CN1265155A - 利用复合竞争性逆转录酶－聚合酶链反应定量测定基因表达的方法 - Google Patents

利用复合竞争性逆转录酶－聚合酶链反应定量测定基因表达的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了通过复合竞争性逆转录酶—聚合酶链反应定量测定基因表达的方法及仪器。该方法和仪器特别适用于细胞和组织的小样品分析。

Description

利用复合竞争性逆转录酶-聚合酶 链反应定量测定基因表达的方法
                        技术背景
本发明是1993年4月6日提交的08/043,390号专利的部分继续申请和1994年1月28日提交的08/118,434号专利的部分继续申请。
本发明是在国立卫生研究所的第ES02679号和第ES01247号研究基金、研究资源部第RR00044号基金、卫生研究所第91-2号合同以及国际铅锌组织第CH611号合同的资助下完成的，他们拥有本发明的某些权利。本发明通常涉及通过逆转录和聚合酶链反应(PCR)扩增定量测定RNA的细胞水平的方法。
PCR技术在美国专利4,683,195、4,683,202和4,965,188中有一般性描述。PCR技术一般包括扩增某一核酸分子中的某一核酸序列所含的任何期望的特定核酸序列的方法。PCR方法包括用过量的两个寡核苷酸引物处理核酸分离的互补链。引物延伸形成互补的引物延伸产物，其作为合成期望的核酸序列的模板。PCR方法是通过同时逐步(simultaneous step-wise)的方式进行的，并且可以根据需要任意重复以增加目的核酸序列的扩增水平。根据PCR方法，位于各个DNA链上两引物之间的DNA序列被选择性地扩增，而DNA和所选样品的其它部分不被扩增。PCR技术为特异扩增DNA目的区域提供了方法。
PCR产物的产量随循环次数的无限增加而呈指数式增加。在一些情况下由于未知的原因，反应受到限制，PCR产物以未知的速率增加。因此，有报道扩增产物的产量在同时进行的相同的样品之间可以有高达6倍的差异。(Gilliland，G等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)87：2725-2729，1990)。(这些出版物和其它参考资料被包含在本发明中，作为发明背景以及在特殊情况下为本发明的实施提供详细的说明，并且所有资料都被明确地引入本发明以作为参考)。所以，经过一定次数的PCR循环后，靶DNA的初始浓度不能通过外推法来正确测定。在进行PCR定量的尝试过程中，许多研究者分析了经过已知能够进行指数扩增的循环次数的扩增样品(Horikoshi，T等人，癌研究(Cancer Res.)52：108-116(1992)；Noonan，K.E.等人，美国国家科学院院报87：7160-7164(1990)；Murphy，L.D等人，生物化学(Biochemistry)29：10351-10356(1990)；Carre，P.C.等人，临床观察杂志(J.Clin.Invest.)88：1802-1810(1991)；Chelly，J等人，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem)187：691-698(1990)；Abbs，S等人，医学遗传学杂志(J.Med.Genet.)29：191-196(1992)；Feldman，A.M.等人，循环(Circulation)83：1866-1872(1991)。一般地，这些分析是在PCR进行的初期进行的，这时PCR产物可利用放射性标记探针和放射自显影进行测定，而不是通过分光光度法或溴化乙锭染色凝胶的光密度测定法测定。放射性的使用不方便、昂贵，并且需要考虑安全问题。而且，必须为每一套实验条件确定其指数期，需要花费额外的时间和材料。
另一项进展是竞争性PCR，其中PCR是在单碱基突变的竞争性模板存在的情况下进行的(Gilliland，同上；Becher-Andre等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)17：943-9446(1989))。已知数量的竞争性模板与未知数量的靶序列共扩增。竞争物与靶序列有相同的序列(除了该序列中某一部分的单碱基突变或缺失)，利用与靶cDNA相同的引物扩增，并且以与靶cDNA相同的效率扩增。靶序列/标准物的起始比例在整个扩增过程中，甚至在指数期结束后都保持不变。
在Siebert，P.D.等人，自然(Nature)359：557-558(1992)；；Siebert，P.D.等人，生物技术(BioTechniques)14：244-249(1993)，以及克隆技术手册(Clontech Brochure)，1993，逆转录酶-PCR(RT-PCR)中对竞争性PCR进行了一般性讨论。但是，竞争性PCR单独并不足以控制模板起始数量的差异。样品的降解和加样的误差会导致差异。当利用Northern分析测定基因表达时，通过探测靶基因和“持家”基因相同的印迹有可能克服这些问题，“持家基因”不随组织样品或对刺激物的反应而改变。“持家”基因作为一般标准物决定靶基因的相关表达。为了尝试应用这一概念，另一些研究者在独立的试管中进行PCR扩增。但是，当两个基因在独立的试管中扩增时，扩增条件的管间差异和加样误差是不可避免的。而非竞争性的复合PCR也已在Noonan，同上中被描述，即靶基因和“持家”基因在同一管中扩增，这个方法并不方便，因为它需要建立标准曲线以测定扩增核苷酸的指数范围。
因此，需要一种基因表达的定量测定技术，它没有上述的缺点并且能够由受过标准训练的技师操作。本发明通过提供一种技术而满足了这些需要，这种技术能够利用任何PCR方法并且能够以简单、直接的方式进行。本发明包含对前面描述的DNA分析方法和PCR技术的巨大改进。
                        发明概述
本发明的方法是对PCR扩增方法的改进，它使得“靶基因”、“持家”基因和这些基因的竞争性模板能够同时扩增。根据本发明，术语“靶DNA序列”和“靶基因”一般指需要选择性扩增该基因或DNA序列的目的基因。术语“持家”基因指适于作为每次PCR反应中RNA量的内部标准物的基因。从一般的和总体的意义上讲，本发明的关键是同时使用靶基因的引物、持家基因的引物，以及含有靶基因和持家基因的突变体的两个内部标准物竞争性模板。这些突变可以是点突变、***、缺失等等。
从广义上讲，本发明涉及定量测定靶DNA序列数量的方法，该靶DNA序列存在于cDNA分子的异源混合物中所选cDNA分子上一段已被鉴定的区域内。需要理解的是可以使用多个靶基因和/或持家基因，此外，定量这些额外的靶基因和/或持家基因需要另外包括含有该额外靶基因和/或持家基因的突变的内部标准物竞争性模板。需要理解，突变的竞争性模板含有至少一个与靶序列相应的核苷酸有关的突变核苷酸。需要指出，与持家基因序列的相应核苷酸互补的单个核苷酸的突变是本发明成功实施所需的。但是，应理解更长的缺失、***或改变也可用于本发明中。靶基因引物(它作为靶基因的天然和竞争性模板的引物)、持家基因引物(它作为持家基因的天然和竞争性模板的引物)、靶基因的竞争性模板、以及持家基因的竞争性模板与含有靶基因和持家基因DNA的天然cDNA一起进行PCR反应。PCR反应提供1)靶基因和持家基因的天然cDNA的cDNA产物和2)靶基因和持家基因突变的竞争性模板cDNA的cDNA产物。利用适于分离cDNA产物的方法分离cDNA产物。天然cDNA产物和突变的cDNA产物的以相关联的量存在是通过测定编码靶基因的天然cDNA和编码靶基因的竞争性模板的突变cDNA的量，并与编码持家基因的天然cDNA和编码持家基因的竞争性模板的突变cDNA的量相比较来检测的。
从另一方面讲，本发明涉及新的核酸引物分子，其用于确定靶DNA序列的量的PCR方法中。
根据本发明，这里的“样品”一般是指从植物、个体或体外细胞培养物中分离的组织或液体样品，
术语引物、核酸和寡核苷酸被理解为指多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，并且这些术语所指的序列的长度没有故意加以区别。这些术语指该分子的一级结构。这些术语包括双链和单链RNA及双链和单链DNA。需要理解寡核苷酸可以衍生自任何现存的或天然的序列，并且可以任何方式产生。更需要理解寡核苷酸可以由化学合成、逆转录、DNA复制以及这些方法的组合产生。术语“引物”一般指当条件适于引物延伸产物合成时能够作为沿互补链合成起始点的寡核苷酸。合成条件包括存在四种不同的脱氧核苷三磷酸和至少一种引发聚合的试剂，如逆转录酶或DNA聚合酶。它们存在于合适的缓冲液中，缓冲液中可以含有辅因子的成分或在不同适当温度下影响如pH等条件的成分。需要理解尽管引物首选单链序列，这样扩增的效率可达最优化，其它的双链序列也可以用于本发明。
术语“靶基因”、“序列”或“靶核酸序列”指待扩增的和/或待检测的寡核苷酸区域。需要理解靶序列位于在扩增过程中所用的引物序列之间。
根据本发明的一个实施方案，基因表达的定量是通过复合竞争性PCR扩增a)来自至少一个目的靶基因和至少一个“持家”基因的cDNA和b)含有目的靶基因和“持家”基因cDNA碱基突变体的内部突变标准物竞争性模板来测定的，其中碱基突变体会造成限制性内切酶识别位点的丧失或获得。根据另一个实施方案，该方法包括PCR扩增a)来自至少一个目的靶基因和至少一个“持家”基因的cDNA和b)含有人工缩短的目的靶基因和“持家”基因序列的竞争性模板。这些缩短的序列保留了与用于PCR扩增的靶基因和持家基因引物同源的序列。从样品细胞或组织中提取的RNA被逆转录。系列稀释的cDNA在与靶基因和“持家”基因同源的寡核苷酸存在下，以及定量的内部突变的标准物竞争性模板存在下被PCR扩增。限制性消化扩增的DNA并在用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上电泳，使天然产物与突变产物分离开。进行光密度测定以定量电泳谱带。这种测定靶基因与“持家”基因的相关联表达的技术是准确的，并且用相同的母混合物(master mixture)和稀释内部标准物进行的研究是可重复的。相关联基因表达比率的浮动低于平均值的25％。此技术可用于测量基因表达的变化。这个方法在研究的样品量有限或基因表达水平很低时特别有用。
