CN1302331A - 樱花素合酶基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了下列DNA:a)含有序列6所示碱基序列的DNA,b)含有源于序列6所示序列的碱基序列的DNA,该序列是通过一个或几个碱基的缺失、取代或添加而产生的,并且在转入水稻细胞中后能够表达一种具有柚配基7－0－甲基转移酶活性的蛋白。一种水稻NOMT基因组DNA以及基本上具有所述DNA的功能的DNA(即,在转入水稻细胞之后表达具有NOMT活性的蛋白的功能)。由于多种植物具有可以作为NOMT底物的柚配基,转入这种DNA可以在植物中由柚配基产生樱花素,并因此赋予所述植物良好的抗细菌特征。

Description

樱花素合酶基因

发明领域

本发明涉及水稻产生的樱花素合酶(柚配基-7-O-甲基转移酶，下文称作“NOMT”)的基因组DNA，并涉及该基因组DNA的启动子区。

发明背景

植物具有对病原体入侵的诱导型抗性，如产生植物抗毒素。

植物抗毒素是一种低分子量抗病原体物质，它的产生和积累不仅仅是因为病原体的入侵，而且还由于化学和物理胁迫。

例如，对水稻(Oryza sativa)来说，樱花素(5,4’-二羟基-7-甲氧基黄烷酮)是水稻的一种主要植物抗毒素，它是根据病原体感染和诸如紫外线辐射，氯化铜处理和茉莉酸处理而产生并积累的。

樱花素是一种类黄酮，它一般被认为是一种植物抗毒素，起到保护植物免受诸如紫外线照射胁迫的作用。O-甲基转移酶是一种参与所述类黄酮生物合成的酶，业已从各种植物组织和培养细胞中分离并纯化了这种酶(Pakusch AE等，Arch.Biochem.Biophys.271:488-494(1989)；Wanek W等，植物197:427-434(1995))。

O-甲基转移酶也与樱花素的生物合成有关。樱花素是通过NOMT对位于柚配基(一种黄烷酮，5,7,4’-三羟基黄烷酮)的7号位置上的羟基进行甲基化而合成的。

由于柚配基存在于多种植物中，可以通过导入能够在植物中表达NOMT的DNA，在该植物中诱导樱花素的产生，因此，该植物可以获得明显的抗细菌特性。

不过，尚未分离和鉴定到导入植物中之后能够表达NOMT的DNA。

因此，有必要分离并鉴定在导入植物中之后能够表达NOMT的DNA。

发明概述

本发明的目的在于提供在导入植物中之后能够表达NOMT的DNA。

为了解决上述问题，我们业已进行了深入研究，并成功地鉴定了从水稻中分离并纯化的NOMT的N-末端区的氨基酸序列(序列4)和C-末端区序列(序列5)，所述水稻受到过胁迫，例如，紫外线辐射，茉莉酸处理或氯化铜处理。用水稻的总的基因组DNA作模板，并用根据上述NOMT的部分氨基酸序列设计的DNA引物F1、F2、Rl和R2进行PCR。用由引物F2和R2通过PCR成功扩增的片段作为探针，筛选水稻基因组的BAC(细菌人工染色体)文库。结果成功地分离并鉴定了水稻NOMT的基因组DNA(序列6)，因此完成了本发明。

具体地讲，本发明提供了下面的(ⅰ)至(ⅹⅱ)。

(ⅰ)(a)含有序列6的核苷酸序列的DNA；或(b)在序列6的核苷酸序列上缺失、取代或添加一个或几个核苷酸的DNA，该DNA在导入水稻或其他植物细胞中之后能够表达具有NOMT活性的蛋白。

(ⅱ)含有(ⅰ)的DNA的重组载体。

(ⅲ)用(ⅱ)的重组载体转化过的宿主细胞。

(ⅳ)通过分化导入了(ⅱ)的重组载体的植物细胞所获得的植物转化体。

(ⅴ)(a)含有序列12的核苷酸序列的DNA；或(b)在序列12的核苷酸序列上缺失、取代或添加一个或几个核苷酸的DNA，该DNA在导入水稻或其他植物细胞中之后能够表达具有NOMT活性的蛋白。

(ⅵ)含有(ⅴ)的DNA的重组载体。

(ⅶ)用(ⅵ)的重组载体转化过的宿主细胞。

(ⅶ)通过分化导入了(ⅵ)的重组载体的植物细胞所获得的植物转化体。

(ⅸ)(a)含有序列2的核苷酸序列的DNA；或(b)在序列2的核苷酸序列上缺失、取代或添加一个或几个核苷酸的DNA，该DNA具有启动子活性。

(ⅹ)含有(ⅸ)的DNA的重组载体。

(ⅹⅰ)用(ⅹ)的重组载体转化过的宿主细胞。

(ⅹⅱ)(a)一种含有序列3的氨基酸序列的蛋白；或(b)在序列3的核苷酸序列上缺失、取代或添加一个或几个氨基酸的蛋白，并具有NOMT活性。

本说明书包括在日本专利申请号11-57748中所披露的全部或部分内容，该专利是本申请的优先权文件。

附图简述

图1表示在实施例3中获得的水稻NOMT的基因组DNA(序列1)的内含子和外显子的位置；

图2表示引物F2和R2在实施例3中获得的水稻NOMT的基因组DNA(序列1)上的预期的结合位置；

图3表示在实施例4中获得的水稻NOMT的基因组DNA(序列6)的外显子的位置；

图4表示在实施例4中获得的水稻NOMT的基因组DNA(序列6)上的蛋白编码区；

图5表示根据所述基因组序列推测的氨基酸序列(序列3)与根据纯化蛋白的一级结构所获得的部分氨基酸序列(序列4和5)之间的比较；和

图6表示水稻NOMT的基因组DNA(序列6)的测序方法。

发明详述

下面将对本发明作更详细的说明。

本发明的第一方面是：

(a)含有序列6的核苷酸序列的DNA；或

(b)在序列6的核苷酸序列上缺失、取代或添加一个或几个核苷酸的DNA，该DNA在导入水稻或其他植物细胞中之后能够表达具有NOMT活性的蛋白。

例如，可以通过下面的步骤(1)-(3)获得含有序列6所示核苷酸序列的DNA：

(1)构建水稻基因组DNA文库

可以用常规方法制备水稻基因组的DNA文库。作为DNA文库，最方便的是使用水稻基因组的BAC(细菌人工染色体)文库。水稻基因组BAC文库的一个例子包括由病害生理学实验室(国家农业生物学资源研究所，日本农林省)保存的BAC文库，该文库包括至少7个水稻(Shimokita)基因组的等同物。由于水稻(Shimokita)基因组的BAC文库可以分成20,000个克隆，可以方便、有效地从其中找到感兴趣的克隆。

(2)筛选含有水稻NOMT基因组DNA的克隆

例如，通过按照膜杂交常规方法，用由能够与水稻NOMT的基因组DNA进行特异杂交的核苷酸序列制备的探针筛选水稻基因组BAC文库，可以筛选到含有水稻NOMT基因组DNA的克隆。用于上述方法的探针的核苷酸序列，可以根据水稻NOMT的氨基酸序列(序列3)确定，所述探针可以按照常规方法化学合成，或者用引物F1、F2、R1、和R2和水稻基因组作模板进行PCR扩增。

(3)水稻NOMT基因组DNA的分离/鉴定

在用某些合适的限制酶消化之后，对所筛选的BAC克隆的片段进行Southern印迹分析，用上述探针鉴定所述克隆中的水稻NOMT的基因组DNA片段。然后将所鉴定的片段再次克隆到合适的载体上。通过Maxam-Gilbert方法、Sanger方法或其改进方法，测定其核苷酸序列，以上方法是自动进行的。在这里，可以使用能够接纳一个大的***片段的二元载体pBIGRZ，以便稳定地保持具有一个启动子的大型片段，并可以直接转化植物。

可以通过在提交本申请时所采用的常规方法，例如，通过定点诱变(核酸研究10,6487-6500,1982)，获得在序列6的核苷酸序列上缺失、取代或添加一个或几个核苷酸，并且在导入水稻或其他植物细胞中之后能够表达具有NOMT活性的蛋白的DNA。具体地讲，将水稻NOMT的基因组DNA变性成单链形式。再将所述单链用来与被设计用于向该单链中引入突变的寡核苷酸退火，以便用聚合酶等制备双链。然后筛选导入了所述突变的链，以便获得感兴趣的DNA。

在序列6的核苷酸序列上缺失、取代或添加的核苷酸的数量或位置没有特别限制，只要该核苷酸在导入水稻或其他植物细胞中之后能够表达具有NOMT活性的蛋白即可。

序列1或6的核苷酸序列包括启动子区和NOMT编码区。启动子区相当于在下面的实施例3中所获得的序列1的核苷酸序列的1-1428号核苷酸区(序列2)，而NOMT编码区相当于序列1的核苷酸序列的1429-1859和3607-4279号核苷酸区(图1)。由所述NOMT编码区所编码的NOMT的氨基酸序列如序列3所示。

因此，在序列6的核苷酸序列上的“缺失、取代或添加”是指在所述启动子区或所述NOMT编码区上的缺失、取代或添加。

在所述启动子区上缺失、取代或添加的核苷酸的数量或位置没有特别限制，只要能保持该启动子区的启动子活性即可。

在所述NOMT编码区上缺失、取代或添加的核苷酸的数量或位置没有特别限制，只要编码区能编码一种具有NOMT活性的蛋白即可。具有NOMT活性的蛋白的例子包括具有序列3的氨基酸序列的蛋白，以及在序列3的氨基酸序列上缺失、取代或添加一个或几个氨基酸所得到的蛋白，该蛋白仍然具有NOMT活性。

