CN1294909C - 一种新型抗生物细胞自由基氧化损伤合剂 - Google Patents

Abstract

该合剂用维生素C、维生素E、褪黑素三种抗氧化剂组成，此组成构成了一种新型抗生物细胞自由基氧化损伤合剂，可将其作为一种新型高效抗生物细胞自由基氧化损伤物质应用于与生物细胞自由基氧化损伤有关的各领域。这些领域是防治与细胞自由基氧化损伤有关的疾病，如神经***退行性病变(早老性痴呆、帕金森性病、脑硬化)、中风、心血管疾病(心绞痛、心肌缺血、冠状动脉粥样硬化)、肿瘤、白内障及皮肤的弹性下降、皮肤皱纹，又如用于心脏手术、溶血栓治疗、器官移植领域、皮肤的护理以及肿瘤的放疗、化疗的支持辅助用药，而其效果比单独使用合剂中的任一成份要高得多，同时又克服了单独使用某一抗氧化剂引起的过氧化现象等缺陷。

Description

一种新型抗生物细胞自由基氧化损伤合剂

技术领域：本发明是生物技术领域中一种新型抗生物细胞自由基氧化损伤合剂。

背景技术：随着现代医学科学技术的进展，人们已经认识到细胞的自由基氧化损伤与健康之间的关系。越来越多的证据显示，许多疾病都是由于机体氧化与抗氧化失衡所致。当机体抗氧化功能低下时，过量的自由基会攻击细胞，造成细胞氧化损伤；细胞氧化损伤达到一定程度时，人体将会产生各种各样的疾病。目前已经证实的与自由基氧化损伤有关的病理变化和疾病包括衰老、神经***退行性病变(老年性痴呆、帕金森氏病、脑硬化)、中风、心血管疾病(心绞痛、心肌缺血、冠状动脉粥样硬化)、肿瘤、白内障及皮肤的弹性下降、皮肤皱纹等等。除此之外，某些疾病的治疗过程中，也可产生大量的自由基。如心脏手术时必须暂时阻断局部的血流供应，或在溶血栓的治疗时，重开血流供应，又如在人体器官移植时，供体器官在被贮存和运输过程中，也会造成细胞的缺氧与缺血，这些治疗过程往往会导致缺血与再灌注，造成缺血与再灌注损伤，影响治疗效果，缺血与再灌注损伤主要病理的基础就是器官的自由基氧化损伤。再如在肿瘤的放疗与化疗过程中，也会产生大量的自由基，引起机体广泛的氧化损伤，导致其它副作用，因此，这些氧化损伤极大的降低和限制了手术、放疗、化疗的临床效果，甚至有时加重了患者的症状，针对细胞自由基氧化损伤，及其在疾病发生过程中的危害性，抗氧化剂已被广泛用于临床，并在预防与治疗上述疾病过程中出现的副作用，取得了一定的效果。

目前抗生物细胞氧化损伤的抗氧化剂，多达数十种，而最常用的，包括小分子量的维生素C、维生素E、辅酶O、褪黑素、谷胱苷肽等等，大分子的抗氧化剂有超氧化歧化酶、过氧化酶等。大部分抗氧剂的作用都有相似之处，这些抗氧化剂都能提供电子中和有害的自由基。但是，由于分子结构的差别，不同的抗氧化剂在细胞中的分布不同，因此，它们的抗氧化作用就存在很大的差别。经典的抗氧化剂有维生素C，维生素C的英文拼写(Ascorbic acid或Vitamin C)，许多动植物食品中都有不同含量维生素C，维生素C于1933年由英国化学家Walter Haworth首先合成，被作为抗氧化剂广泛应用，属于水溶性物质，在机体内主要分布在细胞浆中，很少存在于细胞膜里，所以对细胞膜的抗氧化作用有限。另一种经典的抗氧化剂是维生素E，维生素E的英文拼写为(α-Tocopherol或Vitamin E)，许多动植物食品中也含有不同量的维生素E，维生素E于1922年由美国科学家Herbert M Evans所发现，同样作为抗氧化剂而被广泛应用，维生素E属脂溶性物质，分布在细胞膜中，在胞浆中的含量低，主要为保护生物细胞膜的氧化，而对细胞水溶性成份保护效果欠佳。维生素C与维生素E作为抗氧化剂都存在一个明显的缺陷，即在一定的条件下，例如细胞内有游离铁离子时，维生素C还可以导致促氧化作用，可能会进一步损伤那些需要保护的细胞结构。新型的抗氧化剂有褪黑素，褪黑素的英文拼写为(Melatonin)于1958年由美国科学家Aaron B Lerner所发现，在人体中主要由大脑中的松果体腺分泌，某些植物中也有一定的含量，首先被用于改善睡眠，1993年后国内外广泛用于抗氧化健康食品领域，褪黑素具有水脂兼溶性，按一定的比例分布于细胞结构中，能够有效的保护细胞的各种结构，使其免受自由基损伤，同时褪黑素不会引起促氧化作用。维素生C和维生素E与褪黑素是目前最为常用的抗氧化剂。

