CN1289670C - 用于调节癌细胞增生的多核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及调节癌细胞增生的新蛋白。由本发明多核苷酸编码的这些蛋白质使得可以确定异常细胞增生的恶性程度。
Description
发明领域
本发明涉及调节癌细胞增生的新的蛋白质。通过下述SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.9多核苷酸序列编码的蛋白质还可以确定异常细胞增生的恶性程度。
发明背景
癌症是世界上主要健康问题。尽管过去数年在癌症的检测和治疗方面已经取得了重大的进步，但是目前不存在用于癌症预防或治疗的疫苗或其它通用的治疗方法。疾病的治疗涉及尽可能早的诊断和侵入性治疗的联合，所述侵入性治疗包括各种要素，如外科手术，放射治疗，化学治疗或以及激素治疗。常常在预后参数的基础上选择针对特定癌症的治疗进程，所述预后参数包括癌症特异标记物的分析。然而，已确立的标记物的应用常常导致难以解释的结果，而且在大量癌症患者中继续观察到了增加的死亡率。
乳腺癌和***癌是最常见的恶性肿瘤。在美国，每年诊断出400，000例新病例，并且每年约100,000个男人和女人死于这两种疾病(Harris等，New Eng.J.Med.(1992)，327，319,390和473)。
这些疾病被认为在一个多因素过程中出现，该多因素过程涉及在有限数量，可能是10个或更少的基因中的突变。这些突变引起了组织的生长和细胞增生调节的变化，使得它们不受正常细胞控制而生长，从而形成转移并且逃避免疫监视。参与乳腺和***癌的这类基因对这类肿瘤可能是高度特异的。特别地，在参与激素反应(***，孕酮或以及睾酮类的受体和配体)的基因中的突变特别重要，因为该突变通过使细胞抵抗这些激素的抗肿瘤作用而可能驱动细胞增生。
此外，常常涉及编码生长因子，信号翻译分子及转录因子的基因中的变化，而且这些基因中的有些变化本身即参与肿瘤发育和进展(King，Nature Genetics(1992)，2.125)。
至今未解决的问题是出现在人肿瘤细胞中以不可逆方式引起细胞分化的基因表达变化的本质。该信息对于在分子水平上定义如下基因表达调节模式非常重要，所述调节模式涉及人***和乳腺癌细胞的细胞生长和分化。因此，迫切需要鉴定参与不可逆终末分化的基因序列。
最近，当本申请人已经拥有此后所述的发明时，在Genbank数据库中公开了记录号AK000755，标识号7021039的序列SEQ ID NO.4，然而，没有表明该序列可能编码的蛋白质的活性。
发明概述
本发明的一个主题是包含多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5的分离的多核苷酸。包含所述分离的多核苷酸(即，其含有多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5)的互补序列的反义多核苷酸也是本发明的主题。
本发明也涉及包含多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5的至少一个片段的分离的多核苷酸，所述多核苷酸是编码多肽的多核苷酸，该多肽具有与细胞增生调节有关的蛋白质的至少一个特征性免疫学和/或生物学活性。特别地，本发明涉及具有核苷酸序列SEQ.ID.NO.9的分离的多核苷酸或具有核苷酸序列SEQ.ID.NO.9的互补核苷酸序列的分离的多核苷酸。
而且，本发明的再一个主题是分离的多肽，该分离的多肽包含多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5的互补序列编码的蛋白质的至少一个片段，所述分离的多肽具有与细胞增生调节有关的蛋白质的至少一个特征性免疫学和/或生物学活性。优选地，所述分离的多肽有这样的片段，该片段具有与细胞增生调节有关的蛋白质的特征性免疫学活性。
特别地，本发明涉及多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5中包含在位置420(编码甲硫氨酸的起始密码子ATG)和861(终止密码子)碱基间的多核苷酸片段，即多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9(见下述)所编码的具有序列SEQ.ID.NO.8的蛋白质(见下述)。
本发明也涉及包含分离的多核苷酸的表达载体，所述分离的多核苷酸包含多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5的互补序列的至少一个片段；以及所述分离的多核苷酸编码的多肽，该多肽具有与细胞增生调节有关的蛋白质的至少一个特征性免疫学和/或生物学活性。类似地，本发明也涉及用所述表达载体转化或转染的宿主细胞。
本发明的再一主题是特异结合如前所述的分离多肽的单克隆抗体或其抗原结合片段，特别是特异结合序列SEQ.ID.NO.8蛋白质的单克隆抗体或其抗原结合片段。
而且，本发明涉及作为药物的分离的多肽，该分离的多肽包含多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5的互补序列编码的蛋白质的至少一个片段，所述分离的多肽具有与细胞增生调节有关的蛋白质的至少一个特征性免疫学和/或生物学活性。特别地，所述片段可以是具核苷酸序列SEQ.ID.NO.9或其互补序列的多核苷酸编码的片段，换而言之，可以是序列SEQ.ID.NO.8的蛋白质。类似地，本发明涉及作为药物的分离的多肽，该分离的多肽包含多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4的互补序列编码的蛋白质的至少一个片段，所述分离的多肽具有与细胞增生调节有关的蛋白质的至少一个特征性免疫学和/或生物学活性。
本发明也涉及作为药物的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其片段可特异地结合分离的多肽，该分离的多肽包含多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4或SEQ.ID.NO.5或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4或SEQ.ID.NO.5的互补序列编码的蛋白质的至少一个片段，且该分离的多肽具有与细胞增生调节有关的蛋白质的至少一个特征性免疫学和/或生物学活性。
特别地，本发明涉及作为药物的单克隆抗体或其抗原结合片段，它们可以特异地结合具核苷酸序列SEQ.ID.NO.9的多核苷酸或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9的互补序列编码的分离多肽(换而言之，序列SEQ.ID.NO.8的蛋白质)。
本发明也涉及包含分离的多肽的药物组合物，所述分离的多肽包含：
-多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5的互补序列编码的蛋白质的片段，
-或者，多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4的互补序列编码的蛋白质的片段，
所述分离的多肽具有与细胞增生调节有关的蛋白质的至少一个特征性免疫学和/或生物学活性；
所述组合物还包含一个或多个药学上可接受的赋形剂。
特别地，本发明的一个主题是药物组合物，其包含多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9的互补序列编码的蛋白质(换而言之，序列SEQ.ID.NO.8的蛋白质)及一个或多个药学上可接受的赋形剂。
作为备选方案，本发明药物组合物包含特异结合分离的多肽的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的多肽包含多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4或SEQ.ID.NO.5或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4或SEQ.ID.NO.5的互补序列编码的蛋白质的至少一个片段，且所述分离的多肽具有与细胞增生调节有关的蛋白质的至少一个特征性免疫学和/或生物学活性，所述组合物还包含一个或多个药学上可接受的赋形剂。
特别地，本发明涉及药物组合物，该药物组合物包含特异结合蛋白质的单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂，其中所述蛋白质为多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9的互补序列编码的蛋白质(换而言之，序列SEQ.ID.NO.8的蛋白质)。
根据优选的变异方案，所述药物组合物也包含免疫应答激活物(其可以是佐剂)。
本发明另一个主题是分离的多肽在制备旨在治疗增生性疾病的药物中的用途，其中所述分离的多肽包含：
-多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5的互补序列编码的蛋白质的片段，
-或者，多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4的互补序列编码的蛋白质的片段，
所述分离的多肽具有与细胞增生调节有关的蛋白质的至少一个特征性免疫学和/或生物学活性。
特别地，本发明涉及利用分离的多肽及一种或多种药学上可接受的赋形剂制备旨在治疗增生性疾病的药物，其中所述分离的多肽为多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9的互补序列编码的多肽(换而言之，序列SEQ.ID.NO.8的蛋白质)。
本发明的另一个主题是分离的多核苷酸在制备旨在治疗增生性疾病的药物中的用途，其中所述分离的多核苷酸包含：
-多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5，或
-多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4，或
-多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9。
优选地，所用分离的多核苷酸由多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4，SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.9的多核苷酸组成。
优选地，所用的所述分离的多核苷酸存在于病毒载体中，所述病毒载体可以例如选自：腺病毒，腺相关病毒，反转录病毒和痘病毒。
作为备选方案，根据本发明，还可以使用特异结合分离的多肽的单克隆抗体或其抗原结合片段制备旨在治疗增生性疾病的药物，其中所述分离的多肽包含多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4或SEQ.ID.NO.5或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4或SEQ.ID.NO.5的互补序列编码的蛋白质的至少一个片段，所述分离的多肽具有与细胞增生调节有关的蛋白质的至少一个特征性免疫学和/或生物学活性。
特别地，可以使用特异结合分离的多肽的单克隆抗体或其抗原结合片段制备旨在治疗增生性疾病的药物，其中所述分离的多肽为多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9的互补序列编码的多肽(换而言之，可以使用特异结合序列SEQ.ID.NO.8的蛋白质的单克隆抗体或其抗原结合片段进行所述制备)。
根据上述用途的优选变异方案，前述多肽或多核苷酸治疗的增生性疾病是癌症。而根据更优选的变异方案，癌症选自：***癌，乳腺癌，肺癌和结肠直肠癌。
