CN108026562A - 富集和检测靶微生物的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种检测靶细菌的方法。该方法包括形成初次富集培养物，该初次富集培养物包含测试样品、初次富集介质和氧化还原染料；将初次富集培养物温育等于八小时或更短的第一时间段；在第一时间段期间评估初次富集培养物以检测氧化还原染料是否从第一状态变化至第二状态；如果在第一时间段期间在初次富集培养物中检测到第二状态，则将初次富集培养物的一部分与二次富集介质混合以形成二次富集培养物，并且将二次富集培养物温育第二时间段；以及使用第二富集培养物的一部分进行测试以检测靶细菌。

Description

富集和检测靶微生物的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求提交于2015年9月3日的美国临时专利申请62/213,885的优先权，该临时专利申请的公开内容全文以引用方式并入本文。
背景技术
食源性疾病是一个重大的公共卫生问题。病原性微生物，诸如沙门氏菌(Salmonella)属和弯曲杆菌(Campylobacter)属的物种，是大部分食源性疾病的原因。人类中沙门氏菌感染的最常见来源是受污染的食品，包括鸡蛋、家禽、农产品、肉类和肉制品。由于禽类流行病，鸡蛋和家禽肉被认为是人类感染的主要媒介。
含有相对较低数目的病原性微生物的材料(例如，食品)常常还含有非病原性微生物。因此，待进行病原性微生物测试的材料样品常常经受选择性富集培养技术，以便增加病原性微生物的相对数目。已知许多选择剂，当将其掺入生物生长介质中时允许特定生物体，特别是特定细菌的优先生长(即选择)。
作为诊断感染性疾病的辅助手段，使用各种染料物质或盐来选择存在于从人类或动物受试者获得的样品中的混合细菌群体中的特定生物体(例如病原体)。然而，已知一些选择剂抑制健康细胞的生长并限制损伤细胞的恢复。这是一个严重的缺点，因为在许多实际应用中，期望恢复由于暴露于亚最佳条件(温度、pH值等)而受损伤或“应激”的生物体(例如当试图恢复食品样品中的病原体时)。
存在对在样品分析的早期阶段、优选地在分析的选择性富集阶段鉴定推定的阳性沙门氏菌样品的简单、快速筛选测试的需要。使用单一测试方法同时富集和检测沙门氏菌不仅会减少时间，还会减少劳动力和介质的成本。精简化程序以及减少劳动力和测试成本应当允许更频繁地监测沙门氏菌，从而减少污染危害。
发明内容
某些微菌(例如，“靶”细菌诸如病原性细菌)在相对少量地存在于食品或饮料中时，可引起食源性疾病或可以倍增达到可导致食源性疾病的浓度。因此，希望有检测样品中非常少量的微生物的方法。分子检测方法提供了检测相对少量的微生物的能力，但是它们仍然需要阈值浓度的微生物以提供可靠的检测。例如，DNA扩增方法通常需要大于或等于103个细菌/毫升样品来实现可靠的检测并且免疫学测定通常需要大于或等于105个细菌/毫升样品来实现可靠的检测。因此，为了检测样品(例如，食品或饮料样品)中低于这些阈值水平的细菌的浓度，许多方法利用富集培养技术以增加样品中靶细菌的数量。
富集培养技术常常采用选择剂(例如，盐、抗生素)，靶微生物通常对这些选择剂的效应是抗性的。然而，当靶微生物处于应激或损伤状态(例如，由于热应激、水应激或pH应激)时，某些原本对某些选择剂具有抗性的靶微生物可能被选择剂抑制或杀死。因此，可能有利的是，在初次富集过程期间使用非选择性介质或较低选择性介质以使应激微生物恢复。然而，使用较低选择性培养基可允许非靶微生物与靶微生物竞争生长限制性营养物质(例如，碳源、氮源、能源和/或氧气)。因此，当靶微生物数目上被样品中的非靶微生物超过和/或非靶微生物能够比靶微生物生长更快时，已知现在应当在非靶微生物数目上极大地超过靶微生物之前将样品从较低选择性初次富集介质转移至较大选择性二次富集介质。本公开提供了一种简单的方法来减轻样品中具有大量的非靶微生物对检测样品中的相对低数目的靶微生物的可能负面影响。
在一个方面，本公开提供了检测属于沙门氏菌属的细菌的第一方法。该方法可以包括将第一体积的测试样品与第二体积的初次富集介质混合以形成初次富集培养物，其中初次富集培养物包含氧化还原染料；将初次富集培养物温育等于八小时或更短的第一时间段；在第一时间段期间评估初次富集培养物以检测氧化还原染料是否从第一状态变化至第二状态；如果在第一时间段期间在初次富集培养物中检测到第二状态，则将初次富集培养物的第一部分与二次富集介质混合以形成二次富集培养物，并且将二次富集培养物温育第二时间段；以及使用第二富集培养物的第二部分进行测试以检测沙门氏菌属的细菌。
在另一个方面，本公开提供了检测属于沙门氏菌属的细菌的第二方法。该方法可以包括将第一体积的测试样品与第二体积的初次富集介质混合以形成初次富集培养物，其中初次富集培养物包含氧化还原染料；将初次富集培养物温育等于八小时或更短的第一时间段；在第一时间段期间评估初次富集培养物以检测氧化还原染料是否从第一状态变化至第二状态；如果在第一时间段期间在初次富集培养物中未检测到第二状态，则将初次富集培养物温育第三时间段；以及使用第一富集培养物的第三部分进行测试以检测沙门氏菌属的细菌。
在第一方法或第二方法的任一上述实施方案中，进行测试以检测沙门氏菌属的细菌可包括进行选自以下的测试：检测测试、用于检测与沙门氏菌属的细菌相关联的抗原的免疫学测试、用于检测与沙门氏菌属的细菌相关联的核酸序列的基因测试以及任何两种或更多种前述测试的组合。
在另一方面，本公开提供了检测靶微生物的第三方法。该方法可以包括将第一体积的测试样品与第二体积的初次富集介质混合以形成初次富集培养物，其中初次富集培养物包含氧化还原染料；将初次富集培养物温育等于八小时或更短的第一时间段；在第一时间段期间评估初次富集培养物以检测氧化还原染料是否从第一状态变化至第二状态；如果在第一时间段期间在初次富集培养物中检测到第二状态，则将初次富集培养物的第一部分与二次富集介质混合以形成二次富集培养物，并且将二次富集培养物温育第二时间段；以及使用第二富集培养物的第二部分进行测试以检测靶细菌。
在这些方法的任一上述实施方案中，氧化还原染料可以选自亚甲基蓝、刃天青和四唑染料。在这些方法的任一上述实施方案中，初次富集介质可被预热。在这些方法的任一上述实施方案中，第一状态可以是第一颜色并且第二状态可以是第二颜色，所述第二颜色与第一颜色在可测量的程度上不同。
