CN1284135A - 用有毒化合物抑制和杀灭厌氧菌的快速评定方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于确定供被厌氧菌污染的含水***使用的农药或杀灭生物药剂的最小抑制浓度的快速方法。这种快速技术提供了为控制被微生物污染的水流中厌氧生长物而确定所需的单独的或者组合的抗微生物剂,或者说杀灭生物药剂的最小量的机会。该测试包括pH指示剂染料***的使用,pH指示剂染料***对因厌氧性生物的糖类代谢作用的副产物的产生而引起的环境改变起反应。

Description

用有毒化合物抑制和杀灭厌氧菌的快速评定方法
发明领域
本发明公开了一种用于确定供被厌氧菌污染的含水***使用的农药或杀灭生物药剂的最小抑制浓度的快速方法。这种快速技术提供了确定为控制被微生物污染的水流中厌氧生长物，所需的单独的或者组合的抗微生物剂，或者说杀灭生物药剂的最小量的机会。该测试包括pH指示剂染料***的使用，pH指示剂染料***对由厌氧性生物的糖类代谢作用的副产物的产生而引起的环境改变起反应。
和需要高达1-2周时间的常规测试程序相反，该技术在从约30分钟到约8-10小时的时段内给出测试答案。该测试程序使用微量滴定培养皿上的多列样本孔，每列具有多个样本孔，以及转移被污染的水相***，培养基，pH指示剂的预定等分试样，以及增加的，浓度被顺序稀释的抗微生物剂的技术。
发明背景
在工业水应用的许多领域中，必须使用杀灭生物药剂来控制细菌生长，以避免、防止或控制细菌沉积物的微生物聚积，以及源于细菌沉积物的副产物的聚积。这些细菌及其它微生物有机体的存在通常会干扰水处理或者在使用这些各种各样工业用水场合下的各种产品的制造。工业用水可包括各种各样的水，例如只在冷却水***中循环一次的水，在具有或不具有排放部件的封闭的循环冷却水***中重复循环的水，在工业生产过程中使用之前被使用并被收集以便处理的水，在处理以满足规定的水质量标准之前或之后，作为污水排放的水，在各种产品，例如纸张或纺织品的生产中使用的生产用水，及其它生产用水，例如原油开采中，或者烃类化学制品的加工中使用的那些生产用水。
在工业用水的每种应用中，已使用，并且目前正在使用杀灭生物药剂来降低、防止并控制微生物，有害细菌及类似的生长有机体的存在。这些生长物不仅导致堵塞，而且还会在沉积有这些微生物菌落的金属表面上，引起金属表面的腐蚀。
在各种杀灭生物药剂的应用中，涉及一种方法，该方法包括以这样的浓度把杀灭生物药剂加入被处理的工业用水中，以便控制这些微生物有机体的生长。所谓控制微生物的生长，我们指的是不仅包括生物生长的完全消除以及微生物的消除，而且还包括微生物种群的静态控制，以便虽然不是所有有机体都被杀死，不过可以最大限度地控制生长种群。在测试并确定要使用的杀灭生物药剂的效率和类型的方法中，为了确定特定的杀灭生物药剂的有效应用，尤其是确定为了在其中产生微生物的特定工业用水环境中，实现被处理的特定微生物的静态控制或完全消除，通常需要持续24-约48小时，有时持续1周，最长可达2周或更长的测试程序。
这些较长的测试周期不仅浪费时间，而且浪费资源，并且在确定保持特定污染工业源的微生物控制所需的恰当杀灭生物药剂，及其最佳使用强度和浓度方面，这些测试程序的费用较高。
在各种工业和娱乐场所应用中，杀微生物剂被加入含水***中。这些应用中的一些包括加入杀微生物剂以控制工业冷却水***，诸如游泳池和温泉之类的游息水***中，藻类、细菌、真菌及原生动物的生长，加入杀微生物剂，以控制纸张生产过程中的细菌，使用杀微生物剂来控制原糖加工过程中的细菌生长等等。本发明还发现杀灭生物药剂用于在工业及城市用水进水***中，以及工业冷却水***中控制包括(但不限于)条纹贻贝(zebramussel)，紫贻贝及亚洲蛤(Asiaticclam)的无脊椎动物的应用。虽然特别适用于含水***，不过本发明也可应用于非水相***。这里使用的术语“杀微生物剂”和“杀灭生物药剂”被交替使用，并包括用于在水相和非水相流体***中控制如联邦杀虫剂杀真菌剂和灭鼠剂法令(FIFRA)中定义的“有害物”的化学药品。
目前用于确定流体***中存在的杀微生物剂数量的方法往往是***中细菌生长数量的费时测量方法(一种间接方法)，或者是活性杀微生物剂样本的湿化学分析方法(一种直接方法)。间接方法包括培养取自流体***的样本，以确定细菌生长。如果存在细菌生长，通常把更多的杀微生物剂加入该流体***中，直到细菌培养显示出数量稳定或者逐渐降低的微生物生长为止。湿化学分析方法费时，工作量大，并且当在除了配有实验室的井(well)之外的其它现场中进行湿化学分析时，误差很大。在做出本发明之前，不存在借助间接方法，快速并且精确地确定被厌氧性生物污染的***需要多少杀灭生物药剂的方便的现场方法。
利用示踪物质监视工业用水***中诸如防蚀剂和防锈剂之类的处理化学制品的效果的方法众所周知。Hoots的US.4783314公开了通过利用荧光测定术，使用惰性过渡金属示踪物质监视防蚀剂和防锈剂的浓度。Hoots等的US.4966711和US.5041386公开了使用加入量正比于防蚀剂和/或防锈剂的数量的惰性荧光添加剂来监视给定工业用水***中防蚀剂和/或防锈剂的浓度。US.4992380，5006311和5132096公开了监测工业水处理应用中使用的荧光示踪剂的方法和设备。
US5128419和5171450公开了水溶性聚合物，该水溶性聚合物具有用于监视其在工业水处理应用中的浓度的荧光部分。日本专利No.55003668(1980)公开了一种用于监视杀灭生物药剂浓度的方法，该方法通过加入并测量锂盐物质，间接确定杀微生物剂的浓度。该方法需要单独加入示踪物质，并且为了获得结果，需要使用原子吸收光谱学。和荧光测定术相比，原子吸收光谱学相当昂贵，并且由于所涉及的复杂设备，以及明火和可燃性气体供给的缘故，原子吸收光谱学不易适用于现场使用。