而且，本发明提供了检测患者肿瘤是否是恶性的方法，该方法包括在获自患者的肿瘤样品中检测如下分离的多肽的浓度，该分离的多肽包含：
-多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5的互补序列编码的蛋白质的片段，
-或者，多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4的互补序列编码的蛋白质的片段，
所述分离的多肽具有与细胞增生调节有关的蛋白质的至少一个特征性免疫学和/或生物学活性。
特别地，所述检测方法的主题可以是在获自患者的肿瘤样品中检测多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9的互补序列编码的分离多肽的浓度(换而言之，序列SEQ.ID.NO.8的蛋白质的浓度)。
根据上述方法的优选变异方案，所述方法包括使肿瘤样品与特异识别前述分离的多肽(特别是多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9的互补序列编码的分离的多肽(换而言之，序列SEQ.ID.NO.8的蛋白质的浓度))的单克隆抗体接触。
本发明也涉及检测患者的肿瘤是否是恶性的方法，该方法包括在获自患者的生物样品中检测：
-具有多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.4的多核苷酸的浓度，或
-具有多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.4的核苷酸序列片段的多核苷酸的浓度，所述片段编码分离的多肽，该分离的多肽具有与细胞增生调节有关的蛋白质的至少一个特征性免疫学和/或生物学活性。
特别地，所述方法包括在获自患者的生物样品中检测多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9的互补序列编码的分离的多肽的浓度(换而言之，序列SEQ.ID.NO.8的蛋白质的浓度)。
根据该最后方法的优选的变异方案，所述方法包括：
(a)从肿瘤样品的RNA分子制备cDNA分子，然后，
(b)特异扩增能编码至少一部分所述多肽的cDNA分子。
本发明也提供了监测癌症患者中疾病进展或消退的方法，所述方法包括：
(a)随着时间以选定的时间间隔，在获自患者的生物样品中重复测定分离的多肽的浓度，所述分离的多肽包含至少：
-多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5的互补序列编码的蛋白质的片段，
-或者，多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4的互补序列编码的蛋白质的片段，
所述分离的多肽具有与细胞增生调节有关的蛋白质的至少一个特征性免疫学和/或生物学活性，和
(b)随着时间，比较(a)中测定的浓度。
特别地，所述监测癌症患者中疾病进展或消退的方法将包括，在其步骤(a)中，随着时间以选定的时间间隔，在获自患者的生物样品中重复测定多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9的互补序列编码的分离多肽的浓度(换而言之，序列SEQ.ID.NO.8蛋白质的浓度)。
优选地，上述方法的步骤(a)包括使部分生物样品与特异识别所述多肽(特别地，序列SEQ.ID.NO.8的蛋白质)的单克隆抗体接触。根据上述方法的优选变异方案，获自患者的生物样品进一步是肿瘤的一部分。
再根据本发明，监测癌症患者中疾病进展或消退的另一方法包括下面步骤：
(a)随着时间以选定的时间间隔，在获自患者的生物样品中重复测定编码分离的多肽的RNA的浓度，所述分离的多肽包含至少：
-多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5的互补序列编码的蛋白质的片段，
-或者，多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4的互补序列编码的蛋白质的片段，
所述分离的多肽具有与细胞增生调节有关的蛋白质的至少一个特征性免疫学和/或生物学活性；
(b)随着时间，比较(a)中测定的浓度。
特别地，所述监测癌症患者中疾病进展或消退的方法包括，在其步骤(a)中，随着时间以选定的时间间隔，在获自患者的生物样品中重复测定编码分离的多肽的RNA的浓度，其中所述分离的多肽为多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9的互补序列编码的多肽(换而言之，重复测定编码序列SEQ.ID.NO.8的蛋白质的RNA的浓度)。
根据上述监测方法的优选变异方案，优选地，步骤(a)包括：
(i)将生物样品中的RNA分子制备成cDNA分子，和，
(ii)特异扩增能编码所述分离多肽的至少一部的cDNA分子。
上述所有检测和/或监测方法都可以作为工具使得医生在结果分析后能够对有关患者的肿瘤的严重性和/或进展或消退作出诊断。
而且，本发明的再一主题是用于增生性疾病诊断的试剂盒，其包含：
(1)特异结合分离的多肽的单克隆抗体，该分离的多肽包含多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.4或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.4的互补序列编码的蛋白质的至少一个片段，
(2)可以与(1)中所定义的单克隆抗体结合或与(1)中所定义的分离的多肽结合的第二单克隆抗体或其片段，
所述第二单克隆抗体与标记部分缀合。
特别地，可以对所述用于增生性疾病诊断的试剂盒进行选择，使多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5编码的蛋白质的片段是多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9的互补序列编码的分离的多肽(换而言之，序列SEQ.ID.NO.8的蛋白质)。
优选地，上述诊断试剂盒的标记部分选自：放射性同位素，荧光基团，发光基团，酶，生物素和染色颗粒。
而且，本发明提供了分离的多肽的制备方法，所述分离的多肽包含多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5的互补序列编码的蛋白质的至少一个片段，所述分离的多肽具有与细胞增生调节有关的蛋白质的至少一个特征性免疫学和/或生物学活性，所述制备方法包括下面连续步骤：
(a)在适于所述多肽表达的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞用包含分离的多核苷酸的表达载体转化或转染，所述分离的多核苷酸包含多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5的互补序列编码的蛋白质的至少一个片段，所述分离的多肽具有与细胞增生调节有关的蛋白质的至少一个特征性免疫学和/或生物学活性，和
(b)从宿主细胞的培养物中分离此多肽。
特别地，所述方法的一个主题是多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9的互补序列编码的分离的多肽的制备(换而言之，序列SEQ.ID.NO.8的蛋白质的制备)。
本发明也提供了具有调节细胞生长和/或分化能力的化合物的鉴定方法，其包括下面连续的步骤：
(a)在使得候选试剂能够结合分离的多肽的条件和充足的时间下，使每一个候选化合物接触分离的多肽，所述分离的多肽包含至少：
-多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5的互补序列编码的蛋白质的片段，
-或者，多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4的互补序列编码的蛋白质的片段，
所述分离的多肽具有与细胞生长和/或分化调节有关的蛋白质的至少一个特征性免疫学和/或生物学活性，和
(b)检测每个候选化合物与所述多肽的结合和从候选化合物中鉴定具有调节细胞生长和/或分化能力的化合物。
特别地，所述具有调节细胞生长和/或分化能力的化合物的鉴定方法包括，在其步骤(a)中，在使得候选试剂能够结合分离的多肽的条件和充足的时间下使每一个候选化合物接触多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9的互补序列编码的分离的多肽(换而言之，接触序列SEQ.ID.NO.8的蛋白质)。
具有调节细胞生长和/或分化能力的化合物的备选鉴定方法包括下面连续的步骤：
(a)在使得候选试剂和细胞能够相互作用的条件和充足的时间下，使每一个候选化合物接触能表达如下分离的多肽的细胞，所述分离的多肽包含至少：
-多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5的互补序列编码的蛋白质的片段，
-或者，多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4的互补序列编码的蛋白质的片段，
所述分离的多肽具有与细胞生长和/或分化调节有关的蛋白质的至少一个特征性免疫学和/或生物学活性，和
(b)检测每个候选化合物对细胞中此多肽浓度的影响，并且从候选化合物中鉴定出具有调节细胞生长和/或分化能力的化合物。
特别地，所述的备选方法将包括，在步骤(a)中，在使得候选试剂和细胞能够相互作用的条件和充足的时间下使每一个候选化合物接触能表达多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9的互补序列编码的分离多肽的细胞(换而言之，接触能表达SEQ.ID.NO.8的蛋白质的细胞)。
根据上述具有调节细胞生长和/或分化能力的化合物的鉴定方法的优选实施方式，候选化合物来自于组合化学法产生的小分子文库。
而且，本发明涉及包含与分化有关的蛋白质的内源启动子或调节元件的多核苷酸，其中该蛋白质包含多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5的互补序列编码的序列。
本发明也涉及包含标记基因的多核苷酸，该标记基因受与细胞增生调节有关的蛋白质的内源启动子或调节元件的控制，其中该蛋白质包含多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5的互补序列编码的序列。类似地，本发明涉及用该含标记基因的多核苷酸转化或转染的细胞。
而且，本发明涉及鉴定能够调节与细胞增生调节有关的蛋白质的表达的化合物的方法，其包括下面连续的步骤：
(a)在使得每个候选化合物和启动子或其调节元件能够相互作用的条件和充足的时间下，使每一个候选化合物接触用如下多核苷酸转化或转染的细胞，所述多核苷酸包含在与细胞增生调节有关的蛋白质的内源启动子或调节元件控制下的标记基因，其中所述蛋白质包含多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5的互补序列编码的序列，
(b)检测每个候选化合物对细胞产生的标记蛋白质的浓度的影响，并且鉴定能够调节与细胞增生调节有关的蛋白质的表达的化合物。
根据上述用于鉴定能够调节与细胞增生调节有关的蛋白质的表达的化合物的方法的优选实施方式，候选化合物来自于组合化学程序产生的小分子文库。
根据本发明的多核苷酸和多肽的药理学特性使得它们适于药物应用。实际上，根据本发明，可以将如下分离的多肽收及编码所述多肽的多核苷酸施与癌症患者以减缓他们的肿瘤进展或使所述肿瘤消退，所述分离的多肽包含至少：
-多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5的互补序列编码的蛋白质的片段，