在这些方法的任一上述实施方案中，将初次富集培养物温育等于八小时或更短的第一时间段可以包括将初次富集培养物温育等于六小时或更短的第一时间段。在这些方法的任一上述实施方案中，在第一时间段期间评估初次富集培养物可以包括在第一时间点评估初次富集培养物，并且在第一时间点之后的第二时间点评估初次富集培养物。
在第三方法或第四方法的任一上述实施方案中，进行测试以检测靶细菌可包括进行选自以下的测试：检测测试、用于检测与靶细菌相关联的抗原的免疫学测试、用于检测与靶细菌相关联的核酸序列的基因测试以及任何两种或更多种前述测试的组合。
词语“优选的”和“优选地”指在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其它情况下，其它实施例也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案是不可用的，且并非旨在将其他实施方案排除在本发明范围之外。
术语“包括/包含”及其变型形式在说明书和权利要求中出现这些术语的地方不具有限制的含义。
如本文所用，“一个”、“一种”、“所述(该)”、“至少一个(种)”以及“一个(种)或多个(种)”可互换使用。因此，举例来说，一种营养素可被理解为“一种或多种”营养素。
术语“和/或”意指所列要素的一个或全部，或者所列要素的任意两个或更多个的组合。
另外，在本文中，通过端点表述的数值范围包括该范围内所含的所有数值(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
如本文所用，术语“微生物”或“微菌”是指任何微观生物体，其可为单细胞或多细胞生物体。该术语通常用于指能够在合适的培养基中生长和繁殖的任何原核或真核微观生物体，包括但不限于细菌中的一种或多种。由本发明的范围涵盖的微生物包括原核生物，即细菌和古细菌；以及各种形式的真核生物，包括原生动物、真菌、酵母(例如，厌氧酵母)、藻类等。术语“靶微生物”是指期望被检测到的任何微生物。
如本文所用，术语微生物的“培养”或“生长”是指通过使微生物体在预先确定的培养基中在对于其生长有益的条件下繁殖来使其倍增的方法。更具体地，其为提供合适的培养基和条件以有利于微生物的至少一个细胞***的方法。培养基是包含微生物生长所需的所有营养物和必需物理生长参数的固体、半固体或液体介质。
如本文所用，术语“富集”是指通过以下方式选择性地富集特定微生物的生长的培养方法：提供具有有利于该特定微生物的生长的特定的和已知属性的介质和条件。富集培养的环境将积极地影响所选微生物的生长，和/或消极地影响其它微生物的生长。
本发明的上述发明内容并非意图描述本发明的每个公开的实施方案或每种实施方式。以下描述更为具体地举例说明了示例性实施方案。在本申请的全文的若干处，通过示例列表提供了指导，这些示例可以各种组合使用。在每种情况下，引用的列表仅用作代表性的组，而不应被理解为排他性列表。
下面将结合附图和描述介绍上述及其它实施方案的更多细节。通过具体实施方式、附图和权利要求书，其它特征、目的和优点将变得显而易见。
附图说明
图1是示出了根据本公开的方法的一个实施方案的框图。
图2是示出了初次富集培养物中菌落形成单位(CFU)的初始浓度与使氧化还原染料从第一状态转变至第二状态所花费的时间量之间的关系的图。
具体实施方式
在详细解释本公开的任何实施方案之前，应当了解，本发明在其应用中不仅限于下文说明中所提及或下文附图中所示出的构造细节和部件布置方式。本发明能够具有其它的实施方案，并且能够以多种方式进行实践或实施。而且，应当理解，本文使用的措辞和术语是用于说明目的而不应视为限制性的。本文中“包括”、“包含”或“具有”以及其变型的使用意指涵盖其后所列举的项目及其等同形式以及额外的项目。除非另外说明或限定，否则术语“连接”和“耦接”及其变型以广义方式使用并且涵盖直接和间接连接和耦接。此外，“连接”和“耦接”不限于物理或机械连接或耦接。应当理解，可采用其它的实施方案，并且可以在不偏离本发明范围的情况下作出结构变化或逻辑变化。此外，例如“前”、“后”、“顶部”、“底部”等用语仅用于当元件彼此相关的时候描述元件，而决非意在陈述设备的具体取向，以指示或暗示设备的必要或所需取向，或指定在使用中将如何使用、安装、显示或定位本文所述发明。
本公开总体上涉及样品中靶微生物的检测。具体地，本公开涉及一种包括靶微生物的富集培养以使得相对少的数目(例如，≤100个微生物/毫升、≤10个微生物/毫升、≤1个微生物/毫升、≤0.1个微生物/毫升、≤0.01个微生物/毫升、<＝0.004个微生物/毫升(即，检出限为1个微生物/250mL)、<0.0003个微生物/毫升(即检出限为1个微生物/3500mL)可在还包含相对较高数量的非靶微生物的样品中(例如，每个靶微生物≥10个非靶微生物、每个靶微生物≥100个非靶微生物、每个靶微生物≥1000个非靶微生物、每个靶微生物≥10000个非靶微生物、每个靶微生物≥107个非靶微生物)检测到的方法。
本公开的方法采用，使用早期检测初次富集介质中的相对大浓度的生长微生物(即，靶生长微生物和非靶生长微生物)，以确定是否应使用较高选择性二次富集介质以有利于靶微生物的生长和检测。
在一个方面，本公开提供了一种方法。该方法可用于检测样品中的靶微生物，诸如细菌、酵母或霉菌，该样品含有至少一种可与靶微生物竞争液体培养基中的生长限制性营养物质的非靶微生物，该液体培养基用于培养以检测样品中相对低量的靶微生物。靶微生物可以是特别关注的微生物，诸如例如可能存在于样品中并且可能指示与获得样品的材料或环境相关联的感染或中毒风险的病原性细菌。可根据本公开的方法测试的材料包括例如用于制造食品或饮料产品的原材料、食品或饮料生产中的在制品(包括生产用水等)、来自食品或饮料生产的成品，或者从食品或饮料生产或储存设施采集的环境样品。
特别关注的微生物包括原核生物和真核生物，具体地是***、革兰氏阴性细菌、丝状真菌以及酵母。示例性靶微生物包括但不限于以下项的成员：肠杆菌科或微球菌科或葡萄球菌属、链球菌属、假单胞菌属、肠球菌属、沙门氏菌属、军团杆菌属、志贺菌属、耶尔森氏菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、芽孢杆菌属、李斯特菌属、弧菌属、棒状杆菌属以及曲霉属、镰刀菌属、克罗诺杆菌属(Cronobacter spp)以及念珠菌属。特别毒性的生物体包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、粪肠球菌、炭疽杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、黑曲霉、烟曲霉、棒曲霉、腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)、尖孢镰刀菌、厚孢镰刀菌、单核细胞增多性李斯特菌、依氏利斯特菌(Listeriaivanovii)、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、猪霍乱沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、克鲁斯念珠菌(C.krusei)、阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)以及大肠杆菌O157。
