CN1246457C

CN1246457C - 人tsc403基因和人ing1l基因

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Publication number: CN1246457C
Application number: CNB998026557A
Authority: CN
Inventors: 永田真粧美; 尾崎浩一; 嶋田良和; 崛江正人
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-02-03
Filing date: 1999-02-02
Publication date: 2006-03-22
Anticipated expiration: 2019-02-02
Also published as: CA2319668C; US6403785B1; DE69942723D1; WO1999040190A1; EP1074621A4; CY1110911T1; CA2319668A1; EP1074621B1; EP1074621A1; PT1074621E; CN1289366A; DK1074621T3; US20020151025A1; JP4348504B2; ATE479753T1

Abstract

本发明提供了具有编码SEQ ID NO：1之氨基酸序列的核苷酸序列的TSC403基因，该基因为新基因，它在研究、诊断、治疗肺癌等疾病中有广泛用途。另外，本发明还提供了人ING1L基因，其含有编码SEQ ID NO：4之氨基酸序列的核苷酸序列，该基因为新的人基因，它可用于调节细胞周期，抑制或激活细胞增殖，研究细胞代谢老化或细胞的编程性死亡、病理学探测、诊断和治疗癌症和其它疾病，筛选和研制新药物。

Description

人TSC403基因和人ING1L基因

技术领域

本发明涉及用作预防、诊断和治疗人类疾病之指标的基因，更具体地涉及新的肺-特异性人基因，该基因与人1 amp-1和-2同源[溶酶体膜糖蛋白；Saito，O等，生物化学杂志，267，5700-5711(1992)；Sawada，R等，生物化学杂志，268，12675-12681(1993)；Sawada，R等，生物化学杂志，269，1425-1431(1994)]，并被怀疑是致癌基因。

本发明还涉及类似于大鼠、小鼠、酵母、线虫、已知的人和其它基因的新的人基因，通过cDNA分析、染色体作图及其cDNA的功能性分析，本发明的基因可用于基因诊断和新的治疗药物的开发。

另外，本发明涉及由所述基因编码的新的蛋白质，及其特异性的抗体。

背景技术

生物体的遗传信息由细胞核中4种碱基，即A、C、G和T的排列(DNA)堆积而成，为了维持谱系和个体发育，该遗传信息是保守的。人体中的碱基数目据说约为3×10⁹个，据估计，该群体包括5万-10万个基因。遗传信息通过沿着由基因(DNA)转录为mRNA并确保翻译成蛋白质的流程产生调节蛋白、结构蛋白、酶等而参与维持活体表型。

一般认为由基因至其翻译产物蛋白质的上述流程中的任何异常都会导致在包括细胞增殖和分化的生命维持***中出现错误，从而导致各种疾病。迄今为止所做的基因分析结果表明：多种受体(如胰岛素，LDL和其它受体)的基因，和与细胞生长和分化相关的代谢酶(如蛋白酶，ATP酶，超氧化物歧化酶等)的基因是开发药物的有利工具。

然而，对人基因的分析及其功能和与多种疾病之关系的研究仍处于初级阶段，很多情况是未知的。因此，对新基因的分析，对该基因的功能及其与疾病的关系的分析探索，利用所分析的基因来确立基因诊断的研究，和有关这些基因的药物应用都是本领域很感兴趣的主题。

同时，胰腺癌是消化***的恶性肿瘤之一，预后情况最差，在日本和西方国家胰腺癌在与癌症相关的死亡原因中分别排第四和第五位(Poston，J.G等，Gut.，32，800-812(1991))。癌症研究最重要的目标是在癌症发生的早期鉴定基因中的变化。这种变化的鉴定应能开发出早期诊断所用的遗传工具以及能有效治疗该致死性疾病的新的治疗形式。

对这些基因生理学作用的解释和所得信息对阐明致瘤性疾病的起源和发作机制是至关重要的，这不仅在基础的科学研究领域是需要的，从药学领域中鉴定和治疗恶性肿瘤的观点出发也是需要的。

本发明的公开

因此，假定提供了新的人基因，就可以阐明它在多种细胞中的表达水平及其结构和功能，通过分析基因的表达产物，与该基因相关之疾病(如遗传病和癌症)的病理学的阐明、诊断和治疗也将变得容易。本发明的目的是提供这种新的人基因。

为了达到上述目的，本发明人如下所述作出了深入研究。因此，本发明人首先由提取自多种人组织(如人胎脑，成年血管和胎盘)的mRNA合成cDNA，将其克隆至载体中以构建文库，在琼脂培养基上培养被各个文库转化的大肠杆菌细胞，随机挑选转化子菌落，将其转移至微滴定板中以制备并记录含有多个人基因的大肠杆菌克隆。然后培养各个克隆，提取DNA并纯化之，将所得cDNA用作模板，通过脱氧终止子法进行链终止特异于所述4个碱基的扩增反应，使用DNA自动测序仪测定各个记录克隆中人基因5′-末端的约400个核苷酸的序列。根据如此所得的人基因核苷酸序列资料，探测出新的家族基因，所述基因类似于已知细菌、酵母、线虫、鼠、人和其它动物和植物的基因。上述cDNA分析技术详细描述于Fujiwara等人的报道[Fujiwara，Tsutomu，Saibo Kogaku(细胞工程)，14，645-654(1995)]。

结果，本发明人在从人胎脑cDNA文库中任意挑选的cDNA克隆中发现了携有新基因的克隆，所述基因编码与据认为是癌症-抑制蛋白的p33^ING1[GenBank A.C.No.AF001954，Garkavetsev等，Nature，Genet.，14，415-420(1996)；Garkavetsev等，分子细胞生物学，17，2014-2019(1997)；更新的GenBank A.C.No.AF044076]具有高同源性的氨基酸序列。本发明建立在上述发现的基础之上。

另外，为了提供工业上需要的信息，尤其是与lamp-1基因和lamp-2基因具有同源性的编码新蛋白质的基因，本发明人深入研究了多种人组织的基因，成功地分离和鉴定了符合上述目的的新的肺-特异性基因。本发明建立在上述发现的基础之上。

因此，第一方面，本发明提供了含有编码SEQ ID NO：1之氨基酸序列的核苷酸序列的基因(下文称之为TSC403基因)，尤其是，所述基因为人基因。

另外，本发明提供了由所述TSC403基因编码的新的蛋白质(下文称之为TSC403蛋白)以及对所述蛋白质具有结合亲和性的抗体。

另外，本发明提供了为下列多核苷酸(a)，(b)和(c)中任一个的TSC403基因，尤其是，所述基因为人基因。

(a)含有SEQ ID NO：2之核苷酸序列或其互补链的多核苷酸；

(b)在严紧条件下与具有SEQ ID NO：2之核苷酸序列的DNA杂交的多核苷酸；和

(c)与编码含有SEQ ID NO：1之氨基酸序列的多肽的多核苷酸具有至少95％同源性的多核苷酸。

本发明还提供了具有SEQ ID NO：3之核苷酸序列的TSC403基因。

本发明还提供了具有由SEQ ID NO：2之核苷酸序列中的至少15个连续的核苷酸组成的序列的寡核苷酸，和用作用于检测具有所述寡核苷酸序列的基因的特异性探针或引物的DNA片断。

另外，本发明还提供了含有编码SEQ ID NO：4之氨基酸序列的核苷酸序列的人基因(下文称之为人ING1L基因)。

另外，本发明提供了由所述人ING1L基因编码的蛋白质(下文称之为人ING1L蛋白)以及能结合所述蛋白质的抗体。

另外，本发明提供了含有下列多核苷酸(a)，(b)和(c)中任一个的人ING1L基因。

(a)含有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸；

(b)含有在严紧条件下与具有SEQ ID NO：5之核苷酸序列的DNA杂交的核苷酸序列的多核苷酸；和

(c)与编码含有SEQ ID NO：4之氨基酸序列的多肽的多核苷酸具有至少95％同源性的多核苷酸。

本发明还提供了具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列的人ING1L基因。

另外，本发明还提供了具有由SEQ ID NO：5之核苷酸序列中的至少15个连续的核苷酸组成的序列的寡核苷酸，和用作用于检测具有所述寡核苷酸序列的基因的特异性探针或引物的DNA片断。

本说明书中由缩写表示氨基酸、肽、核苷酸序列、核苷酸等与IUPAC-IUB推荐的规则[有关生物学命名法的IUPAC-IUB通讯，欧洲生物化学杂志，138，9(1984)]，“说明书或涉及核苷酸序列和/或氨基酸序列的说明书的撰写指南”(日本专利局编)和本领域中使用密码和符号的相关惯例一致。

下面将详细描述本发明的TSC403基因。

作为本发明之TSC403基因的一个特例，可提及由下文实施例中所述的被称为“TSC403”的PCR产物的DNA序列推断出的基因。其核苷酸序列示于SEQ ID NO：3。

该基因是编码新的肺特异性蛋白质的人cDNA，所述蛋白质具有SEQ ID NO：1所示的416个氨基酸残基的序列(下文称之为“TSC403”蛋白)，该cDNA的全长为3198个核苷酸。

本发明的TSC403蛋白作为本发明基因的表达产物出现。使用针对GenBank/EMBL数据库的FASTA程序[Person，W.R等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，85，2444-2448(1988)]进行的同源性检索揭示出该基因与人lamp-1基因和lamp-2基因同源(参见上述文献)。

在这一点上，已知所述人的lamp基因在高度转移的结肠癌细胞系中高水平表达，并且与血管内皮细胞上的E-选择蛋白结合。因此，怀疑这些基因与癌症的恶变有关(见上述文献)。

本发明的TSC403基因也是癌症相关基因，有望用作癌症标记物。

另外，本发明基因的染色体基因座是3q27，在多种癌症中检测到该染色体基因座的异常。这一事实(仅有该事实足以)清楚说明本发明的基因与多种致瘤性疾病的关系。

另外还发现本发明的TSC403基因在多种癌症样本中显示出高水平表达，这表明该基因可用作预测肿瘤发生和恶性肿瘤的标记物。

因此、本发明的TSC403基因及其基因产物为阐明、了解、诊断、预防和治疗多种致瘤性疾病，如结肠癌、子宫癌、卵巢癌、肺癌和胰腺癌等提供了非常重要的资料或工具。另外，可使用本发明的基因开发新药，该新药可诱导基因表达以用于治疗所述致瘤性疾病。

另外，检测本发明基因及其产物在个体或给定组织中的表达以及检测所述基因的突变(缺失或点突变)或表达异常将有利于阐明和诊断所述的多种致瘤性疾病。

下面将详细描述本发明的ING1L基因。

作为本发明之ING1L基因的一个特例，可提及由下文实施例中所述的被称为“GEN-146F11”的克隆所包含的DNA序列推断出的基因。该基因的核苷酸序列示于序列表中，因此，由所述克隆包含的基因具有840个核苷酸长的可读框(推定的氨基酸翻译区域；该序列示于SEQ ID NO：5)，该可读框编码序列表中SEQ ID NO：4所示的280个氨基酸残基的序列，该cDNA克隆的全长核苷酸序列由SEQ ID NO：6所示的1078个核苷酸组成。

在上述SEQ ID NO：6的序列中，起始密码子位于第92至94位，终止密码子位于第932至934位。聚腺苷酸化信号样序列(ATTAAA)位于第1058至1063位。