-或者，多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.4的互补序列编码的蛋白质的片段，
且所述分离的多肽具有与细胞增生调节有关的蛋白质的至少一个特征性免疫学和/或生物学活性。
在上述方法中，与细胞增生或分化调节有关的蛋白质特别可以是多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9或多核苷酸序列SEQ.ID.NO.9的互补序列编码的分离的多肽(换而言之，序列SEQ.ID.NO.8的蛋白质)。
一旦阅读了本发明不同方面的更详细的描述，对本领域的技术人员而言，上述各要素将变得显而易见。
本发明不同方面的详细描述
如上述，一般地，本发明涉及用于调节细胞生长和治疗癌症的产品和方法。本发明部分地基于“与细胞增生调节有关的序列”的鉴定，所述序列是与细胞增生调节有关的多肽和多核苷酸序列。与分化有关的mRNA是在分化细胞中比在相应非分化细胞中以较高水平存在的mRNA(即，此mRNA的水平至少高两倍)。与分化有关的cDNA分子是对应于与分化有关的mRNA的序列(和/或互补序列)。
可以用标准技术，如反转录，从RNA或mRNA制备这种cDNA分子。类似地，与分化有关的蛋白质或多肽包含与细胞分化有关的mRNA编码的序列。
这里描述的药物组合物可以包含一种或多种多肽、核酸序列和/或抗体。本发明的多肽包含与细胞增生调节有关的蛋白质的至少一部分或者其变体。本发明的核酸序列包括DNA或RNA序列，其编码至少这种多肽的一部分或与该编码序列互补。
抗体是免疫***的蛋白质或其抗原结合片段，具有与上述多肽的一部分结合的能力。
作为替代方案，组合物可以包含一种或多种能调节与细胞增生调节有关的基因的表达的试剂。
本发明的多核苷酸，多肽和蛋白质：
具体地，本发明的一个主题是序列SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.9的多核苷酸及序列SEQ.ID.NO.8的多肽或蛋白质。
本发明也包括具有与上述多核苷酸序列，特别是序列SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5和SEQ.ID.NO.9有至少75％，优选至少85％，更优选至少90％，甚至95％同源性的多核苷酸序列的多核苷酸。加以必要的变更，这也适用于本发明的其它多核苷酸，多肽和蛋白质的形成部分，特别是序列SEQ.ID.NO.8的蛋白质。
本发明的一个主题是分离的多核苷酸或多肽。如果多核苷酸或多肽从其原始的环境中被取出来，那么就称其为“分离的”。具体地，如果多核苷酸或多肽与在自然***中和其共存的生物材料相分离，那么此多核苷酸或多肽是分离的。
根据本发明，可以用编码本发明多肽或蛋白质及这些多肽或蛋白质的片段或融合蛋白质的多核苷酸序列产生重组DNA分子，该重组DNA分子在适当宿主细胞中可指导这些多肽或蛋白质或其活性部分表达。可替代地，与本发明多核苷酸序列的一部分杂交的多核苷酸序列也可以用在核酸杂交试验，Southern印迹，Northern印迹等之中。
因为遗传密码的简并性，实质上编码本发明多肽或蛋白质的氨基酸序列的其它DNA序列也可以用于所述多肽或蛋白质的克隆和表达。这种DNA序列包括在一定严格条件下能够杂交本发明多核苷酸的多核苷酸序列的DNA序列，其中可以以几种方式调整所述的严格条件。例如，在聚合酶链式反应(PCR)期间，可以调整引物与模板杂交的温度或反应缓冲液中MgCl2的浓度。在利用放射性标记的DNA片段或寡核苷酸探测膜时，通过改变洗涤溶液的离子强度或通过仔细控制洗涤液温度可以调整严格性。
本发明特别包括与序列SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.9的多核苷酸存在至少75％同源性的多核苷酸。同源性的程度按如下计算，以％表示：
100-100x(N’/N)
N’表示相对于序列SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.9发生改变的核苷酸的数，N表示SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.9的核苷酸数。
优选地，在严格条件下，这种同源核苷酸序列可以与序列SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.9的互补序列特异杂交。定义严格条件的参数取决于使50％的配对链分离的温度(Tm)。
对于包含多于30个碱基的序列，根据Sambrook等(Molecular cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold SpringHarbor，NY，1989)，用如下关系式定义Tm：
Tm＝81.5+0.41×(％G+C)+16.6×log[阳离子]-0.63×(％甲酰胺)-(600/碱基数)。
对于本发明，当利用低于Tm 10℃的杂交温度和含有6xSSC溶液(0.9M氯化钠和0.09M柠檬酸钠)的杂交缓冲液时，此严格条件称为“高严格条件”。在这种条件下，非特异的多核苷酸序列不能与序列SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.9的互补序列的多核苷酸杂交。
本发明可以利用的改变的DNA序列包括由不同核苷酸残基的缺失、添加和置换导致的编码相同的基因产物或功能等同物的序列。此基因的产物也可以相对于本发明蛋白质序列包含引起沉默变化的氨基酸残基缺失，添加或置换，因此产生等同功能的多肽和蛋白质。
可以基于所涉及残基的极性，电荷，溶解度，疏水性，亲水性和/或两性属性进行这种氨基酸置换。
例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸，带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸，具有接近的疏水性值的带极性基团的氨基酸包括亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸；甘氨酸，丙氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；苯丙氨酸，酪氨酸。
可以为了多种原因，包括但不限制于修饰基因产物的加工和表达，而修饰本发明DNA序列以改变本发明的多核苷酸序列。例如，可以用本领域技术人员熟知的技术引入突变，例如定向诱变、新的限制位点的***、改变糖基化，磷酸化等。
特别地，在一些表达***，如酵母中，宿主细胞会对基因产物进行过糖基化。在这种***中，优选改变多核苷酸序列以消除糖基化位点。在本发明公开的范围内，也包括了连接异源序列而编码融合蛋白质的修饰多核苷酸序列。可以修饰融合蛋白质以在本发明蛋白质序列(例如序列SEQ.ID.NO.8)和异源蛋白质序列间包含切割位点，这样可以从异源部分切下本发明蛋白质序列。
与细胞增生调节有关的多核苷酸
本发明包括编码这里所述与细胞增生调节有关的多肽或其部分或变体的任何多核苷酸。这种多核苷酸可以是单链(编码链或反义链)或双链的，可以是DNA(基因组的，cDNA的或合成的)或RNA分子。
可以用本领域技术人员已知的任何技术制备与分化有关的多核苷酸。例如，可以通过聚合酶链式反应(PCR)从制备自细胞或人组织的cDNA扩增这种多核苷酸。对于该方法，可以设计和定购或合成特异引物；这些引物基于所述多核苷酸的序列。然后，可以利用本领域技术人员熟知和下面简要提到的技术，用扩增的部分从人基因组DNA库或从任何细胞或任何组织(不管其是正常的，肿瘤的或分化的)的cDNA库分离完整的基因。作为备选方案，可以从几个PCR片段构建完整的基因。通过筛选获自例如细胞或组织mRNA的cDNA库，也可以制备编码与分化有关的蛋白质或其部分的cDNA分子。可以商购得到或通过用标准技术制备这种文库(参见，Sambrook等，Molecular cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratories，Cold Spring Harbor，NY，1989)
可替代地，可以利用本领域技术人员熟知的其它筛选技术。
可以用标准酶技术，如DNA聚合酶I的Klenow片段、测序酶X(USBiochemical Corp.，Cleveland，OH，USA)、Taq聚合酶(Perkin Elmer，Foster City，CA，USA)、热稳定聚合酶T7(Amersham，Chicago，IT，USA)或具有校读活性的重组聚合酶和外切核酸酶的联合，如Elongase扩增***(Gibco BRL，Gaithersburg，MD，USA)测序与分化有关的cDNA分子。可以使用自动测序***，利用可从商品供应商如Perkin Elmer和Pharmacia购得的仪器。
通过利用本领域技术人员熟知的标准技术，可以用部分cDNA序列鉴定编码与细胞增生调节有关的完整蛋白质的多核苷酸序列。这些技术包括利用RecA的重组特性通过用一个或多个多核苷酸探针筛选cDNA文库(ClonCapture cDNA筛选试剂盒，Clontech Laboratories USA)。
对于杂交技术，可以用标准技术放射性标记部分序列(例如通过切口平移或通过用32P或33P进行末端标记)。然后，用标记探针在含有变性细菌菌落的滤膜(或含有噬菌体平板的印迹)上杂交筛选细菌或噬菌体文库(参见，Sambrook等，Molecular cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，NY，1989)。然后选择并扩增阳性菌落或平板，分离DNA用于下一步分析。
然后，可以用标准技术测定完整的序列。然后排列重叠序列组成单一连续的序列。可以用标准技术，通过目的片段的连接产生完整cDNA分子。
可替代地，存在基于扩增从部分cDNA序列获得完整编码序列的大量技术。在这些技术中，一般通过PCR进行扩增。所有商购试剂盒都可以用于此扩增步骤。通过利用，例如本领域熟知的软件可以设计引物。核苷酸引物优选为具有至少50％鸟嘌呤和胞嘧啶含量并能与靶序列在50到72℃之间的温度杂交的具20到30个核苷酸的分子。可以如上所述测序扩增的区域，并且排列重叠序列组成一连续序列。
在可替代的方法中，可以通过用具有连接序列的引物和对已知区域具特异性的引物扩增得到该部分序列的邻近序列。然后对扩增的序列进行第二轮扩增。
其它的技术包括捕获PCR(Lagerstrom等，PCR Methods Applic.(1991)，1，111-19)和步行PCR(Parker等，Nucl.Acids.Res.(1991)，19，3055-60)。其它利用扩增的方法也可以用于获得完整cDNA序列。
通过分析GenBank公共数据库“已表达序列标志”(ESTs)中保存的序列可以获得完整的cDNA序列。可以用本领域技术人员熟知的计算机程序(例如NCBI BLAST)进行覆盖EST的检索，然后可以用这些EST产生连续的完整序列。
本发明的领域也包括上述多核苷酸序列(特别是序列SEQ.ID.NO.4，SEQ.ID.NO.5和SEQ.ID.NO.9)的变体。多核苷酸变体可以包含一个或多个置换、缺失或***(也参见上述在标题为“本发明的多核苷酸，多肽和蛋白质”的部分中的内容)。
编码序列的部分互补序列(即，反义多核苷酸)还可以用作探针或基因表达的调节物。可以向细胞或组织中引入能被转录为反义RNA的cDNA构建体以利于反义RNA的产生。如这里所述，可以用反义多核苷酸抑制与细胞增生调节有关的基因的表达。通过形成三股螺旋，可以用反义技术控制基因表达，该三股螺旋损害了双螺旋充分打开以结合聚合酶、转录因子或调节分子的能力(参见，Gee等，Huber和Carr，Molecular andImmunologic Approaches(1994)，Futura Publishing Co.，Mt.Kisco，NY)。作为备选方案，可以用反义分子与基因控制区(例如启动子或转录起始位点)杂交阻断基因转录或通过抑制核糖体与转录本结合阻断翻译。