在任何实施方案中，可以使用该方法来检测样品中的靶微生物(例如，如靶细菌诸如沙门氏细菌的细菌)。图1显示了根据本公开的检测靶细菌的方法1000的一个实施方案的框图。该方法1000包括步骤100：将第一体积的测试样品与第二体积的初次富集介质混合以形成初次富集培养物。初次富集培养物包含氧化还原染料。氧化还原染料可以是适于在液体培养基中提供微生物代谢活性的可检测(例如在视觉上可检测)指示的任何氧化还原染料。提供微生物活性的在视觉上可检测的指示的氧化还原染料是本领域已知的，并且包括但不限于亚甲蓝、刃天青和四唑染料。合适的四唑染料的非限制性示例是氯化三苯基四唑(“TTC”)。
在任一实施方案中，初次富集介质被选择以提供促进靶微生物生长的营养环境。初次富集介质可以具有某种程度的选择性(例如通过其组成和/或pH)，由此使得相对于可能存在于测试样品中的至少一种其它微生物，该初次富集介质有利于靶微生物的生长。优选地，初次富集介质促进所有靶微生物(包括应激或损伤的靶微生物)的生长。初次富集介质的选择根据待检测的靶微生物进行。用于检测沙门氏菌微生物的合适初次富集介质的非限制性示例是缓冲蛋白胨水。用于细菌(包括沙门氏菌)的生长和检测的合适初次富集介质的其它非限制性示例包括脑心浸液肉汤、脱脂奶粉、乳糖肉汤、缓冲蛋白胨水(ISO)、改良胰蛋白胨大豆肉汤以及通用的预富集肉汤。
初次富集介质可以被提供为干燥粉末、团聚粉末或液体介质。任选地，液体初次富集介质可以是被第一体积的测试样品稀释至工作浓度的浓缩介质。在任一实施方案中，测试样品可以包含初次富集介质的组分(例如营养物质、选择剂诸如盐或抗生素)。
在任一实施方案中，在将测试样品与初次富集介质混合之前，初次富集介质可以任选地被预热。例如，当靶微生物是沙门氏菌微生物时，可将初次富集介质预热至约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃或约43℃的温度。在任一实施方案中，初次富集介质可以预热至包括端值在内的在35℃和43℃之间的温度。在任一实施方案中，初次富集介质可被预热至高于43℃的温度，前提条件是混合步骤不使样品中的靶微生物暴露于致死靶微生物(例如沙门氏菌微生物)的温度环境中。有利地，预热初次富集介质减少了将测试样品的温度调节至温育初次富集培养物所需的温度所花费的时间。
在任一实施方案中，将第一体积的测试样品与第二体积的初次富集介质混合包括使基本上相等的第一体积和第二体积接触。另选地，将第一体积的测试样品与第二体积的初次富集介质混合包括使不相等的第一体积和第二体积混合。例如，第一体积可以小于第二体积，或者第一体积可以大于第二体积。在任一实施方案中，第一体积对第二体积的比率可以小于或等于10:1、小于或等于5:1、小于或等于3:1、小于或等于2:1或者小于或等于1:1。当第一体积对第二体积的比率大于1:1时，任选地，初次富集介质可以提供为浓缩物，该浓缩物当与预定义的第一体积的测试样品混合时稀释至适当的工作浓度。
重新参考图1，方法1000还包括步骤110：将初次富集培养物温育等于八小时或更短的第一时间段。温育初次富集培养物包括将初次富集培养物保持在有利于靶微生物生长的温度下。特定初次富集介质中特定靶微生物的优选温育温度是本领域普通技术人员熟知的。例如，为了检测沙门氏菌微生物，初次富集介质可以是缓冲蛋白胨水，并且第一时间段使用的温育温度可以是包括端值在内的约35℃至约43℃(例如，约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约42.5℃或约43℃)。
第一时间段是适于确定测试样品是否具有大量非靶微生物以致它们(非靶微生物)可能在初次富集培养物中干扰靶微生物的生长的时间量。现在知道，如果存在这种情况(即测试样品中存在大量非靶微生物)，则应当将初次富集培养物的至少一部分与较高选择性二次富集介质混合以便抑制至少一些非靶微生物的生长，从而允许如本文所述的靶微生物的生长和检测。
第一时间段可以根据本领域普通技术人员已知的若干个因素来选择。这些因素包括例如初次富集介质的组成(例如，营养物质、选择剂、pH)、温育温度、微生物(包括非靶微生物)在特定初次营养介质中在特定温育温度下的典型倍增时间以及测试样品中具有应激微生物的可能性。在任一实施方案中，第一时间段可为约12小时或更短；优选地，约10小时或更短；并且更优选地，约8小时或更短。在任一实施方案，包括用于检测沙门氏菌的方法的实施方案中，第一时间段小于或等于8小时、小于或等于7小时、小于或等于6小时、小于或等于5小时、小于或等于4小时、小于或等于3小时、小于或等于2小时、小于或等于1小时、或者小于或等于0.5小时。
在任一实施方案中，将初次富集培养物温育第一时间段任选地包括在搅拌下温育初次富集培养物。在搅拌下温育可有利于培养基的通气，这可另外有利于靶微生物的生长。此外，培养基的通气还可以向靶微生物提供相对于存在于测试样品中的非靶微生物的选择性生长优势。
重新参考图1，该方法1000还包括步骤120：在第一时间段期间评估初次富集培养物以检测氧化还原染料是否从第一状态变化至第二状态。例如，可以通过在视觉上观察介质以检测与氧化还原指示剂相关联的颜色来评估初次富集培养物。
在本公开的方法的任一实施方案中，氧化还原染料具有第一状态(例如，氧化态)和第二状态(例如，还原态)。在其第一状态下，氧化还原染料或其衍生物具有第一种颜色；并且在其第二状态下，氧化还原染料或其衍生物第二状态具有第二颜色，所述第二颜色与第一颜色在可测量的程度上不同(例如，通过光学技术)。第一颜色和第二颜色之间的在可测量的程度上的差异可以涉及强度和/或波长。此外，对于某些氧化还原染料，第一状态可以比第二状态具有显著更深的颜色(例如具有更大的光密度)，或者第一状态可以比第二状态具有显著更浅的颜色(例如具有更小的光密度)。在一些实施方案中，“显著更浅的颜色”是指氧化还原染料在视觉上是无色的。