由于本发明第一方面的DNA包括一个启动子区和编码一种具有NOMT活性的蛋白的区，通过将包括本发明第一方面的DNA的合适的载体导入合适的宿主细胞中，可以在该宿主细胞中有效表达具有NOMT活性的蛋白。

用于整合本发明第一方面的DNA的载体没有特别限制。例如，可以使用pUC18、pUC19、pBluescript、pBR322、pBI121、pBIGRZ或TAC等。

为了便于检测导入了所述载体的转化体，可以事先将合适的标记或报导基因***所述载体。所述标记基因的例子包括能赋予对抗生素的抗性的基因，所述抗生素如四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、新霉素、潮霉素、和壮观霉素。报导基因的例子包括编码β-葡糖醛酸苷酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶(LUX)、绿色荧光蛋白(GFP)等的基因。

用于导入所述载体的宿主细胞没有特别限制，只要该宿主细胞能兼容包括本发明第一方面的DNA的载体，并且能够用该载体转化即可。可以使用各种细胞，如常用的天然细胞以及人工制备的重组细胞。例如，可以使用植物细胞(例如，水稻、黄瓜、番茄、大麦、马铃薯、玉米)，动物细胞(例如，小鼠、大鼠、鸡)，昆虫细胞(例如，蚕)，霉菌(例如，曲霉属)、细菌(例如大肠杆菌、枯草杆菌)和酵母。所述载体可以用已知方法导入宿主细胞，如原生质体方法，锂方法，电穿孔，氯化钙方法或其改进方法。

在将包括本发明的第一方面的DNA的载体导入植物细胞之后，让该植物细胞进行分化，以便获得在每一个细胞中具有本发明第一方面的DNA的重组植物。

例如，所述基因是通过使用农杆菌属方法、电穿孔、聚乙二醇方法、显微注射、微粒子轰击方法导入植物细胞的，不过，方法并不局限于这些，任何方法都可以使用，只要该方法能够将基因导入目标植物细胞中。

宿主植物的种没有特别限制，只要它能与包括本发明第一方面的DNA的载体兼容，并且能够用该载体转化即可。例如，可以使用诸如黄瓜、番茄、大白菜、马铃薯、甘蓝、大豆和油菜的双子叶植物，以及诸如水稻、大麦、玉米和小麦的单子叶植物。

导入了包括本发明第一方面的DNA的载体的植物细胞可以用常规方法分化。例如，当所述基因是通过叶片技术导入植物细胞中时，将从无菌培养的植株上的无菌叶子上采集的叶片浸泡在含有根癌农杆菌EHA101的培养溶液中，然后在叶分化培养基中培养，以便形成并增殖愈伤组织。叶分化培养基可以通过向诸如MS培养基的已知培养基中添加植物激素(例如，2,4-D,NAA，细胞***素)而获得。通过使用用于筛选的叶分化培养基筛选愈伤组织。例如，所述筛选培养基可以通过向所述叶分化培养基中添加诸如卡那霉素或头孢氨噻等而获得的。还可以通过在根分化培养基中培养所述植物细胞进行进一步的分化。所述根分化培养基是通过向诸如MS培养基的已知培养基中添加卡那霉素或头孢氨噻等而制成的。然后，将长根的幼苗转移到土壤中，以便生长成植株。

可以通过将本发明第一方面的DNA导入宿主植物，表达具有NOMT活性的蛋白，这种蛋白可用于对柚配基的7号位置上的羟基进行甲基化，以便合成起着植物抗毒素作用的樱花素。换句话说，将本发明第一方面的DNA导入植物，可以诱导在植物中由柚配基产生樱花素，这样一来，所述植物就被视为获得了明显的抗真菌特性。

本发明第二方面是：

(a)含有序列12的核苷酸序列的DNA；或

(b)在序列12的核苷酸序列上缺失、取代或添加一个或几个核苷酸的DNA，该DNA在导入水稻或其他植物细胞中、酵母、真菌甚至是细菌中之后能够表达具有NOMT活性的蛋白。

序列12所示核苷酸序列是水稻NOMT的cDNA。例如，含有序列12所示核苷酸序列的DNA可以这样获得：首先使用诸如披露于植物分子生物学手册D5 1-13(ST Gelvin,RA Schilperoort著：1994)的寡聚dT乳胶珠或磁性珠，由受到过氯化铜、或紫外线辐射胁迫的水稻绿色叶片制备mRNA级份，然后用上述mRNA作模板，用寡聚dT作引物，用诸如披露于现代分子生物学方法；5.5节(John&Wiley)中的已知方法，并使用逆转录酶合成cDNA。可将寡聚DNA接头连接到所述mRNA的5’末端，以便能够提供用于制备双链DNA的引物，将该双链DNA克隆到合适载体上，以便克隆所述双链DNA。然后通过电穿孔将所述cDNA克隆转入感受态大肠杆菌中，并构建cDNA文库。可以对所述cDNA文库的菌落吸印膜进行杂交，以便检测NOMT克隆，所使用的探针是用F2和R2引物组，并用水稻基因组DNA作模板通过PCR扩增得到的。

在这种情况下，获得了两种长的cDNA克隆片段。它们在长的中央部分是重叠的，并且与分别缺少5’和3’末端区部分的其他克隆互补。

可以通过在提交本申请时所采用的常规技术，例如，通过定点诱变(核酸研究10,6487-6500,1982)，获得在序列12的核苷酸序列上缺失、取代或添加一个或几个核苷酸，并且在导入水稻或其他植物细胞中之后能够表达具有NOMT活性的蛋白的DNA。具体地讲，将水稻NOMT的基因组DNA变性成单链形式，再将所述单链用来与被设计用于向该单链中引入突变的寡核苷酸退火，以便用聚合酶等制备双链。然后筛选导入了所述突变的链，以便获得感兴趣的DNA。

在序列12的核苷酸序列上缺失、取代或添加的核苷酸的数量和位置没有特别限制，只要该核苷酸在导入水稻或其他植物细胞中之后能够表达具有NOMT活性的蛋白即可。

在NOMT-编码区上缺失、取代或添加的核苷酸的数量和位置没有具体限制，只要该编码区能编码具有NOMT活性的蛋白即可。具有NOMT活性的蛋白的例子包括具有序列3的氨基酸序列的蛋白，以及在序列3的氨基酸序列上缺失、取代或添加了一个或几个氨基酸，并且仍然具有NOMT活性的蛋白。

由于本发明第二方面的DNA包括编码具有NOMT活性的蛋白的区，可以通过将包括本发明第二方面的DNA的合适的载体导入合适的宿主细胞，在该宿主细胞中有效表达具有NOMT活性的蛋白。在这种情况下，可以适当使用有助于有效表达的诸如启动子或增强子的调控序列。本领域技术人员很方便选择和使用所述调控序列。

用于整合本发明第二方面的DNA的载体没有特别限制。例如，可以使用pUC18、pUC19、pBluescript、pBR322、pBI121、pBIGRZ、TAC、pET156等。

为了便于检测导入了所述载体的转化体，可以事先将合适的标记或报导基因***所述载体。所述标记基因的例子包括能赋予对抗生素的抗性的基因，所述抗生素如四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、新霉素、潮霉素、和壮观霉素。报导基因的例子包括编码β-葡糖醛酸苷酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶(LUX)、绿色荧光蛋白(GFP)等的基因。

用于导入所述载体的宿主细胞没有特别限制，只要该宿主细胞能兼容包括本发明第二方面的DNA的载体，并且能够用该载体转化即可。可以使用各种细胞，如常用的天然细胞以及人工制备的重组细胞。例如，可以使用植物细胞(例如，水稻、黄瓜、番茄、大麦、马铃薯、玉米)，动物细胞(例如，小鼠、大鼠、鸡)，昆虫细胞(例如，蚕)，霉菌(例如，曲霉属)、细菌(例如大肠杆菌、枯草杆菌)和酵母。所述载体可以用已知方法导入宿主细胞，如原生质体方法，锂方法，电穿孔，氯化钙方法或其改进方法。

在将包括本发明的第二方面的DNA的载体导入植物细胞之后，让该植物细胞进行分化，以便获得在每一个细胞中具有本发明第二方面的DNA的重组植物。

例如，所述基因是通过使用农杆菌属的方法、电穿孔、聚乙二醇方法、显微注射、微粒子轰击方法导入植物细胞的，不过，方法并不局限于这些，任何方法都可以使用，只要该方法能够将基因导入目标植物细胞中。

宿主植物的种没有特别限制，只要它能与包括本发明第二方面的DNA的载体兼容，并且能够用该载体转化即可。例如，可以使用诸如黄瓜、番茄、大白菜、马铃薯、甘蓝、大豆和油菜的双子叶植物，以及诸如水稻、大麦、玉米和小麦的单子叶植物。