可以修饰多核苷酸以体内增加它们的稳定性。可能的修饰包括(但不限于)：在5’和/或3’末端添加序列；在主链中应用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是磷酸二酯酶键；和/或引入碱基如次黄嘌呤核苷，queosine和wybutosine，类似地乙酰腺嘌呤，甲硫腺嘌呤和腺嘌呤、胞嘧啶核苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶核苷的其它修饰形式。
而且，在前面标题为“本发明的多核苷酸，多肽和蛋白质”部分中已经描述了本发明多核苷酸的其它变体。
通过用成熟的重组DNA技术，本发明所述核苷酸序列可以与其它核苷酸序列连接。例如，可以在一大组表达载体，包括质粒，噬粒，λ噬菌体的衍生物和粘粒中克隆多核苷酸。尤其有意义的载体包括表达载体，复制载体和测序载体。一般地，载体含有在至少一个生物体中有功能的复制起点，适合的内切核酸酶限制位点和一个或多个选择标记。其它元件的存在将取决于本领域技术人员需要的特定用途，本领域技术人员可以根据他们的需要和可用的技术选择表达载体的特性。
可以配制多核苷酸以用于导入细胞和表达相应多肽。如此后所述，这种配制在治疗中特别有用。
本领域技术人员将理解现有几种方法可用于在靶细胞中表达多核苷酸，并且任何适合的技术都可利用。例如，可以在病毒载体，如腺病毒或逆转录病毒中(及其它病毒载体中)引入多核苷酸。在这种载体中引入DNA的技术是本领域技术人员熟知的。逆转录病毒载体可以转移和携带选择标记基因和/或(为了使载体具靶特异性)靶实体(如编码靶细胞特异受体的配体的基因)。
用于多核苷酸的其它配制包括胶体分散***如大分子复合物，毫微胶囊，微球体，珠和基于脂质使用的***，包括水/油乳剂，微胶粒，混合微胶粒和脂质体。用于体外和体内递送产物的优选胶体***是脂质体(即，人工膜小泡)。
与细胞增生调节有关的多肽
在本发明公开的范围内，本发明多肽包含与细胞增生调节有关的蛋白质或其变体的至少一部分，所述部分具有免疫学和/或生物学活性。这种多肽可以是任何长度，包括完整蛋白质、寡肽(即，由相对有限数量的氨基酸，如8-10个氨基酸残基通过肽键连接组成)或中间大小的肽。此多肽也可以包含其它序列。
在本发明上下文中，如果多肽可被B和/或T细胞表面受体识别，那么多肽就具有免疫活性。通过用标准技术，如Paul，FundamentalImmunology，第三版，243-247(Raven Press，1993)概述的标准技术可以检测免疫活性。这种技术包括筛选来源于天然多肽的多肽以检测其与能用标准方法制备的抗原特异性抗血清和/或T细胞株系或克隆反应的能力。与细胞增生调节有关的蛋白质的免疫活性部分可以与该抗血清和/或T细胞反应，并且其反应性不显著弱于完整多肽的反应性(例如，在ELISA检验中和/或在T细胞反应性检验中)。通常可以用本领域技术人员熟知的方法，如在Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，1988.中所述的方法进行这种筛选。
通过利用计算机技术也可以预测B和T细胞表位。
可替代地，可以用计算机分析，如Tsites程序(参见Rothbard和Taylor，EMBO J.(1988)，7，93-100；Deavin等，Mol.Immunol.(1996)，33，145-155)鉴定免疫原部分，该程序检索有诱导应答潜能的肽单元。根据BIMAS方法(Parker等，J.Immunol.(1994)，152：163，1994)可以鉴定适于结合鼠或人的I或II类主要组织相容性复合物(MHC)的肽单元。为了证实免疫原性，可以利用HLA A2转基因小鼠和/或借助树突细胞、成纤维细胞或外周血细胞的体外刺激试验检验肽。
类似地，如果多肽具有与细胞增生调节有关的天然蛋白质的一种或多种结构、调节和/或生物化学功能，那么该多肽就具有“生物活性”。可以根据本领域技术人员熟知的方法检测生物活性的存在。
例如，序列比较研究可以指示蛋白质的特定生物活性。然后，可以在本领域已知试验的基础上利用试验评估所述活性。根据体外或体内试验，该蛋白质的某些部分和其它变体也可显示这种特性。
如上述，本发明多肽可以包含内源蛋白质变体的一个和多个部分，其中所述部分具免疫学和/或生物学活性(即，所述部分有完整蛋白质的一种或多种抗原，免疫原和/或生物学特性)。优选地，在能够检测这些特性的试验中，所述部分至少具有与全蛋白质一样的活性。多肽“变体”是通过在氨基酸中置换，***，缺失和/或修饰而不同于天然蛋白质的多肽。一些变体含有保守性置换。“保守性置换”是将氨基酸替换为有相同特性的其它氨基酸，如本领域技术人员确定的预期不会在多肽的二级结构及亲水特性方面引起变化的那些氨基酸。一般地，可以基于残基的极性，电荷，溶解度，疏水性，亲水性和/或两性性质的相似性进行氨基酸的置换。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；有相似疏水性值的极性不带电荷氨基酸包括亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸。特别地，可以代表保守性改变的其它氨基酸组见如下：(1)Ala，Pro，Gly，Glu，Asp，Gln，Asn，Ser，Thr；(2)Cys，Ser，Tyr，Thr；(3)Val，Ile，Leu，Met，Ala，Phe；(4)Lys，Arg，His；和(5)Phe，Tyr，Trp，His。变体也可以，或作为备选方案含有非保守性改变。
形成本发明部分的变体也包括通过与其它多肽或化学结构，如脂质基团或糖基或磷酸乙酰基团形成共价或非共价缀合物修饰天然蛋白质一级结构而形成的多肽。
本发明也包括有或无糖基化单元的多肽。根据所用表达***，在分子量和糖基化模式方面，在酵母表达***或哺乳动物细胞中表达的多肽可以类似或稍微不同于天然分子。
在细菌如大肠杆菌(E.coli)中表达DNA可产生无糖基化的分子。通过三联体氨基酸Asn-A1-Z可以表征真核生物蛋白质的N-糖基化位点，其中A1是除了Pro外的任何氨基酸，Z是丝氨酸或苏氨酸。
本发明也包括与细胞增生调节有关的蛋白质的等位基因。等位基因是由一个或多个突变(可以引起氨基酸缺失，添加或置换)导致的天然蛋白质的可替代形式，其产生改变的RNA。等位基因蛋白质可以在序列上不同，但是总的结构和功能基本相似。一般地，可以用标准技术，从编码期望多肽的核酸制备与细胞增生调节有关的蛋白质，其变体和部分。为了制备内源蛋白质，可以使用分离的cDNA。
此外，在前面标题为“本发明的多肽和多核苷酸”部分中已经描述了本发明多肽和蛋白质的其它变异形式。
为了制备多肽变体，可以用标准诱变技术，如利用定向寡核苷酸的定向诱变。
一般地，可以用本领域技术人员已知的任何表达载体表达本发明重组多肽。可以在任何用表达载体转化或转染的适当宿主细胞中获得此表达，所述表达载体含有编码重组多肽的DNA序列。适合的宿主细胞包括原核细胞，高等真核细胞或酵母细胞。优选地，所用宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)、酵母细胞或哺乳动物细胞如COS、CHO、MCF7(从乳腺癌分离的人肿瘤细胞)或DU145(从***癌分离的人肿瘤细胞)。
表达后，对于重组蛋白质或多肽被分泌至培养基中的宿主/载体***，可以通过标准技术，如乙醇沉淀或利用商购过滤器过滤首先浓缩宿主/载体***的上清液。浓缩步骤后，可以将由此得到的产物加载于适合的纯化基质，如亲和基质或离子交换树脂上。可以用一个或多个HPLC步骤监测多肽的纯化。
也可以用本领域技术人员熟知的技术，通过合成方法产生一些部分和其它变体。例如，通过化学途径可以合成具有少于500个氨基酸，优选少于100个氨基酸，而且更优选少于50个氨基酸的部分和其它变体。通过在商购固相上应用合成技术可以合成多肽，例如在Merrifield树脂上合成，其中合成期间氨基酸被顺序加到氨基酸链上(参见，Merrifield，J.Am.Chem.Soc.(1963)，85，2149-2146)。许多其它固相合成技术也是可用的(例如，Roberge等的方法，Science(1995)，269，202-204)。从供应商如AppliedBiosystems，Inc.(Foster City，CA，USA)可商购多肽的自动合成设备；然后，根据制造商的推荐可以进行多肽的合成。
分离的多核苷酸或多肽
一般地，本发明描述的多肽和多核苷酸是分离的。“分离”的多肽或多核苷酸是指离开其原始环境的多核苷酸或多肽。例如，如果天然蛋白质与其在自然***中共存的生物物质分离，那么此天然蛋白质是分离的。例如，如果多核苷酸被克隆在不是其自然环境的一部分的载体中，那么认为该多核苷酸是分离的。
信号序列
预测蛋白质是否有信号序列的方法是现成的，类似地预测该序列的切割位点的方法也是现成的。例如，McGeoch方法(Virus Res.(1985)，3，271-286)利用了完整蛋白质(没有被切割)非电荷区域的短N-末端电荷序列的信息。Von Heinje方法(Nucleic Acid Res.(1986)，14，4683-4690)利用了切割位点周围残基的信息。对于这些方法中的每一种，已知哺乳动物分泌性蛋白质的切割位点的预测精确性是75-80％。然而，对于给定的蛋白质，这两种方法并不总是预测出相同的切割位点。
在本案例中，通过称为SignalP的计算机程序(序列分析软件包，来自Genetic Computer Group，University of Wisconsin BiotechnologyCenter，1710 University Avenue，Madison，WI 53705，USA)分析分泌性多肽的推导氨基酸序列。该计算机程序根据氨基酸序列预测蛋白质的细胞定位。
也应认识到在一些情况下，分泌性蛋白质的信号序列切割是不一致的，这样就形成几种分子。本发明包括这些多肽和编码这些多肽的多核苷酸。
而且，通过上述分析鉴定的信号序列不能预测天然信号序列。例如，天然信号序列可以在预测序列的上游或下游。然而，所述信号序列可能具有向内质网引导分泌性蛋白质的能力。本发明包括这些多肽和编码这些多肽的多核苷酸。
从一个物种到另一个物种，切割位点有时是不同的，故不能确定地预测该切割位点。
通过确定多核苷酸编码的序列可以鉴定从甲硫氨酸开始的氨基酸序列，而通过利用本领域技术人员熟知的分子生物技术可以容易地翻译其它阅读框架。本发明也设想了由这些可替代的开放读框产生的多肽。
抗体和其片段
本发明提供了结合试剂，如特异结合与细胞增生调节有关的蛋白质的抗体。如果这种试剂能以可检测的水平(例如，ELISA检验)和细胞增生调节相关蛋白质或其部分或变体反应，并且不与其它蛋白质发生可检测的反应，那么该试剂被认“特异结合”调节细胞增生的蛋白质。“结合”指2个分离分子间通过非共价连接形成复合物。例如，通过测定复合物形成的结合常数，可以评估结合能力。结合常数是当复合物浓度值除以成分浓度值的乘积时得到的值。一般地，当结合常数达到103l/mol时，2个产物被认为“结合”。用本领域技术人员熟知的方法可以测定结合常数。
任何能满足上述标准的试剂都可以认为是结合试剂。
在本发明中，结合试剂优选是抗体或其片段。可以用本领域技术人员可用的任何技术制备抗体(参见，Harlow和Lane，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。一般地，通过细胞培养技术可以产生抗体，包括单克隆抗体的产生或通过转染抗体基因进入细菌或哺乳动物宿主细胞以产生重组抗体。
在其它技术中，优选利用此后描述的技术。给一组哺乳动物(例如小鼠，大鼠，兔子，绵羊或山羊)注射含有多肽的免疫原。在这个步骤中，本发明多肽不用修饰就可以作为免疫原，可替代地，特别是对于小肽，如果将多肽与载体蛋白质如牛血清白蛋白或匙孔血蓝蛋白连接，则可以诱导上佳的免疫应答。优选根据预先确定的进度表，给宿主动物注射免疫原，并且周期地从动物取血。这样，例如，利用与适当固相支持体偶联的肽，通过亲和层析可以从这种抗血清纯化对此多肽特异的多克隆抗体。