根据本发明的另一个实施方案，基因表达的定量测定是在利用同时聚合酶链反应扩增每个突变的竞争性模板之前，先进行下列步骤：利用一个外部引物和内部单碱基错配突变的内部标准物竞争性模板引物进行两个初始聚合酶链反应以产生两个重叠的DNA片段；分离并纯化初始聚合酶链反应的重叠DNA片段；仅用外部引物通过聚合酶链反应扩增这两个重叠的DNA片段；进行第一个没有引物的聚合酶链反应扩增以形成异源二聚体；以及纯化并扩增前面步骤的聚合酶链反应产物，随后稀释以用作竞争性模板。
根据本发明的另一个实施方案，许多不同基因的竞争性模板包含于同一竞争性模板混合物中，而不仅仅是持家基因和单一靶基因的竞争性模板。另外，按照此处描述的方法，还可以不必在同一试管中扩增持家基因和靶基因，而能成功地进行定量RT-PCR。本发明进一步涉及自动分子分型(phenotyping)仪器。
因此，本发明的目标是提供基因表达定量测定的改进方法。
本发明的进一步的目标是提供适于作为商业化方法的基于定量PCR的基因表达测定方法。
在结合附图阅读了下面详细的描述后，会更好地理解本发明的这些和其它目标、特征以及许多附加的优点。
                        附图简述
图1是相对靶基因表达的PCR定量工艺流程的概图。
图2是一张照片，表示系列稀释的BEP2D人***状瘤病毒-无限增殖化的支气管上皮细胞系cDNA(代表0.25微克至0.05微克总DNA)，它与恒定量的每个单碱基突变内部标准物(各10渺摩)共转录，用EcoRI限制性内切酶消化并在琼脂糖凝胶上电泳。这个凝胶的负片用于光密度测定以定量电泳谱带。
图3是表示天然产物(□GSH-Px(谷胱甘肽过氧化物酶)和■GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶))对总RNA的曲线图。当初始RNA的量较小时(GSH-Px和GAPDH的前三个方块)，反应全部是指数形式的，但是随着RNA量的增加，反应在扩增中的一些点成为非指数式的，导致形成的产物比在非限制反应中预期的产物少。直线代表假如在整个扩增过程中保持指数形式将会形成的PCR产物(GSH-Px或GAPDH)的理论量。
图4是表示天然/突变的扩增产物(□GSH-Px和■GAPDH)对总RNA的曲线图。在所研究的总RNA的范围内GSH-Px(r2＝.982)和GAPDH(r2＝.973)与总RNA的关系保持线性。这与Gilliand等人，美国国家科学院院报，87：2725-2729，1990的发现一致。这种关系证明了复合竞争性PCR具有定量的特性。
图5是一张照片，它表示a)从作为对照用0.1％DMSO处理的BEP2D细胞中得到的RNA的Northern分析，或用意在诱导细胞色素p450 IA1(CYPIA1)的β-萘黄酮(napthoflavone)处理的结果；以及b)从与a)中相同细胞的系列稀释的cDNA中经PCR扩增的DNA。在GAPDH和CYPIAI的竞争性模板内部标准物及这些基因的寡核苷酸引物存在时共转录cDNA。
图6是基因表达定量测定仪器的示意图。
                            发明详述
多年来，基因表达已利用Northern杂交或点杂交分析通过定量RNA得到测定。这些技术用于测定每次需要从至少105个细胞中获得RNA。通常，一次活体解剖只提供组织诊断所必需的数量的细胞，而这常常远远少于105个细胞。最近改进的PCR技术能够测定少至100个细胞中的RNA水平。但是，迄今所描述的技术仅仅是定性的，而不是定量测定。
本发明涉及利用复合竞争性逆转录酶聚合酶链反应扩增的方法，以简化并改进基因表达的定量测定。从样品中抽提的RNA经逆转录，然后在“持家”基因和目的靶基因的引物存在下进行PCR扩增。
基因表达是通过比较至少一种靶基因与“持家”基因的量来测定的。有各种合适的持家基因可用于本发明，它们包括，例如，在基因表达的Northern分析中已被用作内部标准物的持家基因，包括GAPDH、β-肌动蛋白、28S RNA和18S RNA以及核糖核蛋白(Devereux等人，核酸研究，12：387(1984)；Barbu等人，核酸研究，17：7115(1989)。根据本发明的一个实施方案，可以使用与任何含有已知的限制性内切酶识别位点的序列同源的，或与任何在持家基因中的已知限制性内切酶位点上含有一个或两个碱基对错配的序列同源的合成寡核苷酸。这些限制性内切酶识别位点的应用或是为了将天然存在的位点突变为非识别位点，或是为了将错配位点突变为正确配对的位点，在两种情况下都产生适合于内部突变标准物竞争性模板的突变序列。用于分析任意其它特定基因的持家基因中的特定位点取决于其它基因中存在的正确配对的和错配的位点。一个决定因素是从持家基因和靶基因中产生的DNA片段的大小。要求这些片段在凝胶电泳上可被充分分离。
而且，所有含有与用作持家基因的基因序列同源的序列之寡核苷酸都可以用于本发明中。这些同源序列可用于产生根据Celi等人，核酸研究21：1047(1993)描述的方法获得的持家基因的人工缩短的竞争性模板。
为了鉴定和匹配所有已知识别位点的一个或两个碱基错配序列，可使用遗传学计算机组软件包(Genetics Computer Group softwarepackage(Devereux等人，同上，1984))中的Map程序。获得每个基因的cDNA，然后测定各个基因是否存在每个已知限制性内切酶的一个或两个碱基对错配序列的匹配情况。根据本发明，可能使用每个含有任何这些识别序列或这些序列的一个或两个碱基对错配的基因。
本发明的复合竞争性PCR(对于任何给定的母混合物和稀释的突变标准物)产生的靶基因/持家基因比是可重复的。因为天然产物与总起始RNA之间的关系随RNA量的增加而不再保持线性(图3)，很清楚在整个过程中扩增不是指数式的。但是，使用竞争性模板可以获得一致的靶基因/持家基因比。对于每个基因，天然/突变模板之比与总起始RNA之间的线性关系说明了定量的结果(图4)。这说明了竞争性模板内部对照的用途；测定基因表达的相对量不必使扩增维持在指数期。在同一研究中样品之间比率的可重复性使得可以使用较少的稀释管。只需要一只其中所有的谱带都可定量的试管以测定基因表达。这样就简化了操作步骤并且可以同时测定许多不同的样品。
根据本发明的一个实施方案，可以选择用于从天然产物中分离突变产物的限制性内切酶识别位点。另外，经限制性内切酶消化后PCR产物的最终长度是需要考虑的一个因素。在某些实施方案中，琼脂糖凝胶比聚丙烯酰胺凝胶更优选采用，但是要求DNA片段大小相差更大以使其足够被分离开(大约相差50-100碱基对)。本发明的方法可以通过对靶基因和持家基因使用相同的识别位点得到进一步简化。EcoRI常常是合适的位点。在本发明的一个特别实施方案中，GAPDH竞争性模板是在EcoRI或BamHI消化的基础上从天然GAPDH中分离制备的。但是，需要理解也可以进行基于EcoRI或其他适于更多基因的限制性内切酶消化进行的分离。
利用突变标准物的不同母混合物和稀释物在BEP2D cDNA上进行的研究中，观察到靶基因与持家基因的表达之比(GSH-Px/GAPDH)变化很大(可高达200倍)。因为分别经过逆转录的样品得出相似的结果，所以在这一步所引入的变异很小。反应条件的任何差异都将同等地影响竞争性模板以及天然模板的扩增，因此两者之比将保持恒定。所以，变异似乎是由反应中内部突变标准物竞争性模板的数量不同引起的。竞争性模板的浓度很小(飞摩级)，以至于反应中存在的分子数量的任何变化都将引入大量的误差。
本发明的方法在任何给定的研究中都是精确的，通过利用相同的母混合物与突变的内部标准物竞争性模板所研究的样品之间的可重复性证明了这一点。所以，根据一个优选实施方案，要求所比较的样品利用相同的母混合物和相同稀释的内部突变的标准物竞争性模板同时进行。
在一个优选实施方案中，反应混合物包含下列成分：a)持家基因的竞争性模板，b)目的靶基因的竞争性模板，c)用于持家基因PCR扩增的寡核苷酸引物，d)用于目的靶基因PCR扩增的寡核苷酸引物，e)反应缓冲液，以及f)来自测试样品的cDNA。
通过使用如含有1×PCR缓冲液(例如，50mM KCl，1.5mM Tris-HCl，1.5mM MgCl2)、编码靶基因和持家基因的引物(各25皮摩尔)，0.2mM dNTP(A，T，C，G)，以及每100微升反应混合物恒定量的各个竞争性模板的母混合物，优选地将每个实验的PCR条件标准化。扩增前每100微升反应加入Taq DNA聚合酶(2.5单位)。PCR扩增优选地在94℃1分钟、60℃1分钟和72℃1分钟进行35-38个循环，或者根据所扩增的特定区域的最适条件进行。扩增后，优选地将PCR产物加热10分钟，然后缓慢冷却以形成最多的异源二聚体。
对于使用根据Higuchi突变的竞争性模板的反应，每个PCR管中的样品(40微升)用限制性内切酶消化12-16小时。这些产物在溴化乙锭染色的3％Nusieve、1％LE琼脂糖凝胶上60V电泳2-3小时。使用Polaroid 665正/负即时胶片将凝胶拍摄负片。
将负片进行光密度测定，使用如SLR 2D/1D型Zeineh Soft激光扫描光密度测定仪，Zeineh 1D Autostepover Videophoresis程序软件(生物医学设备公司，Fullerton，California)。或者，染色的胶可以使用数码相机直接进行光密度测定，或在自动测序胶(如应用生物***公司提供的胶)上测定。计算各个峰下的面积用于定量。根据谱带的相对大小和异源二聚体的形成进行修正。结果表示为靶基因和持家基因的相对比值。
复合竞争性PCR改进并简化了基因表达的定量。基因表达可在非常少的组织或细胞样品中定量，并且不借助于放射性标记。因此，复合逆转录PCR比放射性标记更便宜且使用更安全。使用相同的母混合物和稀释的内部突变标准物竞争性模板，各样品之间的结果是可重复的。
需要理解，根据本发明的方法，所有与已知的或潜在的持家基因(包括但不限于人、小鼠和大鼠的GAPDH、β-肌动蛋白、28S RNA、18S RNA和所有的核糖核蛋白基因)cDNA的每条链同源的，并且含有限制性内切酶识别位点序列或者含有一个或两个碱基对错配的限制性内切酶识别序列的寡核苷酸都适用于本发明的实践。使用寡核苷酸制备用于定量PCR的持家基因的竞争性模板。
还需要理解的是，根据本发明的方法，所有含有与已知的或潜在的持家基因(包括但不限于人、小鼠和大鼠GAPDH、β-肌动蛋白、28SRNA、18S RNA和所有的核糖核蛋白基因)中的序列同源的序列之寡核苷酸在产生人工缩短的竞争性模板时都是有用的。使用寡核苷酸制备在本发明中使用的持家基因的竞争性模板。