例如，氧化还原指示剂(例如，亚甲蓝)当其以第一状态(例如，氧化态)存在于水性液体中时具有在视觉上可检测的蓝色，并且当其以第二状态(例如还原态)存在于水性液体中时是无色的。当氧化亚甲蓝存在于微生物培养基中时，培养基的天然颜色被氧化亚甲蓝的蓝色着色(例如蓝色或蓝绿色)。多种微生物能够在正常代谢培养基中的营养物质期间将亚甲蓝从第一状态还原至第二状态(其在视觉上是无色的)，从而消除培养基的蓝色色调(即，培养基恢复到接近其天然颜色的颜色，就好像含有低浓度的氧化形式的亚甲蓝那样)。
另选地，氧化还原指示剂(例如，TTC)在其第一状态(氧化态)下是基本上无色的，并且当TTC被微生物活性还原并且还原形式的TTC自发地聚合产生甲瓒(formazan)时使得含有TTC的富集物从其天然颜色(例如，稻草色)变化至包括在视觉上可检测的红色色调的颜色。
虽然使用在大量细菌存在下形成在视觉上可检测的变化的氧化还原指示剂是检测氧化还原染料的变化的简单方式，但是在任一实施方案中，检测氧化还原指示剂的变化可以另选地使用仪器(例如分光光度计、荧光计)测量初次富集培养物的液体介质的光吸收度、反射度或发射度来进行。
根据本公开在第一时间段期间评估初次富集培养物以检测氧化还原染料是否从第一状态变化至第二状态通常包括将初次富集培养物中氧化还原染料的瞬时状态与参考进行比较以便确定氧化还原染料是否已从第一状态变化至第二状态(或所述变化达到何种程度)。例如，参考可以包括不含测试样品而其它相同的组合物(即，参考含有初次富集介质、氧化还原染料以及等同于初次富集培养物中的第一体积的测试样品的一定体积的合适无菌稀释剂。另选地，参考可以是在“T＝0”(即在形成包含富集介质、测试样品和氧化还原染料的混合物的时刻)处获取的富集培养物的光学图像或读数，或者参考可以是印刷卡，该印刷卡具有被选择以匹配包含测试样品、初次富集介质和氧化还原染料的混合物的颜色的印刷色。
初次富集培养物可在第一时间段期间的任何时间处进行评估，该任何时间包括“T＝0”时间(例如，紧接着测试样品、初次富集介质和氧化还原染料混合之后)，或在第一时间段结束时(例如，在测试样品、初次富集介质和氧化还原染料混合后6小时)。
在根据本公开的方法的任一实施方案中，在第一时间段期间评估初次富集培养物包括在第一时间点评估初次富集培养物，并且在第一时间点之后的第二时间点评估初次富集培养物。例如，第一时间点可以是T＝0时间，并且第二时间点可以是第一时间段期间的任何其它时间点，直到并包括第一时间段结束。有利地，在第一时间段期间的多个时间点评估初次富集培养物允许操作者在可以小于第一时间段的终点的时间处观察氧化还原染料的可检测变化。如果可检测变化发生在第一时间段的结束点处或之前，则操作者可以根据本公开的方法对观察结果进行操作。
重新参考图1，方法1000中的下一个步骤取决于在第一时间段期间是否检测到氧化还原指示剂从第一状态转变至第二状态。如果在第一时间段内检测到氧化还原染料的转变，则该方法包括步骤210：将初次富集培养物的第一部分与二次富集介质混合以形成二次富集培养物，并且将二次富集培养物温育第二时间段。初次富集培养物的第一部分可以是初次富集培养物的整个体积的任何部分(高达100％)。本领域普通技术人员将认识到，存在于第一部分中的测试样品的量将直接影响该方法的整体灵敏度(即检测限)。例如，如果初次富集培养物包含10mL测试样品并且第一部分由10％的初次富集培养物组成，则该方法的总体灵敏度是约1个靶微生物/毫升测试样品。
将初次富集培养物的第一部分与二次富集介质混合通常包括将第一部分与比初次富集介质对靶微生物选择性更大的二次富集介质混合。也就是说，二次富集介质包含相比于初次富集介质更严格地相对于靶微生物抑制非靶微生物生长的营养物质和/或选择剂(例如，盐、脂肪酸、氢离子浓度、抗生素或它们的组合)。二次富集介质可以被提供为干燥粉末或团聚粉末或液体介质。任选地，液体二次富集介质可以是被初次富集培养物的第一部分稀释至工作浓度的浓缩介质。在任一实施方案中，二次富集介质任选地可以比初次富集介质对靶微生物选择性更大(即，二次富集介质有利于-比初次富集介质的程度更大-靶微生物的生长超过至少一种非靶微生物)。
在形成二次富集培养物之后，该方法还包括步骤220：将二次富集培养物温育第二时间段。温育二次富集培养物包括将二次富集培养物保持在有利于靶微生物生长的温度下。特定二次富集介质中特定靶微生物的优选温育温度是本领域普通技术人员熟知的。例如，为了检测沙门氏菌微生物，二次富集介质可以是Rappaport-Vassiliadis肉汤、Rappaport-Vassiliadis大豆蛋白胨肉汤、Rappaport-Vassiliadis R10肉汤、***盐-胱氨酸肉汤、连四硫酸盐肉汤(“TT肉汤”)、Muller-Kaufmann连四硫酸盐肉汤或TT肉汤(Hanja)并且第二时间段使用的温育温度可以是包括端值在内的约35℃至约43℃(例如，约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约42.5℃或约43℃)。
第二时间段是适合允许存在于初次富集培养物中的任何靶微生物进行至少一次细胞***并且优选多次细胞***的时间量。
第二时间段可以根据本领域普通技术人员已知的若干个因素来选择。这些因素包括例如二次富集介质的组成(例如，营养物质、选择剂、pH)、温育温度以及微生物(特别是靶微生物)在特定二次营养介质中在特定温育温度下的典型倍增时间。在任一实施方案中，第二时间段可为约26小时或更短。在任一实施方案中，第二时间段可为约10-48小时、约12-26小时或约18-26小时。在任一实施方案，包括用于检测沙门氏菌微生物方法的实施方案中，第二段时间为约为10-48小时、约10-24小时或约10-18小时。
在任一实施方案中，将二次富集培养物温育第二时间段任选地包括在搅拌下温育二次富集培养物。在搅拌下温育可有利于培养基的通气，这可另外有利于靶微生物的生长。此外，培养基的通气还可以向靶微生物提供相对于存在于测试样品中的非靶微生物的选择性生长优势。
