CN1299823A - 新的人细胞因子、其编码序列及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的人细胞因子－CX1蛋白,编码此多肽的多核苷酸和经重组技术产生这种多肽的方法。本发明还公开了此多肽用于治疗多种疾病的方法,如贫血、造血功能低下等。本发明还公开了抗此多肽的拮抗剂及其治疗作用。本发明还公开了编码这种新的人CX1蛋白的多核苷酸的用途。本发明还提供了含CX1蛋白的药物组合物。

Description

新的人细胞因子、其编码序列及用途

本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及新的编码人细胞因子CX1(也称为“CX1蛋白”)的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。具体地说，本发明的多肽是一种新的与造血有关的细胞因子。

细胞因子是动物体内一类重要的蛋白。许多细胞因子都在体内发挥着重要的作用，例如肿瘤坏死因子、干扰素、白细胞介素(IL2、IL-8、IL17、IL18等)、HGF、血管生成素、红细胞生成素(EPO)、GM-CSF等。

近年，开始了人类基因组计划，以便获得人类的全部基因组信息，揭示人类生命的奥秘及疾病的发生发展规律，最终探索出疾病诊治的有效方法。随着分子生物学和计算机技术、生物信息学的发展，大规模测序已成为揭示细胞基因表达谱和发现新分子的有效手段(Mao et al.Proc Natl Acad Sci U S A.1998；95：8175)。cDNA文库的构建是大规模随机测序的基础和关键。cDNA文库主要有噬菌体文库和质粒文库两大类。噬菌体文库具有滴度高等突出优点，但也存在着空斑率较高的缺点，利用IPTG诱导的LacZ互补表达进行蓝白菌落筛选过程中，部分表达后生长不稳定的克隆可能被抑制，造成克隆的优势选择；而且部分蓝色菌落中也可能含有***子。目前，本领域技术的发展已使质粒文库的滴度足以满足大规模随机测序的要求。

树突状细胞为体内重要的专职抗原提呈细胞，是机体T细胞特异免疫应答的直接启动和调控者。近年来，树突状细胞的分化发育、抗原加工提呈机理及其在肿瘤、感染、自身免疫性疾病和移植排斥中的作用已经成为免疫学的前沿领域，从树突状细胞中寻找免疫新分子是目前免疫学领域的一大研究热点(曹雪涛等，中国免疫学杂志，1998；3：322，Banchereau et al.Nature.1998；392：245)。

国际上一些知名的生物技术公司和研究机构，如DNAX、HGS、Immunex、Genetech等竞相涉足于该领域。树突状细胞新分子的研究对深入阐明其分化发育、体内迁移、生物学作用及其分子机理具有重大意义，同时也可能为肿瘤、感染(HIV)、移植排斥和自身免疫性疾病的治疗提供新的思路和手段。Adema等在人树突状细胞cDNA文库中发现了能特异趋化初始型T细胞CC趋化因子DC-CK1，提示其可能与DC对Naive T细胞独特的刺激作用有关(Adema et al.Nature.1997；387：713)。Anderson等通过EST的同源比较，从人树突状细胞中发现了TNF受体超家族新成员RANK(Receptor Activator of NF-κB)，通过表达克隆进一步克隆到该分子的配体RANKL，并证实RNAK和RANKL的相互作用可以有效维持树突状细胞的活力(Anderson et al.Nature.1997；390：175)。Lebecque等从人树突状细胞cDNA文库中发现了溶酶体相关膜蛋白(DC-LAMP)等免疫新分子(De Saint-Vis etal.Immunity.1998；9：326)。

由于细胞因子在维持正常生理功能方面起着重要作用，而且细胞因子的功能异常也与一些疾病(例如恶性肿瘤、贫血等)密切相关，因此，为治疗目的研究和开发新的人细胞因子及其激动剂/抑制剂有重要意义。

本发明的目的是提供一种新的人细胞因子-CX1蛋白多肽以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

本发明的另一目的是提供含CX1蛋白的药物组合物。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的CX1蛋白多肽，该多肽是人源的，它包含：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、或SEQ ID NO：5氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性：(a)编码上述人CX1蛋白多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中45-587位的序列；(b)具有SEQ ID NO：1中105-587位的序列；(c)具有SEQ ID NO：1中1-704位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备具有人CX1蛋白活性的多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达人CX1蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人CX1蛋白活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了与上述的人CX1蛋白多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的10-704个核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗人CX1蛋白多肽活性的化合物，以及抑制人CX1蛋白多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是人CX1蛋白多肽的编码序列或其片段的反义序列。

在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在CX1蛋白活性的方法，一种方法包括：将样品与CX1反应性细胞接触，观察CX1反应性细胞的增殖是否被促进，CX1反应细胞的增殖被提高就表示样品中存在CX1蛋白活性。较佳地，该CX1反应性细胞是TF1细胞。另一种方法包括：将样品与CX1蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CX1蛋白。

在本发明的第八方面，提供了一种检测与人CX1蛋白多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括：检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。

