CN1261278A - 用pADPRT抑制剂治疗炎症和炎性疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种治疗动物或哺乳动物体内炎症或炎性疾病的方法,该方法包括给予所述动物或哺乳动物有效量的pADPRT抑制性化合物的步骤。

Description

用pADPRT抑制剂治疗炎症和炎性疾病的方法
本发明涉及治疗动物或哺乳动物体内炎症和炎性疾病(包括关节炎)的方法。本发明还涉及治疗患有因脂多糖全身性感染或侵袭而引起的革兰阴性和革兰阳性内毒素症状的动物或哺乳动物的方法。这些方法涉及采用治疗有效量的pADPRT抑制性化合物。
                         发明背景
已经报道pADPRT抑制性化合物可用来治疗癌症和病毒感染。这些方法的例子在美国专利No.5,464,871；5,473,074；5,482,975；5,484,951；5,516,941和5,583,155中有所描述，这些专利内容均纳入本文作参考。
在出版的文献中，最近已经表明，5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)(一种新的核酶多腺苷二磷酸核糖聚合酶(pADPRT)抑制剂)在Ha-ras转染的内皮细胞系中抑制体内致肿瘤作用；Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)处理修饰了ras转化的牛内皮细胞系的生长相关性酶促通道且导致致肿瘤作用明显丧失″，Int.J.Oncol.8：239-252；Bauer等人，1995，″用一种多腺苷二磷酸核糖聚合酶的非共价结合配体5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮逆转恶性肿瘤表型″Biochimie 77：347-377。INH2BP的处理还导致拓扑异构酶I和II和MAP激酶活性发生改变；Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)处理修饰了ras转化的牛内皮细胞系的生长相关性酶促通道且导致致肿瘤作用明显丧失″，Int.J.Oncol.8：239-252；Bauer等人，1995，″用一种多腺苷二磷酸核糖聚合酶的非共价结合配体5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮逆转恶性肿瘤表型″Biochimie 77：347-377。根据观察到的效果，已经提出了关于INH2BP在治疗癌症中有潜在应用的假设；Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)处理修饰了ras转化的牛内皮细胞系的生长相关性酶促通道且导致致肿瘤作用明显丧失″，Int.J.Oncol.8：239-252；Bauer等人，1995，″用一种多腺苷二磷酸核糖聚合酶的非共价结合配体5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮逆转恶性肿瘤表型″Biochimie 77：347-377。
恶性生长和发炎过程均具有某些细胞信号转导通道的激活作用，例如MAP激酶；Kyriakis等人，1996，″警告：由应力和发炎激活的蛋白激酶级联反应″，J.BiolChem.271：24313-24316；Ferrell，JE，1996，″打开难以置信的开关：蛋白激酶级联反应怎样能将分级的输入转变成类似开关的输出″TIBS 21：460-466。慢性炎症通常导致致癌转化作用，例如在肠上皮例子中所证明的；Kawai等人，1993，″脂多糖诱导炎症增强大鼠膀胱致癌作用″Cancer Res.53：5172-5；Rosin等人，1994，″炎症、染色体不稳定和癌症：血吸虫病模型″Caner Res.54(第7增版)：1929s-1933s；Choi等人，1994，″Crohn疾病和溃疡性结肠炎的结肠直肠癌的相似性：致癌作用的暗示和预防″Gut 35：950-4。根据慢性炎症和致癌转化之间的关联，本研究的目的是调查INH2BP是否在体外和体内影响炎症过程。在我们的研究中，多种促炎中介体由细菌脂多糖(内毒素，LPS)诱导产生。已知LPS诱导了大量细胞反应，并触发了全身性炎症反应。LPS诱导的促炎中介体包括肿瘤坏死因子α(TNF)、白细胞介素-1、γ干扰素，而抗炎性中介体包括白细胞介素-10(IL-10)和白细胞介素13；Deltenre等人，1995，″胃癌：幽门螺杆菌踪迹″Acta Gastroenterol Belg.58：193-200；Beutler，1995，″TNF、免疫力和炎性疾病：过去十年的教训″J.Invest.Med.42：277-35；Liles等人，1995，″综述：参与炎症和宿主免疫应答的细胞因子的命名法和生物意义″J.Infect.Dis.172：1573-80；Giroir，1993，″脓毒休克的中介体：打断内源性炎性级联反应的方法″Critical Car.Med.21：780-9。由于产生了这些炎性细胞因子，LPS引发产生炎性自由基(氧集中的自由基如超氧化物，和氮集中的自由基如一氧化氮[NO])和***素；Nathan，1992，″一氧化氮作为哺乳动物细胞的分泌型产物″FASEB J.6：3051-3064；Vane，J.R.，The Croonian Lecture 1993，″内皮：血液循环的大师(maestro)″Proc.Roy.Soc.Lond B 343：225-246；Szabo，C.；1995，″各种形式的循环性休克中一氧化氮的产生的变化″New Horizons 3：3-32。炎症时产生NO是由于NO合成酶的一种独特的同种型(iNOS)的表达，而炎性细胞因子的产生则解释成表达出环加氧酶的独特同种型(环加氧酶-2，COX-2)；Nathan，1992，″一氧化氮作为哺乳动物细胞的分泌型产物″FASEB J.6：3051-3064；Vane，J.R.，The Croonian Lecture 1993，″内皮：血液循环的大师(maestro)″Proc.Roy.Soc.Lond B 343：225-246；Szabo，C.；1995，″各种形式的循环性休克中一氧化氮的产生的变化″New Horizons 3：3-32。iNOS、COX-2以及上述促炎细胞因子和自由基在LPS诱导的发炎反应中起重要作用；Nathan，1992，″一氧化氮作为哺乳动物细胞的分泌型产物″FASEB J.6：3051-3064；Vane，J.R.，The Croonian Lecture 1993，″内皮：血液循环的大师(maestro)″Proc.Roy.Soc.Lond B 343：225-246；Szabo，C.；1995，″各种形式的循环性休克中一氧化氮的产生的变化″New Horizons 3：3-32。另外，已有暗示，NO(或其毒性副产物过氧亚硝酸盐(peroxynitrite))是导致发炎反应转化成致癌过程的关键中介体；Bartsch等人，1994，″人癌症病因学中内源性形成的N-亚硝基化合物和亚硝基化试剂″Pharmacogenetics 2：272-7；Liu等人，1992，″旱獭肝炎病毒表面抗原诱导肝细胞中合成NO：在肝癌形成中可能的作用″Carcinogenesis15：2875-7；Ohshima等人，1994，″作为癌症危险因子的慢性感染和发炎过程：一氧化氮在致癌作用中可能的作用″Mutation Res.305：253-64。在目前的研究中，我们首次调查了INH2BP的处理是否影响LPS诱导的炎症模型中炎性中介体肿瘤坏死因子α[TNF]、白细胞介素-10、白细胞介素-6、NO和***素的体内产生。
有许多胞内过程产生促炎中介体。酪氨酸激酶的激活；Levitzki，A.，1994，″信号转导治疗。治疗疾病的一种新方法″Eur.J.Biochem.226：1-13；Novogrodeky等人，1994，″通过酪氨酸激酶抑制剂防止脂多糖诱导的致死毒性″Science264U(Wash)：1319-22；Marczin等人，1993，″酪氮酸激酶抑制剂阻抑大动脉平滑肌细胞中的内毒素和IL-1β诱导的NO合成″Am.J.Physiol.265：H1014-1018；促细胞***原活化的蛋白激酶(MAP激酶)；Matsuda等人，1994，″促细胞***原活化蛋白(MAP)激酶激酶/MAP激酶级联反应介导的信号传导通道″J.Leukocyte Biol.56：548-53；L′Allemain，G.，1994，″破译MAP激酶通道″Progr.Growth Factor Res.5：291-334；Cowley等人，1994，″MAP激酶激酶的激活对于PC12分化和转化NIH3T3细胞来说充分必要的″Cells 77：841-52；和核因子κB(NF-κB)通道；Baeuerle等人，1994，″免疫***中的NF-B的功能和活化″Ann.Rev.Immunol.12：141-79；Schreck等人，1992，″核因子κB：真核细胞的氧化应力响应性转录因子(综述)”Free Radical Res.Comm 17：221-37；Muller等人，1993，″核因子κB，一种脂多糖效应的中介体″Immunobiol.187：233-56；它们被认为是发炎反应中的重要因子，并对炎性中介体的表达或产生有作用。因此，我们已经调查了INH2BP是否还影响LPS诱导的MAP激酶和NF-κB活化。目前的研究结果表明，INH2BP具有通过调节LPS诱导发炎反应的多个组分的强效抗炎效果。
                           发明概述
本发明一方面涉及一种治疗动物或哺乳动物体内炎症或炎性疾病的方法，该方法包括给予所述动物或哺乳动物有效量的pADPRT抑制性化合物的步骤。
本发明另一方面是一种治疗动物或哺乳动物体内炎症或炎性疾病的方法，该方法包括给予有效量的pADPRT抑制性化合物的步骤，其中pADPRT抑制性化合物选自具有下式的化合物：
Figure A9880638900071
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6各选自氢、羟基、氨基、烷基、烷氧基、环烷基或苯酚，这些基团可任意被烷基、烷氧基、羟基或卤素取代，R1、R2、R3、R4、R5和R6中只有一个是氨基；具有下式的化合物：其中R1、R2、R3、R4和R5各自选自氢、羟基、氨基、烷基、烷氧基、环烷基或苯酚，这些基团可任意被烷基、烷氧基、羟基或卤素取代，R1、R2、R3、R4、R5中只有一个是氨基；和具有下式的化合物：其中R1、R2、R3、R4和R5各自选自氢、羟基、氨基、烷基、烷氧基、环烷基或苯酚，这些基团可任意被烷基、烷氧基、羟基或卤素取代，R1、R2、R3、R4和R5中只有一个是氨基。
较佳的pADPRT化合物包括：6-氨基-1，2-苯并吡喃酮、3-亚硝基苯甲酰胺、5-氨基-1(2H)-异喹啉酮、7-氨基-1(2H)-异喹啉酮和8-氨基-1(2H)-异喹啉酮。
本发明还有一个方面包括一种治疗动物或哺乳动物体内革兰阴性和革兰阳性诱导的症状的方法，所述方法包括给予动物或哺乳动物治疗有效量的pADPRT抑制性化合物的步骤。
