序列为：

N端5’

CGACCCCCGGGAGATGTCGCCCCTGTTCAAGAGACAGGGGCGACATCTCCCGGTTTT

TTGGAAAT

(SEQ ID NO.9)

C端5’

TAGATITCCAAAAAACCGGGAGATGTCGCCCCTGTCTCTTGAACAGGGGCGACATCT

CCCGGGGG

(SEQ ID NO.10)

1.把分别合成的上述两条单链DNA配成双链

把配成50μM的单链DNA各取2μl，加入46μl的annealing Buffer(100mM醋酸钾，30mM Hepes-KOH pH7.4，2mM醋酸镁)，在PCR仪中，95℃ 4分钟，70℃10分钟，关机后冷却至室温，4℃存放后，-20℃保存备用。

2.合成双链DNA的磷酸化

2μl合成双链DNA

1μl T₄多聚核苷酸激酶的缓冲液A

1μl 1mM ATP

1μl T₄多聚核苷酸激酶(T₄PNK)

5μl无菌水

把总体积为10μl的液体混匀，37℃30分钟，70℃ 10分钟，然后冷却至室温，4℃存放后，-20℃保存备用。

3.取已经连接上U6启动子的pRK5质粒16μl(1μg)，加10X限制性内切酶SalI缓冲液2μl，限制性内切酶SalI和XbaI各1μl，混匀，37℃保温酶解5小时，反应后，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在5000bp下方有一条带，切下，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收凝胶上的双链DNA，溶解于20μl无菌水中，-20℃保存备用。

4.将上述酶切的质粒1μl和磷酸化的bcl-2的抑制基因7μl，加入10μl的无菌水，2μl的10XT₄ DNA连接酶缓冲液和1μl的T₄DNA连接酶，22℃孵育1小时。

5.在孵育液中加入100μl的感受态大肠杆菌DH5α，转化大肠杆菌，然后涂布在100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养16-18小时，随机挑取菌落于含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增细菌，抽提质粒，分别用限制性内切酶SalI和XbaI酶切，反应液在2.5％琼脂糖凝胶电泳分离，选择出现64bp***片段的质粒，此即pRI质粒。

四：含G418抗性基因双链RNA质粒pCI的构建

1.把已经构建好的pRI质粒，取17μl(约1μg)，加10X限制性内切酶EcoRI缓冲液2μl，限制性内切酶EcoRI 1μl，混匀，37℃保温酶解1小时，反应后，反应体系中加入16μl 4M醋酸铵溶液，84μl无水乙醇，混合，-20℃ 30分钟，14000g 4℃15分钟离心，去上清，吹干后，加入17μl无菌水和10X限制性内切酶XbaI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶XbaI 1μl，混合，37℃保温酶解5小时。最后，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在400bp有一条带，切下，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收凝胶上的双链DNA，溶解于20μl无菌水中，是为A液，-20℃保存备用。

2.取pcDNA3.0质粒17μl(约1μg，见图4)，加10X限制性内切酶EcoRI缓冲液2μl，限制性内切酶EcoRI 1μl，混匀，37℃保温酶解2小时，反应后，反应体系中加入16μl 4M醋酸铵溶液，84μl无水乙醇，混合，-20℃30分钟，14000g 4℃15分钟离心，去上清，吹干后，加入17μl无菌水和10X限制性内切酶XbaI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶XbaI 1μl，混合，37℃保温酶解5小时。最后，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在5400bp有一条带，切下，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收凝胶上的双链DNA，溶解于20μl无菌水中，是为B液，-20℃保存备用。

3.质粒的连接、转化和鉴定

(1)取上述的A液7μl，B液1μl，加入10μl的无菌水，2μl的10XT₄DNA连接酶缓冲液和1μl的T₄DNA连接酶，22℃孵育1小时。

(2)在孵育液中加入100μl的感受态大肠杆菌DH5α，转化大肠杆菌，然后涂布在100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养18小时，随机挑取菌落于含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增细菌，抽提质粒，分别用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，反应液在1％琼脂糖凝胶电泳分离，选择出现400bp***片段的质粒，即为pCI质粒。