US.4,242,602公开了一种监视多种水处理组分的紫外光谱学技术。该方法涉及昂贵的分析设备以及具有特殊的写入软件的计算机硬件的使用。另外，必须在具***置的基础上校准该设备，并且如果水中的条件改变，还必须进行再校准。欧洲专利申请466303公开了一种把物质加入被处理水中，并观察该物质如何与杀微生物剂反应的方法。连续地测量与杀微生物剂反应的物质，并借助该物质的损耗确定杀微生物剂的浓度。该方法比较麻烦，需要特殊的设备，以及两次独立的化学制品供给。
杀灭生物药剂和杀微生物剂被用于控制或消除多种不同的工业水介质中的细菌生长。通常，一种杀灭生物药剂或杀微生物剂不足以控制被处理的水介质中的所有细菌生长。细菌或其它微生物有机体的存在干扰被处理的工业用水的处理，并会导致与这些污染水接触的设备的腐蚀及其它相关问题。
US专利No.5206151(该专利作为参考包含于此)公开了一种通过使用快速筛选技术，快速确定各种工业用水中杀灭生物药剂和杀微生物剂的效力的方法，该快速筛选技术取得含有微生物有机体的被污染水介质的多个样本；向其中加入指示剂染料，最好是能够与微生物有机体产生的脱氢酶反应的氧化-还原指示剂染料；并且随后向含有该氧化-还原指示剂染料的被处理溶液中加入培养加速剂。被处理样本被装在抗微生物剂数量逐渐稀释的滴定培养皿上，在和微生物有机体存在于其中的工业水***的工作温度相同的温度下，对该滴定培养皿保温。这方法促成生长，并加速微生物有机体活性，导致与氧化-还原指示剂染料反应的还原酶的浓度增大，从而引起颜色的变化。随后记录颜色方面的变化。
通过相对于未处理塔(column)，比较染料中颜色方面的第一变化，能够确定抑制被污染的水***中所含的微生物有机体的生长的抗微生物剂的最小抑制剂浓度(M.I.C)。
在支持厌氧细菌必需的还原环境中，诸如刃天青染料之类的氧化还原指示剂染料会随还原环境而改变颜色。于是，由于环境可能引起不真实的阳性结果，颜色改变不能指示是否存在厌氧性生物。
US专利No.5,206,151描述了一种可用于测试未被厌氧性生物高度污染，于是不具有原有的低(负)ORP的水。ORP是以mV为单位测量的氧化-还原电位。在第6栏第52-57行和第6栏第67行-第7栏第4行中公开的方法可用于评估兼性种群。这种兼性种群在测试水中主要进行需氧呼吸，但是在厌氧条件下可利用厌氧呼吸/发酵。因此，当在中度或重度厌氧条件下监视厌氧种群时，利用氧化还原染料有效监视轻度厌氧条件下的兼性细菌的测试不能给出准确的结果。因为中到重度厌氧条件将影响氧化还原染料给出虚假的数据。相反，当厌氧性生物(专性或兼性)是主要的种群，并且ORP太低，以致不能利用刃天青检测代谢活性的变化时，将使用这里公开的方法。
US专利No.5,374,536公开了一种产物选择测试方法，用于快速确定污水中杀灭生物药剂的增效掺合物的存在或者杀灭生物药剂掺合物的存在。该方法使用还原氧化染料***，供给的培养基，一种或多种杀灭生物药剂或其掺合物的混合物及为染料***的多种颜色变化提供的培养时间和温度。
US专利No.5,413,680中公开了检测毛毡的微生物堵塞的颜色变化，其中碘硝基四唑鎓被用作指示剂。
在Clinical Microbiology，1988年1月，第1-7页中公开了一种用于快速MIC测试的读出装置。但是，由于该方法需要不便于运输的贵重设备，因此该方法不便于现场应用。此外，所描述的技术为生长使用人造液体培养基，而不是天然流体。该液体培养基具有高的蛋白质含量，将不能用于利用造纸工业中最常使用的两种杀灭生物药剂：戊二醛和异噻唑啉进行测试，因为它们将因蛋白质而丧失活性。此外，该测试只对纯的有机体培养物起作用。由于在造纸厂或被测试的冷却塔流体中，通常存在混合的种群，因此该技术不适于这里计划的用途。
在US专利No.5,627,042中，冷光被用于计数测试溶液中活微生物的数目。
PCT申请WO 92/19764描述了基于pH灵敏吸收性的染料，该染料被用于检测收集的体液中的微生物生长。该文献描述了如何检测微生物生长的存在与否。这里公开的方法确定杀微生物剂对厌氧性生物的效用。
本发明通过提供一种易于使用的，准确并且连续的杀微生物剂浓度间接确定方法，解决了上面详述的许多问题，杀微生物剂浓度的确定是控制流体***，尤其是工业用水***中的微生物生长所必需的。
于是本发明的一个目的是提供一种可用于处理工业用水，特别可用于处理造纸过程中使用的工业用水的不同的多种杀微生物剂和/或毒剂的快速筛选方法，以控制微生物。
本发明的另一目的是提供一种筛选并测试可用于控制微生物生长的毒剂和杀灭生物药剂的快速目视筛选程序，并控制或消除工业用水中，特别是造纸过程中的微生物生长。
本发明的另一目的是在目视程序中，使用某些pH指示剂(通常称为pH指示剂染料)，pH指示剂染料在可见光光谱内改变颜色，从而能够确定被微生物有机体污染的水相***中特定抗微生物剂的最小抑制浓度(即MIC)。
本发明的目的是提供一种在现场，而不是在实验室环境中快速筛选可用于处理工业用水的不同的多种杀微生物剂和/或毒剂的方法。
本发明的另一目的是提供一种易于处理的微量滴定培养皿，该微量滴定培养皿含有多个样本管(或者样本孔)，每个样本孔能够保留确定体积的被污染水相***，或者被污染水相***的等分试样。随后向水相样本的等分试样中加入预先规定的已知数量pH指示剂染料，该pH指示剂染料能够与由碳水化合物代谢物引起的环境变化反应，碳水化合物代谢物因微生物***的代谢速率的增大而产生。随后，因增大的代谢速率而产生的碳水化合物代谢物与pH指示剂染料之间的化学反应产生该指示剂染料的颜色变化，这是一种通过向微量滴定培养皿的样本孔中所含的水相等分试样中加入培养基引起的微生物新陈代谢的增大的测量方法。随后就颜色变化测试(目视观察)这些多个等分试样。本发明的目的还包括用于通过产生各种浓度的抗微生物剂的一系列受控稀释，确定在特定的被污染水相***，例如某一造纸配料，或者造纸过程中使用的水中，特定的抗微生物剂或杀灭生物药剂，或者这些抗微生物剂或杀灭生物药剂的任意组合物的最小抑制浓度的程序。
发明要旨