在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进人CX1蛋白多肽活性的激动剂，或者筛选抑制人CX1蛋白多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的人CX1蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的人CX1蛋白多肽以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗免疫疾病、贫血、癌症等病症。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1A是本发明人CX1蛋白的cDNA序列和全长的氨基酸序列。其中非编码序列用小写字母表示，编码序列用大写字母表示。“*”表示终止密码子。“↓”标出了信号肽的切割位点。

图1B是本发明的人CX1蛋白与人白细胞介素(IL17)蛋白的氨基酸序列同源性比较图。上方序列是人CX1蛋白，下方序列是人IL17蛋白。相同氨基酸在两个序列间用单字符氨基酸表示，相似氨基酸用“：”和“.”表示。

图2是对细胞因子CX1进行Kyte-doolitte疏水性分析的疏水性曲线图。

图3是表达质粒pcDNA3.1/myc-his(-)结构图。

图4是对重组表达载体pcDNA-CX1和pCX1-His基因转染的COS7细胞培养上清中CX1和CX1-His表达情况，进行35S代谢标记检测的电泳图。其中自左向右依次是：泳道1，CX1-His；泳道2：转染空载体的COS7细胞对照上清；泳道3，CX1；泳道4：转染空载体的COS7细胞。左侧为分子量大小(kDa)。

图5A是对重组表达质粒pCX1-His基因转染293细胞后培养上清中CX1-His表达产物进行35S代谢标记检测的电泳图。泳道mock为对照；泳道CX1-His为CX1-His表达产物。左侧为分子量大小(kDa)。

图5B是对重组表达质粒pCX1-His基因转染293细胞后培养上清中CX1-His表达产物进行Western印迹分析的电泳图。泳道1和3为对照，泳道2为CX1-His表达产物。左侧为分子量大小(kDa)。

图6是对纯化的CX1-IgG融合蛋白进行SDS-PAGE电泳银染鉴定的电泳图。图中CX1-IgG融合蛋白为单一条带。左侧泳道为分子量标记(kDa)。

图7A显示了CX1基因转染的COS7细胞培养上清对TF1细胞的增殖作用。

图7B显示了CX-His基因转染的293细胞培养上清对TF1细胞的增殖作用。

图7C显示了CX1-IgG融合蛋白对TF1细胞的增殖作用。

在本发明中，术语“CX1蛋白”、“细胞因子CX1”可互换使用，都指具有人细胞因子CX1氨基酸序列的全长形式(SEQ ID NO：1)或无信号肽的成熟形式(SEQID NO：)的氨基酸序列的人细胞因子CX1。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的细胞因子CX1。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的CX1蛋白或多肽”是指CX1蛋白多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化CX1蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。CX1蛋白多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括人CX1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人CX1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(ⅰ)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ⅱ)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(ⅲ)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(ⅳ)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“人CX1蛋白多肽”指具有人CX1蛋白活性的SEQ ID NO.2或3序列的多肽。该术语还包括具有与人CX1蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2或3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人CX1蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人CX1 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人CX1蛋白多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人CX1蛋白多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人CX1蛋白多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人CX1蛋白多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供人CX1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人CX1蛋白多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“人CX1蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID No.2或3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

                           表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或***，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码CX1蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的人CX1蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或CX1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science,1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的CX1蛋白多肽。一般来说有以下步骤：

(1)．用本发明的编码人CX1蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)．在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)．从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，人CX1蛋白多核苷酸序列可***到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg,et al.Gene,1987,56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans,J Bio Chem.263：3521,1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人CX1蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,a Laboratory Manual,coldSpring Harbor Laboratory.New York,1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中***增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的人CX1蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗CX1蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗CX1蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。例如，抗体可用于激活或抑制人CX1蛋白的功能。用表达的重组人CX1蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人CX1蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对人CX1 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人CX1基因产物或片段。较佳地，指那些能与人CX1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人CX1蛋白的分子，也包括那些并不影响人CX1蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人CX1基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人CX1基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人CX1蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495,1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511,1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292,1976；Hammerling等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人CX1蛋白功能的抗体以及不影响人CX1蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人CX1基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人CX1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人CX1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人CX1蛋白。此外，与人CX1蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与人CX1蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人CX1蛋白的产生或活性。

抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人CX1蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人CX1蛋白阳性的细胞(例如肿瘤细胞，如白血病细胞、慢性髓性白血病细胞K562、前髓白血病细胞HL-60、Burkitt氏淋巴瘤细胞Raji、结直肠腺癌细胞SW480、肺癌细胞A549和黑色素瘤细胞等)。

多克隆抗体的生产可用人CX1蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与CX1蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，恶性肿瘤、贫血、造血功能低下等。在使用本发明CX1蛋白时，还可同时使用其他治疗剂，例如EPO、GM-CSF、IL-3、G-CSF等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明CX1蛋白多肽以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的人CX1蛋白可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是安全有效量的CX1蛋白施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

