CN1385441A - 新的人淋巴因子、其编码序列及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的人淋巴因子－JY1蛋白,编码JY1蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种JY1蛋白的方法。JY1蛋白是TSLP的同源分子。本发明还公开了编码这种JY1蛋白的多核苷酸的用途。本发明还公开了此JY1蛋白受体用于治疗多种疾病(如肿瘤、炎症和免疫***疾病)的方法。本发明还提供了含JY1蛋白的药物组合物。

Description

新的人淋巴因子、其编码序列及用途

本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及新的编码人淋巴因子-JY1的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。具体地说，本发明的多肽是一种新的与免疫有关的淋巴因子，它是小鼠TSLP蛋白的同源分子。

细胞生长因子在免疫反应中能影响淋巴细胞的发育，因此对免疫调解起到关键作用。比如白细胞介素7就对B淋巴细胞和T淋巴细胞的发育和增生起到极大的促进作用。针对白细胞介素7的受体的抗体就能够明显抑制B淋巴细胞在体内和体外的发育。

在过去几年，研究人员对B和T淋巴细胞从未成熟的前体细胞发育成有功能的成熟细胞的过程投入了大量的精力。研究人员发现，这一过程受到多种功能相互重叠的可溶性和膜连接的配体的调解。尽管已经有一系列能影响淋巴细胞分化和增生的细胞因子已经被发现，但在体外***中，研究人员还不能用这些因子还原淋巴细胞在体内分化增生的每一步。很显然，应该有更多的细胞因子有待发现。

在1994年，研究人员第一次发现了一种新的淋巴细胞因子的活性，这种活性是从小鼠胸腺基质(stromal)细胞中鉴定出来的，当时其基因的序列并不知道。研究发现，这种新的因子的功能应该与白细胞介素7的功能有所重叠，既能刺激胸腺细胞和T淋巴细胞，也能促进在胚胎肝和骨髓中的B淋巴细胞前体的成熟和生长。小鼠的TSLP基因最终在2000年被Paxton实验室克隆，其受体也在同一年被克隆。正如其他增血细胞因子一样，小鼠TSLP和白细胞介素7的各自受体共用其中一条链。小鼠TSLP受体的另一条链是在2000年克隆的，叫TSLPR。小鼠TSLP和白细胞介素7一样，都能激活STAT5，但激活的方式有所区别。

小鼠的TSLP基因是在2000年9月4日由美国IMMUNEX公司克隆的，其DNA和蛋白序列在实验医学杂志上发表。蛋白全长为140个氨基酸。由于在ATG前没有转译停止编码，于是研究人员怀疑该基因所编译的蛋白可能比已知的要长，即该基因有可能不是全长的基因。该小鼠基因在胸腺、脾脏、骨髓、***和肺里都有表达，但在脑、肝、心、和骨骼肌里没有发现有表达。

尽管小鼠的TSLP已被克隆，但人类的相对应的TSLP尚未被发现。鉴于淋巴因子在人体中常发挥重要作用，其异常或变异经常与某些疾病相关，因此本领域迫切需要开发新的新的淋巴因子。

本发明的目的是提供一种新的人淋巴因子JY1蛋白以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的JY1多肽，该多肽是人源的，它包含：具有SEQ ID NO：2或6氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2或6氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性：(a)编码上述人JY1多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2或6所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中53-529位的序列；(b)具有SEQ ID NO：1中137-529位的序列；(c)具有SEQ ID NO：1中1-557位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备具有人JY1蛋白活性的多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达人JY1蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人JY1蛋白活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了与上述的人JY1多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的10-557个核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗人JY1多肽活性的化合物，以及抑制人JY1多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是人JY1多肽的编码序列或其片段的反义序列。

在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在JY1蛋白的方法，它包括：将样品与JY1蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在JY1蛋白。

在本发明的第八方面，提供了一种检测与人JY1多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括：检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。

在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进人JY1多肽活性的激动剂，或者筛选抑制人JY1多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的人JY1蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的人JY1多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可***、炎症、免疫异常等病症。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

下列图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1是本发明的人淋巴因子JY1的基因组序列，其中外显子和内含子的交界处的gt和ag都用横线标出。蛋白转译的起始编码ATG和终止编码TAG、TGA、或TAA也以大号字符标出。外显子用粗体标出。