如上所述，本发明的人ING1L基因与p33^ING1L具有高度同源性，可用于在其遗传信息的基础上分析人基因并研究所分析基因的多种功能与多种疾病之间的关系，再将所述基因用于与基因相关之疾病的基因诊断和基因治疗，并研究基因在药学领域的用途。因此，由已知同源基因的功能可推测出由本发明的ING1L基因编码的蛋白质(基因产物)的功能，提供本发明的基因之后，即可通过将候选基因克隆至表达载体中来构建重组蛋白质并研究其酶解活性、结合活性和其它功能。具体地说，由于本发明的基因被怀疑为致癌基因，利用这一功能将有利于药物如抗癌药物的开发。

由本发明的人ING1L基因编码的蛋白质(下文称之为“人ING1L蛋白”)在其C末端区域具有锌指基元样序列，据认为该区域与所述p33^ING1L的同源性尤其高。

在这一点上，据报道在几个得自癌症的细胞系，包括乳腺癌细胞系中，所述p33^ING1L被灭活[文献同上]。另外，最近还证明所述p33^ING1L通过已知为癌症抑制基因产物的p53对细胞增殖进行负调节[Garkavetsev等，自然，391，295-298(1998)]。另外，在多种致瘤性人组织中，人ING1L基因的表达水平被特异性地提高。从这些发现中看，我们怀疑人ING1L蛋白通过与p53的相互作用来正调节细胞增殖。

另外，在Northern印迹分析中，在受试的所有16个得自人成年器官的组织中都观察到本发明人ING1L基因的表达，与正常组织相比，在包括结肠癌、食道癌、***、胃癌的几个致瘤性组织中观察到该基因表达的增强。这些发现表明：通过检查本发明的基因在多种组织中的表达，可将该基因用于诊断致瘤性疾病和与其相关的其它疾病，结果发现，本发明的基因可用于筛选抗有丝***的化合物或抗癌化合物。

本发明的基因具体包括含有分别编码SEQ ID NO：1和4之氨基酸序列的SEQ ID NO：2和5的核苷酸序列的多核苷酸，在严紧条件下与含有SEQ ID NO：2和5的核苷酸序列的DNA杂交的多核苷酸，和与编码SEQ ID NO：1和4之氨基酸序列的多核苷酸具有至少95％的同源性的多核苷酸。

因此，本发明的基因包括编码对应于上述氨基酸序列经过某些修饰后所得的氨基酸序列的基因以及与上述核苷酸序列具有一定程度的同源性的基因。

因此，本发明的基因包括含有编码由SEQ ID NO：1或4的氨基酸序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列(即经修饰的氨基酸序列)的核苷酸序列的基因。具有编码所述经修饰的氨基酸序列的核苷酸序列的基因需满足的条件仅仅是通过利用它，可检测到编码未经修饰的氨基酸序列的本发明基因。

顺便说一句，尽管氨基酸序列的修饰(突变等)可以是自发的，例如突变和翻译后修饰，但也可以进行人工修饰，即，利用天然来源的基因(例如本发明的特定基因)进行修饰。

进行人工修饰的方法包括基因工程技术，如定点诱变[酶学方法，154：350，367-382(1987)；期刊名同前，100：468(1983)；核酸研究，12：9441(1984)；Zoku Seikagaku Jikken Koza 1“Idenshi Kenkyuho II”[实验生物化学丛书1“基因研究方法II”(日本生物化学学会编)，p105(1986)]等，和化学合成技术，如磷酸三酯法和磷酸酰胺酯(phosphoamidate)法[J.Am.Chem.Soc.，89：4801(1967)；期刊名同前，91：3350(1968)；科学，150：178(1968)；Tetrahedron Lett.，22：1859(1981)；期刊名同前，24：245(1983)]以及上述技术的适当组合。

作为本发明基因的一个例子，应提及含有具有SEQ ID NO：2或5之核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸的基因。该核苷酸序列是上述氨基酸序列(SEQ ID NO：1或4)之各个氨基酸残基的密码子组合的例子。当然，本发明的基因并不局限于上述组合，还可使用具有通过选择各个所述氨基酸残基的密码子的任意组合而设计的核苷酸序列的基因。可按常规方法选择所述密码子。在选择时，可考虑宿主所用的密码子频率[核酸研究，9：43(1981)]。

另外，尽管本发明的基因以例如SEQ ID NO：3或6中所示的单链DNA核苷酸序列表示，但本发明的基因包括含有与该核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸和包括这两种核苷酸序列的多核苷酸，另外，本发明的基因并不局限于DNA，如cDNA。

另外，如上所述，本发明的基因并不局限于含有具有SEQ ID NO：2或5之核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸的基因，还包括含有与该核苷酸序列具有一定程度的同源性的核苷酸序列的基因。更具体地说，本发明包括的基因含有与编码具有SEQ ID NO：1或4之氨基酸序列的多肽的多核苷酸具有至少95％同源性的多核苷酸。

另外，具有所定同源性的所述核苷酸序列的基因包括在下文所述的严紧条件下与具有SEQ ID NO：2或5之核苷酸序列的DNA杂交，并且甚至当在给定条件下洗涤所得杂合体时也不会失去所述DNA的基因。

例如，可以提及具有如下序列的基因，即当在65℃，6×SSC中或于37℃，在添加有50％甲醛的4×SSC中，与具有SEQ ID NO：2或5之核苷酸序列的DNA杂交过夜，然后于65℃用2×SSC洗涤30分钟而不会从DNA上脱离的核苷酸序列的基因。在这里，SSC表示标准的盐水-柠檬酸盐缓冲液(标准的柠檬酸盐盐水溶液；1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)。所述基因的优选例子是具有甚至在65℃，7％聚乙二醇(PEG)/10％十二烷基硫酸钠(SDS)中与具有SEQ ID NO：2或5之核苷酸序列的DNA杂交过夜，然后于65℃用0.1×SSC/0.1％ SDS洗涤30分钟而不会从DNA上脱离的核苷酸序列的基因。

根据SEQ ID NO：3或6所示特例的序列资料，通过标准的基因工程技术[分子克隆，第2版，冷泉港实验室出版社(1989)；Zoku SeikagakuJikken Koza“Idenshi Kenkyuho I，II，III”[新的实验生物化学系列“基因研究方法I，II，III”(日本生物化学学会编)(1986)等]，易于产生和获得本发明的基因。

更具体地说，通过使用已知方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，78：6613(1981)；科学，222：778(1983)等]由含有本发明基因的适当来源构建cDNA文库，使用适当探针或特异于本发明基因的抗体从该cDNA文库中选择出所需克隆即可获得目的基因。

在上述方法中，cDNA来源包括表达本发明基因的多种细胞或组织以及由其衍生的培养细胞。尤其是，对本发明的TSC403基因而言，可例举肺组织。按常规方法从某一来源中分离总RNA，分离并纯化出mRNA，合成cDNA并进行克隆。cDNA文库也可以购买。在本发明的实践中，也可使用购自，例如，Clontech Lab.公司的商购cDNA文库。

对从cDNA文库中筛选本发明基因的方法没有特别的限制，但可选择性地使用常规方法。具体例如，通过使用针对由cDNA产生的蛋白质的特异性抗体的免疫筛选技术，使用对目的DNA序列具有选择性结合亲和性的探针的噬斑杂交或菌落杂交技术或其组合来选择cDNA克隆。

至于上述方法中使用的探针，一般可使用根据本发明基因的核苷酸序列资料化学合成的DNA。当然，也可以使用已得到的基因或其片断作为所述探针。

可用作所述探针的核苷酸序列包括对应于SEQ ID NO：2或5的部分核苷酸序列，但该序列由至少15个连续的核苷酸组成，优选为20至30个核苷酸。另外，含有上述各个序列的阳性克隆也可用作所述的探针。

可通过使用一套有义和反义引物作为筛选探针的方法进行所述筛选，所述引物基于自给定细胞系或组织分离和纯化出的天然提取物的部分氨基酸序列资料。

另外，通过使用TSC403蛋白或人ING1L蛋白替代所述特异性抗体的蛋白质相互作用克隆方法也可进行所述筛选。

在本发明中，通过使用差异显示法直接进行比较可研究不同条件下或多种细胞群体之间细胞中的mRNA表达[Liang，P等，科学，257，967-971(1992)]。

使用PCR扩增DNA/RNA也有利于得到本发明的基因[科学，230，1350(1985)]。尤其是在从文库中难以得到全长cDNA时，使用RACE[快速扩增cDNA末端]法[Jikken Igaku(实验医学)，12(6)：35(1994)]，尤其是5′-RACE法[Frohman，M.A等，Proc.Natl. Acad.Sci.，USA.，8：8998(1988)]是有利的。根据本发明基因的序列资料可明智地确立上述PCR法中所用的引物，而且通过常规方法可合成所述引物。

通过上文提及的常规技术，如凝胶电泳可将被扩增DNA/RNA片断进行分离和纯化。

可以常规方法，如双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，74：5463(1977)]，Maxam-Gilbert法[酶学方法，65：499(1980)]或更方便地，利用商购的测序试剂盒，测定本发明基因或其任何DNA片断的核苷酸序列。

使用本发明的基因通过标准的基因工程技术可容易地在高的生产规模上以良好的再现性生产该基因的产物。

本发明还提供了携有所述TSC403基因或人ING1L基因的载体(表达载体)，用所述载体转化的宿主细胞，和生产TSC403蛋白或人ING1L蛋白的方法，所述方法包括培养所述宿主细胞。

通过标准的重组DNA技术[科学，224：1431(1984)；生物物理研究通讯，130∶692(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，80：5990(1983)以及上述参考文献]可进行所述TSC403蛋白或人ING1L蛋白的生产。

至于所述宿主细胞，使用原核细胞和真核细胞都可以。至于原核宿主，常规使用的多种原核细胞，如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌都可以使用。优选的宿主细胞是衍生自大肠杆菌的细胞，尤其是大肠杆菌K12细胞。

真核宿主细胞包括脊椎动物和酵母细胞等。对于前一种细胞，例如有猴细胞系COS[细胞，23：175(1981)]，中国仓鼠卵巢细胞及其二氢叶酸还原酶-缺损的细胞系[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，77：4216(1980)]。对于后一种细胞，例如可提及糖酵母属的酵母细胞，但上述细胞不是排它性的选择。

当原核细胞被用作宿主细胞时，选择在宿主细胞中能被复制的载体，为了表达基因，可有利地使用表达质粒，该质粒含有位于本发明基因上游的启动子和SD(Shine-Dalgarno)序列以及起始蛋白质合成所必需的起始密码子(如ATG)。关于上述载体，通常使用衍生自大肠杆菌的质粒，如pBR322，pBR325，pUC12，pUC13等，但这些不是唯一的选择，也可使用多种已知的其它载体。例如可提及的有大肠杆菌表达***所用的商购载体pGEX-4T(Amersham Pharmacia Biotech)，pMAL-c2，pMAL-p2(New England Biolabs)，pET21，pET21/lacq(Invitrogen)，pBAD/His(Invitrogen)等。

至于脊椎动物细胞所用的表达载体，其通常具有位于需表达之基因上游的启动子区域，RNA剪接位点，聚腺苷酸化位点，转录终端序列等，必要时，所述载体还含有复制起点。上述载体的具体例子是含有SV40早期启动子的pSV2dhfr[分子细胞生物学，1：854(1981)]。