人CX1蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于CX1蛋白的无表达或异常/无活性的CX1蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的CX1蛋白，以抑制内源性的CX1蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将CX1基因转移至细胞内。构建携带CX1基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook,et al.)。另外重组人CX1基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

抑制人CX1 mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

能与人CX1蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对人CX1蛋白分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测人CX1蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人CX1蛋白水平，可以用作解释人CX1蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断CX1蛋白起作用的疾病。

一种检测样品中是否存在CX1蛋白活性的方法是利用CX1反应性细胞进行检测，它包括：将样品与CX1反应性细胞接触，观察CX1反应性细胞的增殖是否被促进，CX1反应细胞的增殖被提高就表示样品中存在CX1蛋白活性。在本发明中，“CX1(蛋白)反应性细胞”指会对CX1蛋白的存在作出反应，从而导致增殖增加的细胞，例如红白血病细胞，如TF1细胞。

另一种检测检测样品中是否存在CX1蛋白的方法是利用CX1蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与CX1蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CX1蛋白。

CX1蛋白的多聚核苷酸可用于CX1蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，CX1蛋白的多聚核苷酸可用于检测CX1蛋白的表达与否或在疾病状态下CX1蛋白的异常表达。如CX1蛋白DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断CX1蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用CX1蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测CX1蛋白的转录产物。

检测CX1基因的突变也可用于诊断CX1蛋白相关的疾病。CX1蛋白突变的形式包括与正常野生型CX1 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。简而言之，根据本发明CX1蛋白的cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。

一旦序列被定位到准确的染色***置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick,Mendelian Inheritance inMan(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的成熟多肽。本发明的多核苷酸是从人树突状细胞cDNA文库中分离出的。其序列如SEQ ID NO：1所示：tccaggcgggcagcagctgcaggctgaccttgcagcttggcgga ATG GAC TGG CCT CAC AAC CTG CTG TTT 71CTT CTT ACC ATT TCC ATC TTC CTG GGG CTG GGC CAG CCC AGG AGC CCC AAA AGC AAG AGG  131AAG GGG CAA GGG CGG CCT GGG CCC CTG GCC CCT GGC CCT CAC CAG GTG CCA CTG GAC CTG  191GTG TCA CGG ATG AAA CCG TAT GCC CGC ATG GAG GAG TAT GAG AGG AAC ATC GAG GAG ATG  251GTG GCC CAG CTG AGG AAC AGC TCA GAG CTG GCC CAG AGA AAG TGT GAG GTC AAC TTG CAG  311CTG TGG ATG TCC AAC AAG AGG AGC CTG TCT CCC TGG GGC TAC AGC ATC AAC CAC GAC CCC  371AGC CGT ATC CCC GTG GAC CTG CCG GAG GCA CGG TGC CTG TGT CTG GGC TGT GTG AAC CCC  431TTC ACC ATG CAG GAG GAC CGC AGC ATG GTG AGC GTG CCG GTG TTC AGC CAG GTT CCT GTG  491CGC CGC CGC CTC TGC CCG CCA CCG CCC CGC ACA GGG CCT TGC CGC CAG CGC GCA GTC ATG  551GAG ACC ATC GCT GTG GGC TGC ACC TGC ATC TTC TGA attacctggcccagaagccaggccagcagccc 619gagaccatcctccttgcacctttgtgccaagaaaggcctatgaaaagtaaacactgacttttgaaagcaaaaaaaaaaaa 699aaaaa                                                                            704

其中包含的多核苷酸序列全长为704个碱基，其开放读框位于45-587位，编码全长180个氨基酸的人CX1蛋白(SEQ ID NO：2)。MDWPHNLLFL  LTISIFLGLG  QPRSPKSKRK  GQGRPGPLAP  GPHQVPLDLV  50SRMKPYARME  EYERNIEEMV  AQLRNSSELA  QRKCEVNLQL  WMSNKRSLSP  100WGYSINHDPS  RIPVDLPEAR  CLCLGCVNPF  TMQEDRSMVS  VPVFSQVPVR  150RRLCPPPPRT  GPCRQRAVME  TIAVGCTCIF                          180

其中，氨基酸1-20位为信号肽。去除了信号肽后的成熟的CX1蛋白含160个氨基酸，序列如SEQ ID NO：3所示。QPRSPKSKRK  GQGRPGPLAP  GPHQVPLDLV  SRMKPYARME  EYERNIEEMV  50AQLRNSSELA  QRKCEVNLQL  WMSNKRSLSP  WGYSINHDPS  RIPVDLPEAR  100CLCLGCVNPF  TMQEDRSMVS  VPVFSQVPVR  RRLCPPPPRT  GPCRQRAVME  150TIAVGCTCIF                                                  160