构思了这项创造性技术的应用包括：a)测定通过内镜的活体检验(刷子或钳子)、针吸和骨髓活体检验获得的组织的基因表达；b)定量在瞬时转染鉴定中报告基因的表达；以及c)定量经基因治疗后被转染的基因。
尽管在Morales，M.J.，和Gottlieb，D.I.，中描述的方法(基于聚合酶链反应的检测并定量瞬时转染鉴定中基因表达的方法，分析生化(Analytical Biochemistry)210，188-194(1993))，能够测定报告基因的转录，但是它不能控制由鉴定中包含的RNA量的不同所造成的差异。本发明的方法更适用于同时测定外源报告基因和内源持家基因，例如被转染细胞的GAPDH RNA。
尽管已经报告了在囊性纤维化跨膜传导调节蛋白基因(CFTR)中的许多不同的突变与疾病相关，但最通常与疾病相关的突变是在508位点3个碱基的缺失。利用最近描述的方法(Cha，R.S.，Zarbl，H.，Keohavong，P.，Thilly，W.G.，匹配扩增突变分析(MAMA)：在c-Haras基因上的应用，PCR方法与应用(PCR methods andapplications)，2：14-20(1992)，有可能制备导致仅有非正常的508位点缺失的基因或是仅有正常CFTR基因扩增的寡核苷酸引物。进一步设想有可能利用本发明的方法测量每个细胞中外源CFTR基因的相对数量。不比较非正常CFTR与一些内部标准物的量，就不可能定量转染的效率。而这样的样品太少不能通过Northern分析测量RNA。
本发明的方法可用于开发在突变的内源基因存在下选择性扩增外源正常的肌营养不良蛋白基因的PCR***。肌营养不良是由相对大的基因缺失引起的疾病。已经有几种不同的缺失情况得到描述。利用本发明的方法，可以开发用于选择性扩增各种情况下的被转染的正常基因和组成型非正常基因的不同的PCR***。这可以通过选择跨越缺失区的引物而实现。
还需要理解，根据本发明的方法，可以同时测定多个基因。
                        方法
将来自Pharmacia(Piscataway，N.J.)的纯化的脱氧核糖核苷酸稀释为10mM的储存液。重组栖热水生菌(Thermus aquaticus)DNA聚合酶(Taq聚合酶)、禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶，以及核糖核酸酶抑制剂(RNasin)来自Promega(Madison，WI.)。EcoRI酶来自USB(Cleveland，Ohio)。引物是在应用***公司391型PCR-MateEPTM型合成仪上制备的。PCR在Perkins，Elmer，Cetus DNA热循环仪480上进行。所用的其它缓冲液和溶液来源各异且都是分子生物学级的。
研究是在人***瘤病毒无限增殖化的人支气管上皮细胞系(BEP2D)(Willey等人，癌研究，51：5370-5377(1990)上进行的。
RNA的分离如下：RNA是根据Chomczynski和Sacchi(分析生化，162：156-159，1987)描述的方法分离的。从含有BEP2D细胞系的三角瓶中除去培养基。立即将GIT(4.0M硫氰酸胍，0.1M Tris-ClpH＝7.5，1％β巯基乙醇)缓冲液加到细胞上(大约每5百万-1千万BEP2D细胞加500微升)。然后将每500微升含有裂解细胞的GIT缓冲液转移到1.5毫升微离心管中。向每个离心管中顺序加入50微升pH＝4的2M醋酸钠、500微升水饱和酚和100微升氯仿-异戊醇混合液(49∶1)。将离心管彻底摇匀，于冰上放置15分钟，并在4℃下以14,000转/分离心20分钟。将各管中的水相转移至新管并重复上述抽提步骤。然后，将各管的水相转移至加有异丙醇(500微升)的新管，于-70℃放置15分钟。各管在4℃下以14,000转/分离心20分钟。RNA用70％乙醇洗两次并真空干燥。RNA溶于用0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水中，并通过分光光度法定量(Gilford仪器260型分光光度计)。
逆转录按如下进行：抽提的RNA置于无菌离心管中。每1微克RNA加入0.2毫克Oligo-dT。65℃加热5分钟后，在冰上放1分钟。向其中加入2微升1mM dNTP，2微升逆转录酶(RT)缓冲液(50.0mM Tris，40mMKCl和80mM MgCl2)，0.5微升RNasin，和1微升AMV逆转录酶(9.500单位/毫升)。42℃温育1小时后加热至80℃10分钟以终止反应。形成的cDNA储存在-20℃。
引物和突变的内部竞争性模板的制备如下：理想的序列是用Oligo-TM引物分析软件(国家生物科学公司，Hamel，Mn.)鉴定的。引物是用应用生物***公司391型PCR-Mate DNA合成仪制备的。引物序列的描述如下。
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)(Chada等人，基因组学(Genomics)6：268-271，1990)
用于扩增天然和突变模板的“外”引物产生354碱基对长的产物。“外”引物是
SEQ.I.D.No.1)(Chada等人，基因组学(Genomics)6：268-271，1990)
位点241 5’-GGGCCTGGTGGTGCTTCGGCT-3’(编码有义链)相应于克隆序列的241-261位碱基，以及
SEQ.I.D.No.2)(Chada等人，基因组学(Genomics)6：268-271，1990)
位点574 5’-CAATGGTCTGGAAGCGGCGGC-3’(编码反义链)，其可与碱基574-594退火。
用于合成突变的内部标准物的“内”引物通过改变一个天然cDNA碱基对(加下划线的碱基)去除了一个EcoRI限制性内切酶识别位点(GAATTC)。“内”引物是
SEQ.I.D.No.3)(Chada等人，基因组学(Genomics)6：268-271，1990)
位点309 5’-ATTCT GA TTTC CCTCAAGTACGTCCGGCCT-3’(编码有义链)
SEQ.I.D.No.4)(Chada等人，基因组学(Genomics)6：268-271，1990)
位点309 3’-TAAGA CT AAAG GGAGTTCATGCAGGCCGGA-5’(编码反义链)
两个引物都相应于克隆序列的309-338位碱基。突变是由有义链的316位点上由T替换天然的A造成的。限制性内切酶消化天然的GSH-Px产生280和74个碱基对的产物。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(Tso等人，核酸研究13：2485-2502，1985)。
用于扩增天然和突变模板的“外”引物产生788或790个碱基对长的产物。“外”引物是
SEQ.I.D.No.5)(Tso等人，核酸研究13：2485-2502，1985)
位点46 5’-GGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCG-3’(编码有义链)相应于克隆序列的9-32位碱基，和
SEQ.I.D.No.6)(Tso等人，核酸研究13：2485-2502，1985)
位点812 5’-CCTCCGACGCCTGCTTCACCAC-3’(编码反义链)，其可与碱基777-798退火。
用于合成突变模板的“内”引物通过改变一个天然cDNA碱基对(下划线的碱基)制造了一个EcoRI限制性内切酶识别位点(GAATTC)。“内”引物是：
SEQ.I.D.No.7)(Tso等人，核酸研究13：2485-2502，1985)
位点234 5’-TGATCAATG GAAz TTC CCATCACCA-3’(编码有义链)
SEQ.I.D.No.8)(Tso等人，核酸研究13：2485-2502，1985)
位点234 3’-ACTAGTTACCTT AAGGGTAGTGGT-5’(编码反义链)
两个引物都相应于克隆序列的199-222位碱基。突变是由有义链的211位点上由T替换天然的A造成的。限制性内切酶消化突变的GAPDH产生588和200个碱基对的产物。
采用不同的突变GAPDH模板进行了几次实验。这个模板被引入了一个新的BamHI限制性位点。
用于扩增天然和突变模板的“外”引物产生634个碱基对长的产物。“外”引物是
SEQ.I.D.No.9)(Tso等人，核酸研究13：2485-2502，1985)
位点200 5’-CATGGCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’(编码有义链)相应于克隆序列的165-188位碱基，和
SEQ.I.D.No.10)(Tso等人，核酸研究13：2485-2502，1985)
位点813 5’-CCTCCGACGCCTGCTTCACCAC-3’(编码反义链)其可与碱基777-798退火。
用于合成突变模板的“内”引物通过改变一个天然cDNA碱基对(下划线碱基)制造了一个BamHI限制性内切酶识别位点(GGATCC)。“内”引物是：
SEQ.I.D.No.11)(Tso等人，核酸研究13：2485-2502，1985)
位点368 5’-CAGGGG GGA TCC AAAAGGGTCATCAT-3’(编码有义链)
SEQ.I.D.No.12)(Tso等人，核酸研究13：2485-2502，1985)
位点368 3’-GTCCCC CCT AGG TTTTCCCAGTAGTA-5’(编码反义链)
两个引物都相应于克隆序列的333-358位碱基。突变是由有义链的342位点上由T替换天然的G造成的。限制性内切酶消化突变的GAPDH产生460和174个碱基对的产物。