除此之外，还可使用多种其它已知的商购载体。利用动物细胞的表达***所用的商购载体例如可是用于动物细胞的多种载体，如pEGFP-N，pEGFP-C(Clontech)，pIND(Invitrogen)，pcDNA3.1/His(Invitrogen)等，和可用于昆虫细胞的载体，如pFastBacHT(GibcoBRL)，pAcGHLT(PharMingen)，pAc5/V5-His，pMT/V5-His和pMT/Bip/V5-His(都购自Invitrogen)。

当酵母细胞用作宿主细胞时，可使用的表达载体的特例为具有酸性磷酸酶基因启动子的pAM82[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，80：1(1983)]。酵母细胞所用的商购表达载体包括pPICZ(Invitrogen)和pPICZα(Invitrogen)。

对启动子没有什么特别的限制。当将肠埃希氏菌属的细菌菌株用作宿主时，可使用色氨酸(trp)启动子，1pp启动子，1ac启动子，recA启动子，PL/PR启动子等。当宿主是芽孢杆菌属微生物时，优选使用SP01启动子，SP02启动子，penP启动子等。当将酵母用作宿主时，优选使用的启动子包括pH05启动子，PGK启动子，GAP启动子和ADH启动子等。当将动物细胞用作所述宿主细胞时，优选的启动子包括衍生自SV40的启动子，逆转录病毒启动子，金属硫蛋白启动子，热激启动子，巨细胞病毒启动子和SR启动子等。

至于本发明基因的表达载体，也可有利地使用常规的融合蛋白表达载体。这种类型的载体的例子为表达具有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白的pGEX(Promega)。

对将所述目的重组DNA(表达载体)导入宿主细胞的方法(转化方法)没有特别的限制，但可以使用多种标准化的方法。可按常规方法培养所得的转化子。通过培养，由本发明基因编码的目的蛋白可在转化细胞中表达、产生和积累，或分泌到细胞外或细胞膜上。

根据所用的宿主细胞类型，可从常规培养基中明智地选择出培养所用的培养基，也可在适于宿主细胞增殖的条件下进行培养。

可任选通过利用其物理、化学和其它特性的多种分离方法分离和纯化所产生的重组蛋白质[Seikagaku(生物化学)资料第II册，p1175-1259，第1版，第1次印刷，1980年6月23日，Tokyo Kagaku Dojin；生物化学，25(25)：8274(1986)；欧洲生物化学杂志，163：313(1987)等]。上述方法具体包括标准的重建处理，用蛋白质沉淀剂处理(盐析)，离心，渗透休克法，超声破碎，超滤，各种类型的层析，如分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相层析(HPLC)等，透析及其组合。特别优选的方法是亲和层析，该层析所用的柱上结合有针对本发明的TSC403蛋白或人ING1L蛋白的特异性抗体。

本发明还提供了可按上述方法和生产这些蛋白质的技术得到的新的TSC403蛋白或人ING1L蛋白。如上所述，本发明的蛋白质可用于药物领域。

另外，本发明的蛋白质可用作构建抗所述蛋白质的特异性抗体的免疫原。此时用作抗原的成分可以是通过任一种所述基因工程技术大量生产的蛋白质或其片断，通过使用该抗原可得到所需的抗血清(多克隆抗体)和单克隆抗体。

抗体的生产技术是本领域技术人员众所周知的，也可根据已确立的技术[Zoku Seikagaku Koza “Men-eki Seikagaku Kenkyuho”(新的免疫生化丛书，“免疫生物化学方法”)，日本生物化学学会编(1986)等]生产与本发明相关的抗体。

例如，可从普通动物，如兔、豚鼠、大鼠、小鼠、鸡、山羊和绵羊中任意选择免疫动物以用于收集抗血清，可按常规方法用所述抗原进行免疫并采集血液。

也可按常规方法制备所述单克隆抗体，即构建被所述免疫原免疫之动物的浆细胞与浆细胞瘤细胞的融合细胞，选择产生目的抗体的克隆并培养该克隆。选择免疫动物一般会考虑它与细胞融合所用的浆细胞瘤细胞的相容性，通常优选使用小鼠或大鼠。可按与制备所述抗血清相同的方法进行免疫，任选联合使用普通的佐剂与抗原。

对用于所述融合的浆细胞瘤细胞没有特别的限制，它可以是下列多种大鼠骨髓瘤细胞及其衍生细胞中的任一种：如p3(p3/x63-Ag8)[自然，256：495-497(1975)]，p3-U1[微生物学和免疫学最新专题，81：1-7(1978)]，NS-1[欧洲免疫学杂志，6：511-519(1976)]，MPC-11[细胞，8：405-415(1976)]，SP2/0[自然，276：269-271(1978)]等，R210[自然，277：131-133(1979)]等。

可根据已知方法，在常规融合促进剂，如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等的存在下实现所述免疫细胞和浆细胞瘤细胞之间的融合。可通过已知方法分离所需的杂交瘤[酶学方法，73：3(1981)；Zoku实验生物化学丛书；等]。

产生目的抗体之细胞系的筛选和单克隆抗体的制备也可按常规方法进行。例如，通过一般用于检测抗体的多种技术可找出产生抗体的细胞系，所述技术例如有使用本发明的蛋白质作为抗原的ELISA[酶学方法，70：419-439(1980)]，噬斑法，点法，凝集反应法，Ouchterlony法，放射性免疫测定法等。

从如上所得杂交瘤中分离本发明抗体的方法包括：按常规方法培养杂交瘤，以培养物上清液的形式回收抗体的方法，或给相容的哺乳动物施用杂交瘤，使其在体内增殖并以腹水的形式回收抗体的方法。前一种方法适于制备高度纯化的抗体，而后一种方法适于大量生产抗体。通过常规方法，如盐析、凝胶过滤、亲和层析等可纯化按上述方法生产的抗体。

所得抗体的特征在于能与本发明的蛋白质结合。使用这一特征可将本发明的蛋白质纯化，并通过免疫学技术检测并鉴定蛋白质。本发明还提供了这种新抗体。

根据本发明生产的本发明基因的序列资料，通过使用所述基因的部分或全部核苷酸序列可检测本发明的基因在个体或多种组织中的表达。

在本发明中，为了检测其表达水平在癌组织中有所升高的TSC403基因或人ING1L基因的存在，可制备生物样品，如血液或血清样品，任选地提取DNA并进行分析以观察所述样品是否含有可疑的TSC403基因或人ING1L基因。

根据本发明，为了检测细胞或组织中、恶性肿瘤至前驱症状紊乱的发展过程中或预后恶性肿瘤标记物的存在，制备恶性肿瘤的生物样品，分析TSC403或人ING1L致癌基因的存在。利用该技术，可检测细胞或组织中、恶性肿瘤至前驱症状紊乱的发展过程中或预后是否存在这种恶性肿瘤标记物。因此，本发明能诊断癌症，评价癌症疗法的效果或预测癌症的预后情况。

可按下述进行检测：例如，根据使用肿瘤患者之样品得到的TSC403基因或人ING1L基因的资料，首先制备被设计用来筛选TSC403基因或人ING1L基因和/或扩增该基因的DNA片断。上述DNA片断包括：

(1)具有噬斑杂交、菌落杂交、Southern印迹、Northern印迹等所用探针之特性的片断。

(2)具有通过PCR(用聚合酶扩增核苷酸序列的聚合酶链反应)扩增制备TSC403基因或人ING1L基因之全部或部分DNA片断所用探针之特性的片断。

为了构建所述DNA片断，首先制备与TSC403基因或人ING1L基因具有相同序列的引物。使用该引物作为筛选探针，让它与生物样品(核酸样品)反应以证实具有TSC403基因序列或人ING1L基因序列之基因的存在。

通过易于检测靶序列的多种方法，如变性、限制性消化、电泳或点印迹可制备上述核酸样品。

从敏感性的角度出发，所述筛选方法优选为PCR。该方法并不特别地局限于使用TSC403基因片断或人ING1L基因片断作为引物，它可以是任何已知方法[科学，230：1350-1354(1985)]和新近开发的或有望在将来使用的所有PCR形式[Sakaki，Y等(编)，Jikken Egaku(实验医学)，增刊8(9)(1990)，Yodosha；蛋白质·核酸·酶；增刊，Kyoritsu出版公司，35(17)(1990)]。

用作引物的DNA片断是化学合成的寡聚-DNA。使用DNA自动合成仪，如Phamacia LKB Gene Assembler Plus(Pharnacia)可合成寡聚-DNA。引物(有义引物或反义引物)的长度可以是例如等于约10-50个核苷酸，更优选约15-30个核苷酸。

用于上述筛选的探针通常是经标记的探针，但也可以是未经标记的探针。筛选有可能取决于与直接或间接标记的配体的特异性结合。标记探针或配体的方法是本领域已知的，相关的现有技术包括切口平移，随机引发和激酶处理等。可用作标记物的物质包括经由已知方法可以采用的放射性同位素、生物素、荧光基团、化学发光基团、酶和抗体。

上述检测可按常规方法进行，例如，总可以成功地使用通过RT-PCR[逆转录-聚合酶链反应；E.S.Kawasaki等，RNA的扩增，PCR方法，方法和应用指南，Academic出版社，SanDiego，21-27(1991)]进行的RNA扩增，Northern印迹分析[分子克隆，冷泉港实验室(1989)]，在细胞水平上进行检测，如原位RT-PCR[核酸研究，21：3159-3166(1993)]和原位杂交，NASBA法[基于核酸序列的扩增，自然，350：91-92(1991)]，这些本领域已知技术的改良方法和各种其它方法。

利用检测试剂盒检测样品中的TSC403基因或人ING1L基因可方便地实施本发明的检测方法。本发明还提供了检测TSC403基因或人ING1L基因的检测试剂盒，其含有所述TSC403基因片断或人ING1L基因片断。

重要的是该检测试剂盒至少含有与SEQ ID NO：2或5之部分或全部核苷酸序列或其互补核苷酸序列杂交的DNA片断作为必需成分。至于其它成分，该试剂盒可含有标记试剂和进行PCR必需的试剂，如Taq DNA聚合酶，脱氧核苷酸三磷酸和引物等。

上述标记试剂包括放射性同位素和化学修饰剂，如荧光物质。与DNA片断预缀合时可使用这些标记物。

为了便于检测，本发明的检测试剂盒可含有适当的反应稀释剂、标准的抗体、缓冲液、洗涤缓冲液、反应终止溶液等。

本发明还提供了利用上述检测方法诊断癌症的方法、该诊断方法所用的诊断试剂和诊断试剂盒。

通过常规方法，直接或间接测定经使用本发明的上述检测方法所得受试样品中TSC403基因或人ING1L基因的序列，可以发现新的TSC403或人ING1L-相关基因(突变基因)，所述基因与野生型TSC403基因或野生型人ING1L基因高度同源。因此，本发明还提供了筛选受试样品中TSC403相关基因或人ING1L相关基因的方法，所述方法包括进行所述检测和测定样品中TSC403基因或人ING1L基因的序列。

另外，通过利用由SEQ ID NO：1或4之TSC403基因或人ING1L基因编码的蛋白质、具有由SEQ ID NO：1或4所述序列缺失、取代或添加一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列的蛋白质、或针对该片断的抗体(多克隆抗体或单克隆抗体；下文称之为“TSC403抗体”或“人ING1L抗体”)，可成功地检测所述野生型TSC403基因、野生型人ING1L基因、突变的TSC403基因和突变的人ING1L基因。