CX1蛋白在氨基酸水平与人、大鼠和小鼠IL-17、HSV早期基因13蛋白有一定同源性(16-18％)。通过PCR克隆出含全长编码区的CX1 cDNA，***pcDNA3.1真核表达载体，构建了表达以下蛋白的不同表达质粒：(1)天然CX1、(2)CX1 C端与myc/His融合在一起的融合蛋白CX1-His；以及(3)CX1 C端与IgG Fc段融合的融合蛋白CX1-IgG。在真核细胞中进行不同形式(融合与非融合)的蛋白表达，并在非洲绿猴肾细胞株COS7中进行瞬时表达，在转染后48小时后进行细胞培养上清检测和35S代谢分析，表明细胞因子CX1基因能在真核细胞中得到表达，并分泌至胞外。

应用CX1 C端与myc/His融合以及CX1 C端与IgG Fc段融合得到不同表达质粒，CX1重组表达载体分别转染COS7细胞、人胚肾细胞株293细胞和中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞，均得到有效表达。用抗myc抗体或抗6His抗体均能从转染细胞的培养上清中检测到C端含有myc表位和6His的CX1融合蛋白(CX1-His)，用ProteinG亲和层析法从转染CX1-IgG基因的CHO稳定表达克隆株的无血清培养上清中纯化到50kD左右的CX1-IgG融合蛋白。

为了探讨CX1的潜在功能，选择了红白血病细胞株TF1细胞来检测CX1的造血调控作用。TF1对GM-CSF、IL-3和EPO均有增殖反应(Murate et al.Exp Cell Res.208：35)。试验表明，不同稀释度含CX1和CX1-His培养上清和纯化的融合蛋白CX1-IgG对TF1细胞均有一定的增殖促进作用。这表明CX1蛋白是一种新的细胞因子。此外，TF1作为CX1反应性细胞，可用于CX1生物学活性检测。

试验还表明，单独应用CX1-IgG对CD34⁺骨髓干细胞的增殖分化无明显促进作用，但能促进GM-CSF/G-CSF/IL-3诱导的粒系分化和IL-3/EPO诱导的红系分化。还初步观察到CX1促进单核细胞分泌NO、TNF和IL-6。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：人CX1蛋白cDNA的克隆

用Trizol(Gibco公司)提取人树突状细胞总RNA。然后，从总RNA中分离poly(A)mRNA。将poly(A)mRNA经逆转录形成cDNA后，用SuperScriptⅡ克隆试剂盒(购自Gibco)将cDNA片段定向***到载体的多克隆位点上，转化DH5α细菌形成cDNA质粒文库。用双脱氧法测定随机挑选克隆的5′末端的序列。将测定的cDNA序列与已有的公共DNA序列数据库进行比较，结果发现有一个cDNA克隆SBBI30的DNA序列为新的全长cDNA。通过合成一系列引物对新克隆所含的DNA序列进行双向测定。计算机分析表明，克隆所含的全长cDNA是一个新的cDNA序列(如SEQID NO：1所示)，编码一个新的蛋白质(如SEQ ID NO：2所示)。此蛋白质被命名为人CX1蛋白，其编码基因命名为人CX1基因。

序列SEQ ID NO：1全长为704bp，包括42bp的5′端非编码区和117bp的3′端非编码区，编码含180个氨基酸的多肽。

根据Kyte-Doolitte疏水性分析和GCG软件预测N端含由20个氨基酸组成的信号肽，这表明CX1蛋白是分泌蛋白。成熟的CX1蛋白由160个氨基酸组成，含有8个半胱氨酸，可能参与分子内和/或分子间二硫键的形成；55位Asn符合糖基化共有序列NXS/T，为潜在的糖基化位点。理论上计算未糖基化的成熟分子的分子量为18.1kD。

BLAST分析表明其与已知基因不同，蛋白水平与人、大鼠和小鼠IL-17、HSV早期基因13蛋白有同源性(16-18％)，推测可能是一新的细胞因子，命名为细胞因子CX1。

实施例2：用RT-PCR方法克隆人CX1蛋白的编码序列

用Trizol(Gibco公司)提取处于对数生长期HL-60细胞总RNA，取6μg细胞总RNA与0.5μg $\mathrm{Oligo}-d{T}_{{12}^{-}18}$ 混合，进行反转录。反转录体系为20μl，反应结束后加80μl ddH2O进行稀释。PCR扩增CX1所用的引物如下：引物#261：5′- ggaattc gccacc atg gactgg cct cac aac-3‘(SEQ ID NO：6)，引物#354：5′-gg ggt acctca gaagat gca ggt gca gcc c-3’(SEQ ID NO：7)。引物#261在起始密码子ATG前引入gcc acc利于提高表达水平。PCR反应体积为50μl，其中含反转录模板10μl、0.4μM引物、0.2μM dNTP和1U ExTaq DNA聚合酶(Takara Inc.)，扩增参数为94℃30秒、60℃30秒、72℃45秒，25个循环后PCR产物行2％琼脂糖凝胶电泳初步确认。DNA序列分析结果表明该PCR产物的编码DNA序列与SEQ ID NO：1所示的45-587bp编码区完全相同。