突变的内部标准物竞争性模板是按照Higuchi等人，核酸研究16：7351-7367，1988所描述的通过定点突变制备的。这些单碱基突变的结果或者是形成EcoRI限制性内切酶识别位点(对于GAPDH)或者是失去该位点(对于GSH-Px)。(还利用引入BamHI位点的突变的GAPDH进行了实验)。对于每个突变产物，利用一个“外”引物和一个“内”单碱基错配的引物进行两次起始聚合酶链反应，产生两个重叠的DNA片段。(对于GSH-Px为引物1和4，2和3；对于GAPDH为引物5和8，6和7)。这些重叠的DNA片段在溴化乙锭染色的3％Nusieve、1％琼脂糖上电泳。将谱带切下并用Millipore Ultrafree-MC 0.45微米滤膜(NihonMillipore Kogyo K.K.，Yonezawa，日本)纯化。纯化的DNA用乙醇沉淀、洗涤、真空干燥并溶于100微升无菌蒸馏水中。1微升每种重叠DNA片段只用外引物进行PCR扩增。第一次PCR循环进行时没有引物以使异源二聚体形成。这样就形成并扩增了整个突变产物。突变的PCR产物按上述进行凝胶纯化并重新扩增形成大量产物。大量产物经凝胶纯化并通过分光光度法测量。将突变产物稀释至渺摩尔级用作竞争性模板。1微克/微升的青鱼***DNA(Lofstrand，Bethesda，MD)用作载体。对每个突变模板样品的进行限制性内切酶消化以确保避免污染。
PCR条件如下：通过使用含有1×PCR缓冲液(50mM KCl，10mMTris-HCl，pH9.0，1.5mM MgCl2)、25皮摩尔编码GSH-Px和GAPDH的引物、0.2mM dNTP(A，T，C，G)，以及每100微升反应混合物中恒定量的各个内部标准物的母混合物，将每个实验的PCR条件标准化。扩增前每100微升反应加入Taq DNA聚合酶(2.5单位)。来自BEP2D细胞系的cDNA经系列稀释加入到样品PCR管中。在所有实验中，不含模板、仅含天然cDNA、或仅含突变标准物的对照管被扩增，以检查污染或酶完全消化的情况。
PCR扩增在94℃1分钟、60℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环。扩增后，将PCR产物加热10分钟使异源二聚体形成最多。
产物的定量如下：每个PCR管的样品(40微升)用EcoRI限制性内切酶消化12-16小时(使用具有新的BamHI限制性位点的突变GAPDH进行的实验也用BamHI限制性内切酶消化4-5小时)。在溴化乙锭染色的3％Nusieve、1％LE琼脂糖凝胶上60V电泳2-3小时分离这些产物。使用Polaroid 665正负即时胶片将胶拍成负片。
将负片进行光密度测定(SLR 2D/1D型Zeineh Soft激光扫描光密度测定仪，使用Zeineh 1D Autostepover Videophoresis程序软件，生物医学设备公司，Fullerton，California)。计算各个峰下的面积用于定量。根据谱带的相对大小和异源二聚体的形成进行修正。结果表示为GSH-Px和GAPDH的相对比值。
在第二套实验中，根据Celi法制备用竞争性模板的复合竞争性逆转录酶聚合酶链反应(MC RT-PCR)，以测定暴露在β-萘黄酮中的BEP2D细胞的细胞色素p450(CYP)IAI基因。CYPIAI基因表达的诱导是由利用Celi竞争性模板的MC RT-PCR和Northern分析测定的。制备了CYPIAI和GAPDH基因的竞争性模板。用于制备GAPDH的竞争性模板的引物是：
SEQ.I.D.No.13)(Tokunaga等人，癌研究，47：5616-5619，1990)
位点75 5’-GGT CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG-3’位点94和
SEQ.I.D.No.14)(Tokunaga等人，癌研究，47：5616-5619，1990)
                                    位点822\/位点636
位点842 5’-CCT CCG ACG CCT GCT TCA C CC CAT CAC GCC ACA GTTTCC C-3’位点616
与SEQ.I.D.No.13一起用于扩增竞争性的和天然模板的低级(lower)外引物是
SEQ.I.D.No.15)(Tokunaga等人，癌研究，47：5616-5619，1990)
位点842 5’-CCT CCG ACG CCT GCT TCA CC-3’位点822
用于制备CYPIAI的竞争性模板的引物是：
SEQ.I.D.No.16)(Jaiswal等人，科学228：80-83，1989)
位点1241 5’-CAT CCC CCA CAG CAC AAC AAG-3’位点1262和：
SEQ.I.D.No.17)(Jaiswal等人，科学228：80-83，1989)
                                位点1555\/位点1428
位点1575 5’-ACA GCA GGC ATG CTT CAT G GG TCT CAC CGA TAC ACTTCC G-3’位点1448
与SEQ.I.D.No.18一起用于扩增竞争性的和天然模板的低级外引物是
SEQ.I.D.No.18)(Jaiswal等人，科学228：80-83，1989)
位点1575 5’-ACA GCA GGC ATG CTT CAT GG-3’位点1555
PCR扩增条件与通过Higuchi法利用为GAPDH和GSHPX制备的竞争性模板的实验中所描述的方法相同，除了退火温度为55摄氏度以及扩增进行38个循环。
因为天然和竞争性模板的分离不需要事先的限制性内切酶消化，样品直接从PCR反应管中取出加入溴化乙锭染色的3％Nusieve、1％LE琼脂糖凝胶进行电泳。然后有可能通过用Polaroid 665正负即时胶片拍成负片、将负片进行光密度测定法定量。
按上面所描述的，与β-萘黄酮(10μM)温育不同时间的来自BEP2D细胞的RNA或者在1％LE甲醛变性胶上电泳用于Northern分析，或者进行MC RT-PCR扩增。对于Northern分析，将RNA转移到GeneScreen滤膜上后，与32P-标记的CYPIAI cDNA杂交。结果
在图1中粗略地表示了用于PCR定量的步骤。系列稀释的BEP2DcDNA(代表0.25微克至0.05微克总RNA)与恒定量的各个单碱基突变内部标准物(各10渺摩尔)共扩增，然后按上述进行分析。通过光密度法分析凝胶的负片以定量各个谱带，如图2中所示。
根据各个峰下的面积，得到天然/突变产物的相对比值。根据谱带的相对大小进行修正(即与天然GAPDH比较时突变的GAPDH乘以788/588，而与突变的GSH-Px比较时天然的GSH-Px乘以354/280)。经PCR后将产物加热到100℃10分钟，然后缓慢冷却可使异源二聚体的形成最多。使异源二聚体形成最多后，通过二次方程式分析光密度数据确定各个产物的量，因为异源二聚体的形成在这些条件下符合二项式分布(Gilliland等人，美国国家科学院院报，87：2725-2729，1990；Becher-Andre等人，核酸研究，17：9437-9446，1989)。最终结果表示为天然/突变的GSH-Px与天然/突变的GAPDH的优势比值(oddsratio)。而在图3所示的图中，无论是GSH-Px或是GAPDH，其天然产物(以绝对光密度单位表示)与总初始RNA的量并不总是保持线性，天然/突变的GSH-Px与总初始RNA比值和天然/突变的GAPDH与总初始RNA比值的曲线图对于两个基因都是线性的。将从各个样品管中得到的比值(2.18∶1，1.14∶1，2.00∶1，1.76∶1，2.46∶1，2.71∶1，和1.92∶1)平均，得到天然/突变的GSH-Px与天然/突变的GAPDH的比值的平均值为2.17∶1，标准差为0.33。所有值的变化都不超过平均值的25％。
为了评价该技术的变异性，利用不同稀释度的突变标准物和母混合物重复进行了上述实验。将从各个样品管中得到的比值(1∶9.09，1∶8.13，1∶9.43，1∶8.13，1∶6.62，1∶8.77，1∶7.69，1∶10.00，1∶7.58，和1∶7.04)平均，得到天然/突变的GSH-Px与天然/突变的GAPDH的比值的平均值为1∶8.25，标准差为1.07。所有值的变化都不超过平均值的22％。这证明了本技术的精确性，还表示了由含有新稀释度的突变标准物的新母混合物所引入的变异性。
为了评价使用相同的母混合物和稀释的突变标准物时样品之间的变异性，分别从三个三角瓶中独立地抽提出BEP2D RNA并逆转录为cDNA。只进行cDNA的粗稀释(5倍)。每个实验使用四支PCR管。获得的天然/突变的GSH-Px与天然/突变的GAPDH的比值为15.01∶1，17.69∶1，和21.76∶1(平均18.15，标准差3.40)。所有三个值都在平均值的20％以内。这证明了当经独立逆转录、但用相同的母混合物和内部标准物稀释扩增的样品比较时，本技术的精确性。
BEP2D RNA的Northern分析显示GSH-Px/GAPDH mRNA的比值大约为1∶8。
                        实施例
系列稀释的BEP2D cDNA与恒定量的各个单碱基突变的内部标准物竞争性模板(各10渺摩尔)共扩增，然后进行测定。凝胶的负片(图2所示)经光密度法分析以定量各谱带。
由光密度法分析各谱带得到的各个峰下的面积开始，按下面的方法计算天然/突变产物的比值。每次测定一个基因的数据。根据谱带的相对大小进行修正。(与天然GAPDH比较时突变的GAPDH乘以788/588，而与突变的GSH-Px比较时天然的GSH-Px乘以354/280)。在PCR时，在引物有限的条件下，具有序列同源性的异源单链DNA可以退火形成异源二聚体(Gilliland，G.，Perrin，S.，Blanchard，K.和Bunn，H.F，美国国家科学院院报，87：2725-2729，1990)。当异源单链之间仅相差1个碱基对时，如在本发明中，异源链可以随机地重新退火(Gilliland，G.，等人，同上；Thompson，J.D.，Brodsky，I.，和Yunis，J.J.，血液(Blood)79：1629-1635，1992)，如下面的Punnett方格中所示：N                                                   M
NN NM
NM MM
NM
其中N＝重退火前单链天然产物的比例，M＝重退火前单链突变的产物的比例，NN(或N2)＝重退火后双链天然产物的比例，2NM＝重退火后形成的异源二聚体的比例，以及MM(或M2)＝重退火后双链突变产物的比例。
异源二聚体是被间接计算的，因为它们不被限制性内切酶切，并且与未消化的同源二聚体具有相同的电泳迁移率。所以，异源二聚体与未消化的同源二聚体一起被通过光密度测定法测定。为了定量产物，根据Punnett方格分布，随机异源二聚体的形成在PCR后得到证实。证实的方法是(根据在Gilliland等人，同上；和Thompson等人，同上)通过将产物加热到100℃10分钟，然后缓慢冷却。
