상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 구체예에 따르면, 항산화 활성 및 항노화 효능이 우수한 현삼 추출물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
현삼(玄蔘)은 현삼과의 다년생 초본식물인 현삼의 뿌리를 말하며 한방에서 알려져 있는 효능으로는 녹농간균에 대하여 억제 작용이 있고 혈관을 확장하고 혈압을 하강시키며, 혈당을 낮추는 것으로 알려져 있다. 소량을 쓰면 가벼운 강심작용을 다량을 쓰면 심장 중독을 일으키는 한약재이다. 현삼은 민간요법에서 유래하거나 한방에서 다른 용도로 사용되어오고 있을 뿐 현삼의 항노화 효과에 대해서는 알려진 바 없다.
본 발명의 구체예에 따르면, 항산화 활성 및 항노화 효능이 우수한 현삼 추출물을 제공한다.
상기 현삼 추출물은 물 또는 알코올 등의 유기 용매로 추출한 추출물이 될 수 있다. 또한 일반적인 용매 추출법을 적용한 조추출물일 수 있으며, 또한 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제한 분획물일 수도 있다. 본 발명에 따른 추출물의 제조방법은 본 기술분야에 속하는 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 식물 추출방법을 모두 적용할 수 있으며, 예컨대 물, 알코올 또는 혼합용매에 의한 추출, 중탕이나 상온에 의한 추출법 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
약제로 제조되는 경우 약제학적으로 허용되는 1종 이상의 담체에 첨가하여 제조될 수 있다. 상기 담체로는 식염수, 완충 식염수, 물, 글리세롤 및 에탄올 등이 있으나 이에 한정되지 않으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)는 모두 사용 가능하다.
본 발명의 추출물은 임상 투여 시에 경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
상기 조성물의 투여량은 대상의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 병용되는 약물에 따라 달리 적용될 수 있다. 부작용이 없이 사용될 수 있는 1일 투여량은 몸무게 kg 당 추출건조물 0.015g을 경구 투여한다. 본 발명은 또한 투약 단위의 제형들을 포함한다. 제형은 개별 투약 형태, 예를 들면 정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제, 좌약 및 앰플제로 존재할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 피복정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 현삼 추출물을 포함하는 조성물은 기능성 화장품 또는 기능성 식품에 첨가될 수 있으며 이러한 기능성 화장품이나 식품의 종류는 특별히 한정되지 않는다.
[실시예]
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 제시한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시되는 한 예일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 현삼 추출 조성물의 제조
건조상태의 현삼 100g을 곱게 마쇄한 후 70% 식음용 주정 에탄올로 50℃에서 2시간 동안 추출 후 에탄올에서 녹아 나온 성분을 받아 진공회전증발기를 이용하여 에탄올 성분을 완전히 제거하고 농축한다. 이후 동결건조기를 이용하여 48시간동안 수분을 완전히 제거한 추출물을 만들었다. 이렇게 완성된 추출물의 1/10을 10ml의 물에 녹인 것을 원액(98 mg 추출건조물/ml water)으로 하여 이하 실험에 사용하였다.
이하 실시예에서는 현삼의 효능으로 아직 밝혀지지 않은 노화억제 효과를 in vitro 인간섬유아세포를 이용한 실험에서 규명하고 in vivo의 ICR 마우스를 이용한 실험에서 검증하여 현삼추출물의 노화억제 효과를 증명하였다.
실시예 2: 세포배양을 통한 노화억제 효능 검증
본 실시예에서는 실시예 1의 현삼 추출 조성물을 세포에 처리하여 얼마나 세포노화(Replicative Senescence)를 지연시킬 수 있는가를 측정하기 위하여 현삼 추출물 처리 후 세포분열수의 증가와 일정한 세포분열 후에 SA β-gal염색(노화한 세포에서만 염색됨)을 통하여 노화정도를 비교하였다. 이후 노화억제 효능을 확인하기 위하여 노화표식 단백질의 발현정도를 측정하였으며, 항산화 억제효과와 연관성을 보이는지 규명하기 위하여 SOD, 카탈라제 활성을 측정하였다. 현삼추출물에 의한 DNA 손상 억제효과를 보기 위하여 면역화학요법을 사용하여 DNA 손상을 측정하였다.
가. 인간의 인간섬유아세포(human embryonic fibroblast)의 세포배양
한림대학교에서 확립한 인간의 태아섬유아세포(human embryonic fibroblast)의 세포배양을 통하여 노화과정을 조사하였으며, 성장곡선은 도 1에 도시된 바와 같다.