本发明公开了一种用于确定供被厌氧菌污染的含水***使用的农药或杀灭生物药剂的最小抑制浓度的快速方法。这种快速技术提供了确定为控制被微生物污染的水流中厌氧生长物，所需的单独的或者组合的抗微生物剂，或者说杀灭生物药剂的最小量的机会。该测试包括pH指示剂染料***的使用，pH指示剂染料***对由厌氧性生物的糖类代谢作用的副产物的产生而引起的环境改变起反应。和需要高达1-2周时间的常规测试程序相反，该技术在从约30分钟到约8-10小时的时段内给出测试答案。该测试程序使用微量滴定培养皿上的多列样本孔，每列具有多个样本孔，以及转移被污染的水相***，培养基，pH指示剂的预定等分试样，以及增加的，浓度被顺序稀释的抗微生物剂的技术。发明的详细说明
本方法是一种确定哪种杀灭生物药剂/抗微生物剂最适合用在造纸机流体中，控制微生物生长的手段。不受控制的微生物生长可导致难看的沉积，该沉积会引起纸张断裂或小孔，纸张断裂或小孔导致代价高昂的停机。当关于最佳抗微生物剂进行测试时，重要的是根据种群环境中的天然种群，并在该种群存在于其中的动态***的实际流体中进行测试。这两种因素将影响杀灭生物药剂/抗微生物剂的功效。由于抗微生物剂非常昂贵，并且只可应用于选定的区域，为***选择最佳活性杀灭生物药剂非常重要。测试应在造纸厂现场进行。这可能距离为测试造纸机流体设计的全服务实验室几千英里。在装运过程中，随着时间的发展，微生物的混合种群可改变，或者流体自身可能发生化学变化。这些因素可影响测试结果，并导致杀灭生物药剂匹配性不好。
杀灭生物药剂
术语“杀灭生物药剂”在本领域中被明确定义为能够在生物***中产生杀灭效果的任意抗微生物剂。术语“杀灭生物药剂”在本领域中还用于表示抗微生物剂(杀灭生物药剂的子集)，该抗微生物剂是抑制性的，并且是防止生物生长或生物***积极代谢的药剂。抗微生物剂被定义为含有一种杀灭生物药剂或者含有一种或多种杀灭生物药剂的混合物。通常，抗微生物剂是杀微生物(microcidal)或者静菌(microstatic)，不过杀微生物(microcidal)也可表示杀生物的，意味着对生物***是“灭杀的”(致死的)，或者表示杀灭菌剂的，意味着对微生物***(生物***的亚群)是“灭杀的”。这些术语在工业领域中可交替使用，并且本领域的技术人员可理解这些术语是可互换的。
表1中列举了说明性的杀灭生物药剂，但是本发明并不只限于列举的那些杀灭生物药剂。本方法应适用于任意杀灭生物药剂。
表1杀灭生物药剂
杀灭生物药剂                 有效成分       典型应用
    A  3，5二甲基-四氢-2H-1，3，5-噻二嗪-2-硫酮 淀粉和肉体的防腐剂
    B     亚甲基双硫氰酸盐     杀黏菌剂
    C 1-烷基(C16-C18)氨基-3-氨基丙烷乙酸盐＆二(三氯甲基)砜     杀黏菌剂
    D  5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮＆2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮     杀黏菌剂防腐剂
    E 烷基二甲基苯甲基氯化铵＆二烷基甲基苯甲基氯化铵     杀黏菌剂
    F  2，2-二溴-3-次氮基-丙酰胺(DBNPA)     杀黏菌剂
    G  2-(氰硫基甲基硫基)-苯并噻唑＆二(三氯甲基)砜     杀黏菌剂
    H 二甲基二硫代氨基甲酸钠＆乙烯基双-二硫代氨基甲酸二钠     杀黏菌剂
    I     戊二醛(1，5戊二醇)     杀黏菌剂
    J 1-(3-氯烯丙基)-3，5，7-三氮鎓氯代金刚烷     防腐剂
    K     N-4-二羟基-α-氧代氯化苯     杀黏菌剂
    L     次氯酸钠
    M     4，5-二氯-1，2-二硫基-3-酮
    N     癸基硫代乙胺
培养基
命名的培养基只不过是食物，在本领域中食物被定义为具有营养的任何物质。有营养被进一步定义为提供营养。营养被进一步定义为借助该营养，有机体获取并吸收食物的过程。
术语营养液体培养基是从DIFCO手册得到的，并且是AmericanPublic Health Association在“Standard Methods for theExamination of Water and Waste Water”中规定的技术术语。营养液体培养基，培养基的一种简单例子，可从诸如DIFCO或BBL之类的供应商处得到，并且通常与上述“标准方法”所需的配方相同。配方和说明由公共卫生和医药工业严格控制，从而术语营养液体培养基不是一个类属术语，应被理解为表示脱水粉末的混合物，通常使用时，该混合物含有3份浓缩牛肉汁和5份蛋白胨。营养液体培养基是一种培养基，该培养基是促进微生物有机体的活性和生长的食物。营养液体培养基是一种特殊类型的培养基。
葡萄糖和消毒的混合奶油(dairy half and half pasteurizedcreamer)也是培养基。葡萄糖也被称为右旋糖，是一种简单的结晶糖。根据the Code of Federal Regulations第21章，第131.180节，dairy half and half是牛奶和含有10.5-18％乳脂的奶油的食品混合物。超巴氏杀菌是由Pasteurized Milk Ordinance Code定义为在最低280°F下处理牛奶两秒钟的术语。规定的培养基的加入允许并被用于促进生长，该生长产生与染料反应的碳水化合物代谢物，除非借助抗微生物剂的加入，终止该生长，或者使该生长变成稳定不变的。
加入的培养基的作用是增大微生物代谢，以使微生物，或者由微生物产生的副产物可以与pH染料反应。该反应由流体中的颜色变化指示。这里描述的方法中的营养促进剂的用途是增大微生物新陈代谢。
几乎所有培养基或者食品可被称为生物介质或者琼脂，如果琼胶被加入，以产生分离或计数各种微生物的物质。促进剂中找到的物质通常被用在琼脂生长介质(除了奶油之外)中。几乎所有食物源可在生长介质中用为培养基。其中一些包括V-8汁液和玉米面，通常用在环境微生物琼脂。