对于GAPDH，无论天然产物(NN)还是异源二聚体(NM)都不被EcoRI切割。因此，较大的谱带同时代表了天然的GAPDH同源二聚体(NN)和NM异源二聚体。根据Punnett方格，这条谱带以算术式表示为N2+2NM，而由EcoRI切割产生的谱带中的比例表示为M2。因此，当天然的(N)和突变的(M)模板的量在PCR之前相等(1∶1)时，在异源二聚体随机化形成后，表观比将为3∶1[(N2+2NM)∶M2]。为了进一步说明这一点，将从第一个样品泳道(示于图2)得到的原始光密度数据列于表1，经数学处理为最终比值如下：
M2的值是已知的(2,214)，N2+2NM的值也是已知的(10,095)。从这一信息可以计算M(47.05)并在二次方程(aX2+bX+c)中求解N值：
N2+2N(47.05)-10,095＝0
二次公式
Figure A9880744000281
用于求解N。此外，a＝1，b＝94.1，c＝10,095，所以N＝63.89。要求的信息是N/M比，即为63.89/47.10或1.36/1。(尽管PCR后存在的单链DNA的比例已解出，它们与PCR之前存在的相应的双链DNA的比例相同)。
因为光密度值是相对的，当加上＝1或(N2+2NM)+M2＝1时，有可能通过分配谱带相称的光密度值而避免使用二次公式的不便。解这个方程：
(N2+2NM)+M2＝(N+M)2＝1所以N+M＝1
分配给各个谱带的1的相对分数决定于它们各自的光密度值(表1)。因为两个谱带的总光密度值是12,309(10,095+2,214)，大谱带(N2+2NM)的相对比例是0.82(10,095/12,309)，而小谱带(M2)的相对比例是0.18(2,214/12,309)。因此，突变的GAPDH同源二聚体(M2)的比例是0.18，而单链突变的GAPDH(M)的比例是0.424。因为N+M＝1，所以单链天然GAPDH(N)的比例是1-0.424或0.576，而天然与突变产物之比是0.576/0.424或上面计算的1.36/1。
         表1图2中第一样品泳道的光密度数据
                长度         Zeineh光密度值      大小修正值    相对光密度值
               (碱基对)
     (A)GAPDH天然GAPDH和          788              10,095                            0.820异源二聚体(N2+2NM)突变的GAPDH(M2)     588              1,652          ×788/588＝2214    0.180
     (B)GSH-Px突变的GSH-Px和       354              6,709                             0.442异源二聚体(M2+2MN)天然GSH-Px(N2)      280              6,692          ×354/280＝8461    0.558
其次，使用从与上述GAPDH值相同泳道得到的天然和突变的GSH-Px的光密度值，进行同样的计算(表1)：
N2＝0.558，N＝0.747，M＝1-0.747＝0.253
得到天然/突变比：
GSH-Px天然/突变＝0.747/0.253＝2.95∶1
GAPDH天然/突变＝0.576/0.424＝1.36∶1
最终优势比为：
GSH-Px天然/突变：GAPDH天然/突变＝2.95/1.36＝2.17∶1
如上所述，最终值表示为一个天然/突变的GSH-Px与天然/突变的GAPDH的优势比。尽管无论对于GSH-Px还是GAPDH，天然产物(以绝对光密度单位表示)与总起始RNA的量之间的关系不总是保持线性(如图3所示)，但是天然/突变的GSH-Px和天然/突变的GAPDH与总起始RNA的比值对于两个基因都是线性的(如图4所示)。将从样品管中得到的天然/突变的GSH-Px与天然/突变的GAPDH比值(2.17∶1，2.14∶1，2.00∶1，1.76∶1，2.46∶1，2.71∶1，和1.92∶1)平均，得到平均值为2.17∶1，标准差为0.33。所有值的变化都不超过平均值的25％。
为了评价本技术的变异性，使用不同稀释的突变标准物和母混合物重复进行实验。将从各个样品管中得到的天然/突变的GSH-Px与天然/突变的GAPDH比值(1∶9.09，1∶8.13，1∶9.43，1∶8.13，1∶6.62，1∶8.77，1∶7.69，1∶10.00，1∶7.58，和1∶7.04)平均，得到平均值为1∶8.25，标准差为1.07。所有值的变化都不超过平均值的22％。
为了评价使用相同的母混合物和稀释的突变标准物(使用具有新的BamHI限制性位点的突变的GAPDH)时样品之间的变异性，分别从三个三角瓶中独立地抽提出BEP2D RNA并逆转录为cDNA。用5倍稀释的cDNA进行实验。每个实验四支PCR管。获得的天然/突变的GSH-Px与天然/突变的GAPDH的比值为15.01∶1，17.69∶1，和21.76∶1(平均18.15，标准差3.40)。所有三个值都在平均值的20％以内。
在Northern和MC RT-PCR分析中观察到的CYPIAI基因的表达大约在相同的水平，如图5所示。通过比较分别代表天然的和竞争性模板cDNA的GAPDH持家基因的谱带，清楚地发现大约相同量的cDNA加入到有1微升来自对照细胞样品的泳道和3微升来自β-萘黄酮处理的细胞样品的泳道中。确定了哪个泳道上加入了相同的cDNA，就清楚了在含有来自β-萘黄酮处理的细胞的泳道中，代表天然CYPIAI基因的谱带比在含有对照细胞的泳道中的谱带更强。
                          实施例
将40个竞争性模板集中在一个混合物中，所以在任一给定的样品中能够迅速地定量40个基因(混合物含有编码异生素代谢酶、分化特异的蛋白质、转录因子、DNA修复酶、细胞程序死亡蛋白的基因和其它基因)。在某些实施方案中，有超过80个基因的竞争性模板。在某些优选实施方案中，本发明的实施者并不必同时测定所有的这些基因；但是他们可能希望准备大约50个基因的混合物。
数据的误差和损失的最大来源以及最花费时间的是PCR反应的准备工作，然后是电泳时的上样。
通过制造具有毛细管的机器，利用定量RT-PCR，本发明提供了使分子分型过程自动化的方法和仪器。本发明的仪器是对寡DNA合成仪的改进。根据本发明，PCR反应是从与毛细管相连的储存器中的原液中准备的。混合或结合来自一特定cDNA的特定基因的扩增所必需的各个组份适当的等分样品后，混合物从毛细管转移到空气热循环仪中。然后，经过PCR后，将混合物直接转移到琼脂糖凝胶的孔中。充分电泳后，凝胶经自动数字成像，并且图象经自动分析以定量基因的表达。唯一需要手动的步骤是设定待扩增目的基因的程序和将待分析的cDNA样品加到仪器中以得到适当的等分样品。扩增所有被选基因的时间大约是混合10分钟、PCR扩增30分钟、电泳90分钟、以及10分钟的数字成像和数据分析，总计2小时15分钟。在某些实施方案中，该仪器包括一个40泳道的装置，可以在2小时多一点的时间内分析40个基因。在本发明所设想的范围内，还可以制造具有200或1000或更多泳道的仪器。
图6是本发明的仪器的一个示意图。该线路包括Y-阀1、2和4，多通道连接器1。该仪器的功能如下。
在玻璃瓶A中的溶液A是PCR反应混合物的储存液，含有各种dNTP、缓冲液、电泳染料以及β-肌动蛋白或GAPDH的引物，或不含该引物。一根毛细管穿过玻璃瓶A的盖上的O-环，然后穿过一开/关阀再进入Y-阀1中。进入Y-阀1的其它毛细管由多通道连接器1引出。在所示的实施方案中，有20根进入多通道连接器1中的毛细管。这进入多通道连接器1的20根毛细管的每一根都来自一个开/关阀。进入开/关阀的毛细管来自玻璃瓶中的单独的竞争性模板(CT)混合物(溶液B)，并穿过了盖上的O-环。有4组竞争性模板混合物(每组含100种有5种不同体积摩尔浓度(10E-12-10E-16M)的不同的竞争性模板)。可根据需要将CT混合物改到不同的组中。来自离开Y-阀1的毛细管进入Y-阀2中。进入Y-阀2的其它毛细管来自多通道连接器2。离开Y-阀2的毛细管进入Y-阀4。进入Y-阀4的其它毛细管来自多通道连接器3。离开Y-阀4毛细管进入Y-阀5。
该仪器还包括Y-阀3和多通道连接器2。在所示的实施方案中，有40根集中于多通道连接器2的毛细管，而其中每一根分别来自40个Y-阀3。进入各个Y-阀3的毛细管分别来自40个含有某一特定基因引物的溶液(溶液C)的玻璃瓶中。在Y-阀3和多通道连接器2之间是开/关阀。离开Y-阀3的另一根毛细管进入Y-阀7。
该仪器还包括Y-阀5、6、7和8以及多通道连接器4。在所示的实施方案中，离开每个Y-阀3的其它毛细管通过开/关阀然后与Y-阀7相连。进入Y-阀7的其它毛细管来自多通道连接器4，它们穿过了开/关阀。进入多通道连接器4的毛细管来自Y-阀5。离开Y-阀7的10根毛细管进入Y-阀8。进入Y-阀8的其它毛细管来自Y-阀6，它们穿过了开/关阀。剩下30个Y-阀7的毛细管和离开10个Y-阀8的毛细管分别进入空气热循环仪内的一个玻璃毛细管中。
所需的溶液可以含有下列材料。
含有缓冲液、电泳染料、甘油和各种dNTP，以及含有或不含肌动蛋白或GAPDH引物的PCR反应组成成分(每个反应6微升)，储存于0℃。
10×浓缩的竞争性模板(CT)混合物(每个反应1微升)。50个竞争性模板的四种不同的混合物以五种不同浓度储存于储存器中，共有20个竞争性模板混合物储存器。
引物(每个反应1微升)。有50个引物溶液的分离储存器。每种溶液含有一对10×浓缩的引物。溶液分为50组，根据实验所计划的竞争性模板溶液可以加以改变。
Taq聚合酶溶液(每个反应1微升)，储存于0℃。
cDNA溶液(每个反应1微升)。各个实验可以有所改变。每个cDNA溶液含有β-肌动蛋白和/或GAPDH内部标准物以高效逆转录。逆转录前，在各个RNA样品中含有已知量的含polyA尾巴并与β-肌动蛋白或GAPDH序列共线性的RNA序列。该序列是被缩短的β-肌动蛋白或GAPDH，它将利用扩增天然序列的引物进行扩增。