在将二次富集培养物温育第二时间段之后，该方法1000包括步骤230：使用二次富集培养物的第二部分进行测试以检测靶微生物。虽然第二部分可以是二次富集培养物的整个体积的任何部分(高达100％)，但是优选测试小于100％的部分。在任一实施方案中，第二部分可以显著小于100％(例如，小于或等于10％、小于或等于5％、小于或等于1％、小于或等于0.1％、小于大于或等于0.01％)。本领域普通技术人员将认识到，存在于第二部分中的测试样品的量将直接影响该方法的整体灵敏度(即检测限)。例如，如果初次富集培养物包含10mL测试样品，第一部分由10％的初次富集培养物组成并且第二部分由0.1％的二次富集培养物组成，则该方法的总体灵敏度是约1000个靶微生物/毫升测试样品。
可以使用本领域中已知与富集培养物相容使用的任何检测方法测试第二部分，以检测靶微生物。合适的检测测试可以包括附加的样品制备步骤(例如洗涤步骤、细胞浓缩步骤、细胞裂解步骤等)以便制备样品来检测靶微生物。检测靶微生物的合适测试包括但不限于用于检测与靶微生物相关联的预先确定的酶活性的测试、用于检测与靶微生物相关联的抗原的免疫学测试、用于检测与靶微生物相关联的核酸序列的基因测试、在半固体介质上或半固体介质中培养微生物以及任何两种或更多种前述测试的组合。在根据本公开的方法中用于检测靶微生物的优选检测测试包括明尼苏达州圣保罗(St.Paul,MN)的3M公司以商品名3MTM分子检测***销售的等温核酸检测技术。
如果在第一时间段期间没有检测到氧化还原染料的转变，则该方法1000包括步骤130：将初次富集培养物温育第三时间段。将初次富集培养物温育第三时间段包括将初次富集培养物保持在有利于靶微生物生长的温度下。第三时间段的温育温度可以与第一时间段期间使用的温育温度相同，或者其可以不同于第一时间段期间使用的温度。特定初次富集介质中特定靶微生物的优选温育温度是本领域普通技术人员熟知的。例如，为了检测沙门氏菌微生物，第三时间段使用的温育温度可以是包括端值在内的约35℃至约43℃(例如，约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约42.5℃或约43℃)。
第三时间段是适合允许存在于初次富集培养物中的任何靶微生物进行至少一次细胞***并且优选多次细胞***的时间量。
第三时间段可以根据本领域普通技术人员已知的若干个因素来选择。这些因素包括例如初次富集介质的组成(例如，营养物质、选择剂、pH)、温育温度以及微生物(特别是靶微生物)在特定初次富集介质中在特定温育温度下的典型倍增时间。在任一实施方案中，第三时间段可为约26小时或更短。在任一实施方案中，第三时间段可为约10-48小时、约12-26小时或约18-26小时。在任一实施方案，包括用于检测沙门氏菌微生物方法的实施方案中，第三段时间为约为10-48小时、约10-24小时或约10-18小时。
在任一实施方案中，将初次富集培养物温育第三时间段任选地包括在搅拌下温育初次富集培养物。在搅拌下温育可有利于培养基的通气，这可另外有利于靶微生物的生长。此外，培养基的通气还可以向靶微生物提供相对于存在于测试样品中的非靶微生物的选择性生长优势。
在将二次富集培养物温育第二时间段之后，该方法1000包括步骤140：使用第一富集培养物的第三部分进行测试以检测靶微生物。虽然第三部分可以是初次富集培养物的整个体积的任何部分(高达100％)，但是优选测试小于100％的部分。在任一实施方案中，第三部分可以显著小于100％(例如，小于或等于10％、小于或等于5％、小于或等于1％、小于或等于0.1％、小于大于或等于0.01％)。本领域普通技术人员将认识到，存在于第三部分中的测试样品的量将直接影响该方法的整体灵敏度(即检测限)。例如，如果初次富集培养物包含10mL测试样品并且第三部分由0.1％的初次富集培养物组成，则该方法的总体灵敏度是约100个靶微生物/毫升测试样品。
可以使用本领域中已知与富集培养物相容使用的任何检测方法测试第三部分，以检测靶微生物。合适的检测测试可以包括附加的样品制备步骤(例如洗涤步骤、细胞浓缩步骤、细胞裂解步骤等)以便制备样品来检测靶微生物。检测靶微生物的合适测试包括但不限于用于检测与靶微生物相关联的预先确定的酶活性的测试、用于检测与靶微生物相关联的抗原的免疫学测试、用于检测与靶微生物相关联的核酸序列的基因测试、在半固体介质上或半固体介质中培养细菌以及任何两种或更多种前述测试的组合。在根据本公开的方法中用于检测靶微生物的优选检测测试包括3M公司(明尼苏达州圣保罗)以商品名3MTM分子检测***销售的等温核酸检测技术。
在另一方面，本公开提供了一种在液体培养基中富集靶微生物的方法。当操作者怀疑靶微生物存在于材料(诸如例如本文所述的材料)中时，该方法是特别优选的。因此，该方法可用于从材料的测试样品富集靶微生物。
该方法包括将第一体积的测试样品与第二体积的初次富集介质混合以形成初次富集培养物，如本文所述。初次富集介质包含如本文所述的氧化还原染料。该方法还包括将初次富集培养物温育等于八小时或更短的第一时间段，以及在第一时间段期间评估初次富集培养物以检测氧化还原染料是否从第一状态变化至第二状态，各自如本文所述。
示例性实施方案
实施方案A是一种检测属于沙门氏菌属的细菌的方法，该方法包括：
将第一体积的测试样品与第二体积的初次富集介质混合以形成初次富集培养物；
其中该初次富集培养物包含氧化还原染料；
将该初次富集培养物温育等于八小时或更短的第一时间段；
在该第一时间段期间评估该初次富集培养物以检测该氧化还原染料是否从第一状态变化至第二状态；
如果在该第一时间段期间在该初次富集培养物中检测到该第二状态，则将该初次富集培养物的第一部分与二次富集介质混合以形成二次富集培养物，并且将该二次富集培养物温育第二时间段；以及
使用该第二富集培养物的第二部分进行测试以检测该沙门氏菌属的细菌。
实施方案B是一种检测属于沙门氏菌属的细菌的方法，该方法包括：
将第一体积的测试样品与第二体积的初次富集介质混合以形成初次富集培养物；
其中该初次富集培养物包含氧化还原染料；
将该初次富集培养物温育等于八小时或更短的第一时间段；
在该第一时间段期间评估该初次富集培养物以检测该氧化还原染料是否从第一状态变化至第二状态；
如果在该第一时间段期间在该初次富集培养物中未检测到该第二状态，则该方法还包括将该初次富集培养物温育第三时间段；以及
使用该初次富集培养物的第三部分进行测试以检测该沙门氏菌属的细菌。
实施方案C是根据实施方案A或实施方案B所述的方法，其中该氧化还原染料选自亚甲基蓝、刃天青和四唑染料。
实施方案D是根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中该第一体积对该第二体积的比率小于或等于10:1。