导入了包括本发明第二方面的DNA的载体的植物细胞可以用常规方法分化。例如，当所述基因是通过叶片技术导入植物细胞中时，将从无菌培养的植株上的无菌叶子上采集的叶片浸泡在含有根癌农杆菌EHA101的培养溶液中，然后在叶分化培养基中培养，以便形成并增殖愈伤组织。叶分化培养基可以通过向诸如MS0培养基的已知培养基中添加植物激素(例如，2,4-D,NAA细胞***素)而获得。通过使用用于筛选的叶分化培养基筛选愈伤组织。例如，所述筛选培养基可以通过向所述叶分化培养基中添加诸如卡那霉素或头孢氨噻等而获得的。还可以通过在根分化培养基中培养所述植物细胞进行进一步的分化。所述根分化培养基是通过向诸如MS培养基的已知培养基中添加卡那霉素或头孢氨噻等而制成的。然后，将长根的幼苗转移到土壤中，以便生长成植株。

可以通过将本发明第二方面的DNA导入宿主植物，表达具有NOMT活性的蛋白，这种蛋白可用于对柚配基的7号位置上的羟基进行甲基化，以便合成起着植物抗毒素作用的樱花素。换句话说，将本发明第二方面的DNA导入植物，可以诱导在植物中由柚配基产生樱花素，这样一来，所述植物就被视为获得了明显的抗真菌特性。

本发明第三方面是：

(a)含有序列2的核苷酸序列的DNA；或

(b)在序列2的核苷酸序列上缺失、取代或添加一个或几个核苷酸的DNA，该DNA具有启动子活性。

可以通过从水稻NOMT的基因组DNA的核苷酸序列(序列1)测定并分离启动子区，获得包括序列2的核苷酸序列的DNA。

水稻NOMT的基因组DNA的启动子区可以按照常规方法测定，例如，通过比较从cDNA文库获得的基因的核苷酸序列和从基因组DNA文库获得的核苷酸序列进行测定。

所述启动子区可以用合适的限制酶分离。例如，特别是可以通过用诸如HindⅢ和EcoRⅠ和SauⅢAⅠ的限制酶部分消化水稻NOMT的基因组DNA，以便分离含有所述启动子区的DNA片段。

包括序列2的核苷酸序列的DNA可以通过用水稻基因组DNA作模板，并且用互补于序列2的核苷酸序列的5’末端的核苷酸序列和互补于序列2的核苷酸序列的3’区的核苷酸序列作启动子，通过PCR获得的。

可以通过在提交本申请时的常规技术，如定点诱变(核酸研究10,6487-6500,1982)获得在序列2的核苷酸序列上缺失、取代或添加一个或几个核苷酸并具有启动子活性的DNA。

在序列2的核苷酸序列上缺失、取代或添加的核苷酸的数量和位置没有特别限制，只要能保留该DNA的启动子活性即可。

由于本发明第三方面的DNA具有启动子活性，可以通过将含有本发明第三方面的DNA以及连接在该DNA下游的感兴趣的基因的载体导入宿主细胞中，表达感兴趣的基因。

在这里，感兴趣的基因是指编码要表达的基因产物的基因(例如，蛋白，rRNA或反义RNA)。

可以连接在本发明DNA下游的感兴趣的基因没有特别限制，并且可以是任何基因，如壳多糖酶基因、β-1,3葡聚糖酶基因和PAL(苯丙氨酸脱氨酶)基因。

用于整合本发明第三方面的DNA的载体没有特别限制。例如，可以使用pUC18、pUC19、pBluescript、pBR322、pBI121、pBIGRZ和TAC。

为了便于检测导入了所述载体的转化体，可以将合适的标记或报导基因***本发明第三方面的DNA下游或上游。所述标记基因的例子包括能赋予对抗生素的抗性的基因，所述抗生素如四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、新霉素、潮霉素、和壮观霉素。所述报导基因的例子包括编码β-葡糖醛酸苷酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶(LUX)等的基因。

用于导入所述载体的宿主细胞没有特别限制，只要该宿主细胞与包括本发明第三方面的DNA的载体兼容，并且能够用该载体转化即可。可以使用各种细胞，如常用的天然细胞或人工制备的重组细胞。例如，可以使用植物细胞(例如，水稻、黄瓜、马铃薯、烟草)，动物细胞(例如，小鼠、大鼠、鸡)，昆虫细胞(例如，蚕)，细菌(例如大肠杆菌、枯草杆菌)和酵母。所述载体可以用已知方法导入宿主细胞，如原生质体方法，锂方法，电穿孔，氯化钙方法或其改进方法。

本发明第四方面是：

(a)含有序列3的氨基酸序列的蛋白；或

(b)在序列3的核苷酸序列上缺失、取代或添加一个或几个氨基酸、并且具有NOMT活性的蛋白。

序列3所示氨基酸序列相当于水稻NOMT蛋白的氨基酸序列。例如，含有序列3所示氨基酸序列的蛋白，可以通过在大肠杆菌中超量表达所述cDNA(序列12)而获得。所述大肠杆菌用包括所述cDNA和用于表达该cDNA的合适的启动子的载体例如pET15b(Novcgen,Madison,WI)转化过。正如XZ He等所披露的(植物分子生物学36:43-54,1998)，在大肠杆菌中表达的所述蛋白具有NOMT的酶活性。

可以通过在提交本申请时所常用的技术，例如，通过利用在介绍基因修饰时所披露的定点诱变对所述cDNA结构进行修饰，获得在序列3的氨基酸序列上缺失、取代或添加一个或几个氨基酸并且具有NOMT活性的蛋白。

在序列3的氨基酸序列上缺失、取代或添加的氨基酸的数量和位置没有特别限制，只要能表达一种具有NOMT活性的蛋白即可。

实施例

实施例1：构建水稻基因组的BAC(细菌人工染色体)文库

源于日本水稻品种Shimokita的基因组DNA文库，是按照《分子普通遗传学》(1997)254卷，611-620页上所披露的方法用BAC(细菌人工染色体)载体构建的。所构建的水稻基因组的BAC文库的平均***片段大小大约为155kbp，相当于大约7个等同的基因组。一张微型平板大小的膜上包括3072个克隆(相当于大约1个水稻的基因组等同物)。由于所述克隆被分类并保存在该水稻基因组的BAC文库中，只需要用一种合适的探针对一系列的膜进行菌落杂交，筛选感兴趣的阳性克隆。

实施例2：测定水稻NOMT的氨基酸序列

按照Kodama等的方法(植物化学，3l:3807-3809(1992))栽培水稻(Hitomebore)，然后进行紫外线辐射。在存在4毫升0.2MTris-HCl缓冲液(pH7.8)(含有14mM巯基乙醇，5mM EDTA,10％(w/v)甘油和10％(w/w)聚乙烯吡咯烷酮)和0.05克海沙的研钵中将所述紫外线辐射过的水稻(1克)粉碎。

在18,500×g下将含有所述粉碎的水稻的溶液离心5分钟。通过50微米的尼龙膜对上清液进行过滤，并将滤液加样到用含有缓冲液B(10％甘油，1mM EDTA-2Na和14mM巯基乙醇的0.02M Tris-HCl(pH7.8))平衡过的腺苷-琼脂糖柱(0.7×15cm)上。

所述用缓冲液B平衡的腺苷-琼脂糖柱是按如下方法制备的。用蒸馏水洗涤5毫升5’-AMP-琼脂糖(Sigma)，用溶解在1毫升牛小肠碱性磷酸酶缓冲液(500mM Tris-HCl(pH9.0))中的800单位的牛小肠碱性磷酸酶温育(总量为10毫升)，以便对所述凝胶进行脱磷酸化。温育是这样进行的：将所述凝胶放入一个小瓶中，然后在37℃下连续转动24小时。将所得到的凝胶包装到一个柱中，用蒸馏水洗涤，然后用含有2M氯化钠的10毫升缓冲液B洗涤，最终用100毫升缓冲液B平衡，从而制备成用缓冲液B平衡的腺苷-琼脂糖柱。

用50毫升缓冲液B以18毫升/小时的流速洗涤所述柱，然后用含有0.2M氯化钾的50毫升缓冲液B洗涤。NOMT被含有4mM S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)和0.2M氯化钾的25毫升缓冲液B选择性地洗脱。洗脱的级份分别以1.75毫升的样品收集。

按以下方法测定每一个级份的NOMT活性。

将40微升每一种级份、375微摩尔柚配基、含有5mM DTT和1mMEDTA的0.1M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.5)与92.5Bq/μl S-[¹⁴C]腺苷甲硫氨酸混合(体积为160微升)，并在27℃下反应20分钟。在所述反应结束之后，将25μl的6N盐酸和1毫升的含有0.4％PPO的甲苯闪烁溶液依次加入该反应混合物中并充分搅拌。然后，用一台液体闪烁记数器测定所产生的樱花素的放射性，以便测定NOMT活性。

将具有NOMT活性的级份加样到用缓冲液B平衡过的Superdex 75凝胶过滤Chromato柱(3×30cm)(Pharmacia Biotech)上，用相同的缓冲液作洗脱剂以18毫升/小时的流速洗脱NOMT。收集3.5毫升的级份，并按上述方法测定每一个级份中的NOMT活性，以便获得纯化的NOMT。

用Centricon-30(Amicon，Beverly，美国)对所获得的纯化的NOMT进行浓缩，脱盐(2×500微升milliQ纯化水)，并用旋转干燥浓缩器干燥。将干燥的NOMT(大约10微克)溶解在200微升含有1％溴化氰的70％甲酸中，在暗处培养20小时，并按上述方法干燥。对干燥制品进行TRICINE SDS-PAGE(16.5％T，3％C凝胶)(Schagger H等，分析生物化学166:368-379(1987))，并吸印到PVDF膜(Fluorotrans，Pall，东京，日本)上。将染色的肽从所述膜上切除，安装到直接测序装置上，以便用AB494蛋白测序仪测定其氨基酸序列。