本发明还提供了检测野生型TSC403基因、野生型人ING1L基因、突变的TSC403基因和突变的人ING1L基因的方法。

根据该检测方法学，可由野生型TSC403基因或野生型人ING1L基因中的变化检测致瘤状态紊乱的严重性或肿瘤的恶变。通过用上述任何常规的测序技术测定TSC403基因或人ING1L基因的序列，更优选通过使用所述TSC403抗体或人ING1L抗体的检测方法测定或检测上述变化。通过此方法可检测受试样品中TSC403蛋白或人ING1L蛋白异常(突变)的存在或TSC403蛋白或人ING1L蛋白的存在与否。

在利用抗TSC403抗体或抗人ING1L抗体的本发明检测方法中，可使用所述抗体来免疫沉淀含有受试人之生物材料(如血液或血清)的溶液中的TSC403蛋白或人ING1L蛋白，或在聚丙烯酰胺凝胶Western印迹或免疫印迹上使抗体与TSC403蛋白或人ING1L蛋白发生反应。

另外，通过在免疫组化检测方法中使用抗TSC403抗体或抗人ING1L抗体，可检测石蜡切片或冷冻组织样品中的TSC403蛋白或人ING1L蛋白。所述抗TSC403抗体或抗人ING1L抗体的生产技术和纯化方法是本领域众所周知的。可利用这些已知技术生产和纯化所述抗体。

与检测野生型TSC403或人ING1L或其突变体相关的优选方法包括使用单克隆抗体和/或多克隆抗体的夹心检测法。其它优选的检测技术是酶联免疫吸附法(ELISA)、放射性免疫测定法(RIA)、免疫放射分析(IRMA)和免疫酶学分析(IEMA)。

本发明还提供了TSC403蛋白受体或人ING1L蛋白受体，所述受体存在于细胞膜组分中或细胞表面并具有与TSC403蛋白或人ING1L蛋白结合的活性。通过例如在含有受体的细胞膜组分或含有受体的生物样品中加入经标记的TSC403蛋白或人ING1L蛋白，再经提取，分离和纯化所得的受体-蛋白质结合物(TSC403蛋白质-结合反应产物或人ING1L蛋白质-结合反应产物)并鉴定所分离产物的氨基酸序列，即可生产和得到该TSC403蛋白受体或人ING1L蛋白受体。根据已知方法，本领域技术人员易于制备并对TSC403蛋白或人ING1L蛋白受体测序。

可使用本发明的TSC403蛋白受体或人ING1L蛋白受体或其片断来筛选多种药物。通过这种技术，可筛选出能与所述受体反应的化合物(低分子化合物，高分子化合物，蛋白质，蛋白质片断，抗原，抗体等)。用于进行这类筛选的受体或其片断可以以固定在适当固体基质上的固定化形式被使用或以溶液中的游离物质的形式被转运至细胞表面。

上述药物筛选的例子是在竞争结合试验中优选使用被表达TSC403蛋白或人ING1L蛋白或其片断的重组载体稳定转化的原核或真核宿主细胞的筛选。或者，在标准的结合试验中使用游离形式的或固定化的所述宿主细胞。更具体地说，上述药物筛选法包括：在候选药物的存在下，将TSC403蛋白受体或人ING1L蛋白受体或其片断与TSC403蛋白或人ING1L蛋白或其片断反应以形成复合物，并检测上述候选药物对复合物形成的抑制程度。

因此，本发明提供了药物筛选的方法，所述方法包括：将候选药物与TSC403蛋白受体或人ING1L蛋白受体或其片断接触，通过已知技术检测所得复合物的存在或TSC403蛋白受体或人ING1L蛋白受体或其片断与配体形成的复合物的存在。

另外，通过检测TSC403蛋白受体的活性或人ING1L蛋白受体的活性，可以评价候选药物是否能拮抗TSC403蛋白受体或人ING1L蛋白受体，从而能抑制TSC403蛋白活性或人ING1L蛋白活性，如促进有丝***的活性。

在这种竞争性结合试验中，TSC403蛋白受体或人ING1L蛋白受体或其片断是被标记了的。当游离的TSC403蛋白受体或人ING1L蛋白受体或其片断与相应的复合物分开时，测定游离(未形成复合物)物质的标记量，测定值被当成衡量候选药物与TSC403蛋白受体或人ING1L蛋白受体结合的尺码。另外，测定值还可用于衡量对TSC403蛋白受体或人ING1L蛋白受体与TSC403蛋白或人ING1L蛋白结合的抑制作用。通过按这种方式分析TSC403蛋白或人ING1L蛋白的小肽(假肽)，可将候选药物作为具有TSC403蛋白受体拮抗活性或人ING1L蛋白受体拮抗活性的物质进行测定。

本发明的另一种药物筛选方法是筛选与TSC403蛋白受体或人ING1L蛋白受体具有足够结合亲和性的化合物。简单地说，该方法包括在固体支持物(如塑料别针或其它材料的表面)上合成大量不同的受试肽化合物，将所得受试化合物与TSC403蛋白受体或人ING1L蛋白受体反应，洗涤后，再通过已知方法对结合反应产物进行检测[如PCT专利公开号WO 84-03564]。

可将纯化的TSC403蛋白受体或人ING1L蛋白受体直接涂敷于板上以用于所述的药物筛选法。另外，抗体可被针对多肽的非中和性的抗体捕获，并可将TSC403蛋白受体或人ING1L蛋白受体固定于固相上。

本发明还涉及使用竞争性药物筛选试验。为了结合TSC403蛋白受体或人ING1L蛋白受体或其片断，使能特异性结合TSC403蛋白受体或人ING1L蛋白受体的中和性抗体与候选化合物竞争。通过与中和性抗体的竞争反应，可检测到任何具有TSC403蛋白受体或人ING1L蛋白受体的一个或多个抗原决定簇的肽的存在。

另外，另一种药物筛选的方法包括使用含有非功能性TSC403基因或非功能性人ING1L基因的真核宿主细胞系或细胞。在候选药物的存在下使宿主细胞系或细胞增殖预定的一段时间，测定宿主细胞的生长速度以观察例如候选药物是否能抑制细胞生长。测定生长速度的方法包括检测TSC403蛋白受体或人ING1L蛋白受体之生物活性的方法。

另外，根据本发明，为了研制更具活性或更稳定的TSC403蛋白或人ING1L蛋白衍生物或能在体内增强或干扰TSC403蛋白或人ING1L蛋白之功能的药物，可以构建生物活性蛋白质或所述蛋白可与之相互作用的其结构类似物，例如TSC403蛋白受体或人ING1L蛋白受体激动剂，TSC403蛋白受体或人ING1L蛋白受体拮抗剂或TSC403蛋白或人ING1L蛋白抑制剂。通过用X-射线晶体学或计算机模型设计或联合使用此类技术来分析TSC403蛋白或人ING1L蛋白与第三组蛋白质之间所形成复合物的三维结构，即可鉴定上述结构类似物。通过根据同源蛋白质之结构的蛋白质模型设计也可得到这种结构类似物的结构资料。

至于提供更具活性或更稳定的TSC403蛋白衍生物或人ING1L蛋白衍生物的方法，可提及丙氨酸扫描技术。该技术包括用丙氨酸残基取代所述蛋白质的某些氨基酸残基并测定所述取代对所得蛋白质之活性的影响。换句话说，该技术通过取代蛋白质的氨基酸残基并进行分析，从而测定对蛋白质活性或稳定性有重要作用的功能域。该技术可设计出更具活性或更稳定的TSC403蛋白衍生物或人ING1L蛋白衍生物。

另外，目前已可以分离出通过功能性试验选出的靶特异性抗体并能分析其晶体结构。一般说来，通过此方法可得到药物核心，从而为今后的药物设计工作提供基础。通过产生功能性药物活性抗体的抗独特型抗体，可从化学或生物法构建的肽库中鉴定或分离肽，因此，所选定的肽也有望用作药物核心。

因此，可以设计并研制具有TSC403蛋白或人ING1L蛋白的抑制剂、激动剂或拮抗剂活性的药物，所述TSC403蛋白或人ING1L蛋白具有改进的活性、稳定性和其它特性。

通过使用克隆的TSC403基因或克隆的人ING1L基因，也可以制备足够量的TSC403蛋白或人ING1L蛋白并进行X-射线晶体学和其它分析研究。另外，由于提供了根据本发明的SEQ ID NO：1或4的TSC403蛋白或人ING1L蛋白，可以提供计算机模型设计程序或技术以替代X-射线晶体学或做为附助技术与其联合使用。

本发明能构建携有TSC403基因的剔除试验小鼠(突变体小鼠)或携有人ING1L基因的剔除试验小鼠(突变体小鼠)。通过这一方法，可以确定TSC403基因或人ING1L基因之核苷酸序列的哪个区域会影响TSC403蛋白或人ING1L蛋白的体内趋异活性，也就是说，能够确定TSC403基因产物、人ING1L基因产物、经修饰的TSC403基因产物或经修饰的人ING1L基因产物在体内具有什么功能。

这是通过利用基因的同源重组有意地修饰生物体的遗传信息的技术，而且使用小鼠胚干细胞(ES细胞)的方法是已知的[Capeccchi.M.R.，科学，244，1288-1292(1989)]。

上述突变体小鼠的构建属于本领域技术人员的专长，可对本发明的野生型TSC403基因、野生型人ING1L基因、突变的TSC403基因或突变的人ING1L基因进行这种修饰[Tetsuo Noda(编)：Jikken Igaku(实验医学)，增刊，14(20)(1996)，Yodosha]，从而方便地构建各个突变体小鼠。通过利用此项技术，可以设计和研制出对蛋白质具有TSC403蛋白或人ING1L蛋白的抑制剂、激动剂或拮抗剂活性的药物，所述蛋白质具有改良的TSC403蛋白或人ING1L蛋白活性和稳定性。

因此，本发明还提供了检测本发明的TSC403基因或人ING1L基因所用的特异性引物，和/或用作特异性引物的DNA片断，利用所述引物诊断癌症的方法和诊断试剂盒。

例如，通过使用两种特异于本发明的TSC403基因的引物(有义引物和反义引物)进行标准的PCR技术即可产生和获得本发明的TSC403基因探针。用如此构建的探针可检测到本发明的基因在多种致瘤性组织和其它组织中的表达。

附图简述

图1是根据实施例1-(2)，经Northern印迹分析观察到的本发明的TSC403基因在人组织中的分布图。

图2是显示根据实施例1-(4)，多种正常组织和癌组织的RT-PCR分析结果的图。

图3是显示根据实施例1-(5)，经Northern印迹分析观察到的TSC403基因在人组织中表达的图。

图4是显示根据实施例1-(5)，经Northern印迹分析观察到的TSC403基因在人组织中表达的图。

图5是显示根据实施例1-(5)，经Northern印迹分析观察到的TSC403基因在人组织中表达的图。

图6显示的是根据实施例1-(6)的病灶形成试验中的对照细胞。

图7显示的是在根据实施例1-(6)的病灶形成试验中，被本发明的TSC403基因转化的转化细胞。

图8显示出由本发明的人ING1L基因编码的蛋白质的推测氨基酸序列与p33^ING1[GenBank A.C.No.AF044076]所编码序列之间的同源性研究结果。