本发明还有一个方面是一种治疗动物或哺乳动物体内革兰阴性和革兰阳性菌诱导的内毒素症状，该方法包括给予动物或哺乳动物治疗有效量的pADPRT抑制性化合物，其中所述化合物选自上述的化合物I、化合物II或化合物III。
本发明还有一方面涉及一种治疗动物或哺乳动物体内革兰阴性和革兰阳性诱导的内毒素症状，该方法包括给予动物或哺乳动物治疗有效量的pADPRT抑制性化合物，其中所述化合物具有上述化合物I、化合物II或化合物III所示的结构式。
本发明还有一方面是一种治疗动物或哺乳动物体内关节炎的方法，该方法包括给予有效量的pADPRT抑制性化合物，其中所述化合物具有上述化合物I、化合物II或化合物III所示的结构式。
本发明还有一方面是一种治疗动物或哺乳动物体内Chron疾病的方法，该方法包括给予有效量的pADPRT抑制性化合物，其中所述化合物具有上述化合物I、II或III所示的结构式。
本发明还有一方面是一种治疗动物或哺乳动物体内Barrett疾病的方法，该方法包括给予有效量的pADPRT抑制性化合物，其中所述化合物具有上述化合物I、II或III所示的结构式。
本发明的pADPRT抑制性化合物可用美国专利No.5,464,871；5,473,074；5,482,975；5,484,951；5,516,941和5,583,155中描述的方法制得，这些专利公开内容纳入本文作参考。
用于本发明方法的较佳的化合物包括卤素基团是碘、一个R基团是氨基、一个R基团可以是亚硝基或硝基(如上述专利所述)的那些化合物，但是较佳的是R基团为氨基。另外，已经发现当碘代部分与氨基部分毗邻时，pADPRT的抑制活性强显示。在任何情况下，用于本发明方法的化合物应具有pADPRT抑制活性。
化合物可单独使用，或较佳的是和本领域已知的药学上可接受的酸加成盐或其它合适的药学载体组合使用。
附图简述
图1。INH2BP对J774细胞中LPS诱导的(a)亚硝酸盐的产生、(b)6-酮***素F1α的产生、(c)TNF的产生和(d)线粒体呼吸作用的阻抑的影响。TNF在LPS后4小时测定，其它所有参数在LPS后24小时测定。**代表应答LPS有显著变化(与对照(p＜0.01)相比)；##代表INH2BP在LPS存在下有显著效应(与单用LPS相比(p＜0.01))；n＝6-12孔。
图2。INH2BP抑制J774和RAW 264.7细胞中的iNOS表达。(a)在对照条件下(泳道1)、LPS处理后4小时(泳道2)和有INH2BP(100μM)存在的细胞经LPS处理后4小时(泳道3)，J774细胞(A)和RAW 264.7巨噬细胞(B)中iNOS和18s mRNA的代表性的Northern印迹。(b)在对照条件(C和C+INH2BP)以及LPS处理后12小时(LPS和LPS+INH2BP)，INH2BP对J774细胞匀浆物的iNOS活性的影响。**代表LPS在与对照相比时的显著效应(p＜0.01)；##代表INH2BP有显著的抑制性(p＜0.01)；n＝4。(c)J774对照细胞以及LPS处理后12小时存在或不存在INH2BP的细胞中的代表性的iNOS Western印迹。
图3。(a)在给予LPS前2小时、给予LPS同时或给予LPS后2、4和6小时时，INH2BP(100μM)抑制亚硝酸盐积累的时间依赖型损失。(b)INH2BP对经LPS和IFN组合刺激的J774细胞中亚硝酸盐累积的影响；n＝6-12孔。
图4。INH2BP对RAW264.7细胞中LPS诱导萤光素酶活性的影响，该细胞用全长(约1592bp)或缺失型(约367bp)iNOS启动子-萤光素酶构建物瞬时转染。在经全长或缺失型构建物(黑条)转染的细胞中，LPS的处理(10微克/毫升，4小时)导致萤光素酶活性的诱导是对照值的10-12倍。和INH2BP的共同处理抑制了经全长构建物转染的细胞中LPS介导的萤光素酶活性的增加，但是在经约367bp的缺失型构建物转染的细胞中没有显著的影响(灰色条)。数据表示成萤光素酶活性比对照细胞增加的倍数，并校正成各自的β葡糖苷酶活性。*代表在LPS存在时INH2BP有显著的效应(与单用LPS相比(p＜0.05))；n＝4次分开的转染。
图5。INH2BP阻抑神志清醒的大鼠中iNOS的诱导。在LPS前10分钟(INH2BP+LPS)或LPS后2小时(LPS+INH2BP)时，对照大鼠(c)、注射了INH2BP的大鼠(INH2BP)、注射了LPS(15毫克/千克，腹膜内，6小时)的大鼠中的肺匀浆物(a)和血浆亚硝酸盐-硝酸盐浓缩物(b)的iNOS活性；以及用INH2BP处理(10毫克/千克，腹膜内)的效果。**代表与对照相比显著的LPS效应(p＜0.01)；##代表pADPRT抑制剂的显著抑制性(p＜0.01)；n＝4-5。
图6。给予LPS(4毫克/千克，腹膜内)后90分钟时，INH2BP对小鼠中LPS诱导的TNF、IL-10和IL-6应答的影响。##代表与对照相比显著的LPS效应(p＜0.01)；##代表INH2BP对应答显著的增强作用(p＜0.01)；n＝4-5。
图7。INH2BP提高了经受内毒素休克的小鼠的存活：INH2BP预处理(0.3-10毫克/千克)对小鼠体内内毒素诱导的(120毫克/千克，腹膜内)致死性的影响；每组有7-8只动物。
图8。(a)在100μM PD 98059或150μM INH2BP存在或不存在下，载体或LPS(10微克/毫升)处理后24小时的RAW264.7细胞中的MAP激酶活性。数据代表典型试验中获得的数值：三个不同的试验日看到了类似的结果。(b)在150μMINH2BP存在或不存在下，载体或LPS处理后24小时的RAW264.7细胞中的典型凝胶内MAP激酶试验。泳道1-4分别代表下列组：1：载体处理过的对照；2：LPS处理组；3：150μM INH2BP存在下的载体处理组；4：150μM INH2BP存在下的LPS处理组。
图9。用INH2BP抑制pADPRT没有改变核抽提物的NF-κB Western印迹的核转位，所述核抽提物来自对照J74细胞以及在INH2BP(100μM)存在或不存在下经LPS处理后90分钟的细胞。
图10。描述了INH2BP对角叉菜胶诱导的兽爪水肿(paw edema)发展的影响。数据显示了注射角叉菜胶后1-4小时的兽爪体积(平均值±SEM，每组有6只动物)。从1小时起，兽爪体积有显著增加(p＜0.01)，且INH2BP在1-4小时显著地抑制了兽爪水肿的发展。
图11。描述了INH2BP对胶原诱导的关节炎的开始的影响。图中示出了患关节炎小鼠的百分数(关节炎临床评分大于1的小鼠)。21天处的箭头表示第二次胶原免疫的时间，从第25天起的水平条代表INH2BP(N＝6)或载体(N-10)处理开始的时间。
图12。描述了INH2BP对胶原诱导的关节炎的严重性的影响。胶原诱导的关节炎期间的关节炎评分中值。21天处的箭头表示第二次胶原免疫的时间，从25天起的水平条代表用INH2BP(n-6)或载体(n＝10)处理开始的时间。从第26天起，关节炎评分明显增加(Ip＜0.01)，26-35天之间INH2BP对关节炎评分有显著的阻抑作用(#p＜0.05)。
本发明较佳实例描述
定义
如本文所用的，
“抗炎性”疾病指身体组织有发炎的疾病或病症。这些疾病例如包括：Chron疾病、Barrett疾病、关节炎、多发性硬化、心肌病、结肠炎、感染性脑膜炎、脑炎等。
“药学上可接受的酸加成盐”指保留了生物效果和游离碱性质的那些盐，它们可通过和无机酸(如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、水杨酸等)反应获得。
“ADPRT”指腺苷二磷酸核糖转移酶，也称为多腺苷二磷酸核糖聚合酶(EC2.4.99)，它是一种催化ADP-核糖聚合反应的真核生物特异性DNA结合核蛋白。酶促过程取决于DNA。
“烷基”指饱和或不饱和的、支链或直链烃基。典型的烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。
“烷氧基”指基团-O-烷基。典型烷氧基是甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基等。
“环烷基”指饱和的含有3-8个碳原子的单环烃基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等。
“取代的苯基”指所有可能的异构苯基，如用选自烷基、烷氧基、羟基或卤素的取代基单取代或双取代的苯基。
“卤素”指氯代、氟代、溴代或碘代，较佳的是碘代。
本发明的pADPRT抑制性化合物(尤其是上述的化合物I、II或III)是强效、专一和非毒性的抗炎化合物，它可用于通常已知是炎症的病症和疾病(例如关节炎、Chron疾病、Barrett疾病等)。另外，这些化合物可用来治疗与革兰阴性和革兰阳性诱导的感染相关的病症，尤其是与革兰阴性感染相关的疾病，包括与脂多糖疾病和脓毒症相关的疾病。该化合物是尤其适用的，因为它即使有毒性，毒性也非常低。
在实践中，本发明的化合物或其药学上可接受的盐可以足以抑制动物或哺乳动物体内炎性疾病或病症和/或预防炎症或炎性疾病的量来给予，并且可用于最适用于这些用途的药物形式。
本文所述的活性化合物和盐可通过接受的治疗剂给药方式来给药。这些方法包括全身性或局部给药，例如口服、肠胃外、经皮(transdermal)、皮下或局部外用给药方式。这些药物的较佳的给药方法是口服。在一些例子中，需要以其它肠胃外形式给予组合物。
根据所采用的给药方式，组合物可以是固体、半固体或液体剂型，例如是可注射剂、片剂、栓剂、丸剂、时释胶囊、粉剂、液体、悬浮液等，较佳的是单位剂型。组合物可包括有效量的活性pADPRT抑制性化合物或其药学上可接受的盐，另外它还可包括任何常规的药物赋形剂和其它医学或药学上的药物或制剂、载体、佐剂、稀释剂等，这些均是药学上常规的。
对于固体组合物，可采用这些赋形剂，包括药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。利用例如聚二醇(如丙二醇)作为载体，还可将上述活性pADPRT抑制性化合物配制成栓剂。
液体、尤其是可注射组合物例如可这样制得：将活性化合物溶解、分散在药用溶液(例如水、盐水、水性葡萄糖、甘油、乙醇等)中，从而形成可注射的溶液或悬浮液。
如果需要，待给予的药物组合物还可含有少量无毒性的辅助物质(如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂)，以及其它物质(例如醋酸钠、三乙醇胺油酸盐等)。
另外，如果需要，待给予的药物组合物可含有脂质体配方，其包含磷脂、带负电荷的磷脂和选自胆固醇、胆固醇脂肪酸酯或不饱和脂肪酸的化合物。典型的中性磷脂包括L-a-磷脂酰胆碱、L-a-磷脂酰肌醇、L-a-磷脂酰-丝氨酸、L-a-磷脂酰肌醇、L-a-磷脂酸、L-a-磷脂酰甘油、L-a-溶血磷脂酰胆碱、鞘磷脂和心肌磷脂。
典型的带负电荷的磷脂包括二酰磷酸或磷酸二甘油酯，例如二月桂酰磷酸、二肉豆蔻酰磷酸、二棕榈酰磷酸、二硬脂酰(disteroyl)磷酸。
