CN1295509C - 一种检测血液中磷酸根的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明使用镱离子、以邻苯二酚紫为显色剂在pH6.5-7.5的HEPES缓冲溶液定性、定量地去测定血液磷酸根的含量，测定过程简单，方便，测量结果准确。此方法灵敏度高，而且不受血液中其它成份的干扰，可以应用于临床。

Description

一种检测血液中磷酸根的方法
技术领域：
本发明涉及一种磷酸根的检测方法，具体属于一种检测血液中磷酸根的方法。
背景技术：
磷是在人体中含量较多的元素之一，仅次于钙。百分之八十和钙结合并存于骨骼和牙齿中，剩余的百分之二十分布于神经组织等软组织中，血液中的无机磷酸盐只占极少部分，构成血液的缓冲体系。血液中含有过多的无机磷酸盐则可能的情况是：甲状旁腺机能减退、晚期慢性肾炎、维他命D摄取过多、多发性骨髓瘤或处于骨折愈合期。血液中无机磷酸盐过低的话，可能会有甲状旁腺机能亢进、肾小管变性病变、佝偻病或软骨病、继发性甲状旁腺增生、长期腹泻或吸收不良等疾病。因此，在临床上，测定血液中无机磷酸盐的指标作为血样分析的常规方法。
关于测定血液的磷酸根，以往国内外的方法可归纳为以下几种：
1、使用离子色谱检测血液中的磷酸根(L.Opliti，R.Chiaraluce，V.Consalvi，N.Cetulli and R.Scandurra，Clinica Chimica Acta，184(1989)155-166)；
2、序列注射固定酶方法测定血液中的无机磷酸根(M.D.Luque de Castro，RafaelQuiles.Juan M.Fernández-Romero，and Ernesto Fernández，Clin.Chem，41/1(1995)99-102)；
3、使用合成的受体测定血液中的磷酸根(Suzanne L.Tobey and Eric V.Anslyn，Organic Letter，Vol.5，No.12，(2003)2029-2031)；
但以上的这些方法分别存在一些问题：
1、离子色谱在临床上测量血液中的磷酸根由于窄的线性范围，需要稀释血液，才能去测量。
2、序列注射固定酶方法测定血液中的无机磷酸根，受能还原过氧化氢物质的干扰。
3、使用合成的受体测定血液中的磷酸根，由于需要大量的合成工作并且需要筛选受体，同时还会受到受体水溶性的限制，所以给测量工作带来许多的不便。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种简单、灵敏、快速的、定量检测血液中磷酸根的方法。
本发明提供一种检测血液中磷酸根的方法，该方法基于镱离子、以邻苯二酚紫为显色剂在pH为6.5-7.5的HEPES缓冲溶液中定量地检测血液中的磷酸根，其具体检测步骤如下：
1、取人血样，在高速台式离心机上离心得上层淡黄清液，放置2小时；
2、取上述上层淡黄清液，转入超滤杯，在室温及5×105Pa的氮气条件下使用截留分子量为10kD的PM-10超滤膜用超滤器超滤，收取滤出的无色清亮液，在-17℃至-20℃保存，以供测量；
3、配制pH6.5-7.5的HEPES缓冲溶液，并配制2×10-3M的Yb3+溶液和2×10-3M的邻苯二酚紫溶液；
4、把2ml的HEPES缓冲溶液加到干净的紫外比色皿中，作为空白，用微量进样器吸取2×10-3M的邻苯二酚紫溶液10-100μl，加到此比色皿中，此时溶液由无色变黄，在紫外可见分光光度仪上检测，443nm有最大吸收；
5、在上述的比色皿中，加入摩尔数2倍于邻苯二酚紫溶液的Yb3+溶液，此时溶液由黄变蓝，在紫外可见分光光度仪上检测，发现最大吸收峰由上述的443nm变为623nm；
6、取上述无色清亮液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在紫外可见分光光度仪上检测，随着清亮液的加入，最大吸收峰又由623nm逐渐向443nm变回，溶液的颜色也逐渐由蓝变回黄色，当吸收峰在443nm达到最大，溶液的颜色完全变黄时，停止加清亮液；
7、按[Yb3+]×2/V血液计算出血液中磷酸根的含量。
所述的Yb3+溶液是YbCl3溶液或Yb(ClO4)3的溶液。
所述的Yb3+可以用Nd3+、Sm3+、Gd3+、Er3+或Ho3+代替。
本发明具有如下优点：1、不需要合成任何试剂，在紫外可见分光光度仪上检测，检测过程简单，而且可以用肉眼明显观察到此效应；2、我们的检测方法，对磷酸根显示了很好的选择性；3、我们的检测是定量的，有很大的线性范围，而且误差很小；显然，此发明可以应用到临床上检测血液中的磷酸根。
附图说明：
图1至图8是相应实施例1至实施例8的检测血液中磷酸根的紫外可见吸收图。
具体实施方式：
实施例1：
取人血样，在TGL-16B型高速台式离心机上离心得上层淡黄清液放置2小时；取上述上层淡黄清液6ml，转入10ml超滤杯，在室温及5×105Pa的氮气条件下使用截留分子量为10kD的PM-10超滤膜，用Amicon Model 8010超滤器超滤，收取滤出的无色清亮液，在-17℃至-20℃保存，以供测量；配制pH7.0的HEPES(10mM)缓冲溶液，并配制2×10-3M的YbCl3溶液和2×10-3M的邻苯二酚紫溶液；把2ml的HEPES缓冲溶液加到干净的紫外比色皿中，作为空白，用微量进样器吸取2×10-3M的邻苯二酚紫溶液50μl，加到此比色皿中，此时溶液由无色变黄，在紫外可见分光光度仪上检测，443nm有最大吸收；在上述的比色皿中，加入2×10-3M的Yb3+溶液100μl，此时溶液由黄变蓝，在紫外可见分光光度仪上检测，发现最大吸收峰由上述的443nm变为623nm；取上述清亮液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在HP8453紫外可见分光光度仪上检测，随着清亮液的加入，最大吸收峰又由623nm逐渐向443nm变回，溶液的颜色也逐渐由蓝变回黄色，当吸收峰在443nm达到最大，溶液的颜色完全变黄时，此时清亮液加入量为90μl；计算：100×2/90，得血液中磷酸根含量为2.22mmol/L，紫外可见吸收图见图1。
按实施例1测10个人血液，得血液中磷酸根含量为1.42-2.22mmol/L与医学上统计的血液中无机磷酸盐含量范围(0.81-2.26mmol/L)吻合。
实施例2：配制pH6.5的HEPES(10mM)缓冲溶液，其余同实施例1，得血液中磷酸根含量为2.22mmol/L，紫外可见吸收图见图2。
实施例3：用Yb(ClO4)3的溶液，取另一人的血液，其余同实施例1，100×2/125，得血液中磷酸根含量为1.60mmol/L，紫外可见吸收图见图3。
实施例4：用ErCl3的溶液，其余其余同实施例1，100×2/90，得血液中磷酸根含量为2.22％，紫外可见吸收图见图4。
实施例5：用Nd(ClO4)3的溶液，其余同实施例1，100×2/90，得血液中磷酸根含量为2.22mmol/L，紫外可见吸收图见图5。
实施例6：用Sm(ClO4)3的溶液，其余同实施例1，100×2/90，得血液中磷酸根含量为2.22mmol/L，紫外可见吸收图见图6。
实施例7：用GdCl3的溶液，其余同实施例1，100×2/90，得血液中磷酸根含量为2.22mmol/L，紫外可见吸收图见图7。
实施例8：用HoCl3的溶液，其余同实施例1，100×2/90，得血液中磷酸根含量为2.22mmol/L，紫外可见吸收图见图8。