图2显示了一些编译有相似蛋白的人类EST片段核苷酸序列。

图3是淋巴因子JY1的cDNA序列，其中非编码序列用小写字母表示，编码序列用大写字母表示。

图4是本发明的人JY1蛋白的全长氨基酸序列。其中N端的1-28位氨基酸构成了信号肽。

图5是本发明的人淋巴因子JY1与小鼠TSLP的氨基酸序列同源性比较图。上方序列是人JY1，下方序列是人TSLP蛋白。相同的氨基酸在两个序列之间用单字符缩写标出，相似的氨基酸用“+”标出。相同的半胱氨酸在序列下方用“^*”标出。

图6是本发明的人JY1蛋白编码序列的电泳图。

图7是本发明的人JY1的Northern印迹图谱。

图8是本发明的重组人JY1蛋白的电泳图。

图9显示在淋巴因子JY1(10ng/毫升)刺激下，IgM阳性的B淋巴细胞数目明显增加。

图10显示了重组淋巴因子JY1对树突状细胞的激活作用。

图11显示了由重组淋巴因子JY1激活的树突状细胞对T淋巴细胞的生长的刺激作用。

重组淋巴因子JY1对树突状细胞的激活作用。

在本发明中，术语“JY1蛋白”、“JY1多肽”或“淋巴因子JY1”可互换使用，都指具有人淋巴因子JY1氨基酸序列(SEQ ID NO：2或6)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的淋巴因子JY1。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的JY1蛋白或多肽”是指JY1多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化JY1蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括人JY1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人JY1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“人JY1多肽”指具有人JY1蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与人JY1蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人JY1蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人JY1 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人JY1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人JY1多肽或其片段的融合蛋白(如SEQ ID NO：3所示的融合蛋白)。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人JY1多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人JY1多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供人JY1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人JY1多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“人JY1蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2或6的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

                      表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2或6的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码淋巴因子JY1的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或***，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码JY1蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的人JY1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或JY1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的JY1多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人JY1多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，人JY1多核苷酸序列可***到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人JY1编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，coldSpring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中***增强子序列时将会使转录得到增强。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。

当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的人JY1蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗JY1蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗JY1蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人JY1蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人JY1蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对人JY1 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人JY1基因产物或片段。较佳地，指那些能与人JY1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人JY1蛋白的分子，也包括那些并不影响人JY1蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人JY1基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人JY1基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人JY1蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人JY1蛋白功能的抗体以及不影响人JY1蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人JY1基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人JY1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人JY1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人JY1蛋白。此外，与人JY1蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与人JY1蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人JY1蛋白的产生或活性。

抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人JY1蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人JY1蛋白阳性的细胞(例如***细胞等)。

多克隆抗体的生产可用人JY1蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与JY1蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于肿瘤、炎症、免疫异常等方面的治疗。在使用本发明JY1蛋白时，还可同时使用其他治疗剂，如TNF-α、TNF-β等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明JY1多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的JY1蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

人JY1蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于JY1蛋白的无表达或异常/无活性的JY1蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的JY1蛋白，以抑制内源性的JY1蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将JY1基因转移至细胞内。构建携带JY1基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人JY1基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

抑制人JY1 mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

能与人JY1蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对人JY1蛋白分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测人JY1蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人JY1蛋白水平，可以用作解释人JY1蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断JY1蛋白起作用的疾病。

一种检测检测样品中是否存在JY1蛋白的方法是利用JY1蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与JY1蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在JY1蛋白。

JY1蛋白的多聚核苷酸可用于JY1蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，JY1蛋白的多聚核苷酸可用于检测JY1蛋白的表达与否或在疾病状态下JY1蛋白的异常表达。如JY1 DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断JY1蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用JY1蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测JY1蛋白的转录产物。

检测JY1基因的突变也可用于诊断JY1蛋白相关的疾病。JY1蛋白突变的形式包括与正常野生型JY1 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。然后可通过连锁分析，确定JY1基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2或6所示氨基酸序列的JY1多肽。本发明的多核苷酸是从人脾细胞cDNA文库中分离出的。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为557个碱基，其开放读框位于53-529位，编码全长为159个氨基酸的人JY1蛋白(SEQ ID NO：2)。本发明的JY1蛋白与小鼠的TSLP有41％的相似性，因而将它命名为淋巴因子JY1。研究表明，淋巴因子JY1是一个新的人类淋巴细胞因子，其功能与小鼠的TSLP有不同之处，能调解免疫***，因此对治疗免疫疾病、炎症、和癌症有极大作用，具有巨大的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