典型的胆固醇和胆固醇醚包括胆固醇、3S-羟基-5-胆甾烯、聚氧乙烷胆甾醇癸二酸酯、胆固醇-5，6-环氧化物、胆甾醇乙酸酯、胆甾醇正丁基醚、胆甾醇癸酸酯、胆甾醇十二烷酸酯、胆甾醇***、胆甾醇十七烷酸酯、胆甾醇甲酯。
典型的不饱和脂肪酸包括花生四烯酸、二十二烷六烯酸、反油酸、芥酸、亚油酸、亚麻酸、神经酸、油酸、棕榈油酸、岩芹酸。卤代硝基化合物可根据1993年2月19日提交的题目为“脂质体配方及其制备方法和使用”的专利申请No.08/020,035中的方法包封或分配到脂质体配方的脂质体双层中，该专利纳入本文作参考。
在第一个实例中，首先形成脂质体，然后加入C-氨基、亚硝基或硝基化合物。C-氨基、亚硝基或硝基化合物分配入(即使其自身进入)(而不是包封)脂质体的脂质双层。为了制备该组合物，通常是将组分(例如磷脂酰胆碱、二乙酰磷酸和胆固醇)和溶剂(如氯仿)混合。混合后除去氯仿。然后加入水。当将水加入脂质体后，它形成了多层脂质体(即脂质体与具有多层的洋葱表皮类似)。下一步是对其进行冷融。将其置于液氮中迅速冷却。迅速冻融的目的是使脂质体的大小更均一。此时脂质体的大小是不同的，要处理一次或多次，通常再处理5次。融化在37℃水浴中进行。在冻融前，超声破碎混合物。超声破碎和融化的组合减少了皮层的数量。目的是产生单层(unilamellar)***。此时，加入C-亚硝基化合物至10毫摩尔的浓度。该浓度可超过15毫摩尔。就脂质的这一浓度而言，对于60毫升批量来说，脂质总浓度为648毫克，其中加入60毫升水。磷脂酰胆碱为500毫克，胆固醇为36毫克；二乙酰磷酸为112克。
增加混合物中脂质体浓度能使其含有更多的C-氨基、亚硝基或硝基化合物。例如，它可以浓缩成上述混合物中浓度的两倍。对于60毫升批量来说，可使数量增加一倍至含有1000毫克磷脂酰胆碱、224毫克二乙酰磷酸和72毫克胆固醇。降低浓度则减少了进入其中的C-亚硝基化合物的量。对于假定的60毫升批量而言，C-氨基化合物的上限达到15毫摩尔的C-氨基化合物浓度。对于3-亚硝基苯甲酰胺而言，该上限为135毫克(60毫升批量)。
下一步是重新水合。然后，该过程的下一步是用挤压机(LipexBiomembranes，Inc.Vancouver，British Columbia，Canada)挤出。
挤出过程有两个目的：1)使脂质体的大小均一；和2)灭菌。
挤出通常包括：过滤通过j0.1微米的过滤器，然后通常是冷冻干燥混合物，将混合物冻干(从中除去水，使其变成细粉)。这提高了溶解度，可以建立大约40毫摩尔的溶液，该浓度比冷冻干燥前浓缩了大约3倍。冷冻干燥产生了粉末状脂质和粉末状C-氨基化合物的混合物。现在，就可用相同量的C-氨基化合物和更少量的脂质来制成更浓缩的混合物。例如，可用相同重量的C-氨基、亚硝基或硝基化合物，但是体积只有原来体积的三分之一。
也可对上述过程的步骤进行改进，例如除去诸如冷冻干燥的步骤。
第一个实例的这种方法没有显著地包封C-氨基、亚硝基或硝基化合物。并非是脂质体的中间有化合物，而是化合物本身在膜内。分配到脂质体膜中的C-氨基、亚硝基或硝基化合物将迁移至靶细胞，且脂质会携带C-氨基、亚硝基或硝基化合物进入细胞膜。
较佳的是，该过程制成了直径大约为0.05-0.45微米、更佳的约为0.1-0.2微米的脂质体。单层或多层脂质体是有效的。
挤出的第二个目的是对混合物进行除菌。为了除菌，脂质体通常被制成直径小于45微米。小于0.05微米的大小在理论上是能起作用的。第一个实例的方法具有如下的优点，例如在水中，3NOBA仅有0.5毫摩尔的浓度。本发明的脂质体组合物达到了15毫摩尔的浓度。
另外，与只在水溶液中的3-NOBA不同，含有NOBA的脂质体溶液对抗坏血酸有抵抗作用。这使得它能用于实验室小鼠试验。溶液可含有NOBA单体或NOBA二聚体。
在第二个实例中，可以从液体组分的薄膜开始，使该薄膜与药物水溶液水合。这样就自动形成了捕获(包封)药物的脂质。不能穿透脂质体膜的化合物会发生这种情况。这些化合物的一个例子是美国专利No.5,262,564(1993年11月16日提交)中的那些化合物，例如3-NOBA的L-胱氨酸亚磺酸加合物。
肠胃外可注射给药通常用于皮下、肌内或静脉内注射和灌输。可注射剂可制成常规形式，如液体溶液、悬浮液或适合在注射前溶解在液体中的固体形式。
根据美国专利No.3,710,795，最近发明的一种肠胃外给药方法采用植入一种缓释或持续释放***，该***能确保维持恒定的剂量水平，该专利纳入本文作参考。
上述任何药物组合物可含有0.1-99％、较佳的为1-70％的活性pADPRT抑制性化合物(尤其是式I、II或III的卤代-C-氨基、亚硝基或硝基化合物)作为活性组分。
已知慢性炎症会促进各种组织中的致癌性转化。一种新的核酶聚(ADP)核糖聚合酶(pADPRT)的抑制剂(5-碘-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP))最近已被报道能调节Ha-ras转染的内皮细胞系的各种细胞信号转导通道并除去体内致肿瘤性。本发明的一个方面证明了pADPRT抑制性化合物(如INH2BP)对内毒素(细菌脂多糖(LPS))在体外和体内产生炎性中介体肿瘤坏死因子α(TNF)、白细胞介素-10(IL-10)和白细胞介素(IL-6)、一氧化氮(NO)以及***素的激活作用的效果。另外，本发明还显示了pADPRT抑制性化合物(如INH2BP)在体外对有丝***激活的蛋白激酶(MAP激酶)和核因子κB(NF-κB)的活化作用的影响。在培养的J774和RAW264.7巨噬细胞中，LPS诱导产生***素代谢物，释放TNF并表达出可诱导的NO合成酶同种型(iNOS)。***素和NO的产生被INH2BP以剂量依赖方式抑制，而TNF-α的短期释放却不受影响。在经全长(约1592bp)鼠巨噬细胞iNOS启动子-萤光素酶构建物瞬时转染的RAW细胞中，INH2BP显著地阻抑了LPS介导的萤光素酶活性，但是在约367bp组成的缺失构建物转染的细胞中却不阻抑萤光素酶活性。在体内，INH2BP的预处理抑制了大鼠体内LPS对iNOS的诱导作用，不影响LPS诱导的TNF和IL-6应答，但是增强了LPS诱导的IL-10产生。INH2BP的预处理显著提高了内毒素休克致死模型中的小鼠存活率。这些结果证明，pADPRT抑制性化合物(如INH2BP)在体外和体内具有强效的抗炎作用。
多腺苷二磷酸核糖合成酶(PARS)是一种由DNA单链断裂激活的核酶。响应过氧化氢、过亚硝酸盐或电离辐射诱导的延伸性DNA单链断裂而产生的大量PARS激活能引发耗能的无价值的循环达到细胞损伤。最近已经证明，在各种形式的炎症(包括关节炎和角叉菜胶诱导的兽爪水肿)中有过亚硝酸盐产生。本发明显示了新的、强效的PARS抑制剂、pADPRT抑制性化合物(如5-碘-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP))在1-4小时的角叉菜胶诱导的兽爪水肿大鼠模型和胶原诱导的兽爪水肿小鼠模型中的效果。在第1天和第21天注射II型胶原两次，以诱导雄性DMA/1J小鼠中胶原诱导的关节炎。INH2BP口服治疗小鼠(每日0.5克/千克)从关节炎发作(第25天)起开始，在26-35天间延迟了关节炎临床症状的发展。经INH2BP处理过的动物表现出关节炎指标降低(关节炎评分是用载体处理的小鼠中所见评分的20-50％)，并改善了组织学状况(在膝和足中测定)。这些数据证明，PARS抑制剂INH2BP在体内表现出抗炎效果，即使给予INH2BP的起始时间相对较晚，它也能延迟胶原诱导的关节炎的进程。本发明的数据支持了这样一个观点：即PARS活化在关节炎发展中起一定作用，并可能在其它形式的炎症和炎性疾病中起作用。
下列实施例用来描述本发明。这些实施例不应当被理解成限制了本发明的范围。
实施例1
细胞培养
如以下这些文献所述的，将小鼠巨噬细胞系J774和RAW264.7培养在Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中；Szabo等人，1996，″DNA链断裂、多腺苷二磷酸核糖合成酶的激活以及细胞能量消耗参与了接触过亚硝酸盐的巨噬细胞和平滑肌细胞中的细胞毒性″Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93：1753-1758；Zingarelli等人，1996，″经细菌脂多糖刺激的巨噬细胞中，过亚硝酸盐介导的DNA链断裂激活了多腺苷二磷酸核糖合成酶并引起细胞能量消耗″J.Immunol.156：350-358。在分开的研究中，从雄性Wistar大鼠获得腹膜内巨噬细胞，在LPS存在或不存在以及有或没有INH2BP下体外培育24小时。处死大鼠，取出腹膜内巨噬细胞并培养在DMEM中。在各种浓度(1-150mM)的INH2BP或其它药理学抑制剂存在或不存在下，用大肠杆菌LPS(10毫克/毫升)或LPS和INF(50μ/毫升)处理细胞数次。
MAP激酶相关测定
用PBS洗涤Raw细胞，收集，每百万细胞用100毫升裂解缓冲液裂解。(50mMTris-HCl，pH7.4，1％NP-40，0.4M NaCl，0.1mM NaVO3，50mM KF，1mM EGTA，2mM PMSF，25nM奥卡第酸(okadaic acid)，亮抑酶肽、抑酶肽、抑氨肽酶肽和抗蛋白酶各1毫克/毫升)。在冰上裂解20分钟，然后在Eppendorf离心机中13000rpm离心14分钟。保留上清，用Bio-Rad染色测定法测定蛋白含量。
凝胶内MAP激酶试验
在含有固定化穗磷脂碱性蛋白(MBP，250毫克/毫升凝胶)的100％SDS-PAGE凝胶中对蛋白样品(50毫克/泳道)进行电泳。电泳后，用50mM TRIS-HCl pH7.7缓冲液洗涤凝胶一次(25毫升，20分钟)，然后和含有25％异丙醇的相同缓冲液培育两次30分钟。然后用Tris-HCl缓冲液洗涤凝胶一次，并在50毫摩尔Tris-HClpH7.7，mM 2-巯基乙醇，5M盐酸胍(50毫升)的溶液中浸泡1小时，在30分钟时改变培育的溶液。然后在16小时内在换液5次的50mM TRIS-HCl pH7.7，Mm 2-巯基乙醇、0.04％NP-40的溶液中培育凝胶，来重新培育蛋白。然后洗涤凝胶两次，用含50mM TRIS-HCl pH7.7，5mM MgCl2 7mm 2-巯基乙醇的溶液预先培育半小时。最后在添加了10mm 32p-g ATP(50mCi/试验)的相同溶液中培育1小时。在培育最后，用3×25毫升的10％TCA和3×25毫升的10％乙酸洗涤除去未结合的放射活性，干燥并放射自显影；Sasaki等人，1995，″神经酰胺对生长因子诱导的细胞增殖的受纳效应″Biochem.J.311：829-34。
MAP激酶Western印迹。
将100毫克细胞抽提物蛋白加样到10％SDS-PAGE凝胶上，电泳，转印到硝酸纤维素膜上并进行免疫探测。第一抗体(抗MAP激酶)购自UBI，第二抗体为碱性磷酸酶标记，购自NEN Biolabs。检测采用强化化学发光法；Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)处理修饰了ras转化的牛内皮细胞系的生长相关性酶促通道且导致致肿瘤作用明显丧失″Int.J.Oncol.8：239-252。