图9显示了根据实施例2-(2)对得自成年人16个器官的细胞的Northern印迹分析结果。

图10显示了根据实施例2-(2)对结肠癌患者组织的Northern印迹分析结果。

实施本发明的最佳模式

用下列实施例将更详细地阐明本发明。

实施例1

TSC403基因

(1-1)通过[γ-³³P]ATP标记显像的方法

为了证实由组织特异性技术表达的人基因，使用了[γ-³³P]ATP标记的显像法。该方法基本上按Liang[Liang P.，等，科学，257，967-971(1992)]的方法进行。

因此，在8微升经焦碳酸二乙酯处理的水中将分离自13种人组织(成年脑，胎脑，肺，肝脏，胃，胰腺，脾脏，乳腺，***，胎盘，睾丸，肾脏和心脏；Clontech)的poly A RNA(0.2微克)与25pmol 3′-锚着的寡-dT引物G(T)15MA(M表示G，A和C的混合物)混合，于65℃将混合物加热5分钟。向此溶液中加入4微升5×第一链缓冲液(BRL)，2微升0.1M DTT(BRL)，1微升250mM dNTP(BRL)，1微升RNA酶抑制剂(40单位；Toyobo)和1微升Superscript II逆转录酶(200单位；BRL)。各反应混合物的终体积为20微升。将各溶液于37℃保温1小时，加入30微升蒸馏水稀释2.5倍，将稀释液储存于-20℃待用。

在[γ-³³P]ATP标记的(Pharmacia)3′-锚着引物的存在下经PCR扩增cDNA，如下进行该cDNA的PCR扩增。

20微升PCR混合物含有2微升RT反应混合物，2微升10×PCR缓冲液(Takara)，4微升2.5mM dNTP，0.25微升ExTaq DNA聚合酶(5U/ml；Takara)，25pmol被[α-³³P]ATP标记的3′-锚着的寡-dT引物和25pmol 5′-引物(No.20，10-聚体脱氧寡核苷酸引物，其具有SEQ ID NO：7所示序列的随机化序列)。在下列条件下进行PCR：95℃3分钟，40℃5分钟和72℃5分钟，1个循环；95℃0.5分钟，40℃2分钟和72℃1分钟，40个循环；72℃退火5分钟。

用乙醇提取PCR样品，将样品重新悬浮于甲酰胺-测序染料中，在6％丙烯酰胺-7.5M尿素测序凝胶中反应。无需固定，干燥凝胶，并进行放射自显影过夜。

(1-2)经扩增的cDNA片断的亚克隆

用放射性的墨汁标记其上预先放置有上述干燥凝胶的3MM滤纸，放射自显影图可记录标记情况。将含有目的cDNA带的凝胶连同3MM滤纸一起切下，在300微升dH₂O中搅拌1小时。除去聚丙烯酰胺凝胶和滤纸之后，在1微升10mg/ml糖原和作为载体的0.3M NaOAc的存在下通过乙醇沉淀回收cDNA，并重新溶解于10微升dH₂O中。使用5微升该溶液重新进行扩增。PCR条件及所用引物与第一轮PCR中的相同。按与第一轮PCR产物相同的方法回收适当大小的再扩增产物，将此PCR产物克隆至pUC118载体(Takara)的HincII位点，使用ABI377自动测序仪(Applied BioSystems)测定核酸序列。

通过比较用分离自13种人组织的mRNA所得的各种显像模式，可鉴定出一个在肺中特异性表达的PCR产物。该产物被称为TSC403DD。

该产物由252个核苷酸组成。使用FASTA程序[Person，W.R等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，2444-2448(1988)]将该核苷酸数据与GenBank/EMBL数据库中的DNA序列进行比较，结果表明该PCR产物与任何已知的DNA序列都没有同源性。

(1-3)cDNA筛选

使用寡(dT)+由随机六聚体引发的人正常肺cDNA和Uni-ZAP^TMXR(Stratagene)构建人正常肺cDNA文库。通过上述方法总共分离出1×10⁶个克隆，使用[α-³²P]-dCTP-标记的cDNA片断进行筛选。选择阳性克隆，在pBluescript II SK(-)中，cDNA的克隆位点被体内切除。

结果，针对上述TSC403DD鉴定出约100个噬斑。根据这一结果，总RNA群体的转录量被计算为约0.01％。

与TSC403DD同源的该被装配的cDNA序列(TSC403)含有3198个核苷酸，其中包括1248个核苷酸的可读框，其编码416个氨基酸残基的蛋白质，该蛋白质的计算分子量为44316道尔顿。

由一级序列可看出该基因产物(TSC403蛋白)为含有跨膜区的蛋白质。

发现其染色体基因座为3q27，在多种癌症中可发现该基因座的染色体异常。

另外，本发明的TSC403基因与人lamp-1和lamp-2具有约30％的同源性。

(2)在组织中的表达

为了描述TSC403在组织中的表达模式图，使用多种人组织进行Northern印迹分析。

在Northern印迹分析中，使用了人MTN(多-组织Northern)印迹I和II(Clontech)。使用一套T3和T7启动子序列的引物来制备cDNA片断，并通过PCR用[α-³²P]-dCTP进行标记。对含有扩增产物的膜进行预杂交(在产品上说明的条件下)并根据产品说明进行杂交。

杂交后，洗涤膜，在-80℃将其放射自显影达24小时。结果示于图1。

所用的和图中示出的人组织是心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰腺、脾脏、胸腺、***、睾丸、卵巢、小肠、结肠和外周血白细胞(P.B.L.)。

从图中可以看出，在肺中特异性地检测到了与TSC403同源的转录物。

(3)FISH

通过已知方法[Takahashi E等，人类遗传学，86，14-16(1990)]，使用0.5微克各种粘粒DNA作为探针进行用于染色体作图的FISH。通过Provia 100胶片(Fuji；ISO 100)或CCD照相***(Applied Imaging，Cyto Vision)获得FISH。

结果，用处于典型的R-带(前)中期相的细胞获得的100个信号被定位于3q27带。因此，将TSC403的染色体基因座鉴定为3q27。

(4)通过RT-PCR分析在癌症细胞系和癌症组织中的表达

为了研究TSC403基因的表达在人癌症细胞系和癌症组织中是否会突变，对4个细胞系[Aspcl(转移性腺瘤，国立癌症研究杂志，67，563-569(1981))，Bxpc3(腺瘤，未分化的；癌症研究.，4，15-23(1986))，MiaPaca2(腺瘤，国际癌症杂志，19，128-135(1977))和PANC1(上皮样的，胰管瘤，国际癌症杂志，15，741-747(1975))]和9个癌症组织(由东京大学医学科学研究所的Nakamura博士惠赠)进行RT-PCR分析。

因此，用10个单位不含RNA酶的DNA酶I(Boehringer Mannheim)将10微升通过使用ISOGEN(Wako Chemical Ind.)从各个细胞系或癌症组织中分离出的总RNA处理15分钟，用苯酚-氯仿提取2次，并用乙醇沉淀。使用寡-(dT)和随机引物，通过Superscript I^TM RNA酶H-逆转录酶(Life Technology)合成单链cDNA。对每一产物各取2微升用于PCR扩增。

将具有SEQ ID NO：8和SEQ ID No：9所示核苷酸序列的引物P1和P2用于25轮循环的PCR扩增。

在20微升溶液中进行PCR，所述溶液含有25ng DNA，各为10μM的引物，2.5mM dNTP和0.25U Extaq DNA聚合酶(Takara)。将PCR产物溶解于经溴化乙锭染色的1.5％琼脂糖凝胶中。

通过上述方法对4种细胞系(泳道1＝AsPc-1，泳道2＝B×Pc-3，泳道3＝MIApaca，泳道4＝PANC-1)，正常的胰腺组织(正常胰腺，泳道1和2)，胰腺癌组织(胰腺癌，泳道1-11)和正常的肺组织(正常肺)进行RT-PCR分析所得的结果示于图2。

从图2可以清楚地看出：在正常胰腺组织(正常胰腺，泳道1和2)中未发现TSC403的表达，而只在胰腺癌组织(胰腺癌，泳道1-11)和细胞系(泳道1-4)中观察到表达。

顺便说一句，上述4种细胞系已保藏于ATCC，其保藏号如下：

Aspc-1；CRL-1682

BxPc-3；CRL-1687

MIApaca；CRL-1420

PANC-1；CRL-1469

(5)TSC403基因在多种癌症中的表达(Northern印迹分析)

通过将TSC403基因与携有下列各种癌组织和正常组织mRNA样品(肿瘤Northern印迹分析)的印迹(Invitrogen)杂交，以研究TSC403基因的表达。所有癌症组织和正常组织都购自Invitrogen。

结果示于图3、图4和图5。各图中示出的癌症组织和正常组织如下。

图3：脑瘤、正常脑、肾脏肿瘤、正常肾脏、肝癌、正常肝脏、肺癌、正常肺、乳腺癌、正常乳腺、子宫癌、正常子宫、输卵管肿瘤、正常输卵管、卵巢癌、正常卵巢。

图4：食道癌、正常食道、胃癌、正常胃、结肠癌、正常结肠、直肠癌、正常直肠、甲状腺癌、正常甲状腺、肾上腺癌、正常肾上腺、腮腺癌、正常腮腺、淋巴瘤、正常***。

图5：肾脏肿瘤、正常肾脏、输尿管肿瘤、正常输尿管，膀胱癌、正常膀胱、胃癌、正常胃、卵巢癌(4例)、正常卵巢(4例)。

由上图可以看出TSC403在正常肺中显著表达。另外，在乳腺癌(图3)，输卵管肿瘤(图3)，食道癌(图4)，结肠癌(图4)，直肠癌(图4)，甲状腺癌(图4)，腮腺癌(图4)，输尿管肿瘤(图5)，卵巢癌(图5，4例中的2例)中观察到TSC403基因的表达。

(6)通过表达TSC403基因的病灶形成试验

将TSC403基因的全长可读框连接至pCDNA3.1/His(Invitrogen)载体的BamHI-XhoI位点，得到TSC403基因的表达载体。

然后，使用上述表达载体，根据文献中所述的方法[Shin，C.，Shilo，B.，Goldfarb，M.P等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，76，5714-5718(1979)]，用NIH3T3细胞进行病灶形成试验，以观察TSC403基因对细胞是否有致瘤影响。

结果示于图6(未被TSC403基因转化的对照细胞)和图7(被TSC403基因转化的细胞)。

比较这两个图可清楚地看出：当通过导入基因而在细胞中强迫表达TSC403基因时，如图7显示有一明确的病灶形成。因此，很显然，当TSC403基因不得不过量表达时，会丧失对接触抑制现象(细胞恶性转化现象之一)的敏感性，因此，TSC403基因与细胞的致瘤性有密切的关系。

实施例2

人ING1L基因

(1)人ING1L基因的克隆和DNA测序

从人胎脑cDNA文库和数据库检索中任意选择cDNA克隆，测序后通过下列方法分离出一个克隆(GEN-146F11)，该克隆携有编码与p33^ING1(据认为该蛋白质为肿瘤抑制蛋白)具有高同源性的氨基酸序列的cDNA。