因此，测定了NOMT的N-末端氨基酸序列(序列4)和C-末端氨基酸序列(序列5)。

实施例3：筛选含有水稻NOMT基因组DNA的克隆

根据在实施例2中测定的NOMT的部分氨基酸序列(序列4和5)设计DNA引物。具体地讲，从纯化的NOMT的N-和C-末端氨基酸序列的每一个中筛选具有较少遗传密码丰度的两个部分。根据所筛选的部分设计有义引物F1和F2，反义引物R1和R2。引物F1、F2、R1和R2的核苷酸序列(在附图中标出了这些引物的位置)如下：引物  F1: atgaa(c/t)ca(a/g)ga(c/t)aa(a/g)gtictiatgga(a/g)ag引物  F2: tt(g/c)aa(c/t)aa(a/g)gcita(c/t)ggiatgacigcitt引物  R1: tcict(a/g)ca(a/g)tc(a/g)tgiagiat(a/g)ca(c/t)ttcat引物  R2: agcatiatcat(a/g)tciac(a/g)tg(a/g)aaiac(a/g)cc

在上述核苷酸序列中，“i”表示肌苷；而“(g/c)”，“(c/t)”和“(a/g)”分别表示鸟嘌呤或胞嘧啶，或者胞嘧啶或胸腺嘧啶，以及腺嘌呤或鸟嘌呤。对于寡核苷酸合成来说，对所述简并核苷酸的位置进行混合。

用水稻基因组的总DNA作模板，并使用上述方法设计的DNA引物进行PCR。

PCR反应溶液的组成如下：

Takara Ex Taq(50U/μl)    0.125 μl(0.625U)

10×缓冲液      2.5μl

2.5mM  dNTP     2μl

引物(20微摩尔)  2.5μl

模板            125ng

水              总计25μl

PCR是这样进行的：一个轮次的加热变性(94℃,3分钟)；29轮次的加热变性(94℃,1分钟)，退火(65℃,2分钟)和延伸(72℃,2分钟)；以及1个轮次的延伸(72℃,5分钟)，并在4℃下保存。

获得了其长度为预期的由引物F2和R2通过PCR扩增的产物的单一条带。图2表示引物F2和R2在水稻NOMT基因组DNA(序列1)上的结合位置。

通过PCR扩增的片段进行测序，以便证实它与NOMT的氨基酸序列一致。然后，用ECL(Amersham)对扩增片段进行标记，以便用作ECL探针对在实施例1中构建的水稻基因组的BAC文库进行菌落杂交。结果，获得了6个阳性克隆。在用HindⅢ进行Southern印迹分析之后，发现3个克隆(25-4c,7-4D,58-1A)是真实的。

对所述克隆进行培养，并用限制酶HindⅢ消化所获得的BAC质粒，然后进行Southern杂交。结果，在4个克隆中检测到具有强的信号的大约15kbp的阳性条带。切除该阳性条带，并***能接纳大的***片段的二元载体pBIGRZ。由于载体pBIGRZ具有低的拷贝数，它能够在大肠杆菌以及在农杆菌属中稳定地保持10kbp或更大的***片段。通过农杆菌属方法将所述***的部分直接导入包括水稻在内的各种植物中。可以用合适的引物从所述***片段上的任何位置开始进行直接测序。

用从PCR-衍生的条带的序列合成的引物，从所述载体的克隆位置的两个末端开始对所获得的克隆进行测序。然后，根据由此所获得的数据，合成新的引物，以便进一步延伸该序列，从而补平其缺口。从BAC克隆(25-4c)的SpeⅠ片段获得具有相当于NOMT的氨基酸序列的核苷酸序列的大约8kbp的DNA片段，并***pBIGRZ载体上。根据引物延伸方法测定该片段序列。结果，测定了主要沿一个方向的从5’末端到4371号核苷酸的序列，它含有完整长度的NOMT编码区(包括一个开放读框和一个内含子)，以及一个大约1.4kbp的启动子区。所得到的水稻NOMT的基因组DNA的核苷酸序列如序列1所示。1429-1859和3607-4282号核苷酸区预计是外显子，而1860-3606号核苷酸区预计是内含子(图1)。从水稻NOMT的基因组DNA的核苷酸序列推测的水稻NOMT的氨基酸序列如序列3所示。

比较上面所获得的从所述预计的水稻NOMT的基因组DNA的核苷酸序列(序列1)推测的NOMT氨基酸序列(序列3)和在实施例2中用从紫外线处理过的水稻上分离并纯化的NOMT测定的部分氨基酸序列(序列4和5)。结果，它们彼此之间大部分是一致的，但有局部差别。这种差别被视为是由于在蛋白测序中的实验误差所造成的，所述误差是由诸如色氨酸(W)、半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)的氨基酸的困难特征，其衍生物的接近的峰，以及在实施例2中分离并纯化的NOMT的微小的数量所产生的。图1表示在实施例2中分离并纯化的NOMT的氨基酸序列与水稻NOMT的基因组DNA的核苷酸序列之间的关系，表明所分离的DNA毫无疑问的是水稻NOMT的基因组DNA。在图1中，粗线条表示在实施例2中分离并纯化的NOMT的氨基酸序列。

实施例4：测定水稻NOMT的基因组DNA序列

用能识别4个碱基的SauⅢaⅠ部分消化上述***片段，以便获得所述序列的反方向，该序列在上述序列引物延伸方法中未能获得。将0.5-2kb的片段克隆到质粒pBSK上。通过用T3和T7引物在所述***片段的载体旁侧末端进行随机测序可以读出较大产物的区(图6)。由于保留了多个缺口，设计了新的引物，以便阅读其序列。结果，沿两个方向阅读的残基读数为5026，沿两个方向和/或沿一个方向阅读的残基总数为5241，含有3’末端序列(序列6)。尽管它在12个位置上与在上述实施例3中所获得的序列(序列1)不同，但在由这两种序列推测的蛋白的氨基酸序列之间没有差别。

如图5所示，在通过分析所述酶蛋白的一级结构所确定的氨基酸序列(即N-末端(序列4)和C-末端(序列5))与由所述基因推测的序列(序列3)之间具有某些差别。不过，上述差别大多是由难于检测W(色氨酸)、C(半胱氨酸)、M(甲硫氨酸)等的峰所造成的。除此之外，有9个残基不同，不过I/V，A/E和Y/F也倾向于有错误。因此，在所测定的261个氨基酸中仅有6个氨基酸与NOMT的DNA测序结果不符。由于用于蛋白测序的材料相当少，所述其余的误差可能是由于蛋白测序的难度造成的。因此，所获得的基因被视为是樱花素合酶基因。

实施例5：测定水稻NOMT基因组的cDNA序列

发现在所得到的水稻NOMT的基因组DNA的核苷酸序列(序列6)上的1430-1860和3605-4277号核苷酸区是外显子。cDNA的核苷酸序列(序列12)是按如下方法测定的。

用洗涤剂从水稻(Nipponbare)绿色叶片中提取RNA，并通过用苯酚提取除去蛋白，然后通过添加1体积的5M氯化锂沉淀，并用70％的乙醇漂洗。按照手册中所披露的方法，用乳胶的寡聚dT珠(Roche)分离重新溶解的RNA。以上述mRNA作模板，以寡聚dT作引物，用逆转录酶合成cDNA。用T4 RNA连接酶将单链(ss)cDNA连接到单链DNA接头上，并用寡聚dT和所述接头或引物进行PCR扩增。然后以平端形式将所述cDNA连接到λZAP上，并转入感受态大肠杆菌，构建cDNA文库。可以对所述cDNA文库的菌落吸印膜进行杂交以便检测NOMT克隆，使用F2和R2引物组和水稻基因组DNA作模板进行PCR扩增的探针。在对阳性噬斑进行一系列纯化之后，通过由旁侧载体引物延长序列，测定纯化克隆的***片段的序列。

在这种情况下，获得了cDNA克隆的2个长的序列cDNA #5-37和cDNA #7。它们在长的中央部分(1597-4210；参见序列6)是重叠的，并分别与缺少5’和3’末端区部分的其他克隆互补。

本发明提供了水稻NOMT的基因组DNA以及基本上具有其功能(即在导入水稻细胞之后能表达具有NOMT活性的蛋白的功能)的DNA。由于柚配基存在于各种植物中，可以通过将本发明的DNA导入植物中而在该植物中诱导由柚配基产生樱花素。结果，所述植物可获得显著的抗真菌特性。