融合蛋白质
为了分析本发明蛋白质的亚细胞定位，特别是序列SEQ.ID.NO.8蛋白质的亚细胞定位，本领域技术人员可以制备任何融合基因。有大量质粒构建体可商购获得，如蛋白质谷胱甘肽S转移酶(GST)或荧光蛋白质如绿色荧光蛋白质(GFP)或非限制性地聚组氨酸标记。
在转染程序前继代培养人真核生物宿主细胞(例如，HEK-293)24小时，使细胞能正常代谢和有较好的转染效率。单独载体、含有标记蛋白质(GFP、GST或标记组氨酸)的载体或含有与标记融合的序列SEQ.ID.NO.4多核苷酸、序列SEQ.ID.NO.5多核苷酸或序列SEQ.ID.NO.9多核苷酸的载体的递增浓度(1，5和10μg)根据制造商的推荐(Qiagen)用试剂Effetene产生。
然后可以通过共聚焦显微术分析细胞，例如以检测蛋白质的定位。如果例如怀疑蛋白质是分泌性的，则回收上清液，冻干，加载于丙烯酰胺凝胶上，并且用抗标记蛋白质的抗体通过Western印迹技术分析。
药物组合物
根据本发明的一些方面，可以在药物组合物或疫苗中包含产物如多肽，抗体和/或核酸。药物组合物包括这些产物的一种或多种和一种或多种药学可接受的赋形剂(载体)。一些任选地用作疫苗的药物组合物可以包含一种或多种多肽和免疫应答激活物，如佐剂或脂质体(其中包含本发明产物)。而且，药物组合物和疫苗可以包含给药***，如生物可降解微球体。本发明公开范围内的药物组合物和疫苗也可包含具生物活性的或无生物活性的其它产物。
药物组合物或疫苗可以包含编码上述一种或多种多肽的DNA，这样可以原位产生多肽。如前所述，DNA可以以本领域技术人员已知的任何给药形式存在，包括核酸、细菌或病毒表达***。适合的核酸表达***包含对于在患者中的表达所必需的DNA序列。
基于细菌的给药***涉及施用表面表达多肽的免疫原部分的细菌(如卡介苗)。优选地，可以通过病毒表达***(例如痘病毒，逆转录病毒或腺病毒)，包括非致病(缺陷)病毒的应用，引入DNA。
尽管本发明药物组合物中可以利用本领域技术人员已知的任何适合的载体，但是载体的类型将根据所选择的给药方式而变化。可以针对每种适合的给药方法，包括例如局部，鼻的，静脉内，颅内，腹膜内，皮下和肌内途径配制本发明的组合物。
对于非肠道的给药，如皮下注射，载体优选含有水，盐，醇，脂肪，石蜡或缓冲液。对于口服给药，可以利用上述任何载体或固体载体，如甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，滑石，纤维素，葡萄糖，蔗糖和碳酸镁。生物可降解微球体也可以用作本发明药物组合物的载体。对于一些局部给药，优选剂型为例如霜剂或洗剂。
这种组合物也可以包含缓冲液(例如，中性或磷酸盐缓冲盐溶液)，碳水化合物(例如葡萄糖，甘露糖，蔗糖或葡聚糖)，甘露醇，蛋白质，多肽或氨基酸如甘氨酸，抗氧化剂，螯合剂如EDTA或谷胱甘肽，佐剂(例如氢氧化铝)和/或保护剂。作为备选方案，本发明组合物可以以冻干形式存在。也可以用标准技术将产品包封在脂质体中。
根据本发明，可以在疫苗中利用多种佐剂中的一种用于诱导免疫应答。大部分佐剂含有保护抗原免受快速分解代谢的物质如氢氧化铝或矿物油和免疫应答刺激物，如脂质A、来源于百日咳博德特氏菌(BordetellaPertussis)或结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的蛋白质。可商购得到适合的佐剂，例如弗氏佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，MIY，USA；Merck Adjuvant 65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ，USA))，生物可降解的微球体；单磷酰脂A；和细胞因子如GM-CSF或白细胞介素-2，-7或-12。
也可以以延缓剂型(即，如给药后引发产品缓慢释放的胶囊剂或海绵剂)施用上述组合物。一般地，可以利用本领域技术人员熟知的技术制备此类制剂，并且可以例如通过口服，直肠途径或通过皮下植入或通过在期望靶位点植入给予该制剂。延缓剂型可以含有分散在载体基质中和/或包含在受扩散膜保护的贮库中的多肽，多核苷酸或抗体。用于这种剂型的载体是生物相容的，而且必需也是可生物降解的；优选此剂型提供相对恒定的活性组分释放水平。延缓剂型中含有的活性产物的量取决于植入位点。
抗癌治疗
根据本发明的其它方面，所述产品可以用在抗癌治疗中。特别地，在特异乳腺癌和***癌中，可以用这些与细胞增生调节有关的多核苷酸和多肽抑制生长和诱导细胞增生的调节。
这些多肽或多核苷酸也可以用于治疗许多癌包括黑素瘤，多种形式的成胶质细胞瘤，肺癌及结肠直肠癌。激活这些多肽或多核苷酸表达的试剂也可以用在这些治疗的框架中。
根据本发明的这些方面，产物(可以是多肽或核酸)优选包含在上述药物组合物中。
适宜接受治疗的患者是温血动物，而且优选人。根据本发明，符合治疗条件的患者可以被诊断患有癌症，或可以没有被诊断患有癌症。换言之，上述药物组合物可以用于抑制在疾病不同阶段的癌症发展(为了预防癌症的出现或治疗患癌症的患者)。
本发明药物组合物以适合于要治疗的每种特定癌症的方式给药。
根据患者的状态，疾病的类型和严重性，及给药方法确定给药的途径，持续期和频率。给药的途径和频率可以随不同个体变化。一般地，可以通过注射(例如，通过皮内，肌内，静脉内或皮下途径)、通过鼻内途径(例如通过吸入)或通过口服途径给予药物组合物和疫苗。优选地，可以经52周1至10次给药。其它备选方案可能适于各不同的患者。
一般地，适合的剂量和治疗方案含有足够提供治疗或预防益处的量的活性产物。在受治疗患者中，可以通过与未治疗或用较低剂量治疗的患者比较确定改进的临床结果(例如，疾病更频繁的减轻，在完全、部分或更长期的无疾病状态下的存治)来跟踪这种反应。
根据本发明的其它方面，可以以100μg到5mg的剂量给予多肽。一般地，可以以足以产生类似多肽水平的量施用编码这种多肽的DNA分子。一般地，可以通过利用实验模型和/或临床试验确定适合的剂量。通常，优选应用足以提供有效治疗的最小剂量。通常，可以利用本领域技术人员熟悉的适于治疗或预防情况的试验监测患者以判断治疗效力。
癌症的检测和监控方法
本发明所述多肽，多核苷酸和抗体可以通过多种方法用于患者癌症的检测。在宿主细胞中与细胞增生调节有关的多肽和/或多核苷酸，如本发明所述多肽和/或多核苷酸的出现预示细胞生长的停止和分化。因此，与细胞增生调节有关的序列可以用作正常细胞和恶性细胞的区分标记(并且使医生在解释结果后能对例如***，乳腺，肺和结肠癌作为诊断)。也可以用与细胞增生调节有关的序列作为监控治疗的标记。
包括抗体应用的方法可以使研究者能够在任何可得到的生物样品中检测本发明所述多肽的存在或缺乏。可得到的生物样品包括获自患者的肿瘤组织和健康组织的活检，来源于该组织的组织匀浆或提取物。有多种本领域技术人员已知的试验可用于通过抗体检测样品中的多肽标记。(参见，例如Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，1988)。
例如，根据Western印迹技术可以进行试验，其中对蛋白质制备物进行凝胶电泳，转移到适合的膜上与抗体进行反应。然后，如下所述，通过利用适合的检测试剂可以检测膜上抗体的存在。
根据本发明的其它方面，可以实施这样试验，该试验包括利用固定在固相支持体上的抗体与多肽结合。然后用含有标记部分的第二抗体或其它试剂可以检测结合的抗体。可替代地，可以用竞争试验，其中用标记部分标记多肽，在抗体与样品温育后，使标记的多肽与固定的抗体结合。样品成分抑制标记多肽与抗体结合的能力预示了样品与固定多肽的反应性，由此预示了样品中的多肽浓度。
固相支持体可以是本领域技术人员已知的任何材料，可以将抗体附着在固相支持体上。例如，固相支持体可以是微量滴定板中的试验孔或由硝酸纤维素制成的滤膜或任何其它适合的膜。可替代地，支持体可以是珠，玻璃，塑料材料或乳胶，如聚苯乙烯或聚氯乙烯。支持体也可以是磁性颗粒。
可以用本领域技术人员已知的和科学文献中广泛描述的各种技术在固相支持体上固定抗体。在本发明上下文中，术语“固定”指非共价结合如吸附和共价连接(可以是在支持体的官能团和抗原间的直接连接或通过应用结合试剂产生连接)。优选通过吸附固定到微量滴定板孔或膜上。在这种情况下，可以在存在固相支持体时，通过放置抗体于适合的缓冲液中适合的时间完成吸附。接触时间根据温度变化，但是接触时间通常包括1小时到1天。一般地，在塑料(例如，聚苯乙烯或聚氯乙烯)微量滴定板的孔中存在1pg到10ng，优选100到200ng抗体量的情况下，足以固定适当量的多肽。
也可以通过支持体与双功能试剂反应产生抗体与固相支持体的共价连接，其中该双功能试剂与支持体和抗体上的官能团，如羟基或氨基反应。例如，可以根据标准技术，通过利用苯醌或通过支持体上的醛基与配偶体上的胺和活性氢缩和，以共价方式连接抗体和覆盖有适合聚合物的支持体。
在一些情况下，用于样品中多肽检测的试验是双抗体“夹心”试验。该试验可以通过将生物样品及固定在固相支持体上的抗体放入微量滴定板孔进行，这样样品中的多肽可以与固定的抗体结合。从多肽-抗体复合物中除去未固定的产物，并且加入能结合多肽的不同位点的第二抗体(含有标记部分)。然后，用对标记部分特异的适合方法检测与固相支持体保持结合的第二抗体的量。
更具体地，当将抗体固定在上述支持体上后，通常封闭蛋白质结合位点。可以用本领域技术人员已知的任何封闭试剂如牛血清白蛋白或吐温20TM(Sigma Chemical Co，St.Louis，MO，USA)。然后温育固定的抗体和样品，使多肽能与抗体结合。然后，可以用适合的稀释液，如磷酸缓冲盐(PBS)溶液稀释样品后进行温育。
一般地，适合的接触时间(即温育时间)是在获自个体的样品中足以检测到多肽存在的时间。优选地，由此定义的接触时间是足以使结合水平达到结合肽和未结合肽间达平衡时的结合水平的至少95％的时间。
本领域技术人员将意识到达到平衡所需的时间必须通过检测一段时间的结合水平来确定。在环境温度下，一般30分钟温育时间足够了。然后，可以通过用适当缓冲液，如含有0.1％吐温20TM的磷酸缓冲盐溶液洗涤固相支持体除去未结合的产物。然后可以向固相支持体中加入含有标记部分的第二抗体。
优选标记部分包括酶(如过氧化物酶)，辅因子底物，染色抑制剂，发光基团，荧光基团和生物素。通过用本领域技术人员已知的标准技术可以完成抗体与标记部分的缀合。
然后，温育第二抗体与抗体-多肽固定复合物充足时间以允许实现结合多肽的检测。
一般地，通过检测一段时间的结合水平可以确定适合的时间。然后除去第二未结合的抗体，用标记部分检测第二结合抗体。用于标记部分检测的方法取决于标记部分的性质。对于放射性基团，一般适用闪烁或放射自显影计数方法。可以用光谱方法检测染色试剂，荧光或发光基团。可以用与标记部分(放射性或荧光基团或酶)偶联的抗生物素蛋白检测生物素。通常可以通过底物添加(一般经过一段适合时间)，随后通过对反应产物进行光谱(或其它)分析检测酶学标记部分。
为了检测癌症的存在与否，一般地，将通过与固相支持体结合的标记部分检测到的信号与相应于确定值的来自非肿瘤组织的信号比较。优选地，阈值是当固定化抗体与来自未患癌症的患者的样品温育时获得的平均信号。一般地，认为产生比预定阈值的标准差相应地多或少3倍的信号的样品具预示性。
对于更多的细节，本领域技术人员可参考下面的出版物：Sackett等，Clinical Epidemiology.A basic Science for Clinical Medicine，106-107页，(Little Brown和Co.，1985)。
相对于预先确定的阈值，通过评估生物样品(例如，活检组织)中编码本发明多肽的mRNA的水平也可以确定患者是否患有癌症。