核抽提物的制备和NF-κB Western印迹。
在INH2BP存在和不存在下处理细胞90分钟。按Hassanain等人1993年″测定DNA结合因子的增强的凝胶移位分析″Anal.Biochem.213：162-7中所述的方法制备微量核抽提物。简言之，刮下细胞，简单地离心，将沉淀重悬于400毫升冷的缓冲液A[Hepes pH7.9(10mM)，KCl(10mM)，EDTA(0.1mM)，EGTA(0.1mM)，DTT(1mM)，PMSF(0.5mM)，抑胃酶肽A(1毫克/毫升)、亮抑酶肽(10毫克/毫升)和抑酶肽(10毫克/毫升)]中，在25毫升1％NP-40存在下置于冰上15分钟。然后，振荡样品，10000g离心1分钟，将沉淀重悬于100毫升缓冲液B[HepespH7.9(20mM)，NaCl(400mM)，EDTA(1mM)，EGTA(1mM)，DTT(1mM)，PMSF(0.5mM)，抑胃酶肽A(毫克/毫升)、亮抑酶肽(10毫克/毫升)和抑酶肽(10毫克/毫升)]中。在摇台上4℃振荡15分钟后，4℃ 15 100,000g离心样品15分钟。然后用150毫升SDS-PAGE样品缓冲液处理70毫升等份。如上所述用家兔抗小鼠NF-κB第一抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)(1∶750，用吐温TBS(0.02％)配)进行Western印迹。
亚硝酸盐或亚硝酸盐/硝酸盐浓度的测定
用下述方法测定刺激后24小时培养上清中的亚硝酸盐；Szabo等人，1996，″DNA链断裂、多腺苷二磷酸核糖合成酶的激活以及细胞能量消耗参与了接触过亚硝酸盐的巨噬细胞和平滑肌细胞中的细胞毒性″Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93：1753-1758；Zingarelli等人，1996，″经细菌脂多糖刺激的巨噬细胞中过亚硝酸盐介导的DNA链断裂激活了多腺苷二磷酸核糖合成酶并引起细胞能量消耗″J.Immunol.156：350-358；Szabo等人，1994，″精胺抑制免疫刺激的J774.2巨噬细胞中一氧化氮的产生：血清因子的需求″Br.J.Pharmacol.112：355-356；在100毫升样品介质中加入100毫升Griess试剂(1％磺胺和0.1％萘乙二胺，5％磷酸配)。用Spectramax 250微板读数仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)测定550nm下光密度(OD550)。为了测定血浆样品中的亚硝酸盐/硝酸盐的总浓度，通过和硝酸盐还原酶培育将硝酸盐还原成亚硝酸盐；Zingarelli等人，1996，″经细菌脂多糖刺激的巨噬细胞中，过亚硝酸盐介导的DNA链断裂激活了多腺苷二磷酸核糖合成酶并引起细胞能量消耗″J.Immunol.156：350-358。
测定6-酮***素F12
用特异性放射免疫试验测定LPS刺激后4小时100毫升细胞培养上清样品中6-酮***素F12的产生；Szabo等人，1994，″精胺抑制免疫刺激的J774.2巨噬细胞中一氧化氮的产生：血清因子的需求″Br.J.Pharmacol.112：355-356。
细胞因子的测定
用ELISA测定血浆和细胞培养上清中的细胞因子水平。用购自Endogen(Endogen Inc.，Boston，MA)的ELISA试剂盒测定IL-10和IL-6的血浆水平。如Szabo等人，1997，″异丙基肾上腺素调节肿瘤坏死因子、白细胞介素-10、白细胞介素-6和一氧化氮的产生并保护防止内毒素血症中发生血管反应不足″Immunology 90：95-100中所述的那样，用购自Genzyme(Genzyme Corp.，Boston，MA)的ELISA试剂盒测定血浆和细胞培养上清中的TNF-α浓度。
线粒体呼吸的测定
凭借线粒体将3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴鎓还原成甲臢，测定24小时的线粒体呼吸；Szabo等人，1996，″DNA链断裂、多腺苷二磷酸核糖合成酶的激活以及细胞能量消耗参与了接触过亚硝酸盐的巨噬细胞和平滑肌细胞中的细胞毒性″Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93：1753-1758；Zingarelli等人，1996，″经细菌脂多糖刺激的巨噬细胞中，过亚硝酸盐介导的DNA链断裂激活了多腺苷二磷酸核糖合成酶并引起细胞能量消耗″J.Immunol.156：350-358。
iNOS mRNA的Northern印迹
在INH2BP存在或不存在下使细胞接触LPS 4小时后，如上所述用TRIZOL抽提总RNA。使含15毫克总RNA的等份在含3％甲醛的1％琼脂糖凝胶上电泳。将RNA印迹转移到尼龙膜上并进行UV自交联。如Lowenstein等人，1993，″巨噬细胞一氧化氮合成酶基因：两个上游区域通过干扰素γ和脂多糖介导诱导作用″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：9730-9734所述的那样，用随机引导法(Pharmacia，Piscataway，NJ)使膜和[32P]dCTP(比活为3000Ci/mM；NEN)标记的鼠iNOS cDNA探针(106.cpm/ml)42℃杂交过夜。杂交的滤膜于53℃用2X柠檬酸钠、氯化钠、0.1％SDS和25mM NAHPO4、1mM EDTA、0.1％SDS溶液连续洗涤。在探测了iNOS后，用沸腾的5mM EDTA剥去膜，并和[32P]放射性标记的18S核糖体RNA(作为管家基因)的寡核苷酸探针重新杂交。洗涤后，用Phosphor Imager屏曝光过夜。
iNOS Western印迹。
在pADPRT抑制剂存在和不存在下用LPS处理细胞20小时。然后将细胞刮到冷的PBS中，14000g离心30秒。除去上清，加入含有RIPA(500毫升)、抑酶肽(10毫克/毫升)和PMSF(0.5mM)的裂解缓冲液。使样品通过22计量针(gaugeneedle)从而避开DNA。用Bradford方法(Bio-Rad)测定蛋白含量。将胞质蛋白(200毫克/泳道)加入SDS-PAGE缓冲液中，沸腾5分钟，用7.5％SDS-PAGE分离，用等速电泳缓冲***通过Semi-Dry方法转移到硝酸纤维素膜(0.2mm)上。在3％明胶中封闭1小时和随后的洗涤后，使样品在吐温Tris缓冲盐溶液(TTBS)和0.1％明胶中和第一家兔抗小鼠iNOS(upstate Biotechnology，Lake Placid，NY)(1∶1000配于0.0％TTBS中)免疫印迹2.5小时。用偶联碱性磷酸酶的山羊抗家兔iGG抗体作为第二抗体。用碳酸盐缓冲液中的氮蓝四唑/5-溴-4-氯-吲哚磷酸(NBT/BCIP)使结合蛋白显色。
iNOS活性的测定
在pADPRT抑制剂存在和不存在下用LPS处理细胞12小时。如Szabo等人，1994，″精胺抑制免疫刺激的J774.2巨噬细胞中一氧化氮的产生：血清因子的需求″Br.J.Pharmacol.112：355-356所述的那样，将J774细胞匀浆或肺匀浆中从1-精氨酸到L-瓜氨酸的钙非依赖型转变的测定结果作为iNOS活性的指标。刮下细胞或将肺置于由50mM Tris HCl，0.1mM EDTA，0.1mM EGTA和1mM苯甲磺酰氟(pH7.4)组成的匀浆缓冲液中，用Tissue Tearor 985-370匀浆器(Biospec Products，Racine，WI)在冰上缓冲液中匀浆。然后测定匀浆中[3H]-L-精氨酸到[3H]-L-瓜氨酸的转变。在[3H]-L-精氨酸(10mM，5kBq/管)、NADPH(1mM)、钙调蛋白(30nM)、四氢生物喋呤(5mM)和EGTA(5mM)存在下22℃培育匀浆(30毫升)20分钟。用含有EGTA(2mM)和EDTA(2mM)的冰冷的HEPES缓冲液(pH5.5)稀释来终止反应。将反应混合物施加到Dowex 50W(Na+型)柱上，用闪烁计数法测定洗脱的[3H]-L-瓜氨酸活性。
iNOS启动子的功能试验
由于在我们的试验条件下，J774细胞对于用磷酸钙、脂转染法和脂质转染胺法的瞬时转染有抵抗作用，所以在RAW 264.7细胞上进行转染研究。用报道基因构建物瞬时转染AW264.7细胞，以评价iNOS启动子活性。该构建物将5′鼠巨噬细胞iNOS启动子区插到报道基因萤光素酶的上游；Lowenstein等人，1993，″巨噬细胞一氧化氮合成酶基因：两个上游区域通过干扰素γ和脂多糖介导诱导作用″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：9730-9734；(由Dr.Charles J.Lowenstein，JohnsHopkins University赠与)。采用两种构建物：全长启动子构建物(1-1592bp)和由367bp组成的缺失型构建物。将细胞接种到6孔培养板中至50％铺满，利用阳离子脂质体(Lipofectin，Giboco)用等摩尔量的各自的iNOS启动子-萤光素酶构建物转染。为了控制转染效率的差异，细胞用pSV40-b-半乳糖苷酶共转染。转染后，使细胞恢复过夜，随后单用介质(对照)、LPS(10毫克/毫升)或LPS加上INH2BP(100mM)处理。处理4小时后，用PBS洗细胞一次，在报道物裂解缓冲液(Promega)中裂解，并分析萤光素酶活性，校正各自原始的半乳糖苷酶活性并表达对照细胞(单用介质转染和处理)的增加倍数。
体内实验
雄性Wistar大鼠和雄性BALB/c小鼠购自Charles River Laboratories(Wilmington，MA或Budapest，Hungary)。动物随意接受食物和水，并在12小时周期内维持照明。用大肠杆菌LPS(15毫克/千克)对大鼠腹膜内注射，6小时后处死。取血浆样品测定亚硝酸盐/硝酸盐，取肺样品测定iNOS。其它组大鼠用INH2BP(10毫克/千克，腹膜内注射)处理，处理在LPS前10分钟或在LPS注射后2小时进行。
在测定LPS诱导的细胞因子应答的研究中，对小鼠腹膜内注射药物载体、或INH2BP(10毫克/千克)，每10克体重体积为0.1毫升。半小时后用4毫克/千克LPS腹膜内注射进行攻击。LPS处理后90分钟处死动物，将血液收集到冰冷的含有EDTA的Eppendorf管中，4℃离心10分钟。将血浆-7℃保藏至测定。
在小鼠存活研究中，在0时对动物腹膜内注射LPS(120毫克/千克)并检测LPS后42小时内的存活。其它组小鼠在LPS处理前18小时、前4小时、0小时、后6小时、后24小时和后30小时接受载体或INH2BP处理(0.1-10毫克/千克，腹膜内)。
材料
DMEM、RPM1、TRIZOL和胎牛血清购自Gibco(Grand Island，NY)。[3H]NAD+和[32P]NAD+购自DuPont NEN(Boston，MA)。乙醇脱氢酶和ND+购自BoehringerMannheim(Indianapolis，IN)。PD 98059购自Cal biochem(La Jolla，CA)。其它所有药物购自Sigma(St.Louis，MO)。