五.pCI质粒对人乳腺腺癌MCF-7细胞bcl-2基因表达的抑制作用

1.人乳腺腺癌MCF-7细胞的培养和转染

人乳腺腺癌MCF-7细胞来自上海中科院细胞所，1640培养基+10％小牛血清培养，待培养到细胞的贴壁率在80％左右，铺6孔细胞培养板，1.5×10⁵个细胞/孔，过夜培养后，细胞的贴壁率在40％左右时，吸去培养液，用不含青霉素、链霉素和小牛血清的1640洗1次。接下来取pCI质粒4μg，加入250μl Opti-MEM混合稀释，另一试管加入10μllipofectamin 2000，用250μl Opti-MEM混合稀释。两试管在室温无菌条件下放置5分钟，两试管合并混合后室温无菌条件下放置20分钟，待溶液变稠后移入6孔板中，每孔加入560μl培养介质，37℃5％CO₂下培养4小时，每孔再加入含2倍小牛血清和2倍青霉素、链霉素的1640培养液1440μl，37℃ 5％CO₂下培养72小时。

2.细胞的筛选

吸去培养介质，用含100μg/ml G418的1640培养基筛选阳性细胞，中间不断更换新鲜的含100μg/ml G418的1640培养基，待细胞完全贴壁后，此即为含有pCI质粒的人乳腺腺癌MCF-7细胞。

3.细胞的回收和抑制效果的鉴定

把含有pCI质粒的人乳腺腺癌MCF-7细胞在不含G418的1640培养基培养72小时后，吸去培养介质，用Hank’s液洗一次，每孔加入50μl 1％SDS，取出细胞后，轻微超声粉碎细胞10秒，-70℃冻存。同时取出3μl用Bio-Rad DC测蛋白浓度，OD₇₅₀测吸收值，从标准曲线查出蛋白浓度。调节蛋白浓度使每个样品的的蛋白量为100μg作10％SDS-PAGE电泳，并转印到硝酸纤维素膜上，进行斑点杂交。含有样品的硝酸纤维素膜用2％脱脂奶粉配制的PBS(0.1M，pH7.0)洗30分钟，用鼠单抗按1∶250用2％脱脂奶粉—PBS稀释后，振荡反应1.5小时，用2％脱脂奶粉—PBS洗30分钟。然后用HRP-兔抗鼠IgG按1∶1000 2％脱脂奶粉—PBS稀释后反应1小时，PBS洗30分钟，DAB试剂盒显色处理。结果发现，与对照组比较，转导有pCI质粒的细胞中其抑制bcl-2基因的表达在90％以上。

实施例4：构建的双向作用双链RNA抑制恶性胃腺癌BGC-823细胞中bcl-2基因的表达

本发明所提供的以构建双向作用的小双链RNA(siRNA)，是根据发明人由GenBank中所查找到的关于人bcl-2 mRNA的序列而得到的，这些RNA序列及其所对应的人bcl-2 mRNA的作用位点见表1，这些RNA序列必须符合以下原则：从基因序列中的起始密码后75个碱基开始寻找AA+N19+UU序列或AA+N19序列，其中N19任意19个mRNA核苷酸序列。一般从中找出21个核苷酸中G+C比例为50％左右，并不高于70％或不低于30％。将符合要求的21个碱基序列在NCBI database中通过BLAST搜索小核苷酸序列同源性，以保证所靶向的目的基因是唯一的。将设计好的21个碱基的sense RNA和antisense RNA的3’端用2-4个dT或2-6个U修饰，可减少细胞内降解。

发明人根据以上原则，设计合成了表1中的D序列，序列为：

D：5’CAU CGC CCU GUG GAU GAC U  3’

  3’GUA GGCG GGA CAC CUA CUG A  5’

作用于bcl-2 mRNA的第547-565位。

一.引物的设计

sense 5’CCGGAATTCAAAAAACATCGCCCTGTGGATGACTGGTGTTTCGTCCTTTCCAC  3’

(SEQ ID NO.11)

antisense 5’ATTGGGCCCAAAAAAGTCATCCACAGGGCGATGGGTGTTTCGTCCTTTCCAC  3’

(SEQ ID NO.12)