本发明还提供了具有启动子活性的DNA。由于本发明的DNA具有启动子活性，其可用作将外源基因导入宿主细胞的启动子。

本文所引用的所有文献和专利申请被全文收作本文的参考文献。

                               序列表<110> 日本科学技术公司<120> 樱花素合酶基因<130> PH-752-PCT<160> 12<210> 1<211> 4371<212> DNA<213> 水稻(Oryza sativa)<400> 1actagttagt taagccatcg ttattcatat accacaccgc tggttttgtt gggggagaaa 60caaccaaaat taaatttagt gaagataggt aggaatatga cagcacataa cgttcacttt 120gaactcaagc atggacataa ttagttggag aagaaaatga tggtgcccac ttacctagct 180agctatacag gatatttcaa caaattaaag ggttagcaat tttctgtcaa gtacactttt 240gttccaaaag ggacagtaat cgtcagttaa ccagtttaac tctcacccat atatgatcaa 300tcatgttgaa tattttaggc agacataaaa taggagaaat gtcaatttat ccggcttaat 360taattgctaa attacaatta agttctatgt ggaccatata tatggtttcg tagaaaacaa 420ttcatgtcca taatataatg aagaatatta gtatcagatt ttaatatcta tcaagttacc 480catcacagca gtacagtaac tcctaattaa tgttcttgct tcatcacact catatatata 540cttcctccgt ttcacaacgt aagttattct agcattttcc atatttatat taatgctaat 600gaatctagac atatatatct atttaaattt attagcatca atatgaatgt ggaaaatgct 660agaatgactt acattgtgaa acggatggag taccactcaa attacagggc tccaagctac 720ttaattagtg agcaactaat tggtctactc gatctctcca tcttttggcc accaactcca 780cacactccaa aataaagctt tcactttcat cccagcacaa tatgcatgca acggaatagt 840tgtcgagttt gaccgttaac actaaaaaca aaccccatgc acgacttaac atacctaatc 900gttgaaaata attagccgta aatattacat atatatatat acatcagatg atgaattgta 960gtaattaaat taattaaacc tactaaaccc atacaacgtc gtcacgacta ctcctgatgg 1020tacatctaag ctactccatt tcccatcgga cgaatacaac cacgcaccag acaaagtacg 1080caaacacaaa attatcaatg ataatcatga tgatggagca tcatatctac tactagcaca 1140tacactatct ttcttccttc cttctcctaa ttaattcccc taaaaaattg aaggtgaaga 1200gaagaagaag gaaaagaaag caaaacaaat taattaaaga aaagaaaaga aaagaaaaag 1260gtgagttggt ggtgtcatat atagtgtgtg gtggttggtg aaggcttgag ctcccatata 1320aaccccctcc tccctctcca ttgccttcac ctcactcgcc gccggtgatc agctcctcct 1380ccttcttctc catcgccggc gagagagaga gagagttagc tagctaggat gggttctaca 1440gccgccgaca tggccgcggc ggccgacgag gaggcgtgca tgtacgcgct gcagctggcg 1500tcgtcgtcga tcctgccgat gacgctcaag aacgccatcg agctgggcct gctcgagacg 1560ctgcagtccg ccgccgtcgc cggaggaggg gggaaggcgg cgctgctgac gccggcggag 1620gtggccgaca agctgccgtc caaggcgaac ccggcggcgg ccgacatggt ggaccgcatg 1680ctccgcctgc tcgcctccta caacgtcgtc aggtgcgaga tggaggaggg cgccgacggc 1740aagctctccc gccgatacgc cgccgcgccg gtgtgcaagt ggctgacgcc caacgaggac 1800ggcgtctcca tggccgccct cgccctcatg aaccaggaca aggtcctcat ggagagctgg 1860tcagttcatt ttgtctcctc ctctctcgct gacatgtggg cccaccccta cataaacctt 1920cacaaataaa acccactatg ccaacttcca ttttcaaaag gagttaggtg caacaagcat 1980atcaaacctt gaatttcatt gtttttttta gtttcctttt agaaccttga gacaacatgt 2040tttttagatg ataggataaa ggaatatccc cggcctctga atcatatgat gcacgtaatc 2100gattttctaa agaaactaat tccatgaaga aaaatcgttc ttacacgtat aaatagcacc 2160ggcaggcacg taatcgattt tcaatacata tgctagaaaa gaaattaatt ctctgacgaa 2220aatttgttct tacgtacgca tagcaccgac tgatagccgc atacggcata attatgtgca 2280cttagaaaag ggtgttggtg accctcctct agtagtgggg ggtgatgcta gcaagcacta 2340aacttggtca ccaaactagc tgaggaatat gaaaagaggg gggaaaaggt tgagctcatc 2400ttccttctag agaagcaacc acagccgtcg atcgccgaat cgacggcgaa tagagatccc 2460ttcccaatca tcctaacatg tcatgctcaa aatgcatgat ggagaaatct tggctgatct 2520gatcagctgg cttggttgtc acaaactgat tctccaccta cctgtagaaa attcggtagt 2580gttgtgtata tatagccagt ttgtttgatg tggacagagt actagaaatc aaataagctt 2640gtgtgacttt tcctgcatgc ctttgattat tcttctaaga ttttggggtt cagaaattca 2700ggtagaaagt agaaaaaaga gtacagtagt tattattcag aacatcctgt gcaaagccca 2760agcaagctgt acccttttag tggcaagatt gcaatggcat gtaggttggt tagtaggtag 2820tgcgtctaga caaagacaca tcagtagcaa cagcagcagc tggaggagga acatccatca 2880atttcctacc aaaacaatcc actcacagcc tcacaggcat tcaatggatg cgtggtgtca 2940attataggat ttgaaccccg ttgaacagcc gacttctttc tcattttctc atgacctcat 3000agttatcccg ctgaatcttt atatgcttat atcttacaga atatggattg tactccaaaa 3060tcgttttcac aactttttac aaatttatcg gaccgcctac aacattatta ctctagaaat 3120tattggttaa agttgcatta tgaagaccgt tcaactccaa gaattattat ttttgcgcat 3180aaaaagatat tttattttag gaaaaataag gccccatttt ttaagttgaa attgatggaa 3240tttttctata tctatttcag gtataaacaa atgaagtgta actataacaa agttgaaaaa 3300acatattttc gaaaatatat aatttttttt acaaaacata ccattagaac attggtaagc 3360atgcaaataa aaatccataa tctagaatga gaaaagtaca tggacaataa aaatgaagaa 3420gttgcatatg cctgaatatg gctgtgttta gttcacgcta aaattaaaag tttggttgaa 3480attagaatga tgtgatggaa aagttggaag tttgtgtgta tagaaaaagt tttgatgtga 3540tggaaaagtt ggaagtttga agaaaaagtt tgaaagtaaa ctcgatctat atctatatcg 3600atgcaggtac taccttaagg acgcagtcct ggacggcggc atcccgttca acaaggcgta 3660cgggatgacg gcgttcgagt accacggcac ggacgcccgc ttcaaccgcg tcttcaacga 3720gggcatgaag aaccactccg tcatcatcac caagaagctg ctcgacctct acaccggctt 3780cgacgccgcc tccaccgtcg tcgacgtcgg cggcggcgtg ggcgccactg tggccgccgt 3840cgtctcccgc cacccgcaca tccgggggat caactacgac ctcccccacg tcatctccga 3900ggcgccgccg ttccccgggg tggagcacgt cggcggcgac atgttcgcct ccgtgccccg 3960cggcggcgac gccatcctga tgaagtggat cctccacgac tggagcgacg agcactgcgc 4020gcggctgctc aagaactgct acgacgcgct gccggagcac gggaaggtgg tggtggtgga 4080gtgcgtgctg ccggagagct ccgacgcgac ggcgagggag cagggggtgt tccacgtcga 4140catgatcatg ctcgcccaca accccggcgg caaggagagg tacgagaggg agttcaggga 4200gctcgcccgc gccgccggat tcaccggctt caaggccacc tacatctacg ccaacgcctg 4260ggccatcgag ttcaccaagt aggtgattgg tgatcgatcg ccattgttga gctcgatcaa 4320ggtgttcgac catcgtcttc ttcttctcgt acttcttgtt cttcatccaa a          4371<210> 2<211> 1428<212> DNA<213> 水稻<400> 2actagttagt taagccatcg ttattcatat accacaccgc tggttttgtt gggggagaaa 60caaccaaaat taaatttagt gaagataggt aggaatatga cagcacataa cgttcacttt 120gaactcaagc atggacataa ttagttggag aagaaaatga tggtgcccac ttacctagct 180agctatacag gatatttcaa caaattaaag ggttagcaat tttctgtcaa gtacactttt 240gttccaaaag ggacagtaat cgtcagttaa ccagtttaac tctcacccat atatgatcaa 300tcatgttgaa tattttaggc agacataaaa taggagaaat gtcaatttat ccggcttaat 360taattgctaa attacaatta agttctatgt ggaccatata tatggtttcg tagaaaacaa 420ttcatgtcca taatataatg aagaatatta gtatcagatt ttaatatcta tcaagttacc 480catcacagca gtacagtaac tcctaattaa tgttcttgct tcatcacact catatatata 540cttcctccgt ttcacaacgt aagttattct agcattttcc atatttatat taatgctaat 600gaatctagac atatatatct atttaaattt attagcatca atatgaatgt ggaaaatgct 660agaatgactt acattgtgaa acggatggag taccactcaa attacagggc tccaagctac 720ttaattagtg agcaactaat tggtctactc gatctctcca tcttttggcc accaactcca 780cacactccaa aataaagctt tcactttcat cccagcacaa tatgcatgca acggaatagt 840tgtcgagttt gaccgttaac actaaaaaca aaccccatgc acgacttaac atacctaatc 900gttgaaaata attagccgta aatattacat atatatatat acatcagatg atgaattgta 960gtaattaaat taattaaacc tactaaaccc atacaacgtc gtcacgacta ctcctgatgg 1020tacatctaag ctactccatt tcccatcgga cgaatacaac cacgcaccag acaaagtacg 1080caaacacaaa attatcaatg ataatcatga tgatggagca tcatatctac tactagcaca 1140tacactatct ttcttccttc cttctcctaa ttaattcccc taaaaaattg aaggtgaaga 1200gaagaagaag gaaaagaaag caaaacaaat taattaaaga aaagaaaaga aaagaaaaag 1260gtgagttggt ggtgtcatat atagtgtgtg gtggttggtg aaggcttgag ctcccatata 1320aaccccctcc tccctctcca ttgccttcac ctcactcgcc gccggtgatc agctcctcct 1380ccttcttctc catcgccggc gagagagaga gagagttagc tagctagg              1428<210> 3<211> 368<212> PRT<213> 水稻<400> 3Met Gly Ser Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Ala Ala Asp Glu Glu Ala1               5                  10                  15Cys Met Tyr Ala Leu Gln Leu Ala Ser Ser Ser Ile Leu Pro Met Thr