인간 섬유아세포주는 약 70번의 분열을 지속하다 결과적으로 성장을 정지하는 세포노화 현상을 보여준다.
현삼 추출물의 항노화 효과 규명을 위하여 연속적으로 분열하고 있는 인간섬유아세포의 분열수가 50번(아직 노화의 특성이 나타나기 전 단계)까지 도달하였을 때 실시예 1의 현삼 추출 원액을 1/100(0.98 mg 추출건조물/ml water) 희석한 추출물을 배지의 1/10(0.098 mg 추출건조물/ ml 배지)로 지속적으로 처리하여 한정되어 있는 인간 섬유아세포의 분열수를 증가시킬 수 있는지를 조사하여 그 결과를 표 1에 기재하였다.
세포가 노화하여 성장을 정지하였을 때의 분열수
한약재 |
분열수 |
대 조 구(무처리)현 삼한약재 A지 각차 전 자인 동정 향천 궁 |
6674696666666360 |
표 1에서와 같이 대조구나 다른 천연물 추출액에 비하여 세포분열 정지를 지연시키는 효과를 가지고 있다는 것을 알 수 있다. 이렇게 한정된 분열수를 갖는 세포분열이 현삼 추출물을 지속적으로 처리하여 분열수가 증가한다는 것은 현삼 추출물의 항노화 효과를 직접적으로 증명해 주는 결과라 할 수 있다.
나. 노화표식자인 산성 β-갈락토시다제(acidic β-galactosidase; SA-β-gal) 발현의 분석
노화하는 세포 및 조직에서만 발현이 되는 효소인 산성 β-갈락토시다제의 발현을 X-gal이라는 색깔을 주는 기질을 사용하여 염색하였을 경우 노화가 진행되고 있는 인간 섬유아세포에서 핵 주변이 파란색으로 염색되어지는 것을 알 수 있다. 만일 추출물이 항노화 효능을 가진다면 같은 분열수에서 훨씬 덜 염색이될 것이다. 분열수 63번에서의 SA-β-gal 염색결과를 도 2에 도시하였다.
상기 실험 방법을 이용하여 실시예 1의 현삼 추출 원액의 1/100 희석액(0.98 mg 추출건조물/ml water) 을 처리한 세포와 처리하지 않은 대조구 세포를 염색하면 표 2와 같은 결과를 얻을 수 있다.
세포분열수 63에서 SA-β-gal 염색된 양성 세포의 백분율
한약재 |
양성세포의 % |
대 조 구현 삼한약재 A지 각차 전 자인 동정 향천 궁 |
2016192021252340 |
상기 표 2의 결과에서 현삼 추출물로 처리할 경우 항노화 작용에 의해 세포의 노화가 지연되었기 때문에 노화 표식 단백질인 산성 β-갈락토시다제의 발현이 감소되었다고 볼 수 있다.
다. 노화관련 유전자의 단백질 발현조사
노화할 때 활성화되는 유전자인 p21의 단백질 발현을 조사하기 위해 노화하는 인간의 인간섬유아세포의 배양에서 위와 같은 조건에서 세포를 배양하고 이후 분열수 54, 분열수 66에서 세포를 수거하여 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 2회 세척하고 단백질 추출액을 만든 다음 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 단백질을 분리하고 p21 항체와 ECL 염색을 사용하여 웨스턴 블럿(Western blot)에 의해 분석하였다. 실험에 사용된 현삼 추출물은 실시예 1의 현삼 추출 원액을 1/100 희석한 수용액(0.98 mg 추출건조물/ml water)이다. 분석 결과를 도 3에 도시하였다.
도 3에서 보는 바와 같이 현삼 추출물을 처리한지 얼마 지나지 않은 장년세포(population doubling 수 54)에서는 현삼 추출물을 처리한 세포와 대조구 세포에서 모두 노화표식 인자 단백질인 p21의 발현을 관찰할 수가 없었지만, 대조구의 분열이 끝나는 분열수(population doubling 수 66)에서는 현삼 추출물을 처리한 세포에서 약간의(약 2 배정도) p21 단백질의 발현 감소를 관찰하였다.
이 결과는 현삼 추출물에 의한 노화억제 정도를 다시 한번 확인하는 것으로서 현삼 추출 액이 노화를 지연시키거나 억제함으로써 대조구와 비교하였을 때 노화 표식 단백질인 p21 단백질의 발현을 감소시킨다는 것을 알 수 있다.