实施例3 CX1蛋白的Northern印迹分析

按如下常规方法进行Northern印迹：待检滤膜置于10ml经68℃预热的杂交液，在杂交炉(Bellco)中于68℃预杂交30分钟；将标记好的cDNA探针于95～100℃变性2～5分钟，置冰上迅速冷却后加入杂交液(cDNA探针终浓度为2～10ng/ml或1～2×10⁶cpm/ml)，充分混匀，于68℃杂交2小时。杂交结束后，滤膜用2×SSC、0.05％SDS室温淋洗数次，继振荡冲洗30～40分钟，其间更换洗液数次。随后用0.1×SSC、0.1％SDS于50℃振荡冲洗20～40分钟。最后滤膜用塑料保鲜膜包裹，于-70℃曝光X线胶片24～48小时。

Northern印迹杂交显示：细胞因子CX1在肾、肾上腺、心脏、骨骼肌、肝和胰腺等组织中的表达水平较高，在胎盘、睾丸、卵巢、外周血白细胞、结肠和肺等组织中呈低水平表达，在脑、脾、胸腺、小肠和***中未检测到明显的阳性信号；在肿瘤细胞如人淋巴母细胞白血病细胞Molt-4、慢性髓性白血病细胞K562、前髓白血病细胞HL-60、Burkitt氏淋巴瘤细胞Raji、结直肠腺癌细胞SW480、肺癌细胞A549和黑色素瘤细胞G361均有不同程度的mRNA表达。

此外，细胞因子CX1在肿瘤组织中广泛表达，提示其在肿瘤的发生、发展过程中可能发挥作用，但也可能是肿瘤细胞基因表达调控紊乱的继发表现。实施例4细胞因子CX1重组表达载体pcDNA-CX1,pCX1-His和pCX1-Fc的构建

构建中所用的真核表达载体pcDNA3.1/neo(Invitrogen公司)结构如图3所示。它含CMV启动子、SV40复制起始点、新霉素抗性基因，可进行目的基因的短暂表达和稳定表达。在其外源基因克隆位点的下游，含有myc表位和6个连续组氨酸(6his)编码序列和该读框的终止密码子，因此可根据需要表达C端连有myc表位和6His的融合蛋白，利用6His进行蛋白纯化，利用myc表位检测表达的融合蛋白。此外，外源基因克隆位点的两端分别是含有T7启动子和牛生长激素BGH的polyA信号，可用T7和BGH通用引物对主的外源基因进行直接测序。

(1)构建表达天然的细胞因子CX1的表达载体pcDNA-CX1

以实施例2的PCR扩增产物为模板，行PCR扩增目的基因。扩增CX1引物如表2所示，其中pcDNA-CX1反义链引物中包括CX1的终止密码子，所扩增的PCR产物记为CX1-CQ，大小为564bp；由于编码CX1蛋白的开放读框中含有CX1本身的终止密码子，其下游的myc表位和6His无法翻译，因此所表达的CX1重组蛋白氨基酸序列与天然CX1理论上完全一致，不含myc表位和6His。用于CX1瞬时表达的研究

PCR产物经柱纯化后，EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切后，直接连入同样酶切的真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His(-)，形成的重组载体记为pcDNA-CX1。其CX1的基因序列经T7和BGH引物测序确证。

(2)构建表达细胞因子CX1的C末端与myc/His融合的融合蛋白CX1-His的表达载体pCX1-His的构建

按类似的方法构建表达载体pCX1-His，不同点在于：pCX1-His反义链引物(表2)中去除CX1的终止密码子，所扩增的PCR产物记为CX1-BN，预计大小为563bp，所表达的重组蛋白CX1-His C端含有myc表位和6His，成熟蛋白的理论分子量为22kD。用于CX1稳定表达的研究。

PCR产物经柱纯化后，EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，直接连入同样酶切的真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His(-)，形成的重组载体记为pCX1-His。基因序列经T7和BGH引物测序确证。

(3)构建表达细胞因子CX1的C末端与IgG-Fc片段融合的融合蛋白CX1-IgG的表达载体pCX1-Fc的构建

pCX1-Fc的构建需从B淋巴瘤细胞株Raji中通过RT-PCR克隆编码人IgG1 CH2和CH3的cDNA，其中下游引物含有IgG的终止密码子，扩增Fc引物如表2所示。扩增产物记为IgG1 Fc，预计为740bp。CX1与Fc在同一读框中融合，CX1的cDNA位于Fc上游，所表达的融合蛋白前体为414个氨基酸，其中含由20个氨基酸的CX1信号肽，因此在真核细胞中表达时，分泌至胞外的成熟融合蛋白理论上为395个氨基酸(SEQ ID NO：5)，分子量为46.8kD。

将上述Fc的PCR产物经柱纯化后，BamHⅠ和KpnⅠ双酶切。然后与EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后CX1-His扩增产物、以及EcoRⅠ和KnpⅠ酶切后的真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His(-)大片段混合，连接后形成的重组载体记为pCX1-Fc。基因序列经T7和BGH引物测序确证。