统计学评价
图中和文中所有数值表示成n次观察(n＞4)的平均值±平均标准误差(SEM)。用斯图登特不成对t-测试比较组间的平均值。低于0.05的p值被认为具有统计学意义。
结果
INH2BP抑制J774巨噬细胞中LPS诱导的一氧化氮和***素但不抑制TNF-α的产生
INH2BP的处理导致剂量依赖型地抑制J774巨噬细胞中LPS诱导的亚硝酸盐形成(图1a)。类似地，INH2BP抑制LPS诱导的6-酮***素F12的产生(图1b)，但是不抑制TNF的产生(图1c)，并恢复了LPS诱导的对线粒体呼吸作用的抑制(图1d)。INH2BP明显抑制了iNOS mRNA和蛋白表达(图2a-c)。当试剂在LPS后数小时给予时，INH2BP对亚硝酸盐产生的抑制作用被大大减少，这与在iNOS诱导刺激之前的情况相反(图3a)。而且，当LPS和γ干扰素(TNF-g 50u/ml)联合用于免疫刺激时，INH2BP对iNOS的抑制效果大大减少(图3b)。
选择性调节INH2BP对iNOS启动子的诱导作用
为了进一步研究INH2BP对iNOS启动子的调节作用，我们用鼠巨噬细胞iNOS启动子-萤光素酶构建物进行瞬时测定。我们发现鼠巨噬细胞iNOS的LPS介导的转录调节起重要作用(从LPS诱导出10-12倍的萤光素酶活性的证据可以看出(图4))，这与以前的结果相符(Lowenstein等人，1993，″巨噬细胞一氧化氮合成酶基因：两个上游区域通过干扰素γ和脂多糖介导诱导作用″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：9730-9734)。用INH2BP共同处理经全长(至1592bp)启动子构建物转染的细胞，结果完全抑制了LPS介导的萤光素酶活性(图4)。然而，类似地用INH2BP共同处理经缺失型构建物(至367bp)转染的细胞却没有明显影响LPS-介导的萤光素酶活性(图4)。
INH2BP的体内抗炎效果
INH2BP的预处理明显减少了LPS诱导的神志清醒的大鼠体内血浆亚硝酸盐-硝酸盐的增加以及肺中iNOS活性的增加(图5)。当试剂是在LPS刺激后数小时才加入细胞或给予动物时，INH2BP对NO产生的抑制效果大大减少。与转化的细胞系类似，用100mM INH2BP处理明显减少(56±7％，p＜0.01)了经LPS体外(10毫克/毫升)刺激的原代细胞(从大鼠获得的腹膜巨噬细胞)中亚硝酸盐的产生(n＝4)。
与体外结果类似(图1c)，INH2BP没有明显影响小鼠中LPS诱导的血浆TNF水平的增加(图6a)。INH2BP也没有影响LPS诱导的IL-6的产生(图6C)。然而，INH2BP导致LPS诱导的IL-10血浆应答增加(图6b)。
INH2BP对小鼠的预处理使受LPS致死剂量的大鼠存活显著地、剂量依赖性地提高(图7)。
INH2BP活性消除了LPS诱导的MAP激酶激活，但没有改变NF-κB的激活和核转位
有许多胞内过程在iNOS的诱导和其它炎性中介体产生之前。酪氨酸激酶的激活；Levitzki，A.，1994，″信号转导治疗。治疗疾病的一种新方法″Eur.J.Biochem.226：1-13；Novogrodsky等人，1994，″通过酪氨酸激酶抑制剂防止脂多糖诱导的致死毒性″Science 264U(Wash)：1319-22；Marczin等人，1993，″酪氨酸激酶抑制剂阻抑大动脉平滑肌细胞中的内毒素和IL-1β诱导的NO合成″Am.J.Physiol.265：H1014-1018；促细胞***原活化的蛋白激酶(MAP激酶)；Matsuda等人，1994，″促细胞***原活化蛋白(MAP)激酶激酶/MAP激酶级联反应介导的信号传导通道″J.Leukocyte Biol.56：548-53；L′Allemain，G.，1994，″破译MAP激酶通道″Progr.Growth Factor Res.5：291-334；Cowley等人，1994，″MAP激酶激酶的激活对于PC12分化和转化NIH 3T3细胞来说充分必要的″Cells 77：841-52；和NF-κB通道；Baeuerle等人，1994，″免疫***中的NF-κB的功能和活化″Ann.Rev.Immunol.12：141-79；Schreck等人，1992，″核因子κB：真核细胞的氧化应力响应性转录因子(综述)”Free Radical Res.Comm 17：221-37；Muller等人，1993，″核因子κB，一种脂多糖效应的中介体″Immunobiol.187：233-56；这些均被认为是炎性中介体中的重要因子。因此，我们调查INH2BP是否影响MPA激酶和NF-κB响应LPS刺激的激活作用，以便阐述炎性过程中这些通道参与INH2BP的抑制效应的可能性。
在未刺激的RAW264.7巨噬细胞中有显著的MAP激酶基础活性。LPS处理(10毫克/毫升，24小时)诱导MAP激酶活性增加约2.5倍(图8)，但不影响免疫反应性MAP激酶的量(通过Western印迹证明，结果未显示)。用INH2BP(150mM)预处理细胞3天使MAP激酶基础活性受约50％的抑制，并且消除了LPS诱导的MAP激酶的增加(未显示)。MAP激酶基础活性被MAP激酶激酶抑制剂稍稍阻抑；Pang等人，1995，″MAP激酶激酶的抑制阻断了神经生长因子诱导的PC-12细胞分化″J.Biol.Chem.270：13585-8；PD 98059(100mM)以及LPS诱导的MAP激酶的激活也被抑制(图8)。LPS诱导的亚硝酸盐的产生也被PD 98059阻抑(在100mM下阻抑53％，n＝3)，这与最近在心肌细胞中的数据相符(Singh等人，1996，″心肌细胞和微血管内皮细胞中细胞因子可诱导的一氧化氮合成的调节″J.Biol.Chem.271：1111-1117)。
与最近在一系列单核细胞系中的观察结果(Baeuerle等人，1994，″免疫***中的NF-B的功能和活化″Ann.Rev.Immunol.12：141-79)类似，我们发现J774细胞和RAW264.7细胞中有基础性(组成型)核NF-κB。LPS刺激导致NF-κB核转位增加，而INH2BP的抑制没有影响NF-κB响应LPS的核转位(图9)。
讨论
多腺苷二磷酸核糖合成酶(pADPRT)是丰富存在于细胞核中的修饰蛋白和聚合ADP的酶；Ueda等人，1985，″ADP核糖基化″Ann.Rev.Biochem.54：73-100。pADPRT的生理功能已成为许多辩论的主题。与最初的建议(声称pADPRT是一种DNA修复酶)相反，现在已经清楚pADPRT并不直接参与DNA的修复；Lindahl等人，1995，″DNA链断裂诱导的多腺苷二磷酸核糖聚合酶翻译后修饰″TrendsBiochem.Sci.20：405-411；pADPRT基因已被脱离的转基因小鼠细胞具有正常的DNA修复特征；Buki等人，1995，″用于蛋白结合和自身缔合的多腺苷二磷酸核糖聚合酶结构域的鉴定″J.Biol.Chem.270：3370-3377。在生理性条件下，pADPRT能结合许多细胞蛋白和DNA位点，并能发挥多效性细胞调节功能；Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)处理修饰了ras转化的牛内皮细胞系的生长相关性酶促通道且导致致肿瘤作用明显丧失″，Int.J.Oncol.8：239-252；Bauer等人，1995，″用一种多腺苷二磷酸核糖聚合酶的非共价结合配体5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮逆转恶性肿瘤表型″Biochimie 77：347-377；Buki等人，1995，″用于蛋白结合和自身缔合的多腺苷二磷酸核糖聚合酶结构域的鉴定″J.Biol.Chem.270：3370-3377。pADPRT激活还被指出在诱导细胞死亡(尤其在辐射损伤和氧化应力后)中起作用；Cochrane，1991，″细胞氧化性损伤的机制″Molec.Aspects Med.12：137-147；Berger，1991，″氧化剂诱导的细胞毒性：代谢调节的攻击″Am.J.Respir.Cell.Biol.Biol.4：1-3。pARPRT的一个重要的生理性功能可能是调节酶的诱导作用、基因表达和细胞分化；Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)处理修饰了ras转化的牛内皮细胞系的生长相关性酶促通道且导致致肿瘤作用明显丧失″，Int.J.Oncol.8：239-252；Bauer等人，1995，″用一种多腺苷二磷酸核糖聚合酶的非共价结合配体5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮逆转恶性肿瘤表型″Biochimie 77：347-377；Minaga等人，1978，″用烟酰胺诱导心脏L-鸟氨酸脱羧酶和用腐胺对其进行调节″Eur.J.Biochem.91：577-85；Griffin等人，1984，″苯甲酰胺和***对肝酶—多腺苷二磷酸核糖聚合酶、细胞色素P-450、苯氧化乙烯水解酶、胆固醇氧化物水解酶、谷胱苷肽S-转移酶和UDP葡糖醛酸转移酶—的体内效应：″Biochem.Biophys.Res.Comm.122：770-5。INH2BP对碱性磷酸酶的诱导作用(Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)处理修饰了ras转化的牛内皮细胞系的生长相关性酶促通道且导致致肿瘤作用明显丧失″，Int.J.Oncol.8：239-252)是某些磷酸化依赖型酶(如MAP激酶拓扑异构酶I和拓扑异构酶II)灭活的可能原因。经Ha-ras转染的牛内皮细胞中的INH2BP消除了致肿瘤作用，使细胞复制停止，提高了拓扑异构酶I、拓扑异构酶II和MAP激酶活性，下调了DNA甲基转移酶和蛋白激酶C，且ODC增加了Rb蛋白的磷酸化过少，并抑制了ras基因的表达而不丧失癌基因的表达，Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)处理修饰了ras转化的牛内皮细胞系的生长相关性酶促通道且导致致肿瘤作用明显丧失″，Int.J.Oncol.8：239-252；Bauer等人，1995，″用一种多腺苷二磷酸核糖聚合酶的非共价结合配体5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮逆转恶性肿瘤表型″Biochimie 77：347-377。
根据最近描述的INH2BP的抗癌作用(Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)处理修饰了ras转化的牛内皮细胞系的生长相关性酶促通道且导致致肿瘤作用明显丧失″，Int.J.Oncol.8：239-252；Bauer等人，1995，″用一种多腺苷二磷酸核糖聚合酶的非共价结合配体5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮逆转恶性肿瘤表型″Biochimie 77：347-377)以及慢性炎症和癌症之间的联系(尤其是NO产生方面)(见：引言)，我们在这里调查了INH2BP是否在体外和体内调节LPS诱导的炎性反应。我们发现，受研究的通道和中介体中有一些(MAP激酶、***素、NO)受INH2BP阻抑，而另一些(TNF、IL-6、NF-κB)未受影响，或有所增加(IL-10)。总之，本发明的数据表明，pADPRT抑制性化合物(如INH2BP)发挥了抗炎作用，而这些效应的组合可能是经这种pARPRT抑制剂预处理过的动物存活率增加的原因。