         20                  25                  30Leu Lys Asn Ala Ile Glu Leu Gly Leu Leu Glu Thr Leu Gln Ser Ala

     35                  40                  45Ala Val Ala Gly Gly Gly Gly Lys Ala Ala Leu Leu Thr Pro Ala Glu

 50                  55                  60Val Ala Asp Lys Leu Pro Ser Lys Ala Asn Pro Ala Ala Ala Asp Met65                  70                  75                  80Val Asp Arg Met Leu Arg Leu Leu Ala Ser Tyr Asn Val Val Arg Cys

             85                  90                  95Glu Met Glu Glu Gly Ala Asp Gly Lys Leu Ser Arg Arg Tyr Ala Ala

        100                 105                 110Ala Pro Val Cys Lys Trp Leu Thr Pro Asn Glu Asp Gly Val Ser Met

    115                 120                 125Ala Ala Leu Ala Leu Met Asn Gln Asp Lys Val Leu Met Glu Ser Trp

130                 135                 140Tyr Tyr Leu Lys Asp Ala Val Leu Asp Gly Gly lle Pro Phe Asn Lys145                 150                 155                 160Ala Tyr Gly Met Thr Ala Phe Glu Tyr His Gly Thr Asp Ala Arg Phe

            165                 170                 175Asn Arg Val Phe Asn Glu Gly Met Lys Asn His Ser Val Ile Ile Thr

        180                 185                 190Lys Lys Leu Leu Asp Leu Tyr Thr Gly Phe Asp Ala Ala Ser Thr Val

    195                 200                 205Val Asp Val Gly Gly Gly Val Gly Ala Thr Val Ala Ala Val Val Ser

210                 215                 220Arg His Pro His Ile Arg Gly Ile Asn Tyr Asp Leu Pro His Val Ile225                 230                 235                 240Ser Glu Ala Pro Pro Phe Pro Gly Val Glu His Val Gly Gly Asp Met

            245                 250                 255Phe Ala Ser Val Pro Arg Gly Gly Asp Ala Ile Leu Met Lys Trp Ile

        260                 265                 270Leu His Asp Trp Ser Asp Glu His Cys Ala Arg Leu Leu Lys Asn Cys

    275                 280                 285Tyr Asp Ala Leu Pro Glu His Gly Lys Val Val Val Val Glu Cys Val

290                 295                 300Leu Pro Glu Ser Ser Asp Ala Thr Ala Arg Glu Gln Gly Val Phe His305                 310                 315                 320Val Asp Met Ile Met Leu Ala His Asn Pro Gly Gly Lys Glu Arg Tyr

            325                 330                 335Glu Arg Glu Phe Arg Glu Leu Ala Arg Ala Ala Gly Phe Thr Gly Phe

        340                 345                 350Lys Ala Thr Tyr Ile Tyr Ala Asn Ala Trp Ala Ile Glu Phe Thr Lys

    355                 360                 365<210> 4<211> 20<212> PRT<213> Oryza sativa<220><221> 不确定<222> 15<400> 4Ser Thr Ala Glu Asp Val Ala Ala Ala Ala Asp Glu Glu Ala Xaa Met1               5                  10                  15Tyr Ala Leu Gln

         20<210> 5<211> 240<212> PRT<213> 水稻<220><221> 不确定<222> 146<220><221> 不确定<222> 151<220><221> 不确定<222> 163<220><221> 不确定<222> 173<220><221> 不确定<222> 237<400> 5Gly Val Ser Met Ala Ala Leu Ala Leu Met Asn Gln Asp Lys Val Leu1               5                  10                  15Met Glu Ser Xaa Tyr Tyr Leu Lys Asp Ala Val Leu Asp Gly Gly Ile

         20                  25                  30Pro Phe Asn Lys Ala Tyr Gly Met Thr Ala Phe Glu Tyr His Gly Thr

     35                  40                  45Asp Ala Arg Phe Asn Arg Val Phe Asn Glu Gly Met Lys Asn His Ser

 50                  55                  60Val Ile Ile Thr Lys Lys Leu Leu Asp Leu Tyr Thr Gly Phe Asp Ala65              70                      75                  80Ala Ser Thr Val Val Asp Val Gly Gly Gly Val Gly Ala Thr Val Ala

             85                  90                  95Ala Val Val Ser Arg His Pro His Ile Ser Gly Val Asn Phe Asp Leu

        100                 105                 110Pro His Val Ile Ser Glu Ala Pro Pro Phe Pro Gly Val Val His Val

    115                 120                 125Gly Gly Asp Met Phe Ala Ser Val Pro Ala Gly Asp Ala Ile Leu Met

130                 135                 140Lys Xaa Ile Leu His Asp Xaa Ser Asp Glu His Leu Ala Arg Leu Leu145                 150                 155                 160Lys Asn Xaa Tyr Asp Ala Leu Pro Glu His Gly Lys Val Val Val Val

            165                 170                 175Glu Xaa Val Leu Pro Glu Glu Thr Asp Ala Thr Ala Arg Ala Gln Gly

        180                 185                 190Val Phe His Val Asp Met Ile Met Leu Ala His Asn Pro Gly Gly Lys

    195                 200                 205Glu Arg Tyr Glu Arg Glu Phe Arg Glu Leu Ala Arg Ala Ala Gly Phe