二.U6-sense的合成及pcDNA3.0-sense的构建

以pAVU6+27质粒为PCR模板，PCR的过程为94℃1分钟，57℃1分钟，72℃ 1分钟，35个循环后，72℃ 10分钟，4℃保存。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在300bp有一条很深很亮的条带，这就是U6-sense的条带，紫外光下鉴定后，取17μl PCR产物，加10X限制性内切酶BamHI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶BamHI 1μl，混匀，37℃保温酶解5小时，反应后，反应体系中加入16μl 4M醋酸铵溶液，84μl无水乙醇，混合，-20℃ 30分钟，14000g 4℃15分钟离心，去上清，吹干后，加入17μl无菌水和10X限制性内切酶EcoRI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶EcoRI 1μl，混合，37℃保温酶解2小时。最后，1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在300bp有一条很深很亮的条带，切下，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收凝胶上的双链DNA，溶解于20μl无菌水中，是为A液，-20℃保存备用。

取pcDNA3.0质粒17μl(约1μg)，加10X限制性内切酶EcoRI缓冲液2μl，限制性内切酶EcoRI 1μl，混匀，37℃保温酶解2小时，反应后，反应体系中加入4M醋酸铵溶液16μl，84μl无水乙醇，混合，-20℃30分钟，14000g 4℃15分钟离心，去上清，吹干后，加入17μl无菌水和10X限制性内切酶BamHI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶BamHI 1μl，混合，37℃保温酶解5小时。最后，1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在5400bp有一条带，切下，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收凝胶上的双链DNA，溶解于20μl无菌水中，是为B液，-20℃保存备用。

取上述的A液7μl，B液1μl，加入10μl的无菌水，2μl的10XT₄DNA连接酶缓冲液和1μl的T₄ DNA连接酶，22℃孵育1小时。在孵育液中加入100μl的感受态大肠杆菌DH5α，转化大肠杆菌，然后涂布在100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养18小时，随机挑取菌落于含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增细菌，抽提质粒，分别用限制性内切酶EcoRI和BamHI酶切，反应液在1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，选择出现300bp***片段的质粒，即为pcDNA3.0-sense质粒。

三.U6-antisense的合成及pcDNA3.0-sense-antisense的构建

以pAVU6+27为PCR模板，PCR的过程为94℃ 1分钟，57℃ 1分钟，72℃ 1分钟，35个循环后，72℃ 10分钟，4℃保存。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在300bp有一条很深很亮的条带，这就是U6-antisense的条带，紫外光下鉴定后，取17μl PCR产物，加10X限制性内切酶NotI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶NotI 1μl，混匀，37℃保温酶解8小时，反应后，反应体系中加入16μl 4M醋酸铵溶液，84μl无水乙醇，混合，-20℃30分钟，14000g 4℃15分钟离心，去上清，吹干后，加入17μl无菌水和10X限制性内切酶ApaI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶ApaI 1μl，混合，37℃保温酶解8小时。最后，1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在300bp有一条很深很亮的条带，切下，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收凝胶上的双链DNA，溶解于20μl无菌水中，是为A液，-20℃保存备用。

取pcDNA3.0-sense质粒17μl(约1μg)，加10X限制性内切酶NotI缓冲液2μl，限制性内切酶NotI 1μl，混匀，37℃保温酶解2小时，反应后，反应体系中加入16μl 4M醋酸铵溶液，84μl无水乙醇，混合，-20℃30分钟，14000g 4℃ 15分钟离心，去上清，吹干后，加入17μl无菌水和10X限制性内切酶ApaI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶ApaI 1μl，混合，37℃保温酶解5小时。最后，1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在5400bp有一条带，切下，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收凝胶上的双链DNA，溶解于20μl无菌水中，是为B液，-20℃保存备用。

取上述的A液7μl，B液1μl，加入10μl的无菌水，2μl的10XT₄ DNA连接酶缓冲液和1μl的T₄ DNA连接酶，22℃孵育1小时。在孵育液中加入100μl的感受态大肠杆菌DH5α，转化大肠杆菌，然后涂布在100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养18小时，随机挑取菌落于含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增细菌，抽提质粒，分别用限制性内切酶EcoRI和BamHI酶切，反应液在1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，选择出现300bp***片段的质粒，即为pcDNA3.0-sense-antisense质粒(见图5)。