发明内容：不同的抗氧剂之间存在着一种内在的互动关系，同时不同的抗氧化剂在细胞中的分布不同，基于抗氧化剂的这两大特点，申请人通过理论分析与实验检验，发明了一种全新的抗生物细胞自由基氧化损伤合剂，本发明的创造性就在于抓住了新型抗氧化剂褪黑素能与经典抗氧化剂维生素C、维生素E之间产生一种细胞内互动的代谢联系，这种代谢联系一方面能有效抑制维生素C的促氧化作用，另一方面，又能相互间增强各自的抗氧能力，形成一种高效的抗氧化合剂。这种高效抗氧化合剂中的褪黑素与维生素的内部代谢机理如下：当维生素E清除掉细胞膜上的自由基后，便形成维生素E自由基，此时，维生素C可提供一个电子使维生素E自由基再一次还原成有抗氧化作用的维生素E，而失去一个电子的维生素C在细胞浆内接受谷胱苷肽提供的一个电子，又还原成有抗氧化功能的维生素C；褪黑素在细胞膜及细胞浆内都能清除其中的自由基，然后失去一个电子形成褪黑素自由基，维生素C可提供一个电子给褪黑素自由基，使还原成有抗氧化功能的褪黑素，而失去一个电子的维生素C自由基又在细胞浆内接受谷胱苷肽提供的一个电子，还原成有抗氧化功能的维生素C，所以，维生素C、维生素E和褪黑素实际上在机体内形成了一个共同的抗氧化网络，极大的提高了各自的抗氧化能力。在抗氧化网络中，由于褪黑素能在细胞浆内和细胞膜上均匀分布，起到了联系细胞浆中的维生素C与细胞膜中维生素E的桥梁作用。根据以上理论分析，申请人产生了一个创造性思维，首次明确提出，维生素C、维生素E、和褪黑素按一定的比例组合，能形成一种新型高效抗生物细胞自由基氧化损伤合剂，至目前止，经检索，国内外尚无用维生素C、维生素E、褪黑素三种抗氧化剂组成一种新型抗生物细胞自由基氧化损伤合剂，并将其应用于与生物细胞自由基氧化损伤有关领域的报道与专利。

发明目的：该新型抗生物细胞自由基氧化损伤合剂的各组成成份均为天然物质，它们分别作为抗生物细胞自由基氧化损伤的保健食品在市场上被广泛使用，所以，这种合剂能够安全高效的用于防治前文所述的与细胞自由基氧化损伤有关的疾病，如神经***退行性病变(早老性痴呆、帕金森性病、脑硬化)、中风、心血管疾病(心绞痛、心肌缺血、冠状动脉粥样硬化)、肿瘤、白内障及皮肤的弹性下降、皮肤皱纹，和用于心脏手术、溶血栓治疗、器官移植领域、皮肤的护理以及肿瘤的放疗、化疗的支持辅助用药。因此该新型抗生物细胞自由基氧化损伤合剂可广泛的用于与生物细胞自由基氧化损伤有关的药品，医疗，器官移植领域中的离体生物器官的贮存与运输的保护，保健食品，化妆品领域而其效果比单独使用合剂中的任一成份要高得多，并可以从下面实施实验中显示出来，同时又克服了单独使用某一成份的缺陷。

具体实施方式：自由基氧化损伤对细胞的破坏是多方面的，医学理论认为如上所述的诸多疾病与自由基对细胞的破坏有关，并从理论上以及致病机理上都有了明确的解释，同时就自由基对细胞的氧化损伤程度的测定技术也有了成熟的方案，换而言之，本发明这种新型抗生物细胞自由基氧化损伤合剂对人体细胞的抗氧化保护程度也能科学的、可靠的测定出来。目前就自由基对人体的细胞氧化损伤程度的测定技术有多种、如人体氧合血红蛋白A自氧化的测定，β-淀粉样多肽引发神经细胞的死亡率的测定，脂质过氧化测定，自由基测定等等，本发明选择了前两种最具代表性的测定技术来完成本发明的实施方案。