210                 215                 220Thr Gly Phe Lys Ala Thr Tyr Ile Tyr Ala Asn Ala Xaa Ala Ile Glu225                 230                 235                 240<210> 6<211> 5241<212> DNA<213> 水稻<400> 6actagttagt taagccatcg ttattcatat accacaccgc tggttttgtt ggtgggagaa 60acaaccaaaa ttaaatttag tgaagatagg taggaatatg acagcacata acgttcactt 120tgaactcaag catggacata attagttgga gaagaaaatg atggtgccca cttacctagc 180tagctataca ggatatttca acaaattaaa gggttagcaa ttttctgtca agtacacttt 240tgttccaaaa gggacagtaa tcgtcagtta accagtttaa ctctcaccca tatatgatca 300atcatgttga atattttagg cagacataaa ataggagaaa tgtcaattta tccggcttaa 360ttaattgcta aattactaat taagttctat gtggaccata tatatggatt tcgtagaaaa 420caattcagtc cataatataa tgaagaatat tagtatcaga ttttaatatc tatcaagtta 480cccatcacag cagtacagta actcctaatt aatgttcttg cttcatcaca ctcatatata 540tacttcctcc gtttcacaac gtaagttatt ctagcatttt ccatatttat attaatgcta 600atgaatctag acatatatat ctatttaaat ttattagcat caatatgaat gtggaaaatg 660ctagaatgac ttacattgtg aaacggatgg agtaccactc aaattacagg gctccaagct 720acttaattag tgagcaacta attggtctac tcgatctctc catcttttgg ccaccaactc 780cacacactcc aaaataagct ttcactttca tcccagcaca atatgcatgc aaggaatagt 840tgtcgagttt gaccgttaac actaaaaaca aaccccatgc acgacttaac atacctaatc 900gttgaaaata attagccgta aatattacat atatatatat acatcagatg atgaattgta 960gtaattaaat taattaaacc tactaaaccc atacaacgtc gtcacgacta ctcctgatgg 1020tacatctaag ctactccatt tcccatcgga cgaatacaac cacgcaccag acaaagtacg 1080caaacacaaa attatcaatg ataatcatga tgatggagca tcatatctac tactagcaca 1140tacactatct ttcttccttc cttctcctaa ttaattcccc taaaaaattg aaggtgaaga 1200gaagaagaag gaaaagaaag caaaacaaat taattaaaga aaagaaaaga aaagaaaaag 1260gtgagttggt ggtgtcatat atagtgtgtg gtggttggtg aaggcttgag ctcccatata 1320aaccccctcc tccctctcca ttgccttcac ctcactcgcc gccggtgatc agcctcctcc 1380tccttcttct ccatcgccgg cgagagagag agagagttag ctagctagga tgggttctac 1440agccgccgac atggccgcgg cggccgacga ggaggcgtgc atgtacgcgc tgcagctggc 1500gtcgtcgtcg atcctgccga tgacgctcaa gaacgccatc gagctgggcc tgctcgagac 1560gctgcagtcc gccgccgtcg ccggaggagg ggggaaggcg gcgctgctga cgccggcgga 1620ggtggccgac aagctgccgt ccaaggcgaa cccggcggcg gccgacatgg tggaccgcat 1680gctccgcctg ctcgcctcct acaacgtcgt caggtgcgag atggaggagg gcgccgacgg 1740caagctctcc cgccgctacg ccgccgcgcc ggtgtgcaag tggctgacgc ccaacgagga 1800cggcgtctcc atggccgccc tcgccctcat gaaccaggac aaggtcctca tggagagctg 1860gtcagttcat tttgtctcct cctctctcgc tgacatgtgg gcccacccct acataaacct 1920tcacaaataa aacccactat gccaacttcc attttcaaaa ggagttaggt gcaacaagca 1980tatcaaacct tgaatttcat tgtttttttt agtttccttt tagaaccttg agacaacatg 2040ttttttagat gataggataa aggaatatcc ccggcctctg aatcatatga tgcacgtaat 2100cgattttcta aagaaactaa ttccatgaag aaaaatcgtt cttacacgta taaatagcac 2160cgacaggcac gtaatcgatt ttcaatacat atgctagaaa agaaattaat tctctgacga 2220aaatttgttc ttacgtacgc atagcaccga ctgatagccg ctacggcata attatgtgca 2280cttagaaaag ggtgttggtg accctcctct agtagtgggg ggtgatgcta gcaagcacta 2340aacttggtca ccaaacagct gaggaatatg aaaagagggg ggaaaaggtt gagctcatct 2400tccttctaga gaagcaacca cagccgtcga tcgccgaatc gacggcgaat agagatccct 2460tcccaatcat cctaacatgt catgctcaaa atgcatgatg gagaaatctt ggctgatctg 2520atcagctggc ttggtgtcac aaactgattc tccacctacc tgtagaaaat tcggtagtgt 2580tgtgtatata tagccagttt gtttgatgtg gacagagtac tagaaatcaa ataagcttgt 2640gtgacttttc ctgcatgcct ttgattattc ttctaagatt ttggggttca gaaattcagg 2700tagaaagtag aaaaaagagt acagtagtta ttattcagaa catcctgtgc aaagcccaag 2760caagctgtac ccttttagtg gcaagattgc aatggcatgt aggttggtta gtaggtagtg 2820cgtctagaca aagacacatc agtagcaaca gcagcagctg gaggaggaac atccatcaat 2880ttcctaccaa aacaatccac tcacagcctc acaggcattc aatggatgcg tggtgtcaat 2940tataggattt gaaccccgtt gaacagccga cttctttctc attttctcat gacctcatag 3000ttatcccgct gaatctttat atgcttatat cttacagaat atggattgta ctccaaaatc 3060gttttcacaa ctttttacaa atttatcgga ccgcctacaa cattattact ctagaaatta 3120ttggttaaag ttgcattatg aagaccgttc aactccaaga attattattt ttgcgcataa 3180aaagatattt tattttagga aaaataaggc cccatttttt aagttgaaat tgatggaatt 3240tttctatatc tatttcaggt ataaacaaat gaagtgtaac tataacaaag ttgaaaaaac 3300atattttcga aaatatataa ttttttttac aaaacatacc attagaacat tggtaagcat 3360gcaaataaaa atccataatc tagaatgaga aaagtacatg gacaataaaa atgaagaagt 3420tgcatatgcc tgaatatggc tgtgtttagt tcacgctaaa attaaaagtt tggttgaaat 3480tagaatgatg tgatggaaaa gttggaagtt tgtgtgtata gaaaaagttt tgatgtgatg 3540gaaaagttgg aagtttgaag aaaaagtttg aaagtaaact cgatctatat ctatatcgat 3600gcaggtacta ccttaaggac gcagtcctgg acggcggcat cccgttcaac aaggcgtacg 3660ggatgacggc gttcgagtac cacggcacgg acgcccgctt caaccgcgtc ttcaacgagg 3720gcatgaagaa ccactccgtc atcatcacca agaagctgct cgacctctac accggcttcg 3780acgccgcctc caccgtcgtc gacgtcggcg gcggcgtggg cgccactgtg gccgccgtcg 3840tctcccgcca cccgcacatc cgggggatca actacgacct cccccacgtc atctccgagg 3900cgccgccgtt ccccggggtg gagcacgtcg gcggcgacat gttcgcctcc gtgccccgcg 3960gcggcgacgc catcctgatg aagtggatcc tccacgactg gagcgacgag cactgcgcgc 4020ggctgctcaa gaactgctac gacgcgctgc cggagcacgg gaaggtggtg gtggtggagt 4080gcgtgctgcc ggagagctcc gacgcgacgg cgagggagca gggggtgttc cacgtcgaca 4140tgatcatgct cgcccacaac cccggcggca aggagaggta cgagagggag ttcagggagc 4200tcgcccgcgc cgccggattc accggcttca aggccaccta catctacgcc aacgcctggg 4260ccatcgagtt caccaagtag gtgattggtg atcgatcgcc attgttgagc tcgatcaagg 4320tgttcgacca tcgtcttctt cttctcgtac ttcttgttct tcatccaaaa gcgtgggtaa 4380tcatgtcgtt tgctgctggc tgatgctgct gctgcttgtg ttgtactttt gatgttcaat 4440tccggtgatt ctgagttcta atggatgtaa cctgtctgct attatatata tatatataat 4500cgaatatatg atatatttac ttacgacttg ttaatgattc acaaggttat ataatttctt 4560ctcaatcaat cacagcctct atctatttaa ttctacctaa tttcttaatg attttgtcca 4620aaactaaatt ttcttatatt ctgtggcaga gatagtagtg aatatctaga acaacaaatc 4680gaaatcatag catcacatta tgagtaaaac aacagctcct tatattatac tacatgatat 4740tttttttacg caaaaggtag agagactcta ccttgttacc attgtagtgc tccctccgtt 4800tcaaaatgtt tgacaccgtt gactttttag tacgtgtttg accattcgtt ttattcaaaa 4860aatttaagta attatttatt cttttcatat catttgattc attgttaaat atactttcat 4920gtacacatat aattttactt atttcataaa tttttttgaa taaggcgaac ggtcaaacat 4980gtgctaaaaa gtcaactgtg tcaaacattt tgaaacggag ggagtatgta gtagtagtag 5040tagtaaaaat actacatgat atgatggtat gtttttgata tgttgttcta gagatttaga 5100gtaatgtgtc tgcgtgttca gagtttcaga gaggaaacgg aatctttgta ttgctgctgc 5160tacgtgttga atcgtgcaca attctaggat aaatttacta tcgacttgtt aataattcac 5220aaggttatat agatttcgat c                                        5241<210> 7<211> 5241<212> DNA<213> 水稻<220><221> 外显子<222> 1430..1860<220><221> 内含子<222> 1861..3604<220><221> 外显子<222> 3605..4277<400> 7actagttagt taagccatcg ttattcatat accacaccgc tggttttgtt ggtgggagaa  60acaaccaaaa ttaaatttag tgaagatagg taggaatatg acagcacata acgttcactt  120tgaactcaag catggacata attagttgga gaagaaaatg atggtgccca cttacctagc  180tagctataca ggatatttca acaaattaaa gggttagcaa ttttctgtca agtacacttt  240tgttccaaaa gggacagtaa tcgtcagtta accagtttaa ctctcaccca tatatgatca  300atcatgttga atattttagg cagacataaa ataggagaaa tgtcaattta tccggcttaa  360ttaattgcta aattactaat taagttctat gtggaccata tatatggatt tcgtagaaaa  420caattcagtc cataatataa tgaagaatat tagtatcaga ttttaatatc tatcaagtta  480cccatcacag cagtacagta actcctaatt aatgttcttg cttcatcaca ctcatatata  540tacttcctcc gtttcacaac gtaagttatt ctagcatttt ccatatttat attaatgcta  600atgaatctag acatatatat ctatttaaat ttattagcat caatatgaat gtggaaaatg  660ctagaatgac ttacattgtg aaacggatgg agtaccactc aaattacagg gctccaagct  720acttaattag tgagcaacta attggtctac tcgatctctc catcttttgg ccaccaactc  780cacacactcc aaaataagct ttcactttca tcccagcaca atatgcatgc aaggaatagt  840tgtcgagttt gaccgttaac actaaaaaca aaccccatgc acgacttaac atacctaatc  900gttgaaaata attagccgta aatattacat atatatatat acatcagatg atgaattgta  960gtaattaaat taattaaacc tactaaaccc atacaacgtc gtcacgacta ctcctgatgg 1020tacatctaag ctactccatt tcccatcgga cgaatacaac cacgcaccag acaaagtacg 1080caaacacaaa attatcaatg ataatcatga tgatggagca tcatatctac tactagcaca 1140tacactatct ttcttccttc cttctcctaa ttaattcccc taaaaaattg aaggtgaaga 1200gaagaagaag gaaaagaaag caaaacaaat taattaaaga aaagaaaaga aaagaaaaag 1260gtgagttggt ggtgtcatat atagtgtgtg gtggttggtg aaggcttgag ctcccatata 1320aaccccctcc tccctctcca ttgccttcac ctcactcgcc gccggtgatc agcctcctcc 1380tccttcttct ccatcgccgg cgagagagag agagagttag ctagctagg atg ggt tct 1438

                                                  Met Gly Ser

                                                  1aca gcc gcc gac atg gcc gcg gcg gcc gac gag gag gcg tgc atg tac 1486Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Ala Ala Asp Glu Glu Ala Cys Met Tyr

  5                  10                  15gcg ctg cag ctg gcg tcg tcg tcg atc ctg ccg atg acg ctc aag aac 1534Ala Leu Gln Leu Ala Ser Ser Ser Ile Leu Pro Met Thr Leu Lys Asn20                  25                  30                  35gcc arc gag ctg ggc ctg ctc gag acg ctg cag tcc gcc gcc gtc gcc 1582Ala Ile Glu Leu Gly Leu Leu Glu Thr Leu Gln Ser Ala Ala Val Ala