四.pcDNA3.0-sense-antisense质粒对人胃腺癌BGC-823细胞bcl-2基因表达的抑制作用

人胃腺癌BGC-823细胞来自上海中科院细胞所，1640培养基+10％小牛血清培养，待培养到细胞的贴壁率在80％左右，铺6孔细胞培养板，1.5×10⁵个细胞/孔，过夜培养后，细胞的贴壁率在40％左右时，吸去培养液，用不含青霉素、链霉素和小牛血清的1640洗1次。接下来取pcDNA3.0-sense-antisense质粒4μg，加入250μl 0pti-MEM混合稀释，另一试管加入10μl lipofectamin 2000，用250μl Opti-MEM混合稀释。两试管在室温无菌条件下放置5分钟，两试管合并混合后室温无菌条件下放置20分钟，待溶液变稠后移入6孔板中，每孔加入560μl培养介质，37℃ 5％CO₂下培养4小时，每孔再加入含2倍小牛血清和2倍青霉素、链霉素的1640培养液1440μl，37℃5％CO₂下培养72小时。

2.细胞的筛选

吸去培养介质，用含100μg/ml G418的1640培养基筛选阳性细胞，中间不断更换新鲜的含100μg/ml G418的1640培养基，待细胞完全贴壁后，此即为含有pcDNA3.0-sense-antisense质粒的人胃腺癌BGC-823细胞。

3.细胞的回收和抑制效果的鉴定

把含有pcDNA3.0-sense-antisense质粒的人胃腺癌BGC-823细胞在不含G418的1640培养基培养72小时后，吸去培养介质，用Hank’s液洗一次，每孔加入50μl 1％ SDS，取出细胞后，轻微超声粉碎细胞10秒，-70℃冻存。同时取出3μl用Bio-Rad DC测蛋白浓度，OD₇₅₀测吸收值，从标准曲线查出蛋白浓度。调节蛋白浓度使每个样品的的蛋白量为100μg作10％SDS-PAGE电泳，并转印到硝酸纤维素膜上，进行斑点杂交。含有样品的硝酸纤维素膜用2％脱脂奶粉配制的PBS(0.1M，pH7.0)洗30分钟，用鼠单抗按1∶250用2％脱脂奶粉—PBS稀释后，振荡反应1.5小时，用2％脱脂奶粉—PBS洗30分钟。然后用HRP-兔抗鼠IgG按1∶1000 2％脱脂奶粉—PBS稀释后反应1小时，PBS洗30分钟，DAB试剂盒显色处理。结果发现，与对照组比较，转导有pcDNA3.0-sense-antisense质粒的细胞中其抑制bcl-2基因的表达在85％以上。

实施例5.动物致瘤性实验

将BALB/C裸鼠随机分成对照组1(未处理)、转空白质粒(pcDNA3.0质粒)SMMC7721肝癌细胞组2和转pcDNA3.0-sense-antisense质粒SMMC7721肝癌细胞组3，每组6只，均为雄性。取对数生长期的转pcDNA3.0质粒SMMC7721肝癌细胞以及转pcDNA3.0-sense-antisense质粒的SMMC7721细胞，0.25％胰酶消化后置于无血清1640培养液中，调整浓度为5×107/ml，分别接种子BALB/C裸小鼠的右腋皮下，每只0.2ml，各组均在注射肿瘤细胞20天后，颈椎脱臼处死裸鼠，剖出肿瘤，称量肿瘤的重量。结果表明，对照组和pcDNA3.0-SMMC7721肝癌细胞组在接种裸鼠后10天内就形成肉眼可见肿瘤，第20天时肿瘤的平均重量分别为4.95±0.15克和4.86±0.12克，而pcDNA3.0-sense-antisense--SMMC7721细胞在裸鼠体内形成肿瘤速度明显较慢，在肿瘤细胞接种后18天才在皮下生长出第一个肿瘤。其余均未见明显肿块。结果见图6。

所有的体内外的实验均表明，无论是合成的小双链RNA还是本发明人构建的能够产生小双链RNA的质粒载体，都能够抑制癌细胞bcl-2基因的表达，在体实验证明该双链RNA可以抑制肿瘤的发生和生长。说明该双链RNA及其表达质粒可用于制备治疗或预防与人bcl-2基因表达相关的肿瘤的药物。