人体氧合血红蛋白A是机体输送氧的主要载体，通过分光光度计检测，人体氧合血红蛋白A在575纳米区有一个主要吸收峰，人体氧合血红蛋A中所含的铁离子为正2价，所以，氧合血红蛋白A很容易和环境中的氧化物，包括过氧化氢(H₂O₂)，超氧化阴离子(O₂ ^-)发生反应，产生自氧化，原来正2价的铁离子被氧化成正3价或正4价，因此，人体氧合血红蛋白A失去了携带氧的功能，自氧化后的人氧合血红蛋白A在575纳米区的光密度下降，即人体氧合血红蛋白A自氧化程度越高，其在575纳米区的光密度下降就越多，正是基于此原理，本发明不断调整这种合剂中维生素C、维生素E及褪黑素三者之间的比例，经过反复实验与测试，以期求得最佳组合，和应用的最佳浓度，实验证明该合剂中维生素C、维生素E及褪黑素的比例在1∶1∶0.01至1∶1∶1范围内，对在人体氧合血红蛋白A(1-500微摩)的自氧化有明显保护作用。

为了对本发明合剂功能进一步证实，该发明还选用了另一个施实方案，即β-淀粉样多肽-25-35(Aβ25-35)导致的神经细胞死亡检测。

医学上常用MTT[3-(4，5-dimethylthiazol-2yl)-2.5-diphenyl-tetrazolium bromide]的方法测定培养神经细胞的死亡率，可以用来判断抗氧化剂及其组合的抗氧化能力，加入了抗氧化剂或其组合后使β25-35引起的神经细胞死亡率越低，该抗氧化剂或其组合的抗氧化能力越强，本发明选用了小鼠海马蛔神经细胞(HT22)进行常规神经细胞培养，而小鼠海马蛔神经细胞与记忆有关，对自由基损失很敏感。经过多次反复实验，本发明同样得出该合剂中维生素C、维生素E与褪黑素三者的比例在1∶1∶0.01至1∶1∶1的范围，该抗氧化合剂在细胞培养液中的浓度为1-500微摩尔时都能有效保护海马蛔神经细胞免受自由基氧化损伤。

实施方案一：用维生素C、维生素E、褪黑素组成的新型抗生物细胞自由基氧化损伤合剂，来保护人体氧合血红蛋白A自氧化实验，维生素C、维生素E、褪黑素、人体氧合血红蛋白A及其它化学物品均购自美国Sigma化学试剂公司(Sigma Chemicals.St.Louis，MO，USA)。