营养促进剂中使用的培养基的浓度不同于生长介质中使用的那些培养基的浓度。同样，培养基的用途也不同。在促进剂中，培养基试图增大微生物新陈代谢，同时不会较大地改变商品流体的状态。促进剂溶液的设计考虑到以琼脂中所含有的浓度使用的蛋白质可干扰某些杀灭生物药剂的活性，并使这些药剂丧失活性。促进剂溶液被设计成使该问题降低到最小程度，同时仍然促进快速的微生物新陈代谢。
本发明的好处之一是不需要杀菌，于是不对杀菌进行说明。不必进行杀菌，因此在加入培养基之前或之后，不需要进行杀菌。此外，通常伴随实验程序的杀菌程序既不必要，在现场又不能实现这些杀菌程序。
这里略述的方法中，不需要培养基、溶液、物质等的无菌状态/杀菌。由于工业用水中的种群在短时间内(1-8小时)被测定，因此在该方法中，正是工业用水中的天然种群将提供实测的微生物活性。和标准的杀灭生物药剂选择技术相比，所需时间较短是该方法的最大优点之一。
通常，工业用水的测试样本中的种群将含有500，000-10，000，000群落形成单位(cfu)细菌/毫升。如果种群低于500，000cfu/mL，则在该方法的8小时时间范围内，测试孔的内容将不反应，更重要的是，该测试将不能对杀灭生物药剂提出恰当的需求。利用几乎任意商用抗微生物剂，可很容易地杀死数量较少的细菌。当每毫升流体中存在几百万有机体时，当试图控制种群时，将会有这种需求。在这里公开的方法中已满足了这种需求。
虽然不必在无菌条件下进行测试，但是必须使用清洁的，未被污染的物质。测试中不能使用表现出污染迹象的任意物质。
可被加入利用上述pH指示剂染料处理的待分样本中的培养基包括水溶液或水悬浮液中的任意培养基，或者任意基本培养基混合物，包括葡萄糖，蔗糖，果糖，浓缩牛肉汁，蛋白胨，(浓缩牛肉汁和蛋白胨的组合物通常被称为“营养液体培养基”)胰化蛋白胨，牛奶，混合奶油，酵母提取物，或者上述物质的任意混合物。在使用我们的快速方法来确定特定抗微生物剂的最小抑制浓度(MIC)的情况下，优选的特定培养基是体积比为1∶8∶10的葡萄糖，营养液体培养基和混合奶油的混合物。但是，这些培养基可以任意适当的比例相互掺合，并可成功地促进微生物有机体活性，微生物有机体活性的促进又使新陈代谢速率及碳水化合物代谢物的形成加快，碳水化合物代谢物又可与本发明的pH指示剂染料反应。通过直接向微量滴定培养皿上的溶液加入培养基，使微生物活性或微生物呼吸增大，新陈代谢速率或者微生物的新陈代谢过程增大，从而提供上面的结果。于是借助有机体细胞电子传递体系，这些代谢物与pH指示剂的相互作用为监视细胞生存能力提供保证。
微量滴定培养皿
使用的微量滴定培养皿优选为具有多列称为样本孔的凹陷的透明塑料平皿，每列中具有多个样本孔。微量滴定培养皿最好具有至少两列样本孔，每列中具有至少三个样本孔。最好微量滴定培养皿具有约6-12列，每列具有约6-12个样式孔。但是，这些培养皿也可以是，例如，白瓷皿或者便于辨认或目视观察颜色变化的恰当底色的任意其它皿状结构。这些培养皿可从Mass，Cambridge，Co-star Corporation获得。
把取自被测试的水相***的等体积等分试样加入横向越过微量滴定培养皿的多列样本孔的最上面一系列样本孔中。并向这些样本孔中加入预定浓度的pH指示剂染料，培养基和抗微生物剂。抗微生物剂的加入浓度约为0.1ppm～5000ppm。随后通过使用多个移液管，把抗微生物剂浓度约为0.1ppm～5000ppm的浓度顺序稀释的抗微生物剂加入各列样本孔的每个样本孔中，从而样本孔含有被生物污染的测试水，并且在各列样本孔的每个样本孔中，含有浓度顺序稀释的抗微生物剂。在加入抗微生物剂之前或之后，向每个样本孔中加入已知量的pH指示剂染料，并向其中加入已知量的培养介质。这样在每列中得到一系列含有被污染水相***的顺序稀释的一系列等分试样的样本孔，其中已加入了数量逐渐降低的抗微生物剂。在存在培养基和pH指示剂染料的情况下，该系列数量逐渐降低的抗微生物剂随后测量微生物或代谢活性，微生物或代谢活性反映有机体细胞电子传递体系的活性的增大。每列测试一种杀灭培养基处理后的介质的等分样本中所含的微生物有机体的不同杀灭生物药剂。
随后在基本等于被污染的水相***的温度下，保温培养含有独立的几列样本孔，每列样本孔具有多个样本孔的滴定培养皿，样本孔中含有在微生物的等分试样中浓度顺序降低的抗微生物剂，以及等量的培养基和pH指示剂染料，被微生物有机体污染的样本最初取自该被污染水相***。基本相同的温度意味着包括实际环境温度加减约10-15℃。这些培养温度至少为20℃，但是通常不超过约90℃。保温培养时间应足以通过指示剂染料与由测试介质中培养基促进的活性产生的碳水化合物代谢副产物的产生引起的环境变化的反应，形成指示剂染料颜色方面的变化。样本培养皿必须进行厌氧保温培养。通过Remel从Mitsubishi Gas Chemical Company购买的Anaero Pack System可供现场使用。
保温培养时间可短到约30分钟，并可长到8-10小时。和以前的抗微生物活性测试相比，该测试时间，最好约为4-8小时，就时间而言相当短，并且对于抗微生物剂的最小抑制浓度的存在也更为灵敏。在介于约30分钟～8-10小时间的恰当保温培养时间之后，取出滴定培养皿，并目视检查，以确定已在滴定培养皿的每列样本孔中的各个样本孔中发生的颜色变化。当未处理的样本孔变成适当的颜色(取决于使用的染料)时，读出滴定培养皿的读数。在每列样本孔中，从低的抗微生物剂浓度到高的抗微生物剂浓度，首次观察到颜色变化的浓度被确定为该列样本孔中所含的抗微生物剂的最小抑制浓度。当然，每列样本孔含有单独的抗微生物剂(或者说杀灭生物药剂)或者抗微生物剂的单独混合物。
可使用不同初始浓度的抗微生物剂重复该过程，直到重复实验确定控制并维持控制利用该抗微生物剂处理的水相介质中的微生物有机体的最小抑制浓度为止。