因此，提取自人胎脑的mRNA购自Clontech并被用作起始物质。由该mRNA合成cDNA并克隆至载体λZAPII(Stratagene)中以构建cDNA文库(Otsuka GEN Research Institute，Otsuka Pharmaceutical)。通过体内切除法[Short，J.M等，核酸研究，16，7583-7600(1988)]，使携有人基因的大肠杆菌菌落在琼脂培养基上形成，随机挑选菌落，将携有上述人基因的大肠杆菌克隆标注于96孔微滴定板中，于-80℃储存该被标注的克隆。

在1.5ml LB培养基中将每个被标注的克隆培养24小时，使用质粒自动提取仪PI-100(Kurabo)提取DNA并纯化。通过用RNA酶处理将污染的大肠杆菌RNA分解并除去。最后将DNA溶解于30微升的体积中，取2微升通过微量凝胶法来粗略估计DNA大小和量。再取7微升用于测序反应，将其余21微升作为质粒DNA储存于4℃。

然后，进行使用T3、T7或合成的寡核苷酸引物的桑格双脱氧终止法[Sanger，F等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74，5463-5467(1977)]或循环测序法(双脱氧终止法与PCR法相结合的方法)[Carothers，A.M等，生物技术，7，494-499(1989)]。这些方法是使用少量质粒DNA(约0.1-0.5g)为模板的链延伸反应，其终止特异于4种碱基的方法。

使用FITC(异硫氰酸荧光素)标记的引物作为序列引物，使用Taq聚合酶进行约25轮反应循环。在经荧光标记的DNA片断中，用DNA自动测序仪ALF^TM DNA测序仪(Pharmacia)测定cDNA 5′-末端约400个核苷酸的序列。

基因中3′-非翻译区域的异质性高，适于各个基因的分化。因此，在某些情况下，也按与上相同的方法测定3′-末端区域的序列。

将用DNA测序仪测得的大量核苷酸序列资料输入64位计算机DEC3400中以进行计算机化同源性分析。根据UWGCG的FASTA程序[Pearson，W.R和Lipman，D.J.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，85，2444-2448(1988)]，通过数据库(GenBank，EMBL)检索进行同源性分析。

分析人胎脑cDNA文库的方法详细描述于Fujiwara等[Fujiwara，T等，DNA研究，2，107-111(1991)]。

从按上述构建的人胎脑cDNA文库中随机选择约5040个EST(被表达序列的标记物：表达的基因片断的部分DNA序列)，然后进行测序。

在根据FASTA程序的GenBank/EMBL序列检索中，发现被称为GEN-146F11的克隆携有编码与p33^ING1(GenBank A.C.No.AF001954)具有高同源性的氨基酸序列的基因。

为了弄清楚所述GEN-146F11克隆中的全长序列，使用T7DNA聚合酶和合成引物进行DNA测序反应。另外，将***到载体(pBluescript载体；Stratagene)的双链DNA用作模板，合成的寡核苷酸用作引物，通过桑格双脱氧链终止法测定包括整个编码区的cDNA的核苷酸序列，并将该序列与几个其它相关基因的DNA序列进行比较。

SEQ ID NO：6显示出GEN-146F11克隆(cDNA)的核酸序列；SEQID NO：5显示出所述克隆编码区的核酸序列；SEQ ID NO：4显示出推定的由所述核酸序列编码的氨基酸序列。

在上述核苷酸序列中，发现起始信号序列位于第92-94位，怀疑它是翻译起始密码子。推测的终止密码子位于第932-934位。

所得cDNA的长度为1078个核苷酸，其含有840个碱基对的编码推测为280个氨基酸残基蛋白质的可读框。

通过使用FASTA程序进行同源性检索，发现该基因编码的氨基酸序列与p33^ING1(GenBank A.C.No.AF044076)具有高度同源性，而核苷酸序列的同源性为60.0％。

在氨基酸序列的水平上，研究了由本发明基因编码的蛋白质的推定氨基酸序列与p33^ING1(GenBank A.C.No.AF044076)序列之间的同源性，结果示于图8。

图8显示出以单字母表示的氨基酸序列；上面一行表示由本发明基因编码的人ING1L蛋白质的序列(表示为hING1L)，下面一行表示p33^ING1的序列[Garkavetsev等，Nature.Genet.，14，415-420(1996)；Garkavetsev等，分子细胞生物学，17，2014-2019(1997)，GenBank A.C.No.AF001954；然而，该序列随后被修正，修正后的序列示于GenBankA.C.No.AF044076；在图中以p33^ING1表示]。

另外，在同一图中，实心区域(黑框)表示相同的氨基酸残基，阴影区域(阴影框)表示类似的氨基酸残基，hING1L一行中的符号----表示缺口。

从图中可以看出由本发明基因编码的氨基酸序列与p33^ING1的氨基酸序列有58.9％的同源性(根据经修正的p33^ING1序列计算)。

(2)Northern印迹分析

使用经随机寡核苷酸引发法标记的人cDNA克隆作为探针，通过Northern印迹评价正常人组织中人ING1L mRNA的表达。

根据产品说明书，使用人MTN印迹(人多组织Northern印迹；Clontech)进行Northern印迹分析。

因此，用PCR扩增所述克隆GEN-146F11的全长序列，用[³²P]-dCTP(随机引发的DNA标记试剂盒，Boehringer Mannheim)标记PCR产物以用作探针。

对印迹进行4小时的预杂交，然后于42℃在50％甲酰胺/5×SSC/10×Decherd溶液/2％SDS溶液(含有100微克/ml变性的鲑精DNA)的溶液中杂交过夜。室温下用2×SSC/0.1％SDS洗涤2次后，于65℃用0.2×SSC/0.1％SDS再洗涤2次，各15分钟。于-70℃将滤纸暴露于X-射线胶片(Kodak)。

18小时暴露的结果示于图9。

从图9可以看出，在所有16种人成年器官-衍生的受试组织(心脏，脑，胎盘，肺，肝脏，骨骼肌，肾脏，胰腺，脾脏，胸腺，***，睾丸，子宫，小肠，结肠，外周血和白细胞；与图中示出的名称一致)中都发现了表达，并检测到1.5kb和1.3kb的两个转录物。

另外，根据产品说明书，使用人TP印迹(人肿瘤系列印迹；Invitrogen)对结肠癌、食道癌、输卵管癌和胃癌几个肿瘤组织进行类似的Northern印迹分析。

结肠癌患者组织的结果示于图10。

在图10中，T表示结肠癌组织(在图中以T：肿瘤表示)，N表示正常的结肠组织(在图中以N：正常表示)。一套T和N是得自一个患者的组织，图中显示的是得自4个患者的组织的结果。

从图中可以清楚地看出：在各个患者中，相对于正常组织而言，癌组织中的人ING1L基因的表达水平升高。

根据上述发现，可以认为本发明的人ING1L基因可用于癌症研究和治疗，尤其可用于癌症诊断，如果将来研制出人ING1L基因之表达产物的任何拮抗抑制剂，该抑制剂即可用作抗癌剂。

(3)通过FISH和辐射杂交技术进行染色体作图

使用0.5微克各种粘粒DNA作为探针通过已知技术[Takahashi，E等，人类遗传学，86，14-16(1990)]进行FISH研究，以进行染色体排列，通过Provia 100胶片(Fuji；ISO 100)或CCD照相***(Applied Imaging，Cyto Vision)获得FISH。

结果，100个典型的R一带(前)中期细胞的信号表明：人ING1L基因在染色体上的基因座为4q35.1。

工业实用性

根据本发明，不仅提供了新的肺特异性基因TSC403，还提供了由其编码的蛋白质。通过利用它们，提供了能更清楚了解癌症(如肺癌和胰腺癌)以及癌症发生过程的技术，所述技术可用于诊断、预防和治疗癌症。

本发明还提供了新的人ING1L基因，该基因可检测在多种组织中的基因表达；通过基因工程技术产生人ING1L蛋白，所述蛋白是该基因的表达产物；构建抗所述蛋白质的特异性抗体。这些反过来可研究多种细胞的细胞周期、生长抑制或激活，研究细胞代谢的老化和细胞的编程性死亡，以及探测、治疗或诊断相关疾病，如上文提及的癌症。另外，本发明还能用于研制或筛选出所述人ING1L蛋白的拮抗性抑制剂，即细胞生长抑制剂和抗癌药物。