实验步骤：一、将人体氧合血红蛋白A、溶于TRS-盐酸缓冲液，缓冲液的克分子浓度为20毫摩尔，含乙二胺四乙酸0.1毫摩尔，酸碱度7.4(pH 7.4)。人氧合血红蛋白A的浓度为0.3毫克/毫升，然后置于30℃恒温水浴箱中温浴，随着时间的延长，人氧合血红蛋白A将会不断的自氧化，其自氧化的程度可以通过分光光度计测定其在575纳米的光密度来判断。此实验共分为8组：组1为正常对照组，此组为未加任何试剂的人氧合血红蛋白A：组2为维生素C处理组，此组在经过上述的处理的1毫升人氧合血红蛋白A缓冲液中加入维生素C 500微摩尔；组3为维生素E处理组，此组为在经过上述处理的1毫升人氧合血红蛋白A缓冲液中加入维生素E 500微摩尔：组4为褪黑素处理组，在经过上述处理的1毫升人氧合血红蛋白A缓冲液中加入褪黑素500微摩尔；组5为维生素C与维生素E处理组，在经过上述处理的1毫升人氧合血红蛋白A缓冲液中加维生素C、维生素E各500微摩尔；组6为维生素C与褪黑素处理组，在经过上述处理的1毫升人氧合血红蛋白A缓冲液中加入维生素C、褪黑素各500微摩尔；组7为维生素E与褪黑素处理组，在经过上述处理的1毫升人氧合血红蛋白A缓冲溶液中加入维生素E、褪黑素各500微摩尔；组8为维生素C、维生素E、褪黑素处理组，该组为在经过上述处理的1毫升人氧合血红蛋白A缓冲液中加入维生素C、维生素E、黑素各500微摩尔。用一毫升的聚乙烯比色管在575纳米区测定8组样本的人氧合血红蛋白A的光吸收密度，其值将作为8组样本进行温浴后的相应组的对照标准；然后将各种组合的8组人氧合血红蛋白A缓冲液温浴20小时后，用一毫升的聚乙烯比色管在575纳米区，测定各组的人氧合血红蛋白A的光吸收密度，以温浴前的各相应组的光密度值为100％，用这种方法重复6次独立的试验，再将每次结果的数据进行平均值加减标准误的统计处理，统计处理的方法为方差分析(ANOVA)与t-检验，p＜0.05被认为统计学上存在着显著的差异。统计处理的结果如表一所示，表一是抗氧化剂及其组合对人体氧合血紅蛋自A氧化的影响统计表，表中的数为平均值±标准误；N＝6；*为与对照组相比P＜0.05；**为与对照组相比P＜0.01；^##为与其它实验组相比P＜0.01。人体氧合血紅蛋A自氧化的程度表示为光密度在575纳米区的衰减百分率％。从表一可以看出，第一组标本的人氧合血红蛋白A在575纳米光区的光密度下降了大约14％，分别加入了维生素C、维生素E、和加入了维生素C与维生素E混合体的标本中的人自氧化血红蛋白A在575纳米区的光密度各自下降了17％～24％之间，显示了维生素C维生素E可能产生了过氧化作用，因为可能有游离的铁离子自人氧合血红蛋白A中释出，而加入了褪黑素处理过的标本在575纳米光区的光密度仅下降了13％，与第一组的结果相比，无统计差异。在维生素C、维生素E及褪黑素三者混合的标本中的人氧合血红蛋白A在575纳米光区的光密度仅下降了5％左右，与第一组及其它各组的实验结果相比，统计学上存在着显著的差异，实验结果证明，由维生素C、维生素E及褪黑素三者组合的合剂具有强大的抗氧化作用，不但能显著降低人氧合血红蛋白A的自氧化作用，还能抑制维生素C、维生素E的过氧化作用，保护人氧合血红蛋白A结构的完整，实验结果与理论指导预期十分吻合。

实施方案2：维生素C、维生素E和褪黑素组合对β淀粉样多肽导致的神经细胞死亡的保护作用的实验。

1、细胞培养和处理：小鼠海马神经细胞(HT22细胞株)培养于DMEM培养液中，此培养液中含有10％的小牛血清，2毫摩尔的谷胺，每毫升100单位的连酶素，0.2毫克的头孢酶素和25毫摩尔的HEPEBS。细胞种殖到96孔的培养板，细胞密度为10,000个/平方厘米，放入5％的二氧化碳细胞培养箱中(37℃)培养12小时；当细胞贴壁后再加入不同的试剂，实验共分为9个组，组一为正常对照组，未加入任何试剂，组2至组9为试验组，首先在组3中加入维生素C 50微摩尔；组4加入维生素E 50微摩尔；组5加入褪黑素50微摩尔：组6加入维生素C和维生素E各50微摩尔；组7加入维生素C和褪黑素各50微摩尔；组8加入维生素E及褪黑素各50微摩尔；组9加入维生素C、维生素E及褪黑素各50微摩尔，在培养箱中培养1小时后，从组2至组9各自加入神经毒性的β-淀粉样多肽-25-35(Aβ25-35)30微摩尔，继续培养24小时。

2、细胞成活率分析：MTT[3-(4.5-dimethylthiazol-2yl)-2.5-dipheny-tetrazoliumbromide]方法用于细胞成活率的分析，MTT 0.5毫克/毫升(终浓度)，加到处理后的细胞，继续在培养箱中培养4小时，然后加入溶解液(20％ sodium dodecyl sulfate，50％N.N-DIMETHYLFORMAMIDE.Ph 4.7)，放入37℃度恒温水浴箱中温浴18小时，然后将96孔的培养板置于培养板阅读仪(μQuant.Bio-Tek Instruments Inc.Winooski，VT，USA)在570纳米区阅读计数，对照细胞的计数值为100％(细胞成活率)。