我们的确定抗微生物剂的最小抑制浓度的方法特别适用于测试的被污染水相***是取自制浆和造纸厂中不同场所的原料或配料用水。培养基最好选自营养液体培养基，葡萄糖，超巴氏杀菌的混合奶油及它们的混合物，该混合物也可包括上面描述的其它培养基。微量滴定培养皿含有至少三列，最好四列样本孔，每列最好具有至少八个样本孔。微量滴定培养皿通常由玻璃，陶瓷制成，不过最好由透明塑料或者任意其它介质制成，所述任意其它介质可经受培养温度及培养时间，并提供适当的底色，借助该底色，可观察并说明颜色。处理后的滴定培养皿通常在约30～50℃的温度下进行厌氧保温培养，时间约为30分钟～4-6小时。
另外，可在诸如由氮气，氦气，氩气及二氧化碳等等形成的惰性气体气氛中完成保温培养。当在惰性气体气氛下进行保温培养时，将得到另外的结果，该结果将给予实验人员关于厌氧条件下，被污染的水相***有机体对杀灭生物药剂的反应的信息。
本发明是一种用于确定厌氧性生物污染的水相***中抗微生物剂最小抑制浓度的方法，包括下述步骤：
a)获得所述被污染水相***的样本；
b)向所述样本中加入与由所述厌氧性生物的碳水化合物代谢物引起的环境变化反应的pH指示剂染料；
c)把培养基加入所述样本中，形成染料处理的营养水相***；
d)获取染料处理的营养水相***的等分试样；
e)多次顺序稀释要测试的抗微生物剂，并形成染料处理的营养水相***的所述等分试样与各个所述顺序稀释的抗微生物剂溶液的混合物；
f)在基本等于被污染水相***的温度下，厌氧保温培养所述混合物，保温培养时间应足以借助染料与由碳水化合物代谢物引起的所述环境变化的反应，产生染料颜色的变化；
g)通过观察颜色的变化，确定抑制所述被污染水相***中所含的厌氧性生物的最小抗微生物剂抑制浓度。
此外，厌氧性微生物污染的水相***可选自制浆和造纸生产用水，造纸厂配料用水，造纸厂白水，棕色的原料用水(stock water)，造纸厂污水，开路循环冷却水，闭路循环冷却水，锅炉给水，糖厂生产用水，化学加工液流，发酵液流食品生产用水及石油和精炼厂生产用水和污水。
另外，培养基可选自混合奶油，酵母提取物，葡萄糖，蔗糖，果糖，甘油，浓缩牛肉汁，蛋白胨，胰化蛋白胨，牛奶及它们的混合物。
可进行顺序稀释，以便在染料及培养基处理后的水相***的总体积基础上，顺序稀释的所述抗微生物剂的最终浓度约为0.1ppm～10，000ppm。
pH指示剂染料可选自溴甲酚紫，溴甲酚绿，溴甲酚蓝，氯酚红，亚甲基蓝氯化物，甲基红和酚红。
可在微量滴定培养皿上对顺序稀释的所述染料处理的营养水相***进行保温培养，该微量滴定培养皿含有至少四列样本孔，每列具有至少八个样本孔，保温培养的温度约为25～60℃，时间约为60分钟～24小时。
此外，在保温培养过程中，在被处理的滴定培养皿上方保持主要含有惰性气体的气氛。
惰性气体可选自CO2和N2。
为了本发明的实施，步骤b)被延迟30分钟～20小时。
为了提供关于我们的确定被污染水相***中抗微生物剂最小抑制浓度的方法的更多信息，给出下面的实施例。
实施例
从原料配料(stock furnish)，薄棉纸配料或者其它配料得到约100毫升的过滤造纸配料。
随后把5毫升培养基溶液，1毫升pH指示剂染料溶液加入通过粗滤器，例如通过薄棉纸或者具有约US Std Sieve Series No.90筛号的过滤器过滤的这些过滤溶液中。培养基溶液在100毫升水中含有来自BBL或Difco营养液体培养基的0.4干燥粉末和1克葡萄糖。向该培养基溶液中加入0.5毫升可从当地食品店获得的超巴氏消毒的混合奶油。pH指示剂染料溶液在100毫升0.01％NaOH中含有0.15克染料。随后使用多通道微量移液管，例如由Flow实验室提供的Titertek微量移液管，并在和要测试的杀灭生物药剂一样多的样本孔列中，把约150微升的这种处理后的过滤水配料溶液吸入每个微量滴定样本孔中。Titertek是Flow实验室的注册商标。
把1毫升1％的杀灭生物药剂溶液加入4毫升的含有培养基-染料-配料样本中，以在样本中形成2000ppm的杀灭生物药剂溶液。这些商业或实验杀灭生物药剂可包括，但不限于，聚胺，异噻唑啉，有机硫化合物(organosulfur)，季胺，有机溴化合物，氨基甲酸盐，亚甲基双硫氰酸盐，或者它们的组合物，或者已知的任意其它杀灭生物药剂。
在形成该2000ppm溶液之后，立即取出150微升的该处理溶液，并将其放入微量滴定培养皿的第一测试列的第一微量样本孔中。使一列样本孔保持未被杀灭生物药剂处理的状态。随后把微量滴定样本孔中形成的溶液抽入移液管中，该移液管用于转移杀灭生物药剂2-3次，随后把吸出的溶液放回同一样本孔中，从而混合溶液。混合后，从第一样本孔中提取150微升混合物，并将其加入同一列中的下一样本孔中。再次进行该混合程序，并利用微量移液管吸取150微升的该第二样本孔溶液。把该第二等分试样放入微量滴定培养皿上同列中的第三样本孔中。重复该程序，直到单列中的所有样本孔都含有加入其中并与之混合的浓度顺序稀释的抗微生物剂(杀灭生物药剂)为止。从该列的最后一个样本孔抽取的150微升等分试样被排出。
对于要测试的所有杀灭生物药剂，在每列中重复该程序。使一列样本孔保持未处理状态，以用作对照物，即含有测试溶液，培养基，pH染料，但是没有加入任何杀灭生物药剂或者抗微生物剂的测试列。
随后对含有多列样本孔，每列具有多个样本孔的微量滴定培养皿保温培养。温度最好为被测试的工业生产液流的温度加减10-15℃。这些温度为20℃～80℃，并且通常为大约25-30℃～大约50-60℃。由于微量滴定培养皿在二氧化碳环境中进行厌氧保温培养，即在保温培养之前，把培养皿放入例如由Anaero Pack System提供的厌氧环境中，Anaero Pack System可从Mitsubishi Gas Chemical Company获得。市场上可买到的该***把样本上方的空气中的氧转化为二氧化碳和H2O，从而提供CO2气氛。