淋巴因子JY1基因的发现

本发明人利用生物信息学的方法，使用小鼠在GenBank发表的蛋白序列(编号AF232937)，用tblastn的方法在NCBI的公用网站：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi？CMD＝Web&LAYOUT＝Two Windows&AUTO_FORMAT＝Semiauto&ALIGNMENTS＝50&ALIGNMENT_VIEW＝Pairwise&CLIENT＝web&DATABASE＝nr&DESCRIPTIONS＝100&ENTREZ_QUERY＝(none)&EXPECT＝10&FILTER＝L&FORMAT_OBJECT＝Alignment&FORMAT_TYPE＝HTML&GENETIC_CODE＝0&HITLIST_SIZE＝100&NCBI_GI＝on&PAGE＝Translations&PROGRAM＝tblastn&SERVICE＝plain&SET_DEFAULTS.x＝23&SET_DEFAULTS.y＝10&SHOW_OVERVIEW＝on&UNGAPPED_ALIGNMENT＝no&END_OF_HTTPGET＝Yes，在人类est_human数据库或人类基因组数据库nr中寻找与小鼠TSLP相似蛋白。

选择的参数如下：

filter＝low complexity

expect＝10

MATRIX＝BLOSUM62

Gap Cost＝Existence：11 Extension：1

结果发现了一些编译有相似性的蛋白的EST片段或人类基因组序列：

AC008572是人类第5对染色体克隆CTC-551A13，包括外显子和内含子在内(图1和SEQ ID NO：5)。

EST片断AA889581编码淋巴因子JY1的N端。BG532037、BF244565、BF219288、BG496490、BG493158等五个EST片段(图2)共同编码淋巴因子JY1的C端。

实施例2

淋巴因子JY1的cDNA的克隆

基于淋巴因子JY1的DNA序列，设计并合成了以下两个寡聚核苷酸做PCR克隆：

TCGTGGTGGG AAGAGTTTAG TG(SEQ ID NO：3)

GAAATATGACCATAATAAAGATGGT(SEQ ID NO：4)

模板是Clontech公司的脾细胞cDNA库。使用pfu聚合酶(Stratagene)做PCR克隆，经过35个循环(50微升体积，60℃-1分钟，90℃-1分钟，400nM引物，200mMdNTP)后，再在72℃孵化10分钟。在琼脂糖凝胶上产生了一个明显的大小约550bp的条带(图6)。

将分离出的PCR产物克隆到Invitrogen的TA克隆载体上，建成pCMVJY1构建物后进行DNA测序。

测序结果验证了用生物信息学方法发现的淋巴因子JY1基因的DNA序列。具体而言，淋巴因子JY1的DNA序列如图3和SEQ ID NO：1，ORF位于53-529位。从DNA序列翻译出来的JY1的蛋白有159个氨基酸，其序列如图4和SEQ ID NO：2所示，其中N端有28个氨基酸的信号肽。成熟的淋巴因子JY1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

将人淋巴因子JY1的蛋白序列与小鼠TSLP蛋白进行氨基酸比对，发现两者有41％的相似(图5)。尤其是两个蛋白中的绝大多数半胱氨酸是高度保守的，这暗示两个蛋白虽然同源性并不高，但是结构可能很相似。

实施例3

淋巴因子JY1在组织器官内的表达

使用实施例2中的两个寡聚核苷酸引物通过PCR合成探针，进行Northern印迹分析，以检测淋巴因子JY1在组织器官内的表达。

结果发现了一个约1.4kb的条带，淋巴因子JY1在脾脏、胸腺、***、小肠、和结肠等器官组织内有表达(图7)。

实施例4

淋巴因子JY1的重组表达和提纯

将pCMVJY1和抗新霉素基因表达质粒共同感染哺乳动物细胞CHO细胞，在新霉素选择下建成稳定的基因表达细胞系。

细胞培养液随后通过离心、透析、过滤和分离柱等几步提纯淋巴因子JY1。提纯过程中使用SDS凝胶和考马斯蓝染色来观察蛋白的纯度。结果发现，在22kDa处有一蛋白质条带，分子量大于预测的成熟淋巴因子JY1的分子量(带信号肽的JY1的预测分子量为18.1kDa，无信号肽的JY1的预测分子量为15kDa)(图8)，这可能与真核表达的淋巴因子JY1存在糖基化有关。