实施例2
INH2BP阻抑LPS诱导产生iNOS
通过背景技术知道，在各种细胞中一氧化氮(NO)合成酶的可诱导同种型(iNOS)响应促炎刺激而表达。iNOS过度产生NO在休克和发炎中起重要作用(Nathan，1992，″一氧化氮作为哺乳动物细胞的分泌型产物″FASEB J.6：3051-3064；Vane，J.R.，The Croonian Lecture 1993，″内皮：血液循环的大师(maestro)″Proc.Roy.Soc.Lond B 343：225-246；Szabo，C.；1995，″各种形式的循环性休克中一氧化氮的产生的变化″New Horizons 3：3-32)，并可能倾向于致癌性转化(Bartsch等人，1994，″人癌症病因学中内源性形成的N-亚硝基化合物和亚硝基化试剂″Pharmacogenetics 2：272-7；Liu等人，1992，″旱獭肝炎病毒表面抗原诱导肝细胞中合成NO：在肝癌形成中可能的作用″Carcinogenesis 15：2875-7；Ohshima等人，1994，″作为癌症危险因子的慢性感染和发炎过程：一氧化氮在致癌作用中可能的作用″Mutation Res.305：253-64。现在已经克隆出鼠iNOS的启动子区域，并已鉴定出负责应答LPS和IFN的诱导能力的分开的区域。LPS介导的iNOS的诱导作用看来参与了NF-κB的活动和核转位，随后与iNOS启动子结合。iNOS的诱导也会受酪氨酸激酶和NF-κB激活的药物抑制剂抑制；Szabo，C.；1995，″各种形式的循环性休克中一氧化氮的产生的变化″New Horizons 3：3-32。
INH2BP对iNOS表达的抑制效果表现在抑制亚硝酸盐产生、iNOS mRNA表达和iNOS蛋白表达方面。调节作用发生在iNOS诱导作用的早期，因为随着诱导iNOS的刺激后施加的时间增加，INH2BP的效力逐渐丧失。INH2BP对iNOS诱导的调节作用发生于体外和整个动物体内。另外，我们的数据表明，LPS诱导的环加氧酶代谢物的产生与iNOS的诱导类似，是受INH2BP调节的。促炎性细胞因子产生环加氧酶代谢物是由于通过类似与iNOS诱导过程的过程来合成新的mRNA和蛋白并表达COX-2；Vane等人，1995，″对抗炎药物作用方式的新洞察″Inflamm.Res.44：1-10。然而，对LPS诱导的炎性中介体表达的抑制作用不是对INH2BP的非特异性的反应，因为在J774细胞中LPS对TNF的诱导作用并不受该试剂影响。
感兴趣的是，当LPS与INF结合用于免疫刺激时，INH2BP对iNOS的抑制效果大大减少。这种效应可能是由于IFN诱导的转录因子(如干扰素调节因子，Martin等人，1994，″干扰素调节因子I在诱导一氧化氮合成酶中的作用″J.Exp.Med.180：977-84)绕开了上述试剂对iNOS诱导的抑制作用。
以前的体外研究已经暗示，在体外在巨噬细胞中，iNOS的诱导受pADPRT的药物抑制剂调节；Hauschildt等人，1992，″肿瘤坏死因子α诱导L929细胞中一氧化氮合成酶被多腺苷二磷酸核糖聚合酶的抑制剂所抑制″Biochem J.288：255-260；Pellat-Seceunyk等人，1994，″烟酰胺抑制活化的巨噬细胞中一氧化氮合成酶mRNA的诱导″Biochem.J.297：53-58。然而，在这些研究中，采用的pADPRT抑制剂30氨基苯甲酰胺和烟酰胺的浓度很高(10-30mM)，它们抑制全部的蛋白和RNA合成，并可能有其它药学作用(如清除自由基)；Hauschildt等人，1992，″肿瘤坏死因子α诱导L929细胞中一氧化氮合成酶被多腺苷二磷酸核糖聚合酶的抑制剂所抑制″Biochem J.288：255-260。现在采用INH2BP的实验进一步暗示，pADPRT多效性参与iNOS mRNA转录过程。为了研究INH2BP对iNOS启动子的调节作用，用小鼠巨噬细胞iNOS启动子萤光素酶构建物进行瞬时转染试验。缺失型构建物的这些数据间接暗示，INH2BP调节了涉及-1592和-367bp之间鼠iNOS启动子区域的转录行为。组蛋白和核酶的ADP核糖基化可能参与维持松弛的染色质结构；Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)处理修饰了ras转化的牛内皮细胞系的生长相关性酶促通道且导致致肿瘤作用明显丧失″，Int.J.Oncol.8：239-252；Bauer等人，1995，″用一种多腺苷二磷酸核糖聚合酶的非共价结合配体5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮逆转恶性肿瘤表型″Biochimie 77：347-377；Ueda等人，1985，″ADP核糖基化″Ann.Rev.Biochem.54：73-100。以前的实验数据(Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)处理修饰了ras转化的牛内皮细胞系的生长相关性酶促通道且导致致肿瘤作用明显丧失″，Int.J.Oncol.8：239-252；Bauer等人，1995，″用一种多腺苷二磷酸核糖聚合酶的非共价结合配体5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮逆转恶性肿瘤表型″Biochimie 77：347-377)合理地暗示，在这些实验***中，pADPRT抑制性化合物(如INH2BP)预处理抑制pADPRT和组蛋白的自身多腺苷二磷酸核糖基化。已经知道这种作用引发松弛型染色质向稠密型染色质转变，并且通过利用核酸酶和其它DNA结构调节酶的上调作用(Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)处理修饰了ras转化的牛内皮细胞系的生长相关性酶促通道且导致致肿瘤作用明显丧失″，Int.J.Oncol.8：239-252；Bauer等人，1995，″用一种多腺苷二磷酸核糖聚合酶的非共价结合配体5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮逆转恶性肿瘤表型″Biochimie77：347-377)，它可能影响启动子的功能。
实施例3
INH2BP对MAP激酶和NF-κB激活的抑制效果
这些结果已经证明，INH2BP的处理抑制了LPS诱导的MAP激酶的激活。在这方面，这些数据与转化的内皮细胞很相似；Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)处理修饰了ras转化的牛内皮细胞系的生长相关性酶促通道且导致致肿瘤作用明显丧失″，Int.J.Oncol.8：239-252。对MAP激酶激活的抑制作用可能是通过INH2BP触发的多效性细胞反应来产生的。已经表明，MAP激酶可在经LPS或各种促炎细胞因子(TNF-α、白细胞介素-1、神经生长因子)处理过的各种细胞类型中被激活；Kyriakis等人，1996，″警告：由应力和发炎激活的蛋白激酶级联反应″，J.Biol Chem.271：24313-24316；Matsuda等人，1994，″促细胞***原活化蛋白(MAP)激酶激酶/MAP激酶级联反应介导的信号传导通道″J.Leukocyte Biol.56：548-53；Cowley等人，1994，″MAP激酶激酶的激活对于PC12分化和转化NIH 3T3细胞来说充分必要的″Cells 77：841-52；Pang等人，1995，″MAP激酶激酶的抑制阻断了神经生长因子诱导的PC-12细胞分化″J.Biol.Chem.270：13585-8；Willis等人，1996，″培养的单核细胞和星形细胞中细菌脂多糖对促***原激活的蛋白激酶通道的分化诱导作用″Biochem.J.313：519-524；Saklatvala等人，1993，″白细胞介素-1和肿瘤坏死因子-α激活培养细胞中的促***原激活的蛋白(MAP)激酶激酶″FEBS Lett.334：189-92。各种胞内信号通过不同的MAP激酶激酶-激酶汇聚在MAP激酶激酶/MAP激酶级联反应并引发了细胞反应次谱(vice spectrum)；Kyriakis等人，1996，″警告：由应力和发炎激活的蛋白激酶级联反应″，J.Biol Chem.271：24313-24316；Ferrell，JE，1996，″打开难以置信的开关：蛋白激酶级联反应怎样能将分级的输入转变成类似开关的输出″TIBS21：460-466。MAP激酶或MAP激酶激酶的阻断修饰了许多胞内通道并抑制细胞分化和增殖；Kyriakis等人，1996，″警告：由应力和发炎激活的蛋白激酶级联反应″，J.Biol Chem.271：24313-24316；Matsuda等人，1994，″促细胞***原活化蛋白(MAP)激酶激酶/MAP激酶级联反应介导的信号传导通道″J.Leukocyte Biol.56：548-53；Cowley等人，1994，″MAP激酶激酶的激活对于PC12分化和转化NIH3T3细胞来说充分必要的″Cells 77：841-52；Pang等人，1995，″MAP激酶激酶的抑制阻断了神经生长因子诱导的PC-12细胞分化″J.Biol.Chem.270：13585-8；Willis等人，1996，″培养的单核细胞和星形细胞中细菌脂多糖对促***原激活的蛋白激酶通道的分化诱导作用″Biochem.J.313：519-524；Saklatvala等人，1993，″白细胞介素-1和肿瘤坏死因子-α激活培养细胞中的促***原激活的蛋白(MAP)激酶激酶″FEBS Lett.334：189-92。最近，用PD98059抑制MAP激酶激酶已经表明能在培养的内皮细胞和心肌细胞中阻抑iNOS mRNA的表达。Singh等人，1996，″心肌细胞和微血管内皮细胞中细胞因子可诱导的一氧化氮合成的调节″J.Biol.Chem.271：1111-1117。该发现与我们的观察结果(即PD98059导致RAW巨噬细胞中LPS所诱导的亚硝酸盐的产生受到显著抑制)相符。
由于NF-κB的激活是炎性反应中的主要通道，且它参与了LPS(而不是INF)对iNOS的诱导(Szabo，C.；1995，″各种形式的循环性休克中一氧化氮的产生的变化″New Horizons 3：3-32；Martin等人，1994，″干扰素调节因子I在诱导一氧化氮合成酶中的作用″J.Exp.Med.180：977-84)，因此我们试图调查INH2BP对NF-κB的潜在效应。我们的结果证明，INH2BP没有改变NF-κB激活的核转位，或是INH2BP对NF-κB介导的细胞行为的调节作用(如果有的话)可能发生在远离NF-κB核转位的细胞行为中。