实施方案E是根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中该初次富集介质被预热。
实施方案F是根据实施方案E所述的方法，其中该初次富集介质被预热至包括端值在内的35-45°。
实施方案G是根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中将该初次富集培养物温育第一时间段包括将该初次富集培养物在包括端值在内的37℃-42℃下温育。
实施方案H是根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中将该二次富集培养物温育第二时间段包括将该二次富集培养物在包括端值在内的37℃-42℃下温育。
实施方案I是根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中将该初次富集培养物温育第三时间段包括将该初次富集培养物在包括端值在内的37℃-42℃下温育。
实施方案J是根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该第一状态具有第一颜色并且该第二状态具有第二颜色，所述第二颜色与第一颜色在可测量的程度上不同。
实施方案K是根据实施方案J所述的方法，其中该第一状态是无色状态并且该第二状态是有色状态。
实施方案L是根据实施方案J所述的方法，其中该第一状态是有色状态并且该第二状态是无色状态。
实施方案M是根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中该测试样品包含该初次富集介质的组分。
实施方案N是根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中该第一时间段等于或小于4小时。
实施方案O是根据实施方案N所述的方法，其中该第一时间段等于或小于2小时。
实施方案P是根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在该第一时间段期间评估该初次富集培养物包括在视觉上评估该初次富集培养物。
实施方案Q是根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在该第一时间段期间评估该初次富集培养物包括在第一时间点评估该初次富集培养物，并且在该第一时间点之后的第二时间点评估该初次富集培养物。
实施方案R是根据实施方案Q所述的方法，其中在该第一时间段期间评估该初次富集培养物包括在该第一时间点针对该氧化还原染料的该第一状态评估该初次富集培养物，并且在该第二时间点针对该氧化还原染料的该第二状态评估该初次富集培养物。
实施方案S是根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在该第一时间段期间评估该初次富集培养物包括使用仪器测量该初次富集培养物的光吸收度或反射度。
实施方案T是根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中该第二时间段为包括端值在内的约10小时至约48小时。
实施方案U是根据实施方案T所述的方法，其中该第二时间段为包括端值在内的约10小时至约26小时。
实施方案V是根据实施方案U所述的方法，其中该第二时间段为包括端值在内的约18小时至约26小时。
实施方案W是根据实施方案B至S中任一项所述的方法，其中该第三时间段为包括端值在内的约10小时至约48小时。
实施方案X是根据实施方案W所述的方法，其中该第三时间段为包括端值在内的约10小时至约18小时。
实施方案Y是根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中进行测试以检测该沙门氏菌属的细菌包括进行选自以下的测试：用于检测与该沙门氏菌属的细菌相关联的预先确定的酶活性的测试、用于检测与该沙门氏菌属的细菌相关联的抗原的免疫学测试、用于检测与该沙门氏菌属的细菌相关联的核酸序列的基因测试、在半固体介质上或半固体介质中培养该细菌以及任何两种或更多种前述测试的组合。
实施方案Z是根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中该初次富集介质为液体介质。
实施方案AA是根据实施方案Z所述的方法，其中该二次富集介质为液体介质。
实施方案AB是一种检测靶细菌的方法，该方法包括：
将第一体积的测试样品与第二体积的初次富集介质混合以形成初次富集培养物；
其中该初次富集培养物包含氧化还原染料；
将该初次富集培养物温育等于八小时或更短的第一时间段；
在该第一时间段期间评估该初次富集培养物以检测该氧化还原染料是否从第一状态变化至第二状态；
如果在该第一时间段期间在该初次富集培养物中检测到该第二状态，则将该初次富集培养物的第一部分与二次富集介质混合以形成二次富集培养物，并且将该二次富集培养物温育第二时间段；以及
使用该第二富集培养物的第二部分进行测试以检测该靶细菌。
实施方案AC是一种检测靶细菌的方法，该方法包括：
将第一体积的测试样品与第二体积的初次富集介质混合以形成初次富集培养物；
其中该初次富集培养物包含氧化还原染料；
将该初次富集培养物温育等于八小时或更短的第一时间段；
在该第一时间段期间评估该初次富集培养物以检测该氧化还原染料是否从第一状态变化至第二状态；
如果在该第一时间段期间在该初次富集培养物中未检测到该第二状态，则将该初次富集培养物温育第三时间段；以及
使用该第一富集培养物的第三部分进行测试以检测该靶细菌。
实施方案AD是根据实施方案AB或实施方案AC所述的方法，其中该氧化还原染料选自亚甲基蓝、刃天青和四唑染料。
实施方案AE是根据实施方案AB至AD中任一项所述的方法，其中该第一体积对该第二体积的比率小于或等于10:1。
实施方案AF是根据实施方案AB至AE中任一项所述的方法，其中该初次富集介质被预热。
实施方案AG是根据实施方案AB至AF中任一项所述的方法，其中将该初次富集培养物温育第一时间段包括将该初次富集培养物在包括端值在内的32℃-42℃下温育。
实施方案AH是根据实施方案AB至AG中任一项所述的方法，其中将该二次富集培养物温育第二时间段包括将该二次富集培养物在包括端值在内的32℃-42℃下温育。
实施方案AI是根据实施方案AB至AH中任一项所述的方法，其中将该初次富集培养物温育第三时间段包括将该初次富集培养物在包括端值在内的32℃-42℃下温育。