                        序列表

<110>江苏省基因药物工程技术研究中心

<120>抑制人bcl-2基因表达的siRNA和表达质粒及其在制药中的应用

<160>12

<210>1

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>1

gcugucgcag aggggcuac                                    19

<210>2

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>2

cugggggagg auuguggcc                                    19

<210>3

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>3

ccgggagaug ucgccccug                                        19

<210>4

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>4

caucgcccug uggaugacu                                        19

<210>5

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>5

ccggcaccug cacaccugg                                    19

<210>6

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>6

cggaggcugg gaugccuuu                                    19

<210>7

<211>74

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：U6启动子PCR 3’端引物

<400>7

aatctgcaga aaaagcggac cgaagtccgc tctagatgca tgctcgaggt cgtccggtgt 60

ttcgtccttt ccac                                                   74

<210>8

<211>74

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：U6启动子PCR 5’端引物

<400>8

cgcggatcca aggtcgggca ggaagagggc                                   30

<210>9

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：发夹状双链RNA基因的N端

<400>9

cgacccccgg gagatgtcgc ccctgttcaa gagacagggg cgacatctcc cggttttttg  60

gaaat                                                              65

<210>10

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：发夹状双链RNA基因的C端

<400>10

tagatttcca aaaaaccggg agatgtcgcc cctgtctctt gaacaggggc gacatctccc 60

ggggg                                                             65

<210>11

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：双向作用的双链RNA基因的正义链引物

<400>11

ccggaattca aaaaacatcg ccctgtggat gactggtgtt tcgtcctttcc ac    52

<210>12

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：双向作用的双链RNA基因的反义链引物

<400>12

attgggcccaa aaaaagtcat ccacagggcg atgggtgttt cgtcctttcc ac    52

Claims (8)

1.一种特异性抑制人bcl-2基因表达的小双链RNA，其特征在于该小双链RNA是下列任意六种小双链RNA中的一种或几种，其碱基序列及作用部位如下：

A：5’GCU GUC GCA GAG GGG CUA C 3’

   3’CGA CAG CGU CUC CCC GAU G 5’

作用于人bcl-2mRNA的第97-115位；

B：5’CUG GGG GAG GAU UGU GGC C 3’

   3’GAC CCC CUC CUA ACA CCG G 5’

作用于人bcl-2mRNA的第459-478位；

C：5’CCG GGA GAU GUC GCC CCU G 3’

   3’GGC CCU CUA CAG CGG GGA C 5’

作用于bcl-2mRNA的第519-538位；

D：5’CAU CGC CCU GUG GAU GAC U 3’

   3’GUA GCG GGA CAC CUA CUG A 5’

作用于bcl-2mRNA的第547-565位；

E：5’CCG GCA CCU GCA CAC CUG G 3’

   3’GGC CGU GGA CGU GUG GAC C 5’

作用于人bcl-2mRNA的第577-595位；

F：5’CGG AGG CUG GGA UGC CUU U 3’

   3’GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’

作用于人bcl-2mRNA的第607-625位。

2.根据权利要求1中所述的小双链RNA，其特征是采用合成的方式形成3’端含有2-4个dT或含有2-6个U的延伸结构的小双链RNA。

3.一种可以产生特异性抑制人bcl-2基因表达的小双链RNA的质粒，其特征具有以下的基本结构：

由启动子、bcl-2编码区、终止密码、DNA序列顺序连接而成的环状双链DNA分子；

启动子为真核基因中可启动产生小双链RNA的序列，它是启动它的下游紧邻之基因的表达的元件；

bcl-2编码区为表达权利要求1所述的小双链RNA的编码区，由19-23个核苷酸组成，可采用双向结合形成或以发夹状结构在细胞内形成双链RNA；

终止密码为采用5-6个T作为终止小双链RNA合成的终止密码序列；

DNA序列为任何真核质粒载体和/或病毒的介于RNA编码区和启动子之间的DNA序列，含有质粒载体DNA的复制起始位点，或含有抗生素抗性基因，包括使细菌获得对抗某种抗生素的抗性的基因或使真核细胞获得某种抗生素的抗性的基因。

4、根据权利要求3所述的质粒，其特征是其启动子可以是人的RNA聚合酶III的启动子或人的H1启动子。

5、根据权利要求3所述的质粒，其特征是其DNA序列中所述任何真核质粒载体和/或病毒是pLuescript Sk、pcDNA3.0、pcDNA3.1、pRK5、pMALC-2、pLNCX、腺病毒、腺相关病毒或仙台病毒。

6、根据权利要求3所述的质粒，其特征是DNA序列中含有抗生素抗性基因是氨苄青霉素抗性基因amp、四环素抗性基因tet、卡那霉素抗性基因kan或抗生素G418抗性基因neo。

7.权利要求1或2所述的小双链RNA在制备抗肿瘤的药物中的应用。

8.权利要求3、4、5或6所述的质粒在制备抗肿瘤的药物中的应用。

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