根据这里描述的方法，经定量RT-PCR后利用高密度寡核苷酸阵列测定PCR产物的用途可以有下列变化。与所扩增的各个cDNA的有义链杂交的寡核苷酸可被荧光标记。PCR反应中的一个或多个dNTP可被用荧光染料标记。
可制备具有以下特性的高密度寡核苷酸阵列。对于每个基因，准备两个寡核苷酸阵列。一个阵列已与其寡核苷酸(图2中的a)结合，该寡核苷酸与利用此处描述的方法经PCR扩增的某基因的天然模板特异的序列同源，并可与该序列结合。另一个阵列已与其寡核苷酸(图2中的b)结合，该寡核苷酸与竞争性模板的5’端和根据Celi的方法制备的竞争性模板的缩短的、错排(mis-aligned)的3’端附近的序列同源，并可与该序列结合。
将PCR产物应用于根据上述方法制备的高密度寡核苷酸阵列。靶基因的表达通过比较持家基因和靶基因的天然和竞争性模板阵列的荧光强度而定量。
                  序列表(1)一般信息：
(i)申请人：Willey，James C
(ii)发明名称：利用复合竞争性逆转录酶-聚合酶链反应定量测定基因表达的方法
(iii)序列数目：18
(iv)联系地址：
  (A)联系人：Emch，Schaffer，Schaub，& Porcello Co.，L.P.A.
  (B)街道：One Seagate，Suite 1980
  (C)城市：Toledo
  (D)州：Ohio
  (E)国家：美国
  (F)邮政编码：43604
(v)计算机可读形式：
  (A)介质类型：磁盘
  (B)计算机：IBM兼容机
  (C)操作***：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：PatentIn Release #1.0 Version #1.25
(vi)当前申请信息：
  (A)申请号：08/188,434
  (B)递交日期：1994年1月28日
  (C)分类：
(vi)在先申请信息：
  (A)申请号：08/043,390
  (B)递交日期：1993年4月6日
  (C)分类：
(viii)律师/代理机构信息：
  (A)名称：Martineau，Catherine B.
  (B)登记号：31,854
  (C)文献/案卷号：93206
(ix)通讯信息：
  (A)电话：(419)243-1294
  (B)传真：(419)243-8502(2)SEQ.ID.NO.1的信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：21个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假拟：非
(iv)反义：否
(v)片段类型：内部
(vi)初始来源：
  (A)生物：人
  (H)细胞系：HL-60
(x)公开文本信息：
  (A)作者：Chada，S.
         Le Beau，M.M.
         Casey，L.
         Newberger，P.E.
  (C)杂志：基因组
  (D)卷号：6
  (E)页码：268-271
  (F)日期：1990年9月
(xi)SEQ.ID.NO.1的序列描述：
     GGGGCCTGGT GGTGCTCGGC T(2)SEQ.ID.NO.2的信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：21个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假拟：非
(iv)反义：否
(v)片段类型：内部
(vi)初始来源：
  (A)生物：人
  (H)细胞系：HL-60
(x)公开文本信息：
  (A)作者：Chada，S.
         Le Beau，M.M.
         Casey，L.
         Newberger，P.E.
  (C)杂志：基因组
  (D)卷号：6
  (E)页码：268-271
  (F)日期：1990年9月
(xi)SEQ.ID.NO.2的序列描述：
     CAATGGTCTG GAAGCGGCGG C(2)SEQ.ID.NO.3的信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：30个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假拟：非
(iv)反义：否
(v)片段类型：内部
(vi)初始来源：
  (A)生物：人
  (D)发育阶段：成年
  (H)细胞系：HL-60
(x)公开文本信息：
  (A)作者：Chada，S.
         Le Beau，M.M.
         Casey，L.
         Newberger，P.E.
  (C)杂志：基因组
  (D)卷号：6
  (F)页码：268-271
  (G)日期：1990年
(xi)SEQ.ID.NO.3的序列描述：
    ATTCTGATTT CCCTCAAGTA CGTCCGGCCT(2)SEQ.ID.NO.4的信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：30个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假拟：非
(iv)反义：否
(v)片段类型：内部
(vi)初始来源：
  (A)生物：人
  (D)发育阶段：成年
  (H)细胞系：HL-60
(x)公开文本信息：
  (A)作者：Chada，S.
         Le Beau，M.M.
         Casey，L.
         Newberger，P.E.
  (C)杂志：基因组
  (D)卷号：6
  (F)页码：268-271
  (G)日期：1990年9月
(xi)SEQ.ID.NO.4的序列描述：
    TAAGACTAAA GGGAGTTCAT GCAGGCCGGA(2)SEQ.ID.NO.5的信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：25个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假拟：非
(iv)反义：否
(v)片段类型：内部
(vi)初始来源：
  (A)生物：人
  (D)发育阶段：成年
  (F)组织类型：肝脏
  (G)细胞类型：肝细胞
(x)公开文本信息：
  (A)作者：Tso，J.Y.
         Sun，X.
         Kao，T.
         Reece，K.S.
         Wu，R.
  (C)杂志：核酸研究
  (D)卷号：13
  (E)页码：2485-2502
  (F)日期：1985年
(xi)SEQ.ID.NO.5的序列描述：
    GGTCGGGAGT CAACGGATTT GGTCG(2)SEQ.ID.NO.6的信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：22个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假拟：非
(iv)反义：否
(v)片段类型：内部
(vi)初始来源：
  (A)生物：人
  (D)发育阶段：成年
  (F)组织类型：肝脏
  (G)细胞类型：肝细胞
(x)公开文本信息：
  (A)作者：Tso，J.Y.
         Sun，X.
         Kao，T.
         Reece，K.S.
         Wu，R.
  (C)杂志：核酸研究
  (D)卷号：13
  (E)页码：2485-2502
  (F)日期：1985年
(xi)SEQ.ID.NO.6的序列描述：
    CCTCCGACGC CTGCTTCACC AC(2)SEQ.ID.NO.7的信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：24个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假拟：非
(iv)反义：否
(v)片段类型：内部
(vi)初始来源：
  (A)生物：人
  (D)发育阶段：成年
  (F)组织类型：肝脏
  (G)细胞类型：肝细胞
(x)公开文本信息：
  (A)作者：Tso，J.Y.
         Sun，X.
         Kao，T.
         Reece，K.S.
         Wu，R.
  (C)杂志：核酸研究
  (D)卷号：13
  (E)页码：2485-2502
  (F)日期：1985年
(xi)SEQ.ID.NO.7的序列描述：
    TGATCAATGG AATTCCCATC ACCA(2)SEQ.ID.NO.8的信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：24个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假拟：非
(iv)反义：否
(v)片段类型：内部
(vi)初始来源：
  (A)生物：人
  (D)发育阶段：成年
  (F)组织类型：肝脏
  (G)细胞类型：肝细胞
(x)公开文本信息：
  (A)作者：Tso，J.Y.
         Sun，X.
         Kao，T.
         Reece，K.S.
         Wu，R.
  (C)杂志：核酸研究
  (D)卷号：13
  (E)页码：2485-2502
  (F)日期：1985年
(xi)SEQ.ID.NO.8的序列描述：
    ACTAGTTACC TTAAGGGTAG TGGT(2)SEQ.ID.NO.9的信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假拟：非
(iv)反义：否
(v)片段类型：内部
(vi)初始来源：
  (A)生物：人
  (D)发育阶段：成年
  (F)组织类型：肝脏
  (G)细胞类型：肝细胞
(x)公开文本信息：
  (A)作者：Tso，J.Y.
         Sun，X.
         Kao，T.