实施例5

重组淋巴因子JY1诱导IgM+的B淋巴细胞发育

小鼠的TSLP曾被发现对B淋巴细胞的发育有促进作用，能支持小鼠的骨髓细胞在琼脂糖中长成集落，并刺激IgM^-的骨髓细胞发育成IgM⁺的细胞。

在本实施例中，将人的骨髓细胞(IgM^-)被分离出来后，在含有或不含有实施例4制备的淋巴因子JY1的情况下，在甲基纤维素上培养7天后，用anti-IgM抗体进行染色。

结果如图9所示，在10ng/毫升淋巴因子JY1刺激下，IgM阳性的B淋巴细胞数目明显增加。

实施例6

重组淋巴因子JY1激活树突状细胞

成熟的树突状细胞是一种重要的免疫调节细胞，它能将抗原处理后提供给T淋巴细胞以启动免疫反应。如果这种抗原是肿瘤特异性的抗原，树突状细胞就能为人体启动抗肿瘤的免疫***。树突状细胞的成熟过程可以通过其表面标记如CD40、CD80、CD86等的表达来检测。

在本实施例中，从血中提取CD11c+的未成熟的树突状细胞，在含有或不含有实施例4制备的淋巴因子JY1(10ng/毫升)的情况下，培养未成熟的树突状细胞，以检测JY1是否能影响树突状细胞的成熟过程。

实验结果如图10所示，表明JY1能明显增加树突状细胞的CD86表达，促进树突状细胞的成熟。

实施例7

重组淋巴因子JY1激活的树突状细胞能刺激T淋巴细胞的生长

成熟的树突状细胞的另一项功能指标是它能激活T淋巴细胞。在本实施例中，将树突状细胞与CD4⁺T淋巴细胞共同培养，再加上2.5、5.0和7.5ng/毫升的不同蛋白浓度的淋巴因子JY1，通过³H的标记，检测T淋巴细胞的增生情况。

结果如图11所示，在JY1存在时，T淋巴细胞的增生有很明显的增加。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                          序列表<110>罗，楹

 吴，骏<120>新的人淋巴因子、其编码序列及用途<130>012696<160>6<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>557<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(53)..(529)<400>1tcgtggtggg aagagtttag tgtgaaactg gggtggaatt gggtgtccac gt atg ttc      58

                                                      Met Phe

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        20                  25                  30Asn Cys Asp Phe Glu Lys Ile Lys Ala Ala Tyr Leu Ser Thr Ile Ser

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50                  55                  60Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His Cys Leu Thr Glu Ile Gln65                  70                  75                  80Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly Cys Ala Ser Leu Ala Lys Glu

            85                  90                  95Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala Ile Trp Cys Pro Gly

        100                 105                 110Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met Lys Lys Arg Arg

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        20                  25                  30Thr Glu Phe Asn Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His Cys Leu

    35                  40                  45Thr Glu Ile Gln Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly Cys Ala Ser

50                  55                  60Leu Ala Lys Glu Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala Ile65                  70                  75                  80Trp Cys Pro Gly Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met

            85                  90                  95Lys Lys Arg Arg Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln

        100                 105                 110Val Ser Gln Leu Gln Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg Pro Leu Leu

    115                 120                 125Lys Gln Gln

130

Claims (10)

1.一种分离的人JY1多肽，其特征在于，它包含：具有SEQ ID NO：2或6氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO：2或6氨基酸序列的多肽。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性：

(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2或6所示氨基酸序列的多肽。

5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO：1中53-529位的序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中137-529位的序列；

(c)具有SEQ ID NO：1中1-557位的序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。

8.一种具有人JY1蛋白活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达人JY1蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出具有人JY1蛋白活性的多肽。

9.一种能与权利要求1所述的人JY1蛋白特异性结合的抗体。

10.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽以及药学上可接受的载体。

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