라. DNA 손상(damage) 분석
노화하는 세포에서 증가하는 것으로 알려진 산화 스트레스(Oxidative stress)에 의한 DNA 손상의 정도를 면역염색화학적방법(immunohistochemical staining)을 사용하여 비교하였다. 현삼 추출물을 첨가한 섬유아세포와 첨가하지 않은 섬유아세포에 대해 히드록시 구아닌(Hydroxy guanine)에 대한 항체를 사용한 면역염색화학적방법을 사용하여 비교하였다. 실험에 사용된 현삼 추출물은 실시예 1의 현삼 추출 원액을 1/100 희석한 희석액이다. 그 결과를 도 4에 도시하였다. 도 4에서 현삼 추출물을 처리하지 않은 군에서 염색된 세포의 수가 더 증가됨을 알 수 있다. 이 결과는 현삼 추출 액이 노화의 표식자인 DNA 손상을 저하시킨다는 사실을 말해 주며, DNA 손상의 저하가 섬유아세포의 노화를 더디게 한다는 것을 나타내 주고 있다.
마. 항산화효소 활성 측정
항산화효소의 활성은 바로 산화 스트레스에 의한 세포의 손상을 나타내 준다. 현삼 추출물이 처리된 섬유아세포에서 항산화 효소인 카탈라제(catalase)의 활성을 측정한 결과를 도 5에 도시하고, 수퍼옥사이드 디뮤타제(superoxide dismutase; SOD) 활성을 측정한 결과를 도 6에 도시하였다. 실험에 사용된 현삼 추출물은 실시예 1의 현삼 추출 원액을 1/100 희석한 조성물이다.
도 5 및 도 6에 도시된 바와 같이 현삼 추출물을 처리한 군에서 카탈라제 활성은 상당히(분열수 54에서는 2배 이상, 분열수 66에서는 15 %이상) 증가한 것으로 나타났으나, SOD의 활성은 거의 증가하지 않은 것으로 나타났다. 이 결과는 노화한 섬유아세포에서 SOD는 그다지 부족하지 않으나 카탈라제는 부족하여 현삼 추출물에 의해 발현이 유도되고 현삼 추출물의 노화억제 효능과 연관되는 것으로 추정된다.
실시예 3: 실험동물을 통한 현삼 추출물의 항노화 효과 규명
본 실시예에서는 In vivo 실험을 통해 현삼 추출물의 노화억제 소재로의 유효성 검색을 하였으며 동시에 부작용 검사를 통해 안전성 유무를 판단하였다.
가. 현삼 투여시 마우스의 체중의 변화
실험동물은 한림대학교 실험동물부에서 계통 유지 중인 ICR 마우스를 사용하였다. 실험에 사용된 마우스의 연령은 16개월령을 사용하여 6개월간 투여실험하였다. 실험기간 중 사육실 환경은 23±2℃, 상대습도 55±10 %를 유지하였고 12시간 인공 조명 하에서 마우스용 케이지에 4마리씩 넣어 사육하였으며, 실험동물용 사료 및 식수는 자유로이 공급하였다. 이렇게 확보되어 있는 마우스에 현삼 추출물의 노화 억제 및 항노화 효과를 검증하기 위하여 실시예 1의 현삼 추출물 원액을 100배 희석하고 물대신 섭취시켰다. 대조구는 물만 섭취시켰다. 투여하는 현삼 추출물의 신선도를 유지하기 위해 2일 간격으로 교환하였으며, 6 개월 간 투여하였다. 대조구는 물만 식이시켰다.
체중은 실험 종료 시까지 1 개월 간격으로 일정시간(오전 10시에) 측정하였으며, 그 결과를 도 7에 도시하였다. 도 7에서 보는 바와 같이 16개월령의 마우스의 체중은 대조구가 38.1±5.4 g, 100배 희석한 현삼 추출물 투여군이 37.6±5.7 g이었다. 6개월간 투여 후 현삼 추출물 투여군이 41.2±7.4 g으로 대조구의 31.0±4.7 g보다는 체중 감소가 적게 나타났다. 이는 현삼 추출물이 노화함에 따른 마우스의 체중 감소를 막음으로써 생체 내에서도 노화에 따른 체중감량을 극복하는 효과를 가진다는 것을 알 수 있다.
나. 현삼 추출물에 의한 마우스의 총 운동량의 변화
마우스의 운동량 측정은 Motility-Meter 2012(RHEMA_LABORTELHNIK, Germany)를 사용하여 1시간 동안의 총 운동량을 측정하였다. 이 방법은 1시간동안 마우스가 움직인 거리를 Motility-Meter를 이용하여 수치화하여 마우스의 운동량을 측정하는 방법으로 동물 실험시 문제가 될 수 있는 반복학습에 의한 실험 데이터 향상을 배제할 수 있는 방법이다. 이 방법을 이용하여 실험 종료 시까지 1개월 간격으로 일정시간(오전 10-17시 사이) 측정하였다.