在上述程序之后，浓度梯度，即抗微生物剂的顺序稀释浓度将从第一个高浓度样本孔中的1000ppm变化到最低浓度样本孔中的约8ppm(或者更低)。在存在染料的情况下，不含足量抗微生物剂的样本孔转变成另一颜色。含有足量抗微生物剂的样本孔保持初始的颜色。当所有对照样本孔(未处理的)的颜色是终点颜色-黄色或透明时，读出测试结果。通过比较顺序稀释样本和未处理的样本孔中的浓度，可在其抗微生物剂浓度是控制测试样本中微生物有机体生长的最低浓度的样本孔处，目视确定每个抗微生物剂的MIC。
已发现对该测试起反应的，并且在造纸厂，冷却塔等中常见的细菌包括梭状芽胞杆菌，硫酸盐还原细菌和克雷白氏杆菌。通过恰当地选择抗微生物剂或杀灭生物药剂的初始浓度，能够在约10，000ppm-直到并包括低于1ppm浓度的浓度范围，筛选杀灭生物药剂。
下面给出的实施例用于说明本发明的优选实施方案及应用，除非在附加的权利要求中另外说明，不对本发明进行限制。
实施例1
为了进行实验，利用NaOH或者HCl把从制浆和造纸厂获得的过滤后的白水的pH值调节为6.5。把pH值调节后的100mL等分试样，以及5mL水合MiniToxTM(可从Illinois，Naperville的Nalco Chemical公司购得，含有0.4克营养液体培养基，1.0克葡萄糖，100mLH2O)培养液，1mL的0.15％氯酚红，及0.5mL混合奶油一起加入Whirlpak袋中。充分混合该溶液，直到颜色均匀为止。下面将把该溶液称为AnnaTox处理配料。
把150微升AnnaTox处理配料加入微量滴定托盘(microtitretray)的每个试孔中。随后，把4毫升AnnaTox处理配料加入10毫升烧杯中(一个烧杯用于一种被筛选的杀灭生物药剂)。接下来，把1毫升1％(重量百分比)杀灭生物药剂溶液加入各个烧杯中，并混合。立即抽取150微升，并开始沿着一列试孔从上向下顺序稀释。在该列试孔的终点，该150微升被排除。对感兴趣的所有杀灭生物药剂重复这一程序。一排试孔未用杀灭生物药剂处理，以用作对照物。
随后用透明胶带密封该托盘，以防止蒸发，并在37℃，无搅动情况下，进行厌氧培养，直到对照试孔变黄为止。周期性地检查托盘的从红到黄的颜色变化。氯酚红在pH值6.8时为纯红，在pH值5.1时为纯黄。借助存在于样本中的厌氧细菌种群的发酵副产物(bi-product)，实现pH值的降低。如果不存在杀灭生物药剂，可在1-24小时内发生颜色变化，取决于样本中厌氧种群的类型。如果杀灭生物药剂可有效抑制或杀死这些细菌，则不会观察到颜色变化。在所有对照试孔已变黄后，读出最小抑制浓度。以在该浓度下，试孔下部变黄的浓度的形式读出MIC。这表示在该特定点，没有加入能够产生效果的足量杀灭生物药剂。这样，可以就杀灭生物药剂处理的效用进行定量测定。
为了确保颜色变化是由于实际的pH变化造成的，而是不由于其它外部影响因素造成的，使用AnnaTox方法安排实验；并在读出MIC之后，测量pH。结果显示平均来说，MIC读数对应于浓度之间pH方面的显著下降。结果参见表Ⅸ。
为了确定pH变化是由微生物生长造成的，而不是由吸入的CO2或者其它影响因素造成的，在进行化验之前，在121℃下对该配料高压灭菌30分钟。代替使用透明胶带密封试孔来防止蒸发，在每个试孔中可使用几滴石蜡来密封试孔。同时对未高压灭菌的配料进行测试。石蜡也被用于密封这些试孔。在未高压灭菌的样本中，就杀灭生物药剂功效而论，MIC显示出正常变化。在21小时内，对于消毒配料进行的化验没有显示出颜色变化。此时，终止该测试。
该测试程序还可用于定量确定加入杀灭生物药剂之后，有多少微生物是能活的。从每个样本孔获取等分试样，并利用标准的平皿培养法来确定细菌计数。
重要的是注意在厌氧条件下进行测试。所指的微生物生长包括专性厌氧性生物和兼性厌氧性生物。专性厌氧性生物是不能利用氧的那些微生物，而兼性厌氧性生物是可在有氧或无氧情况下生长的那些微生物。
可使用下述任意pH指示剂执行该程序：表Ⅱ
商品名               化学名称                            供应商
溴甲酚紫         5，5-二溴-邻甲酚磺酞                        Baker
溴甲酚绿         4，4-(2，2-二环氧-3H-1，2苯并xathiol-3-     EMylidene)双[2，6-二溴-3-甲基-一钠盐]         Science
溴百里酚蓝       3，3-二溴百里酚蓝                           Baker
氯酚             4，4-(1，1-二环氧-3H-2，1-benzoxathiol-3-   Acrosylidene)双[2-氯-9Cl]
亚甲基蓝氯化物吩噻嗪-5鎓，3，7-双(二甲基氨基)-氯化物(9Cl)EM Science
甲基红      (邻-[[对-(二甲基氨基)苯基]偶氮]苯甲酸        Baker
酚红         酚磺酞，钠盐                                Baker
使用不同的指示剂的好处是不必较大地调节被测试样本的pH值，而是可考虑到要测试的特定***的固有pH值，选择样本pH值。
利用上面描述的实验程序为得自于东南(Southeastern)制浆和造纸厂的原料测定表Ⅲ中的MIC。
表Ⅲ
杀灭生物药剂    MIC(ppm)
A1                1000
B2                  8
C3                  8
D4                  8
E5                  32
F6                  8
G7                  16
1=四氢-3，5-二甲基-2H-1，3，5-噻二嗪-2-硫酮，可从Buckman购得。
2=二甲基二硫代氨基甲酸钠和乙烯基双-二硫代氨基甲酸二钠，可从Alco Chemical购得。
3=1，3 pentandial(戊二醛)，可从Union Carbide购得。
4=1，3 pentandial和N-烷基二甲基苯甲基氯化铵，可从UnionCarbide购得。