实施例4
病理生理学和治疗上的暗示：INH2BP在多种水平上调节炎性反应
促炎基因iNOS和COX-2表达的pADPRT抑制剂的还原，以及随之还原形成的NO和***素可能在各种形式的炎症是有利的(Nathan，1992，″一氧化氮作为哺乳动物细胞的分泌型产物″FASEB J.6：3051-3064；Vane，J.R.，The CroonianLecture 1993，″内皮：血液循环的大师(maestro)″Proc.Roy.Soc.Lond B 343：225-246；Szabo，C.；1995，″各种形式的循环性休克中一氧化氮的产生的变化″NewHorizons 3：3-32；Vane等人，1995，″对抗炎药物作用方式的新洞察″Inflamm.Res.44：1-10)。另外，IL-10释放的增强可能也有其它抗炎作用；Liles等人，1995，″综述：参与发炎和宿主免疫应答的细胞因子的命名法和生物意义″J.Infect.Dis.172：1573-80；Giroir，1993，″脓毒休克的中介体：打断内源性炎性级联反应的方法″Critical Car.Med.21：780-9；Szabo等人，1997，″异丙基肾上腺素调节肿瘤坏死因子、白细胞介素-10、白细胞介素-6和一氧化氮的产生并保护防止内毒素血症中发生血管反应不足″Immunology 90：95-100。可以想象，这些效果明显导致pADPRT抑制性化合物(如INH2BP)预处理以及经致死性剂量内毒素攻击的小鼠存活率的提高。然而，要描述INH2BP发挥对LPS诱导各种炎性中介体表达的效应的确切机制还需要进一步详细的研究。一方面，可以相信pADPRT活性或pADPRT蛋白的结合参与调节炎性中介体的产生和/或发炎过程组分编码基因的表达。另一方面，INH2BP对MAP激酶活性的间接下调作用(Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)处理修饰了ras转化的牛内皮细胞系的生长相关性酶促通道且导致致肿瘤作用明显丧失″，Int.J.Oncol.8：239-252)可能也导致了如其它研究所预计的观察到的效应；Kyriakis等人，1996，″警告：由应力和发炎激活的蛋白激酶级联反应″，J.Biol Chem.271：24313-24316；Ferrell，JE，1996，″打开难以置信的开关：蛋白激酶级联反应怎样能将分级的输入转变成类似开关的输出″TIBS 21：460-466。该结果证明了pADPRT抑制性化合物(如INH2BP)在各种炎性疾病中有治疗潜力。
实施例5
一氧化氮(NO)的一些细胞毒性效应与过亚硝酸盐(一种NO和超氧化物迅速反应形成的反应性氧化剂)的产生有关；Crow等人，1995，″过亚硝酸盐在一氧化氮介导的毒性中的作用″，Current Top Microbiol.Immunol.196：57-73；Pryor等人，1995，″过亚硝酸盐的化学性质：一氧化氮和超氧化物反应的产物″，Am.J.Physiol.L699-L772。过亚硝酸盐的形成已经在各种炎性症状中得到证实，这些症状包括内毒素诱导的***性发炎(Szabo等人，1995，″各种形式的循环性休克中一氧化氮的产生的变化″New Horizons 3：3-32)、关节炎(Kaur等人，″慢性发炎中一氧化氮介导的氧化性损伤的证据。类风湿性患者的血清和滑液中的硝基酪氨酸″FEBS Lett.1359：9-12)、以及角叉菜胶诱导的兽爪水肿(*Salvemini等人，1996)。实际上，从利用NO合成酶(NOS)抑制剂和超氧化物歧化酶模拟物的药理学研究得出结论，过亚硝酸盐在炎性过程发展中起重要的致病作用(Szabo C，1996，″过亚硝酸盐在休克、发炎和局部缺血(schemia)再灌输损伤的生理病理学中的作用″Shock 6：79-88；*Salvemini等人，1996；*Zingarelli等人，1997)。而且，已经证实，目前用于治疗关节炎的一些试剂实际上是过亚硝酸盐的净化剂(Whiteman等人，1996″用某些抗炎药物和四环素抗生素保护抵抗依赖过亚硝酸盐的酪氨酸硝酸化和α1-抗蛋白酶灭活″Annals.of the Rheumatic Disease 55：383-7)。由于认识到与NO有关的细胞毒性的重要部分是由于形成过亚硝酸盐，因此就有必要围绕过亚硝酸盐的形成和作用来开发新的治疗方法。
过亚硝酸盐触发的一种胞内通道与DNA单链断裂以及多腺苷二磷酸核糖合成酶(PARS)的激活有关(Szabo等人，1996，″过亚硝酸盐在休克、发炎和局部缺血再灌输损伤的生理病理学中的作用″Shock 6：79-88；*Szabo，1996b)。PARS的显著激活会迅速消耗其底物NAD+的胞内浓度，降低糖酵解、电子转运速度，从而减少ATP的形成而导致细胞功能障碍(*Berger，1991；*Cochrane，1991)。因此，PARS的抑制剂在这些情况下保护防止了细胞损伤。该机理称为“PARS***假设”，在以前的H2O2诱导的氧化剂损伤和辐射损伤中曾作过分析(*Berger，1991；*Cochrane，1991)，最近已表明其涉及了内毒性休克、中风、局部缺血再灌输损伤和糖尿病中与NO和过亚硝酸盐有关的细胞损伤(Szabo等人，1996，″过亚硝酸盐在休克、发炎和局部缺血再灌输损伤的生理病理学中的作用″Shock 6：79-88；*Zhang等人，1994，*Heller等人，1995)。
Kroger及其同事最近提出了PARS在关节炎中的潜在作用。在过氧化铬酸钾诱导的模型中，烟酰胺处理导致平均关节炎评分减少25-35％(*Miesel等人，1996)。然而，该研究仍未确定抑制机理，因为其没有指明烟酰胺清除自由基活性和PARS抑制效应之间有明显的不同(*Miesel等人，1995)。在本研究中，利用一种新的强效的PARS活性抑制剂(5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP))(*Bauer等人，1995a，*Bauer等人，1995b)，我们研究了PARS在角叉菜胶诱导的兽爪水肿和胶原诱导的关节炎的历程中的药理学抑制效果。我们的研究结果支持了这样一个观点，即PARS的抑制具有抗炎可能性。
实施例6
角叉菜胶诱导的兽爪水肿的诱导和评价
在这些研究中采用雄性Wister大鼠(250-300克，Charles River Laboratories，Wilmington，MA)。在动物右后足爪的跖底下(subplantar)注射含1％1-角叉菜胶的0.1毫升盐水。将这种致炎症试剂给予经INH2BP处理的动物或载体处理的动物。动物在注射角叉菜胶前24小时和2小时受INH2BP(0.5克/千克p.o.)处理。如*Sautebin等人1995中所述的，在注射后立即用器官充满度测量法(phlethysmometry)测定兽爪体积。随后间隔60分钟读取同一兽爪的体积并与初始值比较。对于这些实验，采用6只载体处理的动物和6只INH2BP处理的动物。
实施例7
胶原诱导的关节炎的诱导和评价
这些研究采用雄性DBA/1J小鼠(9周，Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)。将鸡II型胶原(CII)在0.01M乙酸中至浓度为2毫克/毫升4℃搅拌过夜使溶解。-70℃冷冻溶解的CII待用。通过加入结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosisH37ra)至2毫克/毫升制得完全的Freund佐剂(CFA)。注射前，用等体积CFA乳化CII。如Hughes等人1994，″用非促有丝***性抗-CD3单克隆抗体在自身免疫实验模型中诱导T辅助细胞超反应性″J.Immunol.153：3319-3325中所述的那样诱导胶原诱导的关节炎。在第1天，在小鼠尾根部经皮注射100毫升CII。第21天，第二次注射给予CFA中的CII。从第25天起，每隔24小时用载体(n＝10)或INH2BP(n＝60(0.5克/千克p.o))处理动物。每天用级别为0至4的肉眼评分***评价小鼠的关节炎(1-兽爪或一个脚趾溶胀和/或发红；2-涉及到两个关节；3-涉及到两个以上的关节；3-涉及到两个以上的关节；4＝整个兽爪和脚趾有严重的关节炎)。累加个别兽爪的四种评分，计算每个小鼠的关节炎指数。在实验最后(第35天)，麻醉处死动物，取下兽爪和膝盖并固定，以进行组织学检查。组织学检查由不知道治疗方案的调查人员进行。
数据分析和表示
对于角叉菜胶诱导的兽爪水肿的研究，用不成对的斯图登特测试比较处理组和未处理组动物的兽爪体积。对于关节炎的研究，用Mann-Whitney U测试(双尾，不相关的)来测试关节炎指数中的统计差别。用此非参数统计比较中值(而不是平均值)，因为测定规模是按序的，而分布值通常是非正态分布的(Hughes等人1994，″用非促有丝***性抗-CD3单克隆抗体在自身免疫实验模型中诱导T辅助细胞超反应性″J.Immunol.153：3319-3325)。
图10中的数值表示成n个观察值的平均值±平均值标准误差，其中n代表大鼠的数目(每组6只动物)。图11中的数值代表发病率(％)，而图12中的数值代表中值。认为p值低于0.05在统计学上有意义(I′＜0.05；**p＜0.02)。
材料
如前所述(*Bauer等人，1995a；*Bauer等人，1995b)，制得5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)。鸡II型胶原购自Elastin Products Company，Inc.(Owensville，MO)。结核分支杆菌H37Ra购自Difco(Detroit，MI)。所有其它化学物质均购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。角叉菜胶跖底下注射大鼠兽爪导致兽爪体积依赖于时间增加，最大反应在3小时处(图10)。这种角叉菜胶诱导的兽爪水肿被INH2BP处理明显减少(图10)。
在胶原诱导的小鼠体内的关节炎模型中，在第一次胶原免疫后26-35天之间，从关节炎发病率增加以及关节炎评分增加的证据(图11-12)看出，动物关节炎的发展日益增加。INH2BP的处理减少关节炎的发病率直至第33天，并且在整个实验期间降低了疾病的严重性。在第30天，关节炎评分增加至10，而INH2BP处理的动物中关节炎评分中值仍维持在5左右(图12)。在第35天，所有经载体处理的动物以及大多数受INH2BP处理的动物均具有一定程度的关节炎(图11)。然而，即使在第35天，INH2BP处理仍显著降低了关节炎评分中值(图12)。
在第35天，对载体处理的患关节炎动物的兽爪进行组织学评价，揭示有严重的化脓性关节炎症状，大量混合(中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞)浸润到更大的踝关节和终脚趾中。另外，可以看到严重或中度的坏死、增生和滑膜腐肉分离，以及炎症延伸到毗邻的肌肉***导致纤维化和增多的粘液产生。在INH2BP处理的动物体内，关节炎的程度显著降低。尽管如此，在这些动物体内仍有程度明显的关节炎，有中等程度的、主要是中性粒细胞浸润到一些较大的关节中，还伴有轻度至中度的坏死和滑膜增生。与兽爪中的发现类似，在膝盖中发现的严重的化脓性关节炎症状被INH2BP的治疗减轻(结果未显示)。