序列表

<110>大塚制药株式会社

<120>TSC403基因和人ING1L基因

<130>P99-04

<140>

<141>

(150>JP H10-38133，JP H10-73234 and JP H10-134679

<151>1998-02-03，1998-03-05 and 1998-04-28

<160>9

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>416

<212>PRT

<213>人正常肺cDNA文库

<400>1

Met Pro Arg Gln Leu Ser Ala Ala Ala Ala Leu Phe Ala Ser Leu Ala

1 5 10 15

Val Ile Leu His Asp Gly Ser Gln Met Arg Ala Lys Ala Phe Pro Glu

20 25 30

Thr Arg Asp Tyr Ser Gln Pro Thr Ala Ala Ala Thr Val Gln Asp Ile

35 40 45

Lys Lys Pro Val Gln Gln Pro Ala Lys Gln Ala Pro His Gln Thr Leu

50 55 60

Ala Ala Arg Phe Met Asp Gly His Ile Thr Phe Gln Thr Ala Ala Thr

65 70 75 80

Val Lys Ile Pro Thr Thr Thr Pro Ala Thr Thr Lys Asn Thr Ala Thr

85 90 95

Thr Ser Pro Ile Thr Tyr Thr Leu Val Thr Thr Gln Ala Thr Pro Asn

100 105 110

Asn Ser His Thr Ala Pro Pro Val Thr Glu Val Thr Val Gly Pro Ser

115 120 125

Leu Ala Pro Tyr Ser Leu Pro Pro Thr Ile Thr Pro Pro Ala His Thr

130 135 140

Ala Gly Thr Ser Ser Ser Thr Val Ser His Thr Thr Gly Asn Thr Thr

145 150 155 160

Gln Pro Ser Asn Gln Thr Thr Leu Pro Ala Thr Leu Ser Ile Ala Leu

165 170 175

His Lys Ser Thr Thr Gly Gln Lys Pro Asp Gln Pro Thr His Ala Pro

180 185 190

Gly Thr Thr Ala Ala Ala His Asn Thr Thr Arg Thr Ala Ala Pro Ala

195 200 205

Ser Thr Val Pro Gly Pro Thr Leu Ala Pro Gln Pro Ser Ser Val Lys

210 215 220

Thr Gly Ile Tyr Gln Val Leu Asn Gly Ser Arg Leu Cys Ile Lys Ala

225 230 235 240

Glu Met Gly Ile Gln Leu Ile Val Gln Asp Lys Glu Ser Val Phe Ser

245 250 255

Pro Arg Arg Tyr Phe Asn Ile Asp Pro Asn Ala Thr Gln Ala Ser Gly

260 265 270

Asn Cys Gly Thr Arg Lys Ser Asn Leu Leu Leu Asn Phe Gln Gly Gly

275 280 285

Phe Val Asn Leu Thr Phe Thr Lys Asp Glu Glu Ser Tyr Tyr Ile Ser

290 295 300

Glu Val Gly Ala Tyr Leu Thr Val Ser Asp Pro Glu Thr Val Tyr Gln

305 310 315 320

Gly Ile Lys His Ala Val Val Met Phe Gln Thr Ala Val Gly His Ser

325 330 335

Phe Lys Cys Val Ser Glu Gln Ser Leu Gln Leu Ser Ala His Leu Gln

340 345 350

Val Lys Thr Thr Asp Val Gln Leu Gln Ala Phe Asp Phe Glu Asp Asp

355 360 365

His Phe Gly Asn Val Asp Glu Cys Ser Ser Asp Tyr Thr Ile Val Leu

370 375 380

Pro Val Ile Gly Ala Ile Val Val Gly Leu Cys Leu Met Gly Met Gly

385 390 395 400

Val Tyr Lys Ile Arg Leu Arg Cys Gln Ser Ser Gly Tyr Gln Arg Ile

405 410 415

<210>2

<211>1248

<212>DNA

<213>人正常肺cDNA文库

<400>2

atgccccggc agctcagcgc ggcggccgcg ctcttcgcgt ccctggccgt aattttgcac 60

gatggcagtc aaatgagagc aaaagcattt ccagaaacca gagattattc tcaacctact 120

gcagcagcaa cagtacagga cataaaaaaa cctgtccagc aaccagctaa gcaagcacct 180

caccaaactt tagcagcaag attcatggat ggtcatatca cctttcaaac agcggccaca 240

gtaaaaattc caacaactac cccagcaact acaaaaaaca ctgcaaccac cagcccaatt 300

acctacaccc tggtcacaac ccaggccaca cccaacaact cacacacagc tcctccagtt 360

actgaagtta cagtcggccc tagcttagcc ccttattcac tgccacccac catcacccca 420

ccagctcata cagctggaac cagttcatca accgtcagcc acacaactgg gaacaccact 480

caacccagta accagaccac ccttccagca actttatcga tagcactgca caaaagcaca 540

accggtcaga agcctgatca acccacccat gccccaggaa caacggcagc tgcccacaat 600

accacccgea cagctgcacc tgcctccacg gttcctgggc ccacccttgc acctcagcca 660

tcgtcagtca agactggaat ttatcaggtt ctaaacggaa gcagactctg tataaaagca 720

gagatgggga tacagctgat tgttcaagac aaggagtcgg ttttttcacc tcggagatac 780

ttcaacatcg accccaacgc aacgcaagcc tctgggaact gtggcacccg aaaatccaac 840

cttctgttga attttcaggg cggatttgtg aatctcacat ttaccaagga tgaagaatca 900

tattatatca gtgaagtggg agcctatttg accgtctcag atccagagac agtttaccaa 960

ggaatcaaac atgcggtggt gatgttccag acagcagtcg ggcattcctt caagtgcgtg 1020

agtgaacaga gcctccagtt gtcagcccac ctgcaggtga aaacaaccga tgtccaactt 1080

caagcctttg attttgaaga tgaccacttt ggaaatgtgg atgagtgctc gtctgactac 1140

acaattgtgc ttcctgtgat tggggccatc gtggttggtc tctgccttat gggtatgggt 1200

gtctataaaa tccgcctaag gtgtcaatca tctggatacc agagaatc 1248

<210>3

<211>3198

<212>DNA

<213>人正常肺cDNA文库

<220>

<221>CDS

<222>(64)..(1311)