      表2用于PCR扩增的寡核苷酸引物序列

产物	寡核苷酸(5’-3′)	酶切位点	产物大小
				CX1-CQ	有义：ggaattc gcc acc atg gactgg cct cac aac(SEQID NO：6)	EcoRⅠ	564bp
	反义：GGGGTACCTCAGAAGATGCAGGTGCAGCCC(SEQID NO：7)	KpnⅠ
				CX1-BN	有义：ggaattc gcc acc atg gactgg cct cac aac(SEQID NO：6)	EcoRⅠ	563bp
	反义：ggatcc GG GAA GAT GCA GGT GCA(SEQID NO：8)	BamHⅠ
				IgG1 Fc	有义：CGGGATCCGCCCAAATCTTCTGACAAAC(SEQID NO：9)	BamHⅠ	740bp
	反义：GGGGTACCTCATTTACCCGGAGACAG(SEQID NO：10)	KpnⅠ

注：下划线表示酶切位点。实施例5细胞因子CX1的真核重组表达

将重组质粒DNA与脂质体按一定比例混合，室温作用45分钟；等转染细胞洗两遍后与DNA混合。瞬时表达时，于转染48-72小时收集培养上清；稳定表达时，于转染后72小时加G418进行筛选，得到阳性克隆株，扩增后收集培养上清。进行CX1真核细胞重组表达的³⁵S代谢标记时，转染后收集对数生长期的细胞，进行细胞代谢的³⁵S掺入标记，掺入4小时收集培养上清进行SDS-PAGE电泳和放射自显影分析。

转染pCX1-His或对照质粒的293细胞稳定表达克隆株的培养上清，经centricon(截留分子量10kD)超滤浓缩后行15％的SDS-PAGE电泳。

先将该重组表达质粒转染COS7进行瞬时表达，并对CX1和CX1-His的表达进行35S的代谢标记。转染后48小时，通过³⁵S标记在COS7培养上清中检测到了预计的表达产物，其中主带CX1蛋白的大小约为20kD，CX1-His有23kD和26kD两种不同大小的表达产物(图4)。将pCX1-His质粒转染293细胞，经G418筛选得到稳定表达克隆细胞株，检测到相同的结果见图5A和5B。图5A是对重组表达质粒pCX1-His基因转染293细胞后培养上清中CX1-His表达产物进行³⁵S代谢标记检测的电泳图。泳道mock为转染空白载体的293细胞对照上清；泳道CX1-His为CX1-His表达产物。图5B是对重组表达质粒pCX1-His基因转染293细胞后培养上清中CX1-His表达产物进行Western印迹分析的电泳图。电泳结果都显示，出现了融合蛋白CX1-His的主带。实施例6细胞因子CX1融合蛋白CX1-IgG的纯化

融合表达质粒pCX1Fc转染CHO细胞，经G418筛选后，得到的稳定表达细胞株在HyQ CCM无血清培养基(Hyclone Inc.)中扩增培养。收集其培养上清，用Protein G亲和层析柱HiTrap(Pharmacia)纯化，经柠檬酸(pH3.0)洗脱后迅速调pH值至7.6，行15％SDS-PAGE电泳和银染检测其表观分子量和蛋白纯度(图6)，为单一条带。分析鉴定的CX1-IgG重组蛋白过滤后-20℃保存。实施例7细胞因子CX1对红白血病细胞TF1的增殖作用

待测细胞因子CX1重组表达上清、CX1-His融合蛋白的重组表达上清、纯化的融合蛋白CX1-IgG(500ng/ml)和人GM-CSF标准品在96孔培养板中行1∶2倍比稀释，每个稀释度设3个复孔，每孔50μl；加对数生长期的TF1细胞，最终的培养体系中含10％FCS。于37℃培养72小时后，MTT法检测对TF1的增殖作用。

结果如图7A-C所示，图7A显示了CX1基因转染的COS7细胞培养上清对TFl细胞的增殖作用。图7B显示了CX-His基因转染的293细胞培养上清对TF1细胞的增殖作用。图7C显示了CX1-IgG融合蛋白对TF1细胞的增殖作用。结果表明，发现不同稀释度含CX1和CX1-His培养上清对TF1均有一定的增殖作用(图7A和B)。纯化的CX1-IgG能有效刺激TF1细胞增殖，有效剂量约＞2ng/ml，而CTLA-IgG对照融合蛋白对TF1的增殖无明显作用(图7C)。实施例8细胞因子CX1对骨髓CD34⁺造血干细胞的增殖作用

从患者取下的胸骨冲洗出骨髓细胞，经淋巴细胞分离液梯度离心，悬浮于完全培养基培养2小时以去除其中的基质细胞；加入MACS标记液，非特异性阻断抗体液(A1)、生物素标记抗CD34单抗液(A2)和磁珠交联的抗生物素悬液(B)200μl经磁性细胞分离柱分选，收集阳性细胞。通过流式细胞仪(FACS calibur)检测细胞表面CD34的表达以鉴定细胞。