讨论
过亚硝酸盐、含氧基团以及可诱导的环加氧酶的产物已经被独立地认为是各种形式的炎症(包括关节炎)发病机理中的重要因素(见引言，另见：Brahn，1991，″类风湿性关节炎的动物模型。病因学和治疗的线索″Clin.Orthop.Rel.Res.265：42-53；Kaur等人，″慢性发炎中一氧化氮介导的氧化性损伤的证据。类风湿性患者的血清和滑液中的硝基酪氨酸″FEBS Lett.1359：9-12；Oyanagui Y，1994，″一氧化氮和超氧化物自由基参与大鼠体内反应性关节炎的起始和发展(envelopment)″Life Sci.54：PL285-9；Miesel等人，1994，″别嘌呤醇阻抑小鼠体内关节炎的效果以及在活体外调节人全血中吞噬细胞产生氧自由基″Inflammation6：597-612；Whiteman等人，1996，″用某些抗炎药物和四环素抗生素保护抵抗依赖过亚硝酸盐的酪氨酸硝化和α1-抗蛋白酶灭活″Annals.of the Rheumatic Disease55：383-7；Anderson等人，1996，″选择性抑制环加氧酶(COX)-2逆转了大鼠反应性关节炎中COX-2和白细胞介素6的发炎和表达″J.Clin.Invest.97：2672-2679)。本研究证实了INH2BP在角叉菜胶诱导的兽爪水肿模型和胶原诱导的关节炎模型中的抗炎效果，这支持了这样一个观点，即PARS参与发炎过程的进展且PARS的药理学抑制具有抗炎的潜在可能。
INH2BP的初步作用模式可能与以DNA损伤为特征的琐碎的胞内级联反应被打断有关。PARS激活、腺苷二磷酸核糖化以及NAD+和ATP的清除在发炎关节的各种细胞类型中。用PARS的各种抑制剂(如3-氨基苯甲酰胺、烟酰胺和INH2BP)抑制该通道已经显示出能保护多种细胞免受损伤(Berger，1911；*Cochrane，1991；Szabo等人，1996，″过亚硝酸盐在休克、发炎和局部缺血(schemia)再灌输损伤的生理病理学中的作用″Shock 6：79-88；*Sazbo，1996b)。
炎性病情中过度产生NO是由于可诱导的NOS同种型(iNOS)受阻抑(Nathan，1992，″一氧化氮作为哺乳动物细胞的分泌型产物″FASEB J.6：3051-3064；Szabo；1995，″各种形式的循环性休克中一氧化氮的产生的变化″New Horizons 3：3-32；Southan等人，1996，″氨基烷基胍自发重排成巯基烷基胍-一类新的对于可诱导同种型有选择性的一氧化氮合成酶抑制剂″Br.J.Pharmacol.117：619-632)。几条证据暗示了iNOS和NO过度产生在关节炎致病机理中的作用(综述参见：Stenovic-Racic等人，1993，″一氧化氮和关节炎″Arthr.Rhemat.36：1036-1044；*Evans等人，1995)。第一，在实验动物和人的软骨细胞中已经证明有iNOS表达和NO大量产生(Haeselmann等人，1994，″海藻酸盐培养中人关节软骨细胞合成一氧化氮和蛋白聚糖″FEBS Lett.352：361-364；Sakurai等人，1995，″炎性关节炎中的一氧化氮产生和可诱导的一氧化氮合成酶表达″J.Clin.Invest.96：2357-63；Grabowski等人，1996，″人关节衍生获得的细胞中产生一氧化碳″Br.J.Rheumatol.35：207-12；Murrell等人，1996，″一氧化氮：重要的关节自由基″J.Bone Joint Sur.-Am.78：265-74)。第二，在关节炎患者体内已经证实亚硝酸盐/硝酸盐(NO的降解产物)的循环水平有所增加(Farrell等人，1992，″滑液和血清样品中亚硝酸盐的浓度增加提示类风湿性疾病中的一氧化氮合成增加″Ann.Rhem.Dis.51：1219-22；Stichtenoth等人，1995，″类风湿性关节炎患者的尿液硝酸盐分泌增加，并由强的松龙(predisolone)使其减少″Ann.Rhem.Dis.54：820-4)。第三，关节炎的发展已经表现出被NOS的非同种型选择性抑制剂降低(*Ialential等人，1993；McCartney-Francis等人，1993，″一氧化氮合成酶的抑制剂阻抑关节炎″J.Exp.Med.178：749-753；Weinberg等人，1994，″一氧化氮在自发性鼠自身免疫疾病的致病机理中的作用，增加MRL-1 pr/1pr小鼠中一氧化氮的产生和一氧化氮合成酶的表达，以及通过口服NG-一甲基-L-精氨酸减少了自发产生的肾小球性肾炎和关节炎″J.Exp.Med.1979：651-60；Stefanovic-Racic等人，1994，″一种一氧化氮合成酶的抑制剂N-一甲基精氨酸阻抑大鼠体内反应性关节炎的发展″Arthr.Rheumat.37：1062-9)，以及更近期，被对iNOS有选择性的抑制剂降低(Connor等人，1995，″用可诱导的一氧化氮合成酶的选择性抑制来阻抑佐剂诱导的关节炎″Eur.J.Pharmacol.273：15-24)。在这方面，值得注意的是，在免疫刺激前用PARS抑制剂(包括3-氨基苯甲酰胺、烟酰胺和INH2BP)预处理多种细胞已经显示能阻抑iNOS的mRNA表达并减少NO的产生(*Hauschildt等人，1992，*Pellat-Scecunyk等人，1994；Zingarelli等人，1996，″经细菌脂多糖刺激的巨噬细胞中，过亚硝酸盐介导的DNA链断裂激活了多腺苷二磷酸核糖合成酶并引起细胞能量消耗″J.Immunol.156：350-358；*Szabo等人，1997)。从这些实验数据可以得出结论，PARS通过一个还未确定的机制也能调节iNOS的表达过程，该效应可能代表了PARS抑制在不同形式的发炎中其它有利的作用模式。然而，在解释上述发现时应当谨慎。例如，在上述体外研究中，为了证实能阻抑iNOS诱导，需要非常高浓度(10-30mM)的PARS抑制剂3-氨基苯甲酰胺和烟酰胺。这些试剂的高浓度可能有其它的药理学作用，例如抑制总蛋白和RNA合成和/或清除自由基的作用(*Hauschildt，1992，*Pellat-Seceunyk等人，1994；Zingarelli等人，1996，″经细菌脂多糖刺激的巨噬细胞中，过亚硝酸盐介导的DNA链断裂激活了多腺苷二磷酸核糖合成酶并引起细胞能量消耗″J.Immunol.156：350-358)。另一方面，即使在较低的非细胞毒性浓度(10-300mM)下，INH2BP有效地阻抑了iNOS的表达。然而，在INH2BP情况下，应当认为有几种作用模式，因为该试剂是碱性磷酸酶的诱导物，具有细胞反应的补充的、多效调节作用(*Bauer等人，1996；*Szabo等人，1997)。要在消除PARS基因的细胞或动物中进行实验，以便确切地解决PARS的抑制是否本身阻抑了iNOS诱导过程的问题。
在Ehrlich及其同事最近的研究中，表明在培养的家兔滑液成纤维细胞中，细胞因子诱导的胶原酶活性的表达被3-氨基苯甲酰胺阻抑(*Ehrlich等人，1995)。现在可能可以确定其药理学作用(但是预计将阻抑关节炎的过程)、所用特定抑制剂的性质或者它真正与PARS催化活性的减少有关。在这方面，值得注意的是，根据对药理学抑制剂的研究，PARS已经参与了各种基因的调节，这些基因包括主要组织相容型复合体II类基因(*Hiromatsu等人，1992；Taniguchi等人，1993)、ras c-myc(*Bauer等人，1996，*Nagao等人，1991)、DNA甲基转移酶基因(*Bauer等人，1996)和蛋白激酶C基因(*Bauer等人，1996)。
总之，这个研究工作证实了INH2BP改善了局部炎性反应的发展并抑制了胶原诱导的关节炎的进展。虽然在过去的10年中已经报道了PARS在DNA修复中的作用，但是最近的观察表明消除PARS基因不会损害到DNA的修复：PARS敲除的动物表现正常并存活(*Wang等人，1995)。这一观察加强了药理学抑制剂PARS的抗炎趋势。PARS抑制(与iNOS抑制相反)不可能干扰NO的重要的抗微生物的效果，因为侵入的微生物不含PARS。另一方面，预计PARS抑制不仅能抑制氧化剂诱导的部分细胞毒性，而且在和其它自由基清除剂或其它免疫阻抑剂结合应用时更有效。本发明研究结果支持了这样一个观点，即单独的PARS抑制或与其它抗炎剂的组合代表了一种有前景的新的抗炎方法。
用上述实施例所示类似方式，用式II和式III化合物治疗炎症或炎性疾病，并治疗革兰阴性和革兰阳性感染。
认为前述说明足以使本领域技术人员实施本发明。实际上，对上述用于实施发明的方式进行各种修饰对于药物制剂领域或相关领域技术人员来说是显而易见的，这些均在下列权利要求的范围内。

Claims (6)

1.一种治疗动物或哺乳动物体内炎症或炎性疾病的方法，所述方法包括给予所述动物或哺乳动物有效量的pADPRT抑制性化合物的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中pADPRT抑制性化合物选自下列化合物：具有下式的化合物其中R1、R2、R3、R4、R5和R6各选自氢、羟基、氨基、烷基、烷氧基、环烷基或苯酚，这些基团可任意被烷基、烷氧基、羟基或卤素取代，R1、R2、R3、R4、R5和R6中只有一个是氨基；具有下式的化合物：
Figure A9880638900022
其中R1、R2、R3、R4和R5各自选自氢、羟基、氨基、烷基、烷氧基、环烷基或苯酚，这些基团可任意被烷基、烷氧基、羟基或卤素取代，R1、R2、R3、R4、R5中只有一个选自氨基、亚硝基或硝基；和具有下式的化合物：
Figure A9880638900023
其中R1、R2、R3、R4和R5各自选自氢、羟基、氨基、烷基、烷氧基、环烷基或苯酚，这些基团可任意被烷基、烷氧基、羟基或卤素取代，R1、R2、R3、R4和R5中只有一个是氨基。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述化合物选自：6-氨基-1，2-苯并吡喃酮、3-氨基苯甲酰胺、5-氨基-1(2H)-异喹啉酮、7-氨基-1(2H)-异喹啉酮和8-氨基-1(2H)-异喹啉酮。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物是5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮。
5.一种治疗动物或哺乳动物体内革兰阴性和革兰阳性菌诱导的内毒素症状的方法，所述方法包括给予动物或哺乳动物治疗有效量的pADPRT抑制性化合物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中化合物选自具有下式的化合物。
Figure A9880638900031
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