<400>3

ggcaccgatt cggggcctgc ccggacttcg ccgcacgctg cagaacctcg cccagcgccc 60

acc atg ccc cgg cag ctc agc gcg gcg gcc gcg ctc ttc gcg tcc ctg 108

Met Pro Arg Gln Leu Ser Ala Ala Ala Ala Leu Phe Ala Ser Leu

1 5 10 15

gcc gta att ttg cac gat ggc agt caa atg aga gca aaa gca ttt cca 156

Ala Val Ile Leu His Asp Gly Ser Gln Met Arg Ala Lys Ala Phe Pro

20 25 30

gaa acc aga gat tat tct caa cct act gca gca gca aca gta cag gac 204

Glu Thr Arg Asp Tyr Ser Gln Pro Thr Ala Ala Ala Thr Val Gln Asp

35 40 45

ata aaa aaa cct gtc cag caa cca gct aag caa gca cct cac caa act 252

Ile Lys Lys Pro Val Gln Gln Pro Ala Lys Gln Ala Pro His Gln Thr

50 55 60

tta gca gca aga ttc atg gat ggt cat atc acc ttt caa aca gcg gcc 300

Leu Ala Ala Arg Phe Met Asp Gly His Ile Thr Phe Gln Thr Ala Ala

65 70 75

aca gta aaa att cca aca act acc cca gca act aca aaa aac act gca 348

Thr Val Lys Ile Pro Thr Thr Thr Pro Ala Thr Thr Lys Asn Thr Ala

80 85 90 95

acc acc agc cca att acc tac acc ctg gtc aca acc cag gcc aca ccc 396

Thr Thr Ser Pro Ile Thr Tyr Thr Leu Val Thr Thr Gln Ala Thr Pro

100 105 110

aac aac tca cac aca gct cct cca gtt act gaa gtt aca gtc ggc cct 444

Asn Asn Ser His Thr Ala Pro Pro Val Thr Glu Val Thr Val Gly Pro

115 120 125

agc tta gcc cct tat tca ctg cca ccc acc atc acc cca cca gct cat 492

Ser Leu Ala Pro Tyr Ser Leu Pro Pro Thr Ile Thr Pro Pro Ala His

130 135 140

aca gct gga acc agt tca tca acc gtc agc cac aca act ggg aac acc 540

Thr Ala Gly Thr Ser Ser Ser Thr Val Ser His Thr Thr Gly Asn Thr

145 150 155

act caa ccc agt aac cag acc acc ctt cca gca act tta tcg ata gca 588

Thr Gln Pro Ser Asn Gln Thr Thr Leu Pro Ala Thr Leu Ser Ile Ala

160 165 170 175

ctg cac aaa agc aca acc ggt cag aag cct gat caa ccc acc cat gcc 636

Leu His Lys Ser Thr Thr Gly Gln Lys Pro Asp Gln Pro Thr His Ala

180 185 190

cca gga aca acg gca gct gcc cac aat acc acc cgc aca gct gca cct 684

Pro Gly Thr Thr Ala Ala Ala His Asn Thr Thr Arg Thr Ala Ala Pro

195 200 205

gcc tcc acg gtt cct ggg ccc acc ctt gca cct cag cca tcg tca gtc 732

Ala Ser Thr Val Pro Gly Pto Thr Leu Ala Pro Gln Pro Ser Ser Val

210 215 220

aag act gga att tat cag gtt cta aac gga agc aga ctc tgt ata aaa 780

Lys Thr Gly Ile Tyr Gln Val Leu Asn Gly Ser Arg Leu Cys Ile Lys

225 230 235

gca gag atg ggg ata cag ctg att gtt caa gac aag gag tcg gtt ttt 828

Ala Glu Met Gly Ile Gln Leu Ile Val Gln Asp Lys Glu Ser Val Phe

240 245 250 255

tca cct cgg aga tac ttc aac atc gac ccc aac gca acg caa gcc tct 876

Ser Pro Arg Arg Tyr Phe Asn Ile Asp Pro Asn Ala Thr Gln Ala Ser

260 265 270

ggg aac tgt ggc acc cga aaa tcc aac ctt ctg ttg aat ttt cag ggc 924

Gly Asn Cys Gly Thr Arg Lys Ser Asn Leu Leu Leu Asn Phe Gln Gly

275 280 285

gga ttt gtg aat ctc aca ttt acc aag gat gaa gaa tca tat tat atc 972

Gly Phe Val Asn Leu Thr Phe Thr Lys Asp Glu Glu Ser Tyr Tyr Ile

290 295 300

agt gaa gtg gga gcc tat ttg acc gtc tca gat cca gag aca gtt tac 1020

Ser Glu Val Gly Ala Tyr Leu Thr Val Ser Asp Pro Glu Thr Val Tyr

305 310 315

caa gga atc aaa cat gcg gtg gtg atg ttc cag aca gca gtc ggg cat 1068

Gln Gly Ile Lys His Ala Val Val Met Phe Gln Thr Ala Val Gly His

320 325 330 335

tcc ttc aag tgc gtg agt gaa cag agc ctc cag ttg tca gcc cac ctg 1116

Ser Phe Lys Cys Val Ser Glu Gln Ser Leu Gln Leu Ser Ala His Leu

340 345 350

cag gtg aaa aca acc gat gtc caa ctt caa gcc ttt gat ttt gaa gat 1164

Gln Val Lys Thr Thr Asp Val Gln Leu Gln Ala Phe Asp Phe Glu Asp

355 360 365

gac cac ttt gga aat gtg gat gag tgc tcg tct gac tac aca att gtg 1212

Asp His Phe Gly Asn Val Asp Glu Cys Ser Ser Asp Tyr Thr Ile Val

370 375 380

ctt cct gtg att ggg gcc atc gtg gtt ggt ctc tgc ctt atg ggt atg 1260

Leu Pro Val Ile Gly Ala Ile Val Val Gly Leu Cys Leu Met Gly Met

385 390 395

ggt gtc tat aaa atc cgc cta agg tgt caa tca tct gga tac cag aga 1308

Gly Val Tyr Lys Ile Arg Leu Arg Cys Gln Ser Ser Gly Tyr Gln Arg

400 405 410 415

atc taattgttgc ccggggggaa tgaaaataat ggaatttaga gaactctttc 1361

Ile

atcccttcca ggatggatgt tgggaaattc cctcagagtg tgggtccttc aaacaatgta 1421

aaccaccatc ttctattcaa atgaagtgag tcatgtgtga tttaagttca ggcagcacat 1481

caatttctaa atactttttg tttattttat gaaagatata gtgagctgtt tattttctag 1541

tttcctttag aatattttag ccactcaaag tcaacatttg agatatgttg aattaacata 1601

atatatgtaa agtagaataa gccttcaaat tataaaccaa gggtcaattg taactaatac 1661

tactgtgtgt gcattgaaga ttttatttta cccttgatct taacaaagcc tttgctttgt 1721

tatcaaatgg actttcagtg cttttactat ctgtgtttta tggtttcatg taacatacat 1781

attcctggtg tagcacttaa ctccttttcc actttaaatt tgtttttgtt ttttgagacg 1841

gagtttcact cttgtcaccc aggctggagt acagtggcac gatctcggct tatggcaacc 1901

tccgcctccc gggttcaagt gattctcctg cttcagcttc ccgagtagct gggattacag 1961

gcacacacta ccacgcctgg ctaatttttg tatttttatt atagacgggt ttcaccatgt 2021

tggccagact ggtcttgaac tcttgacctc aggtgatcca cccacctcag cctcccaaag 2081

tgctgggatt acaggcatga gccattgcgc ccggccttaa atgttttttt taatcatcaa 2141

aaagaacaac atatctcagg ttgtctaagt gtttttatgt aaaaccaaca aaaagaacaa 2201

atcagcttat attttttatc ttgatgactc ctgctccaga atgctagact aagaattagg 2261

tggctacaga tggtagaact aaacaatdag caagagacaa taataatggc ccttaattat 2321

taacaaagtg ccagagtcta ggctaagcac tttatctata tctcatttca ttctcacaac 2381

ttataagtga atgagtaaac tgagacttaa gggaactgaa tcacttaaat gtcacctggc 2441

taactgatgg cagagccaga gcttgaattc atgttggtct gacatcaagg tctttggtct 2501

tctccctaca ccaagttacc tacaagaaca atgacaccac actctgcctg aaggctcaca 2561

cctcatacca gcatacgctc accttacagg gaaatgggtt tatccaggat catgagacat 2621

tagggtagat gaaaggagag ctttgcagat aacaaaatag cctatcctta ataaatcctc 2681

cactctctgg aaggagactg aggggctttg taaaacatta gtcagttgct catttttatg 2741

ggattgctta gctgggctgt aaagatgaag gcatcaaata aactcaaagt atttttaaat 2801

ttttttgata atagagaaac ttcgctaacc aactgttctt tcttgagtgt atagccccat 2861

cttgtggtaa cttgctgctt ctgcacttca tatccatatt tcctattgtt cactttattc 2921

tgtagagcag cctgccaaga attttatttc tgctgttttt tttgctgcta aagaaaggaa 2981

ctaagtcagg atgttaacag aaaagtccac ataaccctag aattcttagt caaggaataa 3041

ttcaagtcag cctagagacc atgttgactt tcctcatgtg tttccttatg actcagtaag 3101

ttggcaaggt cctgacttta gtcttaataa aacattgaat tgtagtaaag gtttttgcaa 3161

taaaaactta ctttggaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 3198

<210>4

<211>280

<212>PRT

<213>人胎脑cDNA文库

<400>4

Met Leu Gly Gln Gln Gln Gln Gln Leu Tyr Ser Ser Ala Ala Leu Leu

1 5 10 15

Thr Gly Glu Arg Ser Arg Leu Leu Thr Cys Tyr Val Gln Asp Tyr Leu

20 25 30

Glu Cys Val Glu Ser Leu Pro His Asp Met Gln Arg Asn Val Ser Val

35 40 45

Leu Arg Glu Leu Asp Asn Lys Tyr Gln Glu Thr Leu Lys Glu Ile Asp

50 55 60

Asp Val Tyr Glu Lys Tyr Lys Lys Glu Asp Asp Leu Asn Gln Lys Lys

65 70 75 80

Arg Leu Gln Gln Leu Leu Gln Arg Ala Leu Ile Asn Ser Gln Glu Leu

85 90 95

Gly Asp Glu Lys Ile Gln Ile Val Thr Gln Met Leu Glu Leu Val Glu

100 105 110

Asn Arg Ala Arg Gln Met Glu Leu His Ser Gln Cys Phe Gln Asp Pro

115 120 125

Ala Glu Ser Glu Arg Ala Ser Asp Lys Ala Lys Met Asp Ser Ser Gln

130 135 140

Pro Glu Arg Ser Ser Arg Arg Pro Arg Arg Gln Arg Thr Ser Glu Ser

145 150 155 160

Arg Asp Leu Cys His Met Ala Asn Gly Ile Glu Asp Cys Asp Asp Gln

165 170 175

Pro Pro Lys Glu Lys Lys Ser Lys Ser Ala Lys Lys Lys Lys Arg Ser

180 185 190

Lys Ala Lys Gln Glu Arg Glu Ala Ser Pro Val Glu Phe Ala Ile Asp

195 200 205

Pro Asn Glu Pro Thr Tyr Cys Leu Cys Asn Gln Val Ser Tyr Gly Glu

210 215 220

Met Ile Gly Cys Asp Asn Glu Gln Cys Pro Ile Glu trp Phe His Phe

225 230 235 240

Ser Cys Val Ser Leu Thr Tyr Lys Pro Lys Gly Lys trp Tyr Cys Pro

245 250 255

Lys Cys Arg Gly Asp Asn Glu Lys Thr Met Asp Lys Ser Thr Glu Lys

260 265 270

Thr Lys Lys Asp Arg Arg Ser Arg

275 280

<210>5

<211>840

<212>DNA

<213>人胎脑cDNA文库

<400>5

atgttagggc agcagcagca gcaactgtac tcgtcggccg cgctcctgac cggggagcgg 60

agccggctgc tcacctgcta cgtgcaggac taccttgagt gcgtggagtc gctgccccac 120

gacatgcaga ggaacgtgtc tgtgctgcga gagctggaca acaaatatca agaaacgtta 180

aaggaaattg atgatgtcta cgaaaaatat aagaaagaag atgatttaaa ccagaagaaa 240

cgtctacagc agcttctcca gagagcacta attaatagtc aagaattggg agatgaaaaa 300

atacagattg ttacacaaat gctcgaattg gtggaaaatc gggcaagaca aatggagtta 360

cactcacagt gtttccaaga tcctgctgaa agtgaacgag cctcagataa agcaaagatg 420

gattccagcc aaccagaaag atcttcaaga agaccccgca ggcagcggac cagtgaaagc 480

cgtgatttat gtcacatggc aaatgggatt gaagactgtg atgatcagcc acctaaagaa 540

aagaaatcca agtcagcaaa gaaaaagaaa cgctccaagg ccaagcagga aagggaagct 600

tcacctgttg agtttgcaat agatcctaat gaacctacat actgcttatg caaccaagtg 660

tcttatgggg agatgatagg atgtgacaat gaacagtgtc caattgaatg gtttcacttt 720

tcatgtgttt cacttaccta taaaccaaag gggaaatggt attgcccaaa gtgcagggga 780

gataatgaga aaacaatgga caaaagtact gaaaagacaa aaaaggatag aagatcgagg 840

<210>6

<211>1078

<212>DNA

<213>人胎脑cDNA文库

<220>

<221>CDS

<222>(92)..(931)

<400>6

tccaagctga gctgagggcc cgcggcggcc gcggccgtg catgtgcggc tgctggatgc 60

ggaggcggcg gcgacggcgc ggatcggcag g atg tta ggg cag cag cag cag 112

Met Leu Gly Gln Gln Gln Gln

1 5

caa ctg tac tcg tcg gcc gcg ctc ctg acc ggg gag cgg agc cgg ctg 160

Gln Leu Tyr Ser Ser Ala Ala Leu Leu Thr Gly Glu Arg Ser Arg Leu

10 15 20

ctc acc tgc tac gtg cag gac tac ctt gag tgc gtg gag tcg ctg ccc 208

Leu Thr Cys Tyr Val Gln Asp Tyr Leu Glu Cys Val Glu Ser Leu Pro

25 30 35

cac gac atg cag agg aac gtg tct gtg ctg cga gag ctg gac aac aaa 256

His Asp Met Gln Arg Asn Val Ser Val Leu Arg Glu Leu Asp Asn Lys

40 45 50 55

tat caa gaa acg tta aag gaa att gat gat gtc tac gaa aaa tat aag 304

Tyr Gln Glu Thr Leu Lys Glu Ile Asp Asp Val Tyr Glu Lys Tyr Lys

60 65 70

aaa gaa gat gat tta aac cag aag aaa cgt cta cag cag ctt ctc cag 352

Lys Glu Asp Asp Leu Asn Gln Lys Lys Arg Leu Gln Gln Leu Leu Gln

75 80 85

aga gca cta att aat agt caa gaa ttg gga gat gaa aaa ata cag att 400

Arg Ala Leu Ile Asn Ser Gln Glu Leu Gly Asp Glu Lys Ile Gln Ile

90 95 100

gtt aca caa atg ctc gaa ttg gtg gaa aat cgg gca aga caa atg gag 448

Val Thr Gln Met Leu Glu Leu Val Glu Asn Arg Ala Arg Gln Met Glu

105 110 115

tta cac tca cag tgt ttc caa gat cct gct gaa agt gaa cga gcc tca 496

Leu His Ser Gln Cys Phe Gln Asp Pro Ala Glu Ser Glu Arg Ala Ser

120 125 130 135

gat aaa gca aag atg gat tcc agc caa cca gaa aga tct tca aga aga 544

Asp Lys Ala Lys Met Asp Ser Ser Gln Pro Glu Arg Ser Ser Arg Arg

140 145 150

ccc cgc agg cag cgg acc agt gaa agc cgt gat tta tgt cac atg gca 592

Pro Arg Arg Gln Arg Thr Ser Glu Ser Arg Asp Leu Cys His Met Ala

155 160 165

aat ggg att gaa gac tgt gat gat cag cca cct aaa gaa aag aaa tcc 640

Asn Gly Ile Glu Asp Cys Asp Asp Gln Pro Pro Lys Glu Lys Lys Ser

170 175 180

aag tca gca aag aaa aag aaa cgc tcc aag gcc aag cag gaa agg gaa 688

Lys Ser Ala Lys Lys Lys Lys Arg Ser Lys Ala Lys Gln Glu Arg Glu

185 190 195

gct tca cct gtt gag ttt gca ata gat cct aat gaa cct aca tac tgc 736

Ala Ser Pro Val Glu Phe Ala Ile Asp Pro Asn Glu Pro Thr Tyr Cys

200 205 210 215

tta tgc aac caa gtg tct tat ggg gag atg ata gga tgt gac aat gaa 784

Leu Cys Asn Gln Val Ser Tyr Gly Glu Met Ile Gly Cys Asp Asn Glu

220 225 230

cag tgt cca att gaa tgg ttt cac ttt tca tgt gtt tca ctt acc tat 832

Gln Cys Pro Ile Glu trp Phe His Phe Ser Cys Val Ser Leu Thr Tyr

235 240 245

aaa cca aag ggg aaa tgg tat tgc cca aag tgc agg gga gat aat gag 880

Lys Pro Lys Gly Lys trp Tyr Cys Pro Lys Cys Arg Gly Asp Asn Glu

250 255 260

aaa aca atg gac aaa agt act gaa aag aca aaa aag gat aga aga tcg 928

Lys Thr Met Asp Lys Ser Thr Glu Lys Thr Lys Lys Asp Arg Arg Ser

265 270 275

agg tagtaaaggc catccacatt ttaaagggtt atttgactat tatataatcc 981

Arg

280

gtttgctttc agaaaatgtt ttagggtdaa tgcataagac tatgcaataa ttattaatca 1041

ttagtattaa tggtgtatta aaagttgttg tactttg 1078

<210>7

<211>10

<212>DNA

<213>TSC403的PCR引物序列

<400>7

gatctgacac 10

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>PCR引物P1

<400>8

gatcggatcc aggaggatgc gggtccgg 28

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>PCR引物P2

<400>9

gatcctcgag ttactgtggt ggctgctgct 30

Claims

1.一种分离的基因，其由编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列组成。

2.一种分离的基因，其为选自下列(a)、(b)和(c)之一的多核苷酸：

(a)由SEQ ID NO：2所示核苷酸序列或其互补序列组成的多核苷酸；

(b)在包括在7％聚乙二醇/10％十二烷基硫酸钠在65℃杂交过夜，然后洗涤，其中所述洗涤包括在0.1％×SSC/0.1％SDS/中在65℃洗涤30分钟的条件下与(a)之多核苷酸杂交的多核苷酸；和

(c)与编码组成为SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸具有至少95％同源性的多核苷酸，所述同源多核苷酸编码对细胞具有致癌影响的多肽。

3.权利要求1或2的基因，其为人基因。

4.权利要求2的基因，其具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

5.一种分离的蛋白质，其由权利要求1所述基因编码的由SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列组成。

6.一种抗体，特异性结合于权利要求5所述的蛋白质。