用IMDM配成1×10⁴/ml，在24孔板(1ml/孔)中培养，分别进行粒系和红系的体外诱导分化。粒系诱导体系为IL-3+GM-CSF+G-CSF；红系诱导体系为IL-3+EPO；生长因子的终浓度为IL-3和GM-CSF 20ng/ml,G-CSF为100U/ml,EPO2U/ml。于5％CO₂、37℃条件下培养3天。在上述粒系和红系的体诱导体系中加入100ng/ml的CX1-IgG融合蛋白，观察其对CD34⁺骨髓干细胞体外诱导分化的作用，同时用CTLA-IgG(100ng/ml)作为其对照。

第3天，采用甲基纤维素法进行粒单细胞集落形成细胞(CFU-GM)和红系细胞集落形成细胞(CFU-E)培养。加入20％胎牛血清、20％细胞IMDM培养液(含经诱导的CD34+细胞)、10％GM-CSF(100U/ml)和50％甲基纤维素(27g/L)。将混合物加入96孔培养板，100μl/孔，每组设3个复孔，置37℃、饱和湿度CO₂培养箱中培养。于培养后第7天，在倒置显微镜下计数集落，每个集落至少含40个细胞。

FACS检测CD34⁺细胞纯度＞88％。CX1单独对CD34⁺骨髓干细胞的体外增殖和分化无明显促进作用，但能促进GM-CSF/G-CSF/IL-3对CD34⁺骨髓干细胞的粒系诱导分化作用，见下表3。对照组CTLA-IgG融合蛋白无明显促进作用，见表4。CX1-IgG对IL-3/EPO诱导的红系分化具有显著的促进作用。

表1 CX1-IgG促进GM-CSF/G-CSF/IL-3诱导的CD34⁺骨髓干细胞粒系分化

Groups	CFU-GM(X±SD)
GM-CSF/IL-3/G-CSFGM-CSF/IL-D/G-CSF/CTLA4-IgGGM-CSF/IL-3/G-CSF/CS1-IgG	66.3±11.270.8±13.4120.2±15.7*
*p＜0.01，与对照相比表 2.CX1--IgG促进IL-3/EPO诱导的CD34+骨髓干细胞红系分化
		Groups	CFU-E(X±SD)
IL-3/EPOIL-3/EPO/CTLA4-IgGIL-3/EPO/CX1-IgG	73.7±15.077.3±16.0145.0±17.5*

^*p＜0.01，与对照相比

实施例9：抗人CX1蛋白抗体的产生

将实施例7中获得的重组蛋白CX1-IgG用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund′s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund′s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人CXl基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生沉淀。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                      序列表(1)一般信息：

(ⅱ )发明名称：新的人细胞因子、其编码序列及用途

(ⅲ)序列数目：10(2)SEQID NO：1的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：704bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQID NO：1：tccaggcggg cagcagctgc aggctgacct tgcagcttgg cggaATGGAC TGGCCTCACA 60ACCTGCTGTT TCTTCTTACC ATTTCCATCT TCCTGGGGCT GGGCCAGCCC AGGAGCCCCA 120AAAGCAAGAG GAAGGGGCAA GGGCGGCCTG GGCCCCTGGC CCCTGGCCCT CACCAGGTGC 180CACTGGACCT GGTGTCACGG ATGAAACCGT ATGCCCGCAT GGAGGAGTAT GAGAGGAACA 240TCGAGGAGAT GGTGGCCCAG CTGAGGAACA GCTCAGAGCT GGCCCAGAGA AAGTGTGAGG 300TCAACTTGCA GCTGTGGATG TCCAACAAGA GGAGCCTGTC TCCCTGGGGC TACAGCATCA 360ACCACGACCC CAGCCGTATC CCCGTGGACC TGCCGGAGGC ACGGTGCCTG TGTCTGGGCT 420GTGTGAACCC CTTCACCATG CAGGAGGACC GCAGCATGGT GAGCGTGCCG GTGTTCAGCC 480AGGTTCCTGT GCGCCGCCGC CTCTGCCCGC CACCGCCCCG CACAGGGCCT TGCCGCCAGC 540GCGCAGTCAT GGAGACCATC GCTGTGGGCT GCACCTGCAT CTTCTGAatt acctggccca 600gaagccaggc cagcagcccg agaccatcct ccttgcacct ttgtgccaag aaaggcctat 660gaaaagtaaa cactgacttt tgaaagcaaa aaaaaaaaaa aaaa                  704(2)SEQID NO：2的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：180个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：多肽

(ⅹⅰ)序列描述：SEQID NO：2：MDWPHNLLFL  LTISIFLGLG  QPRSPKSKRK  GQGRPGPLAP  GPHQVPLDLV  50SRMKPYARME  EYERNIEEMV  AQLRNSSELA  QRKCEVNLQL  WMSNKRSLSP  100WGYSINHDPS  RIPVDLPEAR  CLCLGCVNPF  TMQEDRSMVS  VPVFSQVPVR  150RRLCPPPPRT  GPCRQRAVME  TIAVGCTCIF                          180(2)SEQID NO：3的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：160个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：多肽