实施方案AJ是根据实施方案AB至AI中任一项所述的方法，其中该第一状态具有第一颜色并且该第二状态具有第二颜色，所述第二颜色与第一颜色在可测量的程度上不同。
实施方案AK是根据实施方案AJ所述的方法，其中该第一状态是无色状态并且该第二状态是有色状态。
实施方案AL是根据实施方案AJ所述的方法，其中该第一状态是有色状态并且该第二状态是无色状态。
实施方案AM是根据实施方案AB至AL中任一项所述的方法，其中该测试样品包含该初次富集介质的组分。
实施方案AN是根据实施方案AB至AM中任一项所述的方法，其中该初次富集介质被预热至包括端值在内的在32℃和45℃之间的温度。
实施方案AO是根据实施方案AB至AN中任一项所述的方法，其中该第一时间段等于或小于4小时。
实施方案AP是根据实施方案AO所述的方法，其中该第一时间段等于或小于2小时。
实施方案AQ是根据实施方案AB至AP中任一项所述的方法，其中在该第一时间段期间评估该初次富集培养物包括在视觉上评估该初次富集培养物。
实施方案AR是根据实施方案AB至AQ中任一项所述的方法，其中在该第一时间段期间评估该初次富集培养物包括在第一时间点评估该初次富集培养物，并且在该第一时间点之后的第二时间点评估该初次富集培养物。
实施方案AS是根据实施方案AR所述的方法，其中在该第一时间段期间评估该初次富集培养物包括在该第一时间点针对该氧化还原染料的该第一状态评估该初次富集培养物，并且在该第二时间点针对该氧化还原染料的该第二状态评估该初次富集培养物。
实施方案AT是根据实施方案AB至AS中的一项所述的方法，其中在该第一时间段期间评估该初次富集培养物包括使用仪器测量该初次富集培养物的光吸收度或反射度。
实施方案AU是根据实施方案AB至AT中任一项所述的方法，其中该第一温度、该第二温度或该第三温度是包括端值在内的在32℃和43℃之间的温度。
实施方案AV是根据实施方案AB至AU中任一项所述的方法，其中该第二时间段为包括端值在内的约10小时至约48小时。
实施方案AW是根据实施方案AV所述的方法，其中该第二时间段为包括端值在内的约10小时至约24小时。
实施方案AX是根据实施方案AC至AW中任一项所述的方法，其中该第三时间段为包括端值在内的约10小时至约48小时。
实施方案AY是根据实施方案AV所述的方法，其中该第三时间段为包括端值在内的约10小时至约18小时。
实施方案AZ是根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中进行测试以检测该靶细菌包括进行选自以下的测试：用于检测与该靶细菌相关联的预先确定的酶活性的测试、用于检测与该靶细菌相关联的抗原的免疫学测试、用于检测与该靶细菌相关联的核酸序列的基因测试、在半固体介质上或半固体介质中培养该细菌以及任何两种或更多种前述测试的组合。
实施方案BA是根据实施方案AB至AZ中任一项所述的方法，其中该初次富集介质为液体介质。
实施方案BB是根据实施方案BA所述的方法，其中该二次富集介质为液体介质。
实施方案BC是一种在液体培养基中富集靶微生物的方法，该方法包括：
将第一体积的测试样品与第二体积的初次富集介质混合以形成初次富集培养物；
其中该初次富集培养物包含氧化还原染料；
将该初次富集培养物温育等于八小时或更短的第一时间段；
在该第一时间段期间评估该初次富集培养物以检测该氧化还原染料是否从第一状态变化至第二状态；
如果在该第一时间段期间在该初次富集培养物中检测到该第二状态，则将该初次富集培养物的第一部分与二次富集介质混合以形成二次富集培养物，并且将该二次富集培养物温育第二时间段。
实施方案BD是根据实施方案BC所述的方法，其中该测试样品被怀疑含有该靶微生物。
下面的实施例对本发明的目的和有益效果作出更进一步的解释，但这些实施例中列举的具体材料和用量以及其它条件和细节不应解释为是对本发明不当的限制。
实施例
材料
初次富集介质缓冲蛋白胨水(“BPW”；件号BP0115005)可购自明尼苏达州圣保罗的3M医疗保健公司(3M Health Care(St.Paul,MN))。二次富集介质Rappaport-VassiliadisR10肉汤(“RVR10”；件号BP0288500)可购自3M医疗保健公司。生鸡冲洗样品可获自商业家禽加工厂。“干预前”冲洗液通过以下方式获得：用BPW洗涤去毛鸡屠体，之后使其经受旨在减少附着至屠体的细菌数目的过程。“干预后”通过以下方式获得：在使去毛鸡屠体经受旨在减少附着至屠体的细菌数目的过程之后，用BPW洗涤去毛鸡屠体。塑料袋(件号BP134S，可获自3M食品安全用于在温育期间盛装富集培养物。亚甲蓝(件号M9140)可购自密苏里州圣路易斯的西格玛化学公司(Sigma Chemical Company(St.Louis,MO))。分子检测***沙门氏菌检测试剂盒(件号MDAS96NA)和3M PETRIFILMTM好氧计数板(“AC板”)可获自明尼苏达州圣保罗的3M公司。
实施例1.检测鸡冲洗液样品中的沙门氏菌。
将二十个随机化的干预前和干预后的鸡冲洗样品(每个样品30mL)各自放置到装有30mL预热(41.5℃)初次富集介质(含有20mg/mL亚甲蓝的BPW)的单独袋中以形成初次富集培养物。每种初次富集培养物中的液体介质具有蓝色。将每种初次富集培养物的小样品连续稀释，并且使用1mL所选择的稀释液来确定PETRIFILM AC板中总好氧微生物的初始计数。
将初次富集培养物在41.5℃下的环境试验箱中温育。在1、2、3、4、6、10和18小时的温育之后在视觉上检查每个袋以确定亚甲蓝染料是否从蓝色(氧化)形式转变至无色(还原)形式。当在4小时内在袋中观察到染料转变至无色状态时，在形成初次富集培养物4.5小时后移取100微升初次富集培养物，并且将其与10mL无菌二次富集介质混合以形成二次富集培养物。将二次富集培养物在41.5℃下温育18小时。将初次富集培养物(其中氧化还原染料已转变至无色)的剩余部分在41.5℃下再温育18小时。
当在4小时内没有观察到氧化还原染料的转变时，使初次培养物继续在41.5℃下再温育18小时。在18小时温育期结束时，从每种初次或二次富集培养物中移取20微升样品并且进行处理以根据制造商说明书使用3M分子检测***检测沙门氏菌微生物。结果在表1中示出。
表1.来自PETRIFILM AC板的菌落计数以Log CFU/mL示出。使用3M分子检测***进 行沙门氏菌的检测。
在初次富集培养物接种时的总好氧计数和转变氧化还原染料所花费的时间量之间的相关性显示在图2中。结果表明初始细菌计数和转变氧化还原染料所需的时间之间呈逆相关性。