通过用本领域技术人员已知的大量方法，例如原位杂交和通过聚合酶链式反应(PCR)扩增可以进行这样的评估。通常可以从实施例中所列出的序列或从其它个体中鉴定到的类似序列产生用在该方法中的探针和引物。探针可以用在标准杂交技术中，并且可以用检测试剂标记探针以有利于探针的检测。该试剂包括(但不限于)：放射性核素，荧光染色剂和能催化可检测产物形成的酶。
一般地，引物可以用于检测方法，包括聚合酶链式反应(PCR)，如PCR与逆转录联合使用的RT-PCR中。通常地，从样品组织提取RNA，用逆转录方法转录以产生cDNA分子。用特异引物进行PCR扩增产生与细胞增生调节有关的cDNA分子，可以用例如凝胶电泳分离和观察该cDNA。通常可对获自相同个体的肿瘤和非肿瘤组织的样品或对获自不同个体的肿瘤和非肿瘤组织的样品进行扩增。可以对覆盖2个数量级的cDNA系列稀释物进行扩增反应。通过与相同稀释的非肿瘤样品比较，肿瘤样品稀释物中表达的2倍或更高倍改变一般被认为具预示性。
而且，可以直接对肿瘤进行目的在于确立诊断的一些试验。
这样的试验包括使肿瘤细胞与抗体或其片段接触，所述抗体或其片段能结合与细胞增生调节有关的蛋白质。可以直接或通过标记部分间接检测结合的抗体或其片段。这种抗体也可以用在组织学应用中。作为备选方案，反义多核苷酸可以用在该应用中。
根据本发明的其它方面，可以在一段时间内，通过进行上述的任何一种试验和评估反应水平的变化(即，检测到的多肽或mRNA的量)监测癌症治疗的进展和/或反应。例如，可以在1到2年期间，每月进行试验。一般地，如果患者的反应水平随着时间降低，那么患者的癌症在发展。相反地，当检测到的信号保持恒定或随着时间而增加时，癌症没有进展。
本发明也提供了用于所有上述诊断方法的试剂盒。所述试剂盒包含进行这些试验所必需的两个(或多个)成分。该成分可以是产物，试剂和/或容器或装置。例如试剂盒中的一个容器可以含有能与细胞增生调节相关多肽特异结合的单克隆抗体或其片段。如上述，可以提供与支持体材料结合的这种抗体或片段。一个或多个其它的容器可以含有试验中所用的成分，如试剂或缓冲液。该试剂盒也可以含有检测试剂(例如抗体)，该检测试剂含有适于对结合的抗体进行直接或间接检测的标记部分。
结合或调节试剂的鉴定方法：
而且，本发明提供了鉴定能结合和/或调节与细胞增生调节有关的蛋白质的表达的产品的方法。一般可以在足以使本发明多肽和/或其效应物(例如，其受体)与候选产品/试剂可以相互作用的条件和时间下，使本发明提供的多肽与候选产品/试剂接触而鉴定这种试剂。这样，可以进行本领域技术人员熟知的各种结合试验以检测候选产品结合多肽或其效应物(例如，其受体)的能力。
在其它试验中，可以用已知在细胞增生调节相关基因的表达方面有增加的细胞来筛选试剂。可以使这种细胞与候选试剂接触，并且相对于在缺乏候选试剂的情况下观察到的表达评估与细胞增生调节有关的基因的表达。
备选地，可以根据候选产品调节细胞增生调节相关蛋白质的表达(例如，转录)的能力，对其实施筛选。为了评估候选试剂对细胞增生调节相关蛋白质的表达的影响，可以将后者的启动子或调节元件与上述标记基因结合。可以通过转染将这种构建体导入适合的宿主细胞，然后使细胞与候选试剂接触。
所述宿主细胞优选用于筛选由组合化学法产生的小分子文库。根据这个优选的变体方案，温育细胞和文库；然后裂解细胞，根据标准程序分析上清液中标记基因的活性。
使标记基因活性增加的产品是细胞增生调节相关基因的转录诱导物，因此可以用于抑制癌症的发展。
除非特别说明，这里所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同意思。类似地，这里提到的所有出版物，专利申请，所有专利和所有其它参考文献以参考文献形式并入。
为了示例上述过程，给出下面的实施例，但决不应该认为它们是对本
发明范围的限制。
实施例：
实施例1：cDNA片段SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5的分离和表征
我们采用了在含有ETS的公共数据库中存在的DNA序列SEQ.ID.NO.1(Genbank，记录号：AA176076)，其显示如下：
1 ctccatgana tgccactgtt cctgaccagc cgaagtccag gcagggggag gtttccttgt
61 ccaggaggga gaggacctcc accctctgac ctttcagttt tccatagcag cccagtgtga
121 agctcggcag ngggtgggca gggcatcagg acaagatgaa gatgctggct ctggaatgag
181 gactcccctt ggcataaggg gtagtggctg gcagaggttg cccagctctt ttggaggcca
241 cagggaatag aggtggggtg gtgcttccgt tcctgtgagg cccgcccccc tgagccccct
301 ccgtctgctt cttgtttggc agaaatagat gtggggcaca gcctaagaat gatgggaatc
361 tgcccaagct gtgccctctg gggaaatgaa atcttgctcc tcgtgcagct tccccttttc
421 ccttgcgggg tgggggctgg gggtgccaag gctccaccct tggaaggggt tgctggggtg
481 ccaagctcca acctttgctc gctggcagaa ggaaggaagc acctcctgta tctttcaggg
541 ncctgaagcc antttgcctc agagaagaga nagtcc
从这个序列中，合成具有相应序列SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3(见下)的一对引物5’-Fwd1和3’-Revl以获得允许克隆完整cDNA的探针，所述完整cDNA含有编码相应基因的完整开放阅读框。
序列SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3如下：
-SEQ.ID.NO.2：5’-CTG ACC TTT CAG TTT TCC ATA GC-3’
-SEQ.ID.NO.3：5’-ATC TAT TTC TGC CAA ACA AGA A-3’
在开始阶段，通过利用序列SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3的引物，对一系列商购cDNA库进行聚合酶链式反应(PCR)。在50μl终体积中，反应条件包括0.5μM Fwd1(SEQ.ID.NO.2)和Rev1(SEQ.ID.NO.3)，200μM脱氧核糖核苷三磷酸(或dNTP：dATP，dCTP，dGTP和dTTP)，10mMTris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl2和0.5U Taq DNA聚合酶。热循环参数包括94℃变性30秒，60℃引物杂交1分钟，72℃聚合延伸30秒(最后延伸5分钟)。
在1％琼脂糖凝胶上分离PCR获得的产物，用溴化乙锭染色观察。结果显示了来自于人大脑，垂体，肺，肾和肠cDNA库(Quantum)的245碱基对的条带和来自于人乳腺和***cDNA库的290碱基对条带。在图1中显示了该结果。
用电洗脱纯化通过PCR获得的产物，并且利用ClonCapture cDNA克隆试剂盒(Clontech)根据制造商的说明，将该产物用作探针以克隆含有完整开放阅读框的cDNA。
用自动测序仪测定阳性克隆的核酸序列。见如下序列SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5。
-SEQ.ID.NO.4：
1 aggagggtct gaaggtggga gggcagctcc atgagcagcc actgttcctg accagccgaa
61 gtgccaggca gggggaggtt tccatgtcca ggagggagag gacctccacc ctctgacctt
121 tcagttttcc atagcagccc agtgtgaagc tcggcggggg tgggcagggc atcaggacaa
181 gatgaagatg ctggctctgg aatgaggact ccccttgggc taaggggtag tggctggcag
241 aggttgccca gctcttttgg aggccacagg gaatagaggt ggggtggtgc ttccgttcct
301 gtgaggcccg cccccctgag ccccctcgtc tgcttcttgt ttggcagaaa tagatgtggg
361 gcacagcccc tagatgatgg gaatctgccc aagctgtgtc ctctggggaa tgaaatcttg
421 ctcctcatgc agcttcccct ttcccttgcg gggtgggggc tgggggtgcc aaggctccac
481 ccttggaggg ggttgctggg ggtgccaagg ctccaccctt tgctcgctgg gcagagggaa
541 ggaagcacct ccctgtatgc tctgcagggg cccctgcagg ccactttgcc tcagaggaag
601 gaggagaggt cccctgggaa aatgcgcaca cacacacaca cacacacacg cacacacaca
661 cgcacatgca cacacgcacg catgcacaca cacacacata tgtgcagggg tgcagcctaa
721 gtcagtggag ccaggactgg ctgcgcagct gggcctgccc cattcttgga gtccccaggg
781 aatgagcctc aggatccact tcgtcccttg tttctaagcc aggctgcacg gccgttcctg
841 ggtgtgaaag cattctgtcc tgtctccagt cagagggaac cgcccccaaa ctagaaagct
901 aatttccccc gaaggttcat gaagccagag gcatgccctt gggggttggt cgggagaagg
961 gtgagaggca gtgctgtgga aggggcctgg cccctgctgc ctgcgattc
-SEQ.ID.NO.5：
1 aggagggtct gaaggtggga gggcagctcc atgagcagcc actgttcctg accagccgaa
61 gtgccaggca gggggaggtt tccatgtcca ggagggagag gacctccacc ctctgacctt
121 tcagttttcc atagcagccc agtgtgaagc tcggcggggg tgggcagggc atcaggacaa
181 gatgaagatg ctggctctgg aatgaggact ccccttgggc taaggggtag tggctggcag
241 aggttgccca gctcttttgg aggccacagg gaatagaggt ggggtggcaa caggaaatag
301 ggtgtgggct gtagaccata gtgggtgggg tggtgcttcc gttcctgtga ggcccgcccc
361 cctgagcccc ctcgtctgct tcttgtttgg cagaaataga tgtggggcac agcccctaga
421 tgatgggaat ctgcccaagc tgtgtcctct ggggaatgaa atcttgctcc tcatgcagct
481 tcccctttcc cttgcggggt gggggctggg ggtgccaagg ctccaccctt ggagggggtt
541 gctgggggtg ccaaggctcc accctttgct cgctgggcag agggaaggaa gcacctccct