(ⅹⅰ)序列描述：SEQID NO：3：QPRSPKSKRK  GQGRPGPLAP  GPHQVPLDLV  SRMKPYARME  EYERNIEEMV  50AQLRNSSELA  QRKCEVNLQL  WMSNKRSLSP  WGYSINHDPS  RIPVDLPEAR  100CLCLGCVNPF  TMQEDRSMVS  VPVFSQVPVR  RRLCPPPPRT  GPCRQRAVME  150TIAVGCTCIF                                                  160(2)SEQID.NO：4的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：191个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：多肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQID NO：4：QPRSPKSKRK  GQGRPGPLAP  GPHQVPLDLV  SRMKPYARME  EYERNIEEMV  50AQLRNSSELA  QRKCEVNLQL  WMSNKRSLSP  WGYSINHDPS  RIPVDLPEAR  100CLCLGCVNPE  TMQEDRSMVS  VPVFSQVPVR  RRLCPPPPRT  GPCRQRAVME  150TIAVGCTCIF  PDPSSVPSFL  EQKLISEEDL  NSAVDHHHHH  H           191(2)SEQ D NO：5的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：395个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：多肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQID NO：5：QPRSPKSKRK  GQGRPGPLAP  GPHQVPLDLV  SRMKPYARME  EYERNIEEMV  50AQLRNSSELA  QRKCEVNLQL  WMSNKRSLSP  WGYSINHDPS  RIPVDLPEAR  100CLCLGCVNPF  TMQEDRSMVS  VPVFSQVPVR  RRLCPPPPRT  GPCRQRAVME  150TIAVGCTCIF  PDPEPKSSDK  THTSPPSPAP  ELLGGPSVFL  FPPKPKDTLM  200ISRTLEVTCV  VVDVSHEDLE  VKFNWYVDGV  EVHNAKTKPR  EEQYNSTYRV  250VSVLTVLHQD  WLNGKEYKCK  VSNKALPAPI  EKTISKAKGQ  PREPQVYTLP  300PSRDELTKNQ  VSLTCLVKGF  YPSDIAVEWE  SNGQPENNYK  TTPPVLDSDG  350SFFLYSKLTV  DKSRWQQGNV  FSCSVMHEAL  HNHYTQKSLS  LSPGK       395(2)SEQIDNO：6的信息(ⅰ)序列特征

(A)长度：31碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ )分子类型：寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述：SEQID NO：6：GGAATTCGCC ACCATGGACT GGCCTCACAA C                       31(2)SEQID NO：7的信息(ⅰ)序列特征

(A)长度：30碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述：SEQID NO：7：GGGGTACCTC AGAAGATGCA GGTGCAGCCC                         30(2)SEQID NO：8的信息(ⅰ)序列特征

(A)长度：23碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述：SEQIDNO：8：GGATCCGGGA AGATGCAGGT GCA                                23(2)SEQID NO：9的信息(ⅰ)序列特征

(A)长度：28碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述：SEQID NO：9：CGGGATCCGC CCAAATCTTC TGACAAAC                           28(2)SEQID NO：10的信息(ⅰ)序列特征

(A)长度：30碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述：SEQID NO：10：GGGGTACCTC ATTTACCCGG AGACAG                             26

Claims (16)

1．一种分离的人CX1蛋白多肽，其特征在于，它包含：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

2．如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有选自下组氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQID NO：4和SEQ ID NO：5。

3．一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性：

(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4．如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQID NO：2或SEQID NO：3所示氨基酸序列的多肽。

5．如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO：1中45-587位的序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中105-587位的序列；

(c)具有SEQ ID NO：1中1-704位的序列。

6．一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7．一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。

8．一种具有人CX1蛋白活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达人CX1蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出具有人CX1蛋白活性的多肽。

9．一种能与权利要求1所述的人CX1蛋白特异性结合的抗体。

10．一种核酸分子，它含有权利要求3所述的多核苷酸中连续的10-704个核苷酸。

11．一种检测CX1蛋白生物学活性的方法，其特征在于，包括：

将样品与CX1反应性细胞接触，

观察CX1反应性细胞的增殖是否被促进，CX1反应细胞的增殖被提高就表示样品中存在CX1蛋白活性。

12．如权利要求11所述的方法，其特征在于，该CX1反应性细胞是TF1细胞。

13．一种检测样品中是否存在CX1蛋白的方法，其特征在于，包括：

将样品与权利要求9所述的抗体接触，

观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CX1蛋白。

14．如权利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，它被用于筛选促进人CX1蛋白活性的激动剂，或者筛选抑制人CX1蛋白活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。

15．一种如权利要求10所述的核酸分子的用途，其特征在于，它被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

16．一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽以及药学上可接受的载体。

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