         Reece，K.S.
         Wu，R.
  (C)杂志：核酸研究
  (D)卷号：13
  (E)页码：2485-2502
  (F)日期：1985年
(xi)SEQ.ID.NO.9的序列描述：
    CATGGCACCG TCAAGGCAAC(2)SEQ.ID.NO.10的信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：22个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假拟：非
(iv)反义：否
(v)片段类型：内部
(vi)初始来源：
  (A)生物：人
  (D)发育阶段：成年
  (F)组织类型：肝脏
  (G)细胞类型：肝细胞
(x)公开文本信息：
  (A)作者：Tso，J.Y.
         Sun，X.
         Kao，T.
         Reece，K.S.
         Wu，R.
  (C)杂志：核酸研究
  (D)卷号：13
  (F)页码：2485-2502
  (G)日期：1985年
(xi)SEQ.ID.NO.10的序列描述：
    CCTCCGACGC CTGCTTCACC AC(2)SEQ.ID.NO.11的信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：26个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假拟：非
(iv)反义：否
(v)片段类型：内部
(vi)初始来源：
  (A)生物：人
  (D)发育阶段：成年
  (F)组织类型：肝脏
(x)公开文本信息：
  (A)作者：Tso，J.Y.
         Sun，X.
         Kao，T.
         Reece，K.S.
         Wu，R.
  (C)杂志：核酸研究
  (D)卷号：13
  (F)页码：2485-2502
  (G)日期：1985年
(xi)SEQ.ID.NO.11的序列描述：
    CAGGGGGGAT CCAAAAGGGT CATCAT(2)SEQ.ID.NO.12的信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：26个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假拟：非
(iv)反义：否
(v)片段类型：内部
(vi)初始来源：
  (A)生物：人
  (D)发育阶段：成年
  (F)组织类型：肝脏
(x)公开文本信息：
  (A)作者：Tso，J.Y.
         Sun，X.
         Kao，T.
         Reece，K.S.
         Wu，R.
  (C)杂志：核酸研究
  (D)卷号：13
  (E)页码：2485-2502
  (F)日期：1985年
(xi)SEQ.ID.NO.12的序列描述：
    GTCCCCCCTA GGTTTTCCCA GTAGTA(2)SEQ.ID.NO.13的信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：24个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假拟：非
(iv)反义：否
(vi)初始来源：
  (A)生物：人
  (F)组织类型：肝脏
(x)公开文本信息：
  (A)作者：Tokunaga，K.
         Nakamura，Y.
         Sakata，K.
        Fujimora，K.
        Ohkubo，M.
        Sawada，K.
        Sakiyama，S.
  (B)标题：人肺癌中甘油醛-3-磷酸脱氢酶的表达提高
  (C)杂志：癌症研究
  (D)卷号：47
  (F)页码：5616-5619
  (G)日期：1990年夏
  (K)SEQ IN NO：13的相关残基：1-24
(xi)SEQ.ID.NO.13的序列描述：
    GGTCGGAGTC AACGGATTTG GTCG(2)SEQ.ID.NO.14的信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：40个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA至mRNA
(iii)假拟：非
(iv)反义：否
(vi)初始来源：
  (A)生物：人
  (D)发育阶段：成年
  (F)组织类型：肺
  (G)细胞类型：支气管上皮
  (H)细胞系：肺癌
(x)公开文本信息：
  (A)作者：Tokunaga，K.
         Nakamura，Y.
         Sakata，K.
         Fujimora，K.
         Ohkubo，M.
         Sawada，K.
         Sakiyama，S.
  (B)标题：人肺癌中甘油醛-3-磷酸脱氢酶的表达提高
  (C)杂志：癌症研究
  (D)卷号：47
  (F)页码：5616-5619
  (G)日期：1990年夏
  (K)SEQ IN NO：14的相关残基：1-40
(xi)SEQ.ID.NO.14的序列描述：
    CCTCCGACGC CTGCTTCACC CCATCACGCC ACAGTTTCCC(2)SEQ.ID.NO.15的信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA至mRNA
(iii)假拟：非
(iv)反义：否
(vi)初始来源：
  (A)生物：人
  (D)发育阶段：成年
  (F)组织类型：肺
  (G)细胞类型：支气管上皮
  (H)细胞系：肺癌
(x)公开文本信息：
  (A)作者：Tokunaga，K.
         Nakamura，Y.
         Sakata，K.
         Fujimori，K.
         Ohkubo，M.
         Sawada，K.
         Sakiyama，S.
  (B)标题：人肺癌中甘油醛-3-磷酸脱氢酶的表达提高
  (C)杂志：癌症研究
  (D)卷号：47
  (F)页码：5616-5619
  (G)日期：1990年夏
  (K)SEQ IN NO：15的相关残基：1-20
(xi)SEQ.ID.NO.15的序列描述：
    CCTCCGACGC CTGCTTCACC(2)SEQ.ID.NO.16的信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：21个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA至mRNA
(iii)假拟：非
(iv)反义：否
(vi)初始来源：
  (A)生物：人
  (D)发育阶段：成年
  (F)组织类型：乳腺
  (G)细胞类型：乳腺上皮
  (H)细胞系：MCF-7
(x)公开文本信息：
  (A)作者：Jaiswal，A.K.
         Gonzalez，F.J.
         Nebert，D.W.
  (B)标题：人二恶英诱导的细胞色素P-1-450(TCDD-诱导)mRNA，完整CDS。
  (C)杂志：科学
  (D)卷号：228
  (F)页码：80-83
  (G)日期：1989年6月15日
  (K)SEQ IN NO：16的相关残基：1-21
(xi)SEQ.ID.NO.16的序列描述：
    CATCCCCCAC AGCACAACAA G(2)SEQ.ID.NO.17的信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：40个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA至mRNA
(iii)假拟：非
(iv)反义：否
(vi)初始来源：
  (A)生物：人
  (D)发育阶段：成年
  (F)组织类型：乳腺
  (G)细胞类型：乳腺上皮
  (H)细胞系：MCF-7
(x)公开文本信息：
  (A)作者：Jaiswal，A.K.
         Gonzalez，F.J.
         Nebert，D.W.
  (B)标题：人二恶英诱导的细胞色素P1-450：互补DNA和氨基酸序列。
  (C)杂志：科学
  (D)卷号：228
  (F)页码：80-83
  (G)日期：1989年6月15日
  (K)SEQ IN NO：17的相关残基：1-40
(xi)SEQ.ID.NO.17的序列描述：
    ACAGCAGGCA TGCTTCATGG GTCTCACCGA TACACTTCCG(2)SEQ.ID.NO.18的信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA至mRNA
(iii)假拟：非
(iv)反义：否
(vi)初始来源：
  (A)生物：人
  (D)发育阶段：成年
  (F)组织类型：乳腺
  (G)细胞类型：乳腺上皮
  (H)细胞系：MCF-7
(x)公开文本信息：
  (A)作者：Jaiswal，A.K.
         Gonzalez，F.J.
         Nebert，D.W.