601 gtatgctctg caggggcccc tgcaggccac tttgcctcag aggaaggagg agaggtcccc
661 tgggaaaatg cgcacacaca cacacacaca cacacgcaca cacacacgca catgcacaca
721 cgcacgcatg cacacacaca cacatatgtg caggggtgca gcctaagtca gtggagccag
781 gactggctgc gcagctgggc ctgccccatt cttggagtcc ccagggaatg agcctcagga
841 tccacttcgt cccttgtttc taagccaggc tgcacggccg ttcctgggtg tgaaagcatt
901 ctgtcctgtc tccagtcaga gggaaccgcc cccaaactag aaagctaatt tcccccgaag
961 gttcatgaag ccagaggcat gcccttgggg gttggtcggg agaagggtga gaggcagtgc
1021 tgtggaaggg gcctggcccc tgctgcctgc gattc
实施例2：在表达载体中克隆SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5
从核酸序列SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5合成具有相应序列SEQ.ID.NO.6和SEQ.ID.NO.7(见下)的新引物5’-F1和3’-R1。这些序列分别含有HindIII和EcoRI限制位点。
序列SEQ.ID.NO.6和SEQ.ID.NO.7如下：
-SEQ.ID.NO.6：5’GCA AGC TTG CGG GGG AGG AGG AGG G-3，
-SEQ.ID.NO.7：5’CGG AAT TCC CGG GGG GAA TCG CAG-3，
用如实施例1中所述相同的反应条件及引物SEQ.ID.NO.6和SEQ.ID.NO.7进行PCR反应。通过PCR反应获得的产物可以直接***(例如但不限于)pCDNA3.1(In Vitrogen)表达载体类型中。PCR扩增步骤后，产物进行HindIII和EcoRI水解以释放含有这些末端的序列，然后通过电洗脱从琼脂糖凝胶进行纯化。
然后向表达载体，例如pCDNA3.1(In Vitrogen)中***序列SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5。通过对已经接受了所述表达载体的不同细菌克隆进行适当限制酶消化分析可以分离含有新的“表达载体/SEQ.ID.NO.4”或“表达载体/SEQ.ID.NO.5”构建体的细菌克隆。
利用质粒DNA纯化试剂盒(Qiagen)进行这些质粒构建体的大量制备。
序列SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5的多核苷酸的特性
在人肿瘤组织中序列SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5的多核苷酸的表达
从细胞培养物和肿瘤组织制备RNA
在总RNA提取步骤前，在-80℃保藏培养细胞或肿瘤组织。总RNA提取是利用试剂Trizol(Gibco/BRL)，根据科学文献中所述的技术(Chomczynski和Sacchi，Anal.Biochem.(1987)，162，156)进行的。在溴化乙锭存在的情况下，在1％琼脂糖凝胶上分析由此提取的RNA的质量。
RNA的反转录
通过利用Superscript反转录酶(Gibco/BRL)按制造商说明书中的建议，用寡(dT)引物，以反转录方式转录总RNA。
对反转录获得的产物进行聚合酶链式反应(PCR)
通过利用分别具有序列SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3的引物5’Fwd1和3’Rev1对反转录产物进行聚合酶链式反应(PCR)，分析序列SEQ.ID.NO.4或SEQ.ID.NO.5的表达。在50μl终体积中，反应条件包括0.5μM Fwd1和Rev1，200μM dNTP，10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mMKCl，1.5mM MgCl2和0.5U Taq DNA聚合酶。热循环参数包括94℃变性30秒，60℃引物杂交1分钟，72℃聚合延伸30秒(最后延伸5分钟)。
在1％琼脂糖凝胶上分离通过PCR获得的产物，用溴化乙锭染色观察。
在一些情况下，利用随机标记试剂盒(Pharmacia)，用αP32-dCTP标记的序列SEQ.ID.NO.4作为探针进行尼龙膜上的杂交分析。然后在低严格性条件下(在60℃，2 X SSC，0.1％SDS)及随后在高严格性条件(在65℃，0.1 X SSC，0.1％SDS)下洗膜。然后使膜对Kodak XAR胶片曝光。
分析乳腺肿瘤样品中序列SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5多核苷酸的表达
对15份通过外科手术取自乳腺肿瘤患者的肿瘤样品进行序列SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5多核苷酸表达的分析。
用以稳定方式表达的G3PDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)标记物标准化根据上述程序获得的cDNA以控制样品间RNA或cDNA量的变化。然后，根据上述程序在尼龙膜上杂交PCR反应产物。
图2中显示了获得的结果，其表明通过这种方法可以观察到乳腺癌肿瘤样品中存在序列SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5的多核苷酸。
通过序列SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5的多核苷酸抑制细胞增生
在含有100U/ml青霉素和100μg/ml硫酸链霉素，及补充了10％胎牛血清的DMEM培养基(Dulbecco氏改良Eagle培养基)中培养DU145(ATCC代码)***肿瘤细胞。在转染程序前继代培养细胞24小时，使细胞能正常代谢和有较好的转染效率。根据制造商的推荐用试剂Effetene(Qiagen)制备递增浓度(1，5和10μg)的单独载体(pCDN3.1)或含有序列SEQ.ID.NO.4多核苷酸SEQ.ID.NO.5多核苷酸或序列的载体。
转染后48小时，通过胰蛋白酶处理，回收细胞，然后计数。在相同温度下，以5000rpm离心细胞，然后在-80℃冷冻用于上述RNA提取(参见，标题为“从细胞培养物和肿瘤组织制备RNA”的部分)。
在图3(序列SEQ.ID.NO.4多核苷酸)和图4(序列SEQ.ID.NO.5多核苷酸)中显示了结果。它们表明编码序列SEQ.ID.NO.4多核苷酸的cDNA或编码序列SEQ.ID.NO.5多核苷酸的cDNA的表达与含有序列SEQ.ID.NO.4多核苷酸或序列SEQ.ID.NO.5多核苷酸的表达载体的量成比例(A部分)。而且，结果表明，在含有序列SEQ.ID.NO.4多核苷酸或序列SEQ.ID.NO.5多核苷酸的表达载体以递增浓度存在的情况下，细胞生长相对于用10μg单独载体转染的细胞的生长而言显著地受到抑制(B部分)。在肿瘤细胞生长抑制和含有序列SEQ.ID.NO.4多核苷酸或序列SEQ.ID.NO.5多核苷酸的转染载体的数量之间的相关性分别等于1或0.96。
序列SEQ.ID.NO.5的片段编码的多肽
在序列SEQ.ID.NO.5中，观察到开放阅读框，在位置420有编码起始甲硫氨酸的起始密码子(ATG)而在位置861有终止密码子(UAA)的存在。由147个氨基酸组成的序列SEQ.ID.NO.8的蛋白质对应于按此被翻译的多核苷酸，其显示如下：
M M G I C P S C V L W G M K S C S S C S F P F P L R G G G W 30
G C Q G S T L G G G C W G C Q G S T L C S L G R G K E A P P 60
C M L C R G P C R P L C L R G R R R G P L G K C A H T H T H 90
T H A H T H A H A H T H A C T H T H I C A G V Q P K S V E P 120
G L A Q L G L P H S W S P Q G M S L R I H F V P C F 147
序列SEQ.ID.NO.8的蛋白质对应的多核苷酸具有如下所示的核苷酸
序列SEQ.ID.NO.9：
1 atgatgggaa tctgcccaag ctgtgtcctc tggggaatga aatcttgctc ctcatgcagc
61 ttcccctttc ccttgcgggg tgggggctgg gggtgccaag gctccaccct tggagggggt
121 tgctgggggt gccaaggctc caccctttgc tcgctgggca gagggaagga agcacctccc
181 tgtatgctct gcaggggccc ctgcaggcca ctttgcctca gaggaaggag gagaggtccc
241 ctgggaaaat gcgcacacac acacacacac acacacgcac acacacacgc acatgcacac
301 acgcacgcat gcacacacac acacatatgt gcaggggtgc agcctaagtc agtggagcca
361 ggactggctg cgcagctggg cctgccccat tcttggagtc cccagggaat gagcctcagg
421 atccacttcg tcccttgttt ctaa
附图说明
图1表示在1％琼脂糖凝胶上分离和用溴化乙锭染色后观察到的通过PCR获得的结果。
图2表示对15份乳腺癌样品(命名为S1到S15)进行Southern印迹所获得的结果。
图3的A部分显示在DU145(***肿瘤)细胞中编码序列SEQ.ID.NO.4多核苷酸的cDNA的表达，B部分显示在含有序列SEQ.ID.NO.4多核苷酸的表达载体以递增浓度存在的情况下细胞生长的抑制。
最后，图4的A部分显示在DU145(***肿瘤)细胞中编码序列SEQ.ID.NO.5多核苷酸的cDNA的表达，B部分显示在含有序列SEQ.ID.NO.5多核苷酸的表达载体以递增浓度存在的情况下细胞生长的抑制。
序列表
<110>科学研究和应用咨询公司
<120>用于调节癌细胞增生的多核苷酸
<130>RS 314 PCT-Hap-1
<140>
<141>
<150>FR 01/02801
<151>2001-03-01
<160>9
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>576
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
ctccatgana tgccactgtt cctgaccagc cgaagtccag gcagggggag gtttccttgt 60
ccaggaggga gaggacctcc accctctgac ctttcagttt tccatagcag cccagtgtga 120
agctcggcag ngggtgggca gggcatcagg acaagatgaa gatgctggct ctggaatgag 180
gactcccctt ggcataaggg gtagtggctg gcagaggttg cccagctctt ttggaggcca 240