5=1-烷基(C8-C18)3-氨基-3-氨基丙烷一乙酸盐和二(三氯甲基)砜，可从Akzo购得。
6=5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和甲基-4-异噻唑啉-3-酮，可从Rohm＆Haas购得。
7=N-烷基二甲基苯甲基氯化铵和N-二烷基甲基苯氯化铵，可从Mason购得。
实施例2
使用实施例1中描述的程序，测试来自不同的东南(Southeastern)制浆和造纸厂的原料，获得表Ⅳ的结果。表Ⅳ
杀灭生物药剂    MIC(ppm)
A1               1000
B2                 8
C3                 32
D4                 64
E5                 125
F6                 32
G7                 125
1=四氢-3，5-二甲基-2H-1，3，5-噻二嗪-2-硫酮，可从Buckman购得。
2=二甲基二硫代氨基甲酸钠和乙烯基双-二硫代氨基甲酸二钠，可从Alco Chemical购得。
3=1，3 pentandial(戊二醛)，可从Union Carbide购得。
4=1，3 pentandial和N-烷基二甲基苯甲基氯化铵，可从UnionCarbide购得。
5=1-烷基(C8-C18)3-氨基-3-氨基丙烷一乙酸盐和二(三氯甲基)砜，可从Akzo购得。
6=5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和甲基-4-异噻唑啉-3-酮，可从Rohm＆Haas购得。
7=N-烷基二甲基苯甲基氯化铵和N-二烷基甲基苯氯化铵，可从Mason购得。
实施例3
使用实施例1中描述的实验程序，测试来自另一东南(Southeastern)制浆和造纸厂的不同原料，获得表Ⅴ的结果。
表Ⅴ
杀灭生物药剂    MIC(ppm)
A1              1000
B2                8
C3                8
D4                8
H8                16
E5                8
F6                8
G7                8
1=四氢-3，5-二甲基-2H-1，3，5-噻二嗪-2-硫酮，可从Buckman购得。
2=二甲基二硫代氨基甲酸钠和乙烯基双-二硫代氨基甲酸二钠，可从Alco Chemical购得。
3=1，3 pentandial(戊二醛)，可从Union Carbide购得。
4=1，3 pentandial和N-烷基二甲基苯甲基氯化铵，可从UnionCarbide购得。
5=1-烷基(C8-C18)3-氨基-3-氨基丙烷一乙酸盐和二(三氯甲基)砜，可从Akzo购得。
6=5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和甲基-4-异噻唑啉-3-酮，可从Rohm＆Haas购得。
7=N-烷基二甲基苯甲基氯化铵和N-二烷基甲基苯氯化铵，可从Mason购得。
8=2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇(溴硝丙二醇)，可从Angus购得。
实施例4
使用实施例1中描述的程序测试另一东南(Southeastern)制浆和造纸厂原料，获得表Ⅵ的结果。
表Ⅵ
杀灭生物药剂    MIC(ppm)
A1              1000
B2               16
C3               8
D4               8
H8               32
F5               32
G6               32
1=四氢-3，5-二甲基-2H-1，3，5-噻二嗪-2-硫酮，可从Buckman购得。
2=二甲基二硫代氨基甲酸钠和乙烯基双-二硫代氨基甲酸二钠，可从Alco Chemical购得。
3=1，3 pentandial(戊二醛)，可从Union Carbide购得。
4=1，3 pentandial和N-烷基二甲基苯甲基氯化铵，可从UnionCarbide购得。
5=5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和甲基-4-异噻唑啉-3-酮，可从Akzo购得。
6=N-烷基二甲基苯甲基氯化铵和N-二烷基甲基苯氯化铵，可从Rohm＆Haas购得。
8=2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇(溴硝丙二醇)，可从Angus购得。
实施例5
使用实施例1中描述的程序测试另一东南(Southeastern)制浆和造纸厂原料，获得表Ⅶ的结果。
表Ⅶ
杀灭生物药剂    MIC(ppm)
B2                 64
C3                 32
H8                 32
E5                 64
G7                 64
2=二甲基二硫代氨基甲酸钠和乙烯基双-二硫代氨基甲酸二钠，可从Alco Chemical购得。
3=1，3 pentandial(戊二醛)，可从Union Carbide购得。
5=1-烷基(C8-C18)3-氨基-3-氨基丙烷一乙酸盐和二(三氯甲基)砜，可从Akzo购得。
7=N-烷基二甲基苯甲基氯化铵和N-二烷基甲基苯氯化铵，可从Mason购得。
8=2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇(溴硝丙二醇)，可从Angus购得。
实施例6
使用实施例1中描述的程序测试另一东南(Southeastern)制浆和造纸厂原料，获得表Ⅷ的结果。
表Ⅷ