생후 16개월 된 ICR 마우스(대조구)에서 1시간 동안의 총운동량은 816± 341에서 생후 22개월에서는 총운동량이 439±308로 연령이 증가함에 따라 운동량이 현저하게 감소하였다(46.2% 감소). 이에 비하여 실시예 1의 현삼 추출물 원액을 100배 희석한 조성물을 투여한 군(현삼 추출물 투여군)에서는 총운동량이 749±354에서 생후 22개월에서는 총운동량이 924±344로 연령이 증가함에도 불구하고 운동량이 실험시작시 보다 23.1%가 증가하였다(도 8).
이상의 결과에서 현삼 추출물 투여군 마우스의 운동량 증가는 현삼 추출물에 의한 마우스의 노화억제 효과를 직접적으로 증명하는 결과라 할 수 있다.
다. 간에서 Total SOD(superoxide Dismutase) 활성의 변화
생후 16개월된 ICR 마우스에 실시예 1의 현삼 추출물 원액을 100배 희석한 조성물(이하 "현삼 추출물")을 6개월간 투여한 후에 간에서 SOD의 활성을 측정한 결과를 하기 표 3에 기재하였다.
6개월간 현삼 투여후 ICR 마우스의 간에서 추출한 SOD 활성 측정
Group(N=2) |
Units/g wet weight tissue |
Unit/mg of total protein |
대 조 구 |
1,118 ± 110.7 |
9.2 ± 0.3 |
현삼추출물 투여군 |
1,099 ± 120.7 |
8.5 ± 2.8 |
표 3에서 보는 바와 같이 조직 g당 활성이 대조구에서는 1,118±110.7, 현삼추출물 투여군에서는 1,099±120.7로 대조구와 현추출물 투여군과 별차이가 없었다. 감소를 보였으며, 단백질 mg 당 SOD 활성도 유사한 경향을 보여 대조군에서는 9.2±0.3, 현삼추출물 투여군에서는 8.5±2.8로 큰 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 in vitro 실험을 뒷받침 해주는 결과로서 현삼추출물에 의한 노화억제 및 지연은 SOD 활성에 의한 것이 아니라는 것을 보여준다.
라. 안정성 검사 및 장기무게의 변화
생후 16개월된 ICR 마우스에 실시예 1의 현삼 추출물 원액을 100배 희석한 조성물(이하 "현삼 추출물)을 6개월간 투여한 후에 심장, 간, 폐, 신장, 및 비장의 체중 대비 무게를 측정하여 하기 표 4에 기재하였다.
6개월간 현삼추출물 투여후 각 장기의 무게비교
Group(N=2) |
organ |
organ weight/animal weight × 100 ratio |
대 조 구 |
심장(g) |
0.9±0.1 |
간(g) |
6.1±0.5 |
비장(g) |
1.0±0.0 |
폐(g) |
0.9±0.2 |
신장 |
Left(g) |
1.0±0.3 |
Right(g) |
0.9±0.1 |
현삼추출물 |
심장(g) |
1.0±0.3 |
간(g) |
4.8±0.2 |
비장(g) |
0.4±0.0 |
폐(g) |
1.0±0.2 |
신장 |
Left(g) |
1.1±0.1 |
Right(g) |
1.1±0.1 |
표 4에 기재된 바와 같이 대조구와 투여군 사이에 체중비 장기무게는 통계적인 유의 차를 나타내지 않아 안정성 검사의 소견을 뒷받침하였다. 또한 일반 부검을 통해 얻어 육안검사를 실시하였으나 이상을 보인 장기는 발견되지 않았다.
마. in vivo 노화억제 효능의 분자생물학적 분석
현삼의 in vivo 노화억제 효능의 분자생물학적 분석을 위해서 3개월, 6개월 간 현삼추출물을 12개월령 ICR 마우스에 투여후 뇌에서 노화의 표식자인 p27(노화 시에 발현이 증가)의 단백질 발현을 웨스턴 블럿에 의해 분석한 결과 3개월 처리 구에서는 별 효과가 없었으나 6개월 투여군에서 현삼추출액 처리에서 p27의 발현이 저하되었다(도 9).
이 결과는 in vitro 세포배양에서 뿐 아니라 in vivo에서도 현삼이 노화를 지연시키는 효능이 있음을 나타내준다.