3、结果：Aβ25-35为神经毒素，是形成老年性痴呆大脑特征性病变老年斑的主要成份；Aβ25-35在大脑中的沉积产生大量自由基，造成细胞结构的氧化损伤，最终导致神经细胞的死亡。从本实验中的结果可以看出，30微摩尔的淀粉样多肽造成了培养的神经细胞氧化损伤，在24小时之内，有60％的神经细胞死亡(成活率为40％)，实验中，选用了临界有效浓度的3种抗氧化剂，包括经典的抗氧化剂维生素C、维生素E和新型的抗氧化剂褪黑素。单一的抗氧化剂和两种抗氧化剂合用，与组2相比，能够轻微提高细胞的成活率(成活率为45％-55％)。而用维生素C、维生素E和褪黑素3种物质的组合，完全防止了Aβ25-35导致的神经细胞毒性。使培养的神经细胞成活率与对照组一样，达到了100％。其结果如表二，表二是抗氧化剂及其组合对β-淀粉样多肽-25-35(Aβ25-35)导致神经细胞死亡保护作用效果统计表，表中的数值为平均值±标准误；N＝6；统计处理的方法为方差分析(ANOVA)与t-检验，p＜0.05被认为统计学上存在着显著的差异，*为与对照组相比P＜0.05：**为与对照组相比P＜0.01；^##为与其它实验组相比P＜0.01。除对照组外，其它实验组均加有Aβ25-35试剂30毫摩尔；抗氧化剂均为50毫摩尔，表二中显示，维生素C、维生素E、褪黑素三种物质的组合，在培养的神经细胞中能发挥高效的抗氧化作用。三者的组合发生了协同作用，使其抗氧化效果倍增。

本发明的这种新型抗生物细胞自由基氧化损伤合剂作为一种健康食品对人类健康是有益的，特别是对上述某些疾病的治疗与预防，对某些手术的术后治疗以及延长离体移植器官贮存与运输时间，提高移植成功率都有广泛的应用前景。高效抗氧化合剂中各成份目前在国内外作为一种健康食品都有标准的安全用量，根据这些用量，再根据本发明中三种成份的比例，本发明推荐该合剂作为健康食品的用量是需用者每次用603毫克，而603毫克中含维生素C有300毫克、维生素E 300毫克和褪黑素3毫克，每日一次。可用口服，口服可用片剂，也可用胶囊或口服液，还可用肌肉注射，静脉注射等多种方法；同时也可以膏脂等形式直接涂敷在皮肤上使用，作为皮肤的护理和化妆用品；可以配成液体储存和运输离体生物器官；该合剂可进一步开发成药品，用于与生物细胞自由基氧化损伤有关的领域，该发明将对促进人类健康起到积极的作用。

表一：抗氧化剂及其组合对人体氧合血紅蛋自A氧化的影响统计表

抗氧化剂组合	575纳米处光密度衰减％
		组1：对照组	14±0.8
组2：维生素C组	18±1.2*
		组3：维生素E组	20±1.3*
组4：褪黑素组	13±1.1
		组5：维生素C和E组合组	24±1.5*
组6：维生素C和褪黑素组合组	18±1.5*
		组7；维生素E和褪黑素组合组	17±1.4*
组8：维生素C和E加褪黑素组合组	6±0.7**##

表中的数为平均值±标准误；N＝6；*为与对照相比P＜0.05；**为与对照相比P＜0.01；

^##为与其它实验组相比P＜0.01。人体氧合血紅蛋A自氧化的程度表示为光密度在575纳米区的衰减％，抗氧化剂均为500毫摩尔。

表二：抗氧化剂及其组合对β-淀粉样多肽-25-35(Aβ25-35)导致的神经细胞死亡的保护作用效果的统计表

抗氧化剂及其组合	神经细胞成活率％
		组1：对照组	100±8.2
组2：Aβ25-35	40±6.0
		组3：维生素C组	45±5.5
组4：维生素E组	46±7.4
		组5：褪黑素组	46±5.8
组6：维生素C和维生素E组合组	58±7.7*
		组7：维生素C和褪黑素组合组	60±8.4*
组8；维生素E和褪黑素组合组	57±6.7*
		组9：维生素C和维生素E加褪黑素组合组	100±6.5**##

表中的数值为平均值±标准误；N＝6；*为与对照组相比P＜0.05；**为与对照组相比P＜0.01；^##为与其它实验组相比P＜0.01。除对照组外，其它实验组均加有Aβ25-35试剂30毫摩尔；抗氧化剂均为50毫摩尔。

Claims (3)

1、一种抗生物细胞自由基氧化损伤合剂，其特征是该合剂由褪黑素、维生素C、维生素E组成。

2、权利要求1所述的抗生物细胞自由基氧化损伤合剂，其特征是该合剂维生素C、维生素E、褪黑素三者的比例为1∶1∶0.01至1∶1∶1。

3、权利要求1所述的抗生物细胞自由基氧化损伤合剂在制备防治老年性痴呆药物中的用途。