             40                  45                  50gga gga ggg ggg aag gcg gcg ctg ctg acg ccg gcg gag gtg gcc gac 1630Gly Gly Gly Gly Lyg Ala Ala Leu Leu Thr Pro Ala Glu Val Ala Asp

         55                  60                  65aag ctg ccg tcc aag gcg aac ccg gcg gcg gcc gac atg gtg gac cgc 1678Lys Leu Pro Ser Lys Ala Asn Pro Ala Ala Ala Asp Met Val Asp Arg

     70                  75                  80atg ctc cgc ctg ctc gcc tcc tac aac gtc gtc agg tgc gag atg gag 1726Met Leu Arg Leu Leu Ala Ser Tyr Asn Val Val Arg Cys Glu Met Glu

 85                  90                  95gag ggc gcc gac ggc aag ctc tcc cgc cgc tac gcc gcc gcg ccg gtg 1774Glu Gly Ala Asp Gly Lys Leu Ser Arg Arg Tyr Ala Ala Ala Pro Val100                 105                 110                 115tgc aag tgg ctg acg ccc aac gag gac ggc gtc tcc atg gcc gcc crc 1822Cys Lys Trp Leu Thr Pro Asn Glu Asp Gly Val Ser Met Ala Ala Leu

            120                 125                 130gcc ctc atg aac cag gac aag gtc ctc atg gag agc tg gtcagttcat ttt 1873Ala Leu Met Asn Gln Asp Lys Val Leu Met Glu Ser Tr

        135                 140gtctcctcct ctctcgctga catgtgggcc cacccctaca taaaccttca caaataaaac 1933ccactatgcc aacttccatt ttcaaaagga gttaggtgca acaagcatat caaaccttga 1993atttcattgt tttttttagt ttccttttag aaccttgaga caacatgttt tttagatgat 2053aggataaagg aatatccccg gcctctgaat catatgatgc acgtaatcga ttttctaaag 2113aaactaattc catgaagaaa aatcgttctt acacgtataa atagcaccga caggcacgta 2173atcgattttc aatacatatg ctagaaaaga aattaattct ctgacgaaaa tttgttctta 2233cgtacgcata gcaccgactg atagccgcta cggcataatt atgtgcactt agaaaagggt 2293gttggtgacc ctcctctagt agtggggggt gatgctagca agcactaaac ttggtcacca 2353aacagctgag gaatatgaaa agagggggga aaaggttgag ctcatcttcc ttctagagaa 2413gcaaccacag ccgtcgatcg ccgaatcgac ggcgaataga gatcccttcc caatcatcct 2473aacatgtcat gctcaaaatg catgatggag aaatcttggc tgatctgatc agctggcttg 2533gtgtcacaaa ctgattctcc acctacctgt agaaaattcg gtagtgttgt gtatatatag 2593ccagtttgtt tgatgtggac agagtactag aaatcaaata agcttgtgtg acttttcctg 2653catgcctttg attattcttc taagattttg gggttcagaa attcaggtag aaagtagaaa 2713aaagagtaca gtagttatta ttcagaacat cctgtgcaaa gcccaagcaa gctgtaccct 2773tttagtggca agattgcaat ggcatgtagg ttggttagta ggtagtgcgt ctagacaaag 2833acacatcagt agcaacagca gcagctggag gaggaacatc catcaatttc ctaccaaaac 2893aatccactca cagcctcaca ggcattcaat ggatgcgtgg tgtcaattat aggatttgaa 2953ccccgttgaa cagccgactt ctttctcatt ttctcatgac ctcatagtta tcccgctgaa 3013tctttatatg cttatatctt acagaatatg gattgtactc caaaatcgtt ttcacaactt 3073tttacaaatt tatcggaccg cctacaacat tattactcta gaaattattg gttaaagttg 3133cattatgaag accgttcaac tccaagaatt attatttttg cgcataaaaa gatattttat 3193tttaggaaaa ataaggcccc attttttaag ttgaaattga tggaattttt ctatatctat 3253ttcaggtata aacaaatgaa gtgtaactat aacaaagttg aaaaaacata ttttcgaaaa 3313tatataattt tttttacaaa acataccatt agaacattgg taagcatgca aataaaaatc 3373cataatctag aatgagaaaa gtacatggac aataaaaatg aagaagttgc atatgcctga 3433atatggctgt gtttagttca cgctaaaatt aaaagtttgg ttgaaattag aatgatgtga 3493tggaaaagtt ggaagtttgt gtgtatagaa aaagttttga tgtgatggaa aagttggaag 3553tttgaagaaa aagtttgaaa gtaaactcga tctatatcta tatcgatgca g g tac    3608

                                                     p Tyr

                                                       145tac ctt aag gac gca gtc ctg gac ggc ggc atc ccg ttc aac aag gcg   3656Tyr Leu Lys Asp Ala Val Leu Asp Gly Gly Ile Pro Phe Asn Lys Ala

            150                 155                 160tac ggg atg acg gcg ttc gag tac cac ggc acg gac gcc cgc ttc aac 3704Tyr Gly Met Thr Ala Phe Glu Tyr His Gly Thr Asp Ala Arg Phe Asn

        165                 170                 175cgc gtc ttc aac gag ggc atg aag aac cac tcc gtc atc atc acc aag 3752Arg Val Phe Asn Glu Gly Met Lys Asn His Ser Val Ile Ile Thr Lys

    180                 185                 190aag ctg ctc gac ctc tac acc ggc ttc gac gcc gcc tcc acc gtc gte 3800Lys Leu Leu Asp Leu Tyr Thr Gly Phe Asp Ala Ala Ser Thr Val Val

195                 200                 205gac gtc ggc ggc ggc gtg ggc gcc act gtg gcc gcc gtc gtc tcc cgc 3848Asp Val Gly Gly Gly Val Gly Ala Thr Val Ala Ala Val Val Set Arg210                 215                 220                 225cac ccg cac atc cgg ggg atc aac tac gac ctc ccc cac gtc atc tcc 3896His Pro His Ile Arg Gly Ile Asn Tyr Asp Leu Pro His Val Ile Ser

            230                 235                 240gag gcg ccg ccg ttc ccc ggg gtg gag cac gtc ggc ggc gac atg ttc 3944Glu Ala Pro Pro Phe Pro Gly Val Glu His Val Gly Gly Asp Met Phe

        245                 250                 255gcc tcc gtg ccc cgc ggc ggc gac gcc arc ctg atg aag tgg atc ctc 3992Ala Set Val Pro Arg Gly Gly Asp Ala Ile Leu Met Lys Trp Ile Leu

    260                 265                 270cac gac tgg agc gac gag cac tgc gcg cgg ctg crc aag aac tgc tac 4040His Asp Trp Set Asp Glu His Cys Ala Arg Leu Leu Lys Asn Cys Tyr

275                 280                 285gac gcg ctg ccg gag cac ggg aag gtg gtg gtg gtg gag tgc gtg ctg 4088Asp Ala Leu Pro Glu His Gly Lys Val Val Val Val Glu Cys Val Leu290                 295                 300                 305ccg gag agc tcc gac gcg acg gcg agg gag cag ggg gtg ttc cac gtc 4136Pro Glu Ser Set Asp Ala Thr Ala Arg Glu Gln G1y Val Phe His Val

            310                 315                 320gac atg atc atg ctc gcc cac aac ccc ggc ggc aag gag agg tac gag 4184Asp Met Ile Met Leu Ala His Asn Pro Gly Gly Lys Glu Arg Tyr Glu

        325                 330                 335agg gag ttc agg gag crc gcc cgc gcc gcc gga ttc acc ggc ttc aag 4232Arg Glu Phe Arg Glu Leu Ala Arg Ala Ala 6ly Phe Thr Gly Phe Lys

    340                 345                 350gcc acc tac arc tac gcc aac gcc tgg gcc atc gag ttc acc aag tag 4280Ala Thr Tyr Ile Tyr Ala Asn Ala Trp Ala Ile Glu Phe Thr Lys

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Claims (12)

1．(a)含有序列6的核苷酸序列的DNA；或

(b)在序列6的核苷酸序列上缺失、取代或添加一个或几个核苷酸的DNA，该DNA在导入水稻细胞中之后能够表达具有柚配基7-O-甲基转移酶活性的蛋白。

2．一种包括权利要求1的DNA的重组载体。

3．一种用权利要求2的重组载体转化过的宿主细胞。

4．一种通过分化导入了权利要求2的重组载体的植物细胞而获得的植物转化体。

5．(a)含有序列12的核苷酸序列的DNA；或

(b)在序列12的核苷酸序列上缺失、取代或添加一个或几个核苷酸的DNA，该DNA在导入水稻细胞中之后能够表达具有柚配基7-O-甲基转移酶活性的蛋白。

6．一种包括权利要求5的DNA的重组载体。

7．一种用权利要求6的重组载体转化过的宿主细胞。

8．一种通过分化导入了权利要求6的重组载体的植物细胞而获得的植物转化体。

9．(a)含有序列2的核苷酸序列的DNA；或

(b)在序列2的核苷酸序列上缺失、取代或添加一个或几个核苷酸的DNA，该DNA具有启动子活性。

10．含有权利要求9的DNA的重组载体。

11．一种用权利要求10的重组载体转化过的宿主细胞。

12．(a)一种含有序列3的氨基酸序列的蛋白；或

(b)在序列3的核苷酸序列上缺失、取代或添加一个或几个氨基酸的蛋白，并具有柚配基7-O-甲基转移酶活性。

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