Claims (2)

1、一种检测血液中磷酸根的方法，其特征在于，该方法包括如下检测步骤：
(1)取人血样，在高速台式离心机上离心得上层淡黄清液，放置2小时；
(2)取上述上层淡黄清液，转入超滤杯，在室温及5×105Pa的氮气条件下使用截留分子量为10kD的PM-10超滤膜用超滤器超滤，收取滤出的无色清亮液，在-17℃至-20℃保存，以供测量；
(3)、配制pH6.5-7.5的HEPES缓冲溶液，并配制2×10-3M的Yb3+溶液和2×10-3M的邻苯二酚紫溶液；
(4)、把2ml的HEPES缓冲溶液加到干净的紫外比色皿中，作为空白，用微量进样器吸取2×10-3M的邻苯二酚紫溶液10-100μl，加到此比色皿中，此时溶液由无色变黄，在紫外可见分光光度仪上检测，443nm有最大吸收；
(5)、在上述的比色皿中，加入摩尔数2倍于邻苯二酚紫溶液的Yb3+溶液，此时溶液由黄变蓝，在紫外可见分光光度仪上检测，最大吸收峰由上述的443nm变为623nm；
(6)、取无色清亮液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在紫外可见分光光度仪上检测，随着清亮液的加入，最大吸收峰又由623nm逐渐向443nm变回，溶液的颜色也逐渐由蓝变回黄色，当吸收峰在443nm达到最大，溶液的颜色完全变黄时，停止加无色清亮液；
(7)、按[Yb3+]×2/V血液计算出血液中磷酸根的含量；
其中，所述的Yb3+溶液是YbCl3溶液或Yb(ClO4)3溶液。
2、按权利要求1或2所述的一种检测血液中磷酸根的方法，其特征在于所述的Yb3+可以用Nd3+、Sm3+、Gd3+、Er3+或Ho3+代替。
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