cagggaatag aggtggggtg gtgcttccgt tcctgtgagg cccgcccccc tgagccccct 300
ccgtctgctt cttgtttggc agaaatagat gtggggcaca gcctaagaat gatgggaatc 360
tgcccaagct gtgccctctg gggaaatgaa atcttgctcc tcgtgcagct tccccttttc 420
ccttgcgggg tgggggctgg gggtgccaag gctccaccct tggaaggggt tgctggggtg 480
ccaagctcca acctttgctc gctggcagaa ggaaggaagc acctcctgta tctttcaggg 540
ncctgaagcc antttgcctc agagaagaga nagtcc 576
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述
5′寡核苷酸
<400>2
ctgacctttc agttttccat agc 23
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述
3′寡核苷酸
<400>3
atctatttct gccaaacaag aa 22
<210>4
<211>1009
<212>DNA
<213>人
<300>
<308>GenBank：AK000755
<400>4
aggagggtct gaaggtggga gggcagctcc atgagcagcc actgttcctg accagccgaa 60
gtgccaggca gggggaggtt tccatgtcca ggagggagag gacctccacc ctctgacctt 120
tcagttttcc atagcagccc agtgtgaagc tcggcggggg tgggcagggc atcaggacaa 180
gatgaagatg ctggctctgg aatgaggact ccccttgggc taaggggtag tggctggcag 240
aggttgccca gctcttttgg aggccacagg gaatagaggt ggggtggtgc ttccgttcct 300
gtgaggcccg cccccctgag ccccctcgtc tgcttcttgt ttggcagaaa tagatgtggg 360
gcacagcccc tagatgatgg gaatctgccc aagctgtgtc ctctggggaa tgaaatcttg 420
ctcctcatgc agcttcccct ttcccttgcg gggtgggggc tgggggtgcc aaggctccac 480
ccttggaggg ggttgctggg ggtgccaagg ctccaccctt tgctcgctgg gcagagggaa 540
ggaagcacct ccctgtatgc tctgcagggg cccctgcagg ccactttgcc tcagaggaag 600
gaggagaggt cccctgggaa aatgcgcaca cacacacaca cacacacacg cacacacaca 660
cgcacatgca cacacgcacg catgcacaca cacacacata tgtgcagggg tgcagcctaa 720
gtcagtggag ccaggactgg ctgcgcagct gggcctgccc cattcttgga gtccccaggg 780
aatgagcctc aggatccact tcgtcccttg tttctaagcc aggctgcacg gccgttcctg 840
ggtgtgaaag cattctgtcc tgtctccagt cagagggaac cgcccccaaa ctagaaagct 900
aatttccccc gaaggttcat gaagccagag gcatgccctt gggggttggt cgggagaagg 960
gtgagaggca gtgctgtgga aggggcctgg cccctgctgc ctgcgattc 1009
<210>5
<211>1055
<212>DNA
<213>人
<400>5
aggagggtct gaaggtggga gggcagctcc atgagcagcc actgttcctg accagccgaa 60
gtgccaggca gggggaggtt tccatgtcca ggagggagag gacctccacc ctctgacctt 120
tcagttttcc atagcagccc agtgtgaagc tcggcggggg tgggcagggc atcaggacaa 180
gatgaagatg ctggctctgg aatgaggact ccccttgggc taaggggtag tggctggcag 240
aggttgccca gctcttttgg aggccacagg gaatagaggt ggggtggcaa caggaaatag 300
ggtgtgggct gtagaccata gtgggtgggg tggtgcttcc gttcctgtga ggcccgcccc 360
cctgagcccc ctcgtctgct tcttgtttgg cagaaataga tgtggggcac agcccctaga 420
tgatgggaat ctgcccaagc tgtgtcctct ggggaatgaa atcttgctcc tcatgcagct 480
tcccctttcc cttgcggggt gggggctggg ggtgccaagg ctccaccctt ggagggggtt 540
gctgggggtg ccaaggctcc accctttgct cgctgggcag agggaaggaa gcacctccct 600
gtatgctctg caggggcccc tgcaggccac tttgcctcag aggaaggagg agaggtcccc 660
tgggaaaatg cgcacacaca cacacacaca cacacgcaca cacacacgca catgcacaca 720
cgcacgcatg cacacacaca cacatatgtg caggggtgca gcctaagtca gtggagccag 780
gactggctgc gcagctgggc ctgccccatt cttggagtcc ccagggaatg agcctcagga 840
tccacttcgt cccttgtttc taagccaggc tgcacggccg ttcctgggtg tgaaagcatt 900
ctgtcctgtc tccagtcaga gggaaccgcc cccaaactag aaagctaatt tcccccgaag 960
gttcatgaag ccagaggcat gcccttgggg gttggtcggg agaagggtga gaggcagtgc 1020
tgtggaaggg gcctggcccc tgctgcctgc gattc 1055
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述
5′寡核苷酸
<400>6
gcaagcttgc gggggaggag gaggg 25
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述
3′寡核苷酸
<400>7
cggaattccc ggggggaatc gcag 24
<210>8
<211>147
<212>PRT
<213>人
<400>8
Met Met Gly Ile Cys Pro Ser Cys Val Leu Trp Gly Met Lys Ser Cys
1 5 10 15
Ser Ser Cys Ser Phe Pro Phe Pro Leu Arg Gly Gly Gly Trp Gly Cys
20 25 30
Gln Gly Ser Thr Leu Gly Gly Gly Cys Trp Gly Cys Gln Gly Ser Thr
35 40 45
Leu Cys Ser Leu Gly Arg Gly Lys Glu Ala Pro Pro Cys Met Leu Cys
50 55 60
Arg Gly Pro Cys Arg Pro Leu Cys Leu Arg Gly Arg Arg Arg Gly Pro
65 70 75 80
Leu Gly Lys Cys Ala His Thr His Thr His Thr His Ala His Thr His
85 90 95
Ala His Ala His Thr His Ala Cys Thr His Thr His Ile Cys Ala Gly
100 105 110
Val Gln Pro Lys Ser Val Glu Pro Gly Leu Ala Ala Gln Leu Gly Leu
115 120 125
Pro His Ser Trp Ser Pro Gln Gly Met Ser Leu Arg Ile His Phe Val
130 135 140
Pro Cys Phe
145
<210>9
<211>444
<212>DNA
<213>人
<400>9
atgatgggaa tctgcccaag ctgtgtcctc tggggaatga aatcttgctc ctcatgcagc 60
ttcccctttc ccttgcgggg tgggggctgg gggtgccaag gctccaccct tggagggggt 120
tgctgggggt gccaaggctc caccctttgc tcgctgggca gagggaagga agcacctccc 180
tgtatgctct gcaggggccc ctgcaggcca ctttgcctca gaggaaggag gagaggtccc 240
ctgggaaaat gcgcacacac acacacacac acacacgcac acacacacgc acatgcacac 300
acgcacgcat gcacacacac acacatatgt gcaggggtgc agcctaagtc agtggagcca 360
ggactggctg cgcagctggg cctgccccat tcttggagtc cccagggaat gagcctcagg 420
atccacttcg tcccttgttt ctaa 444
Claims (11)
1.分离的多核苷酸，其包含多核苷酸序列SEQ.ID.NO.5。
2.由核苷酸序列SEQ.ID.NO.9组成的分离的多核苷酸。
3.分离的反义多核苷酸，其包含与权利要求1的多核苷酸序列互补的序列。
4.分离的多核苷酸，其由与核苷酸序列SEQ.ID.NO.9互补的核苷酸序列组成。
5.具有序列SEQ.ID.NO.8的分离的多肽。
6.能够与权利要求5的分离的多肽特异性结合的单克隆抗体。
7.表达载体，其包含分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包括具有核苷酸序列SEQ.ID.NO.5的分离的多核苷酸。
8.用权利要求7的表达载体转化或转染的宿主细胞。
9.药物组合物，其包含具有序列SEQ.ID.NO.8的分离的多肽和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
10.具有序列SEQ.ID.NO.8的分离的多肽在制备用于治疗增生性疾病的药物中的用途。
11.权利要求10的用途，其特征在于所述增生性疾病为癌症。
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