  (B)标题：人二恶英诱导的细胞色素P1-450：互补DNA和氨基酸序列。
  (C)杂志：科学
  (D)卷号：228
  (F)页码：80-83
  (G)日期：1989年6月15日
  (K)SEQ IN NO：18的相关残基：1-20
(xi)SEQ.ID.NO.18的序列描述：
    ACAGCAGGCA TGCTTCATGG

Claims (30)

1.一种定量测定靶基因的基因表达的方法，它包括：
(a)分离靶基因和持家基因的细胞mRNA，其经逆转录并在竞争性模板存在下被特异性扩增，得到各靶基因与各持家基因之比，将该比值用于估计各靶基因的基因表达量，方法是通过进行如下混合物的同时聚合酶链反应扩增，混合物中含有下列成分：
i)各靶基因的至少一个寡核苷酸引物对，
ii)各持家基因的至少一个寡核苷酸引物对，
iii)各靶基因的至少一个突变的竞争性模板，
iv)各持家基因的至少一个突变的竞争性模板，及
v)含有各靶基因cDNA的至少一个拷贝，和各持家基因cDNA的至少一个拷贝的天然cDNA；
经扩增以形成聚合酶链反应cDNA产物，其中含有：各靶基因与各持家基因的天然cDNA，和各靶基因与各持家基因的突变的cDNA；PCR反应混合物中含有适量的不同靶基因的竞争性模板混合物各竞争性模板之间的浓度已知，还含有相对于靶基因定量的不同的持家基因，从而使被评估的靶基因与持家基因的天然和竞争性模板通过下列扩增而测得，方法是：i)制备足够的含有cDNA等份、竞争性模板混合物、各种dNTP、热稳定的DNA聚合酶和相应于待测基因数目的缓冲液的母混合物；ii)将反应混合物的等分样品加入到置于冰上的反应容器中，反应容器的数目相应于待测基因的数目，和iii)将待测基因的特异性引物的等分样品加入到各反应容器中，并将持家基因的引物加入一个单独的管中，
(b)分离cDNA产物；
(c)通过将编码各靶基因的天然cDNA的量和编码靶基因竞争性模板的突变的cDNA的量，与编码各持家基因的天然cDNA的量和编码持家基因竞争性模板的突变的cDNA的量相比较，检测天然cDNA产物和突变cDNA产物的相关存在量其中比较靶基因与持家基因的天然cDNA产物和突变cDNA产物的量的相关存在量提供了定量测定靶基因表达的方法；以及，
(d)测定相应于天然基因的PCR产物的谱带密度与相应于各基因的竞争性模板的PCR产物的谱带密度之比；其中，对于各个基因，将靶基因的天然/竞争性模板的密度比除以持家基因的天然/竞争性模板的密度比，得到单位为mRNA/106β-肌动蛋白mRNA的最终值。
2.权利要求1的方法，其中靶基因和持家基因的突变的竞争性模板：a)包括至少一个含有分别与靶基因或持家基因同源的序列的寡核苷酸；和b)含有至少一个已知的限制性内切核酸酶识别位点序列或有一个点突变的限制性内切核酸酶识别序列。
3.权利要求2的方法，其中点突变包括一个或两个碱基对错配。
4.权利要求3的方法，其中点突变导致EcoRI限制性内切核酸酶识别位点的获得或丢失。
5.权利要求1的方法，其中靶基因和持家基因具有相同的识别位点。
6.权利要求1的方法，其中cDNA产物的分离是通过用限制性酶消化cDNA产物，然后将被消化的cDNA产物电泳使天然cDNA产物与突变cDNA产物分开。
7.权利要求6的方法，其中靶基因的突变竞争性模板导致EcoRI限制性位点的丢失，而持家基因的突变竞争性模板导致EcoRI限制性位点的获得。
8.权利要求7的方法，其中cDNA产物用EcoRI消化。
9.权利要求1的方法，其中靶基因和持家基因的突变竞争性模板含有人工缩短的竞争性模板。
10.权利要求1的方法，其中聚合酶链反应扩增可以进行到使异源二聚体的形成最多的程度。
11.权利要求1的方法，其中至少一种持家基因选自甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白或28S RNA。
12.权利要求1的方法，其中突变的内部标准物竞争性模板通过定点突变制备。
13.权利要求1的方法，其中在进行同时聚合酶链反应扩增各个突变的竞争性模板之前：
i)利用一个外部引物和一个内部单碱基错配的突变内部标准物竞争性模板引物，进行两次初始聚合酶链反应，产生两个重叠的DNA片段；
ii)分离并纯化上面步骤(i)的初始聚合酶链反应产生的重叠DNA片段；
iii)仅利用外部引物进行聚合酶链反应扩增每个重叠DNA片段；
iv)根据上面的权利要求7，在没有引物下进行聚合酶链反应扩增，以形成异源二聚体；以及
v)纯化并扩增上面步骤(iv)的聚合酶链反应产物，然后加以稀释用作竞争性模板。
14.一种定量测定组织样品中不同靶基因表达的方法，它包括：
a)合成至少一种持家基因的至少一种寡核苷酸引物对，
b)合成各个靶基因的至少一种寡核苷酸引物对，
c)合成各个持家基因的至少一种竞争性模板，
d)合成各个靶基因的至少一种竞争性模板，
e)从所述组织样品中分离至少一种RNA序列的一部分，
f)将该RNA序列逆转录获得至少一种天然cDNA，
g)在各个靶基因的寡核苷酸引物、各个持家基因的寡核苷酸引物、以及预先定量的各个持家基因的竞争性模板和各个靶基因的竞争性模板存在的情况下，进行聚合酶链反应扩增天然cDNA，其中PCR扩增混合物中含有适当量的不同靶基因的竞争性模板混合物，各竞争性模板之间的浓度已知还含有相对于靶基因的定量的不同持家基因混合物，以使被评价的靶基因与持家基因的天然和竞争性模板在扩增后能够测得，方法是通过i)制备足够的含有cDNA等分样品、竞争性模板混合物、各种dNTP、热稳定的DNA聚合酶和相应于待测基因的数目的缓冲液的母混合物；ii)将反应混合物的等分样品加入到置于冰上的反应容器中，反应容器的数目相应于待测基因的数目，和iii)将待测基因特异性引物的等分样品加入到各反应容器中，并将持家基因的引物加入一个单独的管中，
h)将上面步骤“g”扩增的cDNA产物用至少一种限制性酶消化，
i)将经消化的cDNA电泳，使扩增的靶基因和扩增的持家基因与扩增的靶基因竞争性模板和扩增的持家基因竞争性模板分离开，以及
j)测定至少一种组织样品中靶基因的相关联的表达，方法是将靶基因与已知量的靶基因的竞争性模板之比除以持家基因与持家基因的已知量的竞争性模板之比，通过测定相应于天然基因PCR产物谱带的密度与相应于各基因的竞争性模板的PCR产物谱带的密度之比，定量测定靶基因的表达；其中，对于每个基因，将靶基因的天然/竞争性模板密度之比除以持家基因的天然/竞争性模板密度之比，得到单位为mRNA/106β-肌动蛋白mRNA的最终值。
15.权利要求14的方法，其还包括制备持家基因经人工缩短的竞争性模板以作为持家基因的内部突变标准物竞争性模板，从而不必将扩增的cDNA进行限制性酶消化。
16.权利要求14的方法，其中聚合酶链反应产物在约94℃变性，并缓慢冷却使异源二聚体形成。
17.一种用于定量测量目的靶基因基因表达的仪器，包括一种自动混合母混合物和竞争性模板混合物的程序化的方法，使得目的基因能够在任何特定cDNA样品上进行分析。
18.权利要求17的仪器，包括一种通过定量RT-OCR进行分子分型的方法，包括一种从与毛细管相连的储存器中的储存液中准备PCR反应的方法；
一种将从特定cDNA扩增特定基因所必需的各组成成分的适当等分样品混合起来形成混合物的方法；
一种将混合物经过毛细管转移到空气热循环仪中去的方法；
一种在PCR后将混合物直接转移到琼脂糖凝胶孔中去的方法；
一种凝胶数字成像方法；以及，
一种分析数字图象以定量基因表达的方法。
19.权利要求18的仪器，其中该仪器包括的线路含有
i)Y-阀1，2和4以及多通道连接器1，其中玻璃瓶A中的溶液A是PCR反应混合物的储存液，其中含有各种dNTP、缓冲液、电泳染料、含有或不含β-肌动蛋白或GAPDH的引物，一根毛细管通过玻璃瓶A盖子上的O-环、再通过一个开/关阀进入Y-阀1；另一根进入Y-阀1的毛细管来自多通道连接器1；
其中多根毛细管被引入多通道连接器1中，每根引入多通道连接器1的毛细管都来自于一个开/关阀，引入开/关阀的毛细管在经过盖子上的O-环后来自玻璃瓶中的独立的竞争性模板(CT)混合物(溶液B)，其中有4组竞争性模板混合物(每组含100个有5种不同摩尔浓度的竞争性模板(10E-12-10E-16M)，以及一种将竞争性模板混合物组改变为不同组别的方法；
其中来自Y-阀1的毛细管进入Y-阀2，其它进入Y-阀2的毛细管来自多通道连接器2，离开Y-阀2的毛细管进入Y-阀4，其它进入Y-阀4的毛细管来自多通道连接器3，而离开Y-阀4的毛细管进入Y-阀5；
ii)Y-阀3和多通道连接器2，其中有多根毛细管进入多通道连接器2，且都来自各个Y-阀3，进入各个Y-阀3的毛细管来自一个含有特定基因引物溶液的玻璃瓶中，其中在Y-阀3和多通道连接器2之间是开/关阀，而其它离开Y-阀3的毛细管进入Y-阀7；以及
iii)Y-阀5，6，7和8及多通道连接器4，其中其它离开各个Y-阀3的毛细管经过一个开/关阀后与Y-阀7相连，其它进入Y-阀7的毛细管在经过开/关阀后来自多通道连接器4，进入多通道连接器4的毛细管来自Y-阀5，四分之一离开Y-阀7的毛细管进入Y-阀8，其它进入Y-阀8的毛细管在经过开/关阀后来自Y-阀6，Y-阀7的剩余四分之三的毛细管和离开Y-阀8的毛细管进入空气热循环仪中的独立的玻璃毛细管。
20.权利要求19的仪器，其中溶液A含有PCR反应组成成分，包括缓冲液、电泳染料、甘油，和各种dNTP，以及含有或不含肌动蛋白或GAPDH引物，储存于0℃(每个反应6微升)。
21.权利要求19的仪器，其中溶液B含有10×浓度的竞争性模板(CT)混合物(每个反应1微升)，还包括盛有5种不同浓度的4种不同的50个竞争性模板混合物的储存器，总共有20个竞争性模板混合物储存器。
22.权利要求19的仪器，其中溶液C含有引物(每个反应1微升)，还包括50个盛有引物溶液的独立储存器，其中每种溶液含有一对10×浓度的引物。
23.权利要求19的仪器，其使用储存于0℃的Taq聚合酶溶液(每个反应1微升)。
24.权利要求19的仪器，其使用依每个实验变化的cDNA溶液(每个反应使用1微升)，其中各cDNA溶液含有β-肌动蛋白和/或GAPDH内部标准物以提高逆转录的效率，并且在逆转录前，各个RNA样品中已包含有已知量的与β-肌动蛋白或GAPDH序列共线性的、含有多聚A尾巴的RNA序列，其中该序列是用扩增天然序列所用的引物扩增的β-肌动蛋白或GAPDH的缩短的序列。
25.权利要求19的仪器，其还包括经定量RT-PCR后测定PCR产物的高密度寡核苷酸阵列。
26.权利要求25的仪器，其中可与被扩增的各个cDNA的有义链杂交的寡核苷酸被荧光标记。
27.权利要求25的仪器，其中PCR反应中的一种或多种dNTP被荧光染料标记。
28.权利要求25的仪器，其中高密度寡核苷酸阵列具有下列特征：
对于每个基因，制备两个寡核苷酸阵列；
i)一个阵列与经PCR扩增的基因之天然模板的独特序列同源的寡核苷酸结合，并可与该独特序列结合；以及
ii)另一个阵列与跨越竞争性模板的5’端和被缩短的、错排的竞争性模板的3’端之间的连接区的序列同源的寡核苷酸结合，并可与该序列结合。
29.权利要求28的仪器，其中的PCR产物用于高密度寡核苷酸阵列。
30.权利要求29的仪器，其中靶基因表达的定量是通过比较持家基因和靶基因的天然模板与竞争性模板阵列的荧光强度完成的。
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