杀灭生物药剂    MIC(ppm)
A1               1000
B2                16
I9                250
J10               250
G7                64
1=四氢-3，5-二甲基-2H-1，3，5-噻二嗪-2-硫酮，可从Buckman购得。
2=二甲基二硫代氨基甲酸钠和乙烯基双-二硫代氨基甲酸二钠，可从Alco Chemical购得。
7=N-烷基二甲基苯甲基氯化铵和N-二烷基甲基苯氯化铵，可从Mason购得。
9=亚甲基双(硫氰酸盐)，可从Rohm和Haas购得。
10=1-(3-氯稀丙基)-3，5，7-三氮杂-1-氮鎓金刚烷，可从Michigan，Midland的Dow Chemical公司购得。
实施例7
表Ⅸ举例说明了随着以不同的浓度把杀灭生物药剂加入该***中，pH发生变化。在所有情况下，用粗体字表示pH转效点。对于没有加入杀灭生物药剂的情况(H)，***中不会产生明显的pH变化。在本发明的方法中，指示剂染料跟踪的正是这种pH变化。
表Ⅸ
    随着杀灭生物药剂的加入的pH变化
  浓度(ppm)   A1   B2   C3   D4   E5   F6   G7   H8
  1000  4.66  6.95  6.34  6.59  7.08  6.87  6.87  5.19
   500  4.71  6.89  6.70  6.70  6.82  6.94  6.92  4.76
   250  5.20  7.01  6.76  6.80  6.82  6.99  6.85  4.72
   125  4.67  7.21  6.80  6.80  6.93  6.95  6.85  4.92
    64  4.86  6.97  6.70  6.70  7.06  5.61  6.12  --
    32  4.79  5.95  6.61  6.60  6.50  4.87  5.79  --
    16  4.67  5.91  5.76  5.33  4.56  4.88  4.62  --
    8  4.87  4.48  5.64  5.52  4.47  4.82  4.83
初始pH 7.21  6.95  6.95  6.89  7.20  7.16  6.81  6.97
1=四氢-3，5-二甲基-2H-1，3，5-噻二嗪-2-硫酮，可从Buckman购得。
2=二甲基二硫代氨基甲酸钠和乙烯基双-二硫代氨基甲酸二钠，可从Alco Chemical购得。
3=1，3 pentandial(戊二醛)，可从Union Carbide购得。
4=N-烷基二甲基苯甲基氯化铵和N-二烷基甲基苯甲基氯化铵，可从Mason购得。
5=2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇(溴硝丙二醇)，可从Angus购得。
6=5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和甲基-4-异噻唑啉-3-酮，可从Rohm＆Haas购得。
7=N-烷基二甲基苯甲基氯化铵和N-二烷基甲基苯氯化铵(可从Mason购得)和1，3 pentandial(戊二醛)(可从Union Carbide购得)的混合物。
8=对照物，没有加入杀灭生物药剂。
在不脱离权利要求中限定的本发明的原理和范围的情况下，可改变这里描述的本发明方法的组成、操作及安排。

Claims (9)

1．一种确定厌氧性生物污染的水相***中抗微生物剂的最小抑制浓度的方法，包括下述步骤：
a)获得所述被污染水相***的样本；
b)向所述样本中加入与因所述厌氧性生物的碳水化合物代谢物引起的环境变化而发生反应的pH指示剂染料；
c)把培养基加入所述样本中，形成染料处理的营养水相***；
d)获取染料处理的营养水相***的等分试样；
e)多次顺序稀释要测试的抗微生物剂，并形成染料处理的营养水相***的所述等分试样与各个所述顺序稀释的抗微生物剂溶液的混合物；
f)在基本等于被污染水相***的温度下，厌氧保温培养所述混合物，保温培养时间应足以借助染料与由碳水化合物代谢物引起的所述环境变化的反应，产生染料颜色的变化；
g)通过观察颜色的变化，确定抑制所述被污染水相***中所含的厌氧性生物的最小抗微生物剂抑制浓度。
2．按照权利要求1所述的方法，其中所述厌氧性微生物污染的水相***选自制浆和造纸生产用水，造纸厂配料用水，造纸厂白水，棕色的原料用水(stock water)，造纸厂污水，开路循环冷却水，闭路循环冷却水，锅炉给水，糖厂生产用水，化学加工液流，发酵液流食品生产用水及石油和精炼厂生产用水和污水。
3．按照权利要求1所述的方法，其中所述培养基选自混合奶油，酵母提取物，葡萄糖，蔗糖，果糖，甘油，浓缩牛肉汁，蛋白胨，胰化蛋白胨，牛奶及它们的混合物。
4．按照权利要求1所述的方法，其中进行所述顺序稀释，以便在染料及培养基处理后的水相***的总体积基础上，顺序稀释的所述抗微生物剂的最终浓度约为0.1ppm～10，000ppm。
5．按照权利要求1所述的方法，其中所述pH指示剂染料选自溴甲酚紫，溴甲酚绿，溴甲酚蓝，氯酚红，亚甲基蓝氯化物，甲基红和酚红。
6．按照权利要求1所述的方法，其中在微量滴定培养皿上对顺序稀释的所述染料处理的营养水相***进行保温培养，该微量滴定培养皿含有至少四列样本孔，每列具有至少八个样本孔，保温培养的温度约为25～60℃，时间约为60分钟～24小时。
7．按照权利要求6所述的方法，其中在保温培养过程中，在被处理的滴定培养皿上方保持主要含有惰性气体的气氛。
8．按照权利要求7所述的方法，其中惰性气体选自CO2和N2。
9．按照权利要求1所述的方法，其中步骤b)被延迟30分钟～20小时。
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