表1中的数据显示，利用氧化还原染料确定何时将初次富集培养物的一部分转移至二次富集介质使得与原本通过测试初次富集培养物检测到的样品相比，在多三个(即样品1、7和9)的样品中检测到沙门氏菌。
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所有的标题是为了阅读者方便，而不应该用于限制该标题后面的正文的含义，除非如此规定。
在不脱离本发明的实质和范围的前提下，可进行各种修改。这些实施方案以及其它实施方案均在如下权利要求书的范围内。

Claims (20)

1.一种检测属于沙门氏菌属的细菌的方法，所述方法包括：
将第一体积的测试样品与第二体积的初次富集介质混合以形成初次富集培养物；
其中所述初次富集培养物包含氧化还原染料；
将所述初次富集培养物温育等于八小时或更短的第一时间段；
在所述第一时间段期间评估所述初次富集培养物以检测所述氧化还原染料是否从第一状态变化至第二状态；
如果在所述第一时间段期间在所述初次富集培养物中检测到所述第二状态，则将所述初次富集培养物的第一部分与二次富集介质混合以形成二次富集培养物，并且将所述二次富集培养物温育第二时间段；以及
使用所述第二富集培养物的第二部分进行测试以检测所述沙门氏菌属的所述细菌。
2.一种检测属于沙门氏菌属的细菌的方法，所述方法包括：
将第一体积的测试样品与第二体积的初次富集介质混合以形成初次富集培养物；
其中所述初次富集培养物包含氧化还原染料；
将所述初次富集培养物温育等于八小时或更短的第一时间段；
在所述第一时间段期间评估所述初次富集培养物以检测所述氧化还原染料是否从第一状态变化至第二状态；
如果在所述第一时间段期间在所述初次富集培养物中未检测到所述第二状态，则将所述初次富集培养物温育第三时间段；以及
使用所述初次富集培养物的第三部分进行测试以检测所述沙门氏菌属的所述细菌。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述氧化还原染料选自亚甲基蓝、刃天青和四唑
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一体积对所述第二体积的比率小于或等于10:1。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一状态具有第一颜色并且所述第二状态具有第二颜色，所述第二颜色与第一颜色在可测量的程度上不同。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第一状态为无色状态并且所述第二状态为有色状态，或者其中所述第一状态为有色状态并且所述第二状态为无色状态。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测试样品包含所述初次富集介质的组分。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一时间段等于或小于4小时。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述第一时间段期间评估所述初次富集培养物包括在第一时间点评估所述初次富集培养物，并且在所述第一时间点之后的第二时间点评估所述初次富集培养物。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述第一时间段期间评估所述初次富集培养物包括使用仪器测量所述初次富集培养物的光吸收度或反射度。
11.一种检测靶细菌的方法，所述方法包括：
将第一体积的测试样品与第二体积的初次富集介质混合以形成初次富集培养物；
其中所述初次富集培养物包含氧化还原染料；
将所述初次富集培养物温育等于八小时或更短的第一时间段；
在所述第一时间段期间评估所述初次富集培养物以检测所述氧化还原染料是否从第一状态变化至第二状态；
如果在所述第一时间段期间在所述初次富集培养物中检测到所述第二状态，则将所述初次富集培养物的第一部分与二次富集介质混合以形成二次富集培养物，并且将所述二次富集培养物温育第二时间段；以及
使用所述第二富集培养物的第二部分进行测试以检测所述靶细菌。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，
将第一体积的测试样品与第二体积的初次富集介质混合以形成初次富集培养物；
其中所述初次富集培养物包含氧化还原染料；
将所述初次富集培养物温育等于八小时或更短的第一时间段；
在所述第一时间段期间评估所述初次富集培养物以检测所述氧化还原染料是否从第一状态变化至第二状态；
如果在所述第一时间段期间在所述初次富集培养物中未检测到所述第二状态，则将所述初次富集培养物温育第三时间段；以及
使用所述第一富集培养物的第三部分进行测试以检测所述靶细菌。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述氧化还原染料选自亚甲基蓝、刃天青和四唑染料。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中所述第一体积对所述第二体积的比率小于或等于10:1。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其中所述第一状态具有第一颜色并且所述第二状态具有第二颜色，所述第二颜色与第一颜色在可测量的程度上不同。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一状态为无色状态并且所述第二状态为有色状态，或者其中所述第一状态为有色状态并且所述第二状态为无色状态。
17.根据权利要求11至16中任一项所述的方法，其中所述测试样品包含所述初次富集介质的组分。
18.根据权利要求11至17中任一项所述的方法，其中所述第一时间段等于或小于4小时。
19.根据权利要求11至18中任一项所述的方法，其中在所述第一时间段期间评估所述初次富集培养物包括在第一时间点评估所述初次富集培养物，并且在所述第一时间点之后的第二时间点评估所述初次富集培养物。
20.根据权利要求11至19中任一项所述的方法，其中在所述第一时间段期间评估所述初次富集培养物包括使用仪器测量所述初次富集培养物的光吸收度或反射度。
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