CN1253178A - 新的肥胖抑素受体相关蛋白和编码序列、及制法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的肥胖抑素受体相关蛋白OB－RGRP2及其核酸编码序列,该蛋白是与肥胖抑素受体相关的蛋白,并且与OB－RGRP高度同源。本发明还提供了生产该核酸序列和蛋白多肽的方法,以及该多肽和核酸序列的用途。

Description

新的肥胖抑素受体相关蛋白和编码序列、及制法和用途

本发明属于生物技术和基因工程领域，更具体地说，本发明涉及一种新的肥胖抑素受体相关蛋白OB-RGRP2及其核酸编码序列，生产该核酸序列和蛋白多肽的方法，以及该多肽和核酸序列的用途。

肥胖症是西方发达国家中最常见的营养性疾病。30％以上的成年人体重超过标准体重的20％。因此，肥胖症成为了重要的公共健康问题。此外，肥胖常与糖尿病，高血压病，高脂血症，心脑血管病甚至癌症密切相关。因而，人们对肥胖症的研究一直投入了大量的人力和物力。然而，肥胖的分子机制一直不清。

多年以来人们认为肥胖与遗传和基因有关。近年从一种患肥胖症的小鼠中克隆到一个与肥胖密切相关的基因-ob基因，该基因编码一个调节人体能量平衡的激素类因子，称为肥胖抑素(leptin，也有人译为消瘦素)，后来，在人类中也克隆到同源的OB基因[Zhang Y，et al.Nature 1994；372：425]。人类的OB基因被定位于7q31.3。OB基因编码由167个氨基酸残基组成的肥胖抑素原蛋白，在去除了N-端的21个氨基酸长的信号肽之后，形成的成熟肥胖抑素含有146个氨基酸。研究表明，肥胖抑素主要由白色的脂肪组织细胞所分泌。

研究还表明，肥胖抑素有多方面的生物学作用[Halaas JL，et al.Science1995；269：543]：

(1)调节能量代谢的平衡。这是肥胖抑素的最重要的功能之一，主要调节食物的摄入和刺激能量的消耗(包括生成热量)。其作用部位和途径有两个：

A.作用于中枢神经内分泌***：主要的靶位点是下丘脑。肥胖抑素经渗透转运方式通过血脑屏障进入中枢神经***。肥胖抑素下游作用分子可能是下丘脑神经肽Y(NPY)。NPY能刺激食物的摄入，而肥胖抑素可抑制NPY合成。另外，其他一些因子或激素如促肾上腺皮质激素(ACTH)、糖原样多肽等也可能与肥胖抑素的活性有关。

B.作用于外周组织：肥胖抑素通过调控脂质代谢而发挥调节能量平衡的作用。肥胖抑素可直接抑制细胞内脂肪酸和甘油三酯的合成，同时增加脂质的氧化，从而导致细胞中脂肪酸和甘油三酯的含量下降。进一步的研究表明，线粒体中氧化作用的增加并不伴有ATP合成的增加，也就是说，氧化作用所增加的能量大多被转换成了热量。

(2)肥胖抑素对其他***也有重要的调节作用。例如A.对生殖***，肥胖抑素对胚胎的发育和成熟有重要作用。B.对造血***，肥胖抑素可直接作用于早期造血过程及刺激红系和粒系祖细胞的发育和分化。这提示，肥胖抑素对血液病有治疗价值，比如可用于分离OB-R阳性的早期造血祖细胞，这对造血干细胞移植有重要意义。另外也可用于治疗贫血及增强巨噬细胞功能和免疫力。

肥胖抑素是通过位于细胞表面的肥胖抑素受体(简称“OB-R”)的介导而起作用的。OB-R是一种跨膜蛋白，它与白介素-6的受体gp130亚单位有相当高的同源性，属于细胞因子I类家族[Tartaglia LA，et a1.Cell 1995；83：1263]。

已发现主要有二种类型的受体：OB-RL和OB-RS。OB-RL由3000多个氨基酸残基组成，其胞内部分长约303个氨基酸，含有与胞内信号传导有关的结构域，如与Jak结合的基序(Motif)和激活STAT的基序。OB-RS缺少了STAT基序，但其胞外部分与OB-RL完全相同。目前至少有四种长度不等的OB-RS。

另一种更短的肥胖抑素受体还缺失了跨膜部分，它是一种存在于血液中的可溶性成分，有可能是一种肥胖抑素的结合蛋白。其来源可能是由OB-RS经蛋白酶作用后胞外部分进入血液所形成的。

OB-RL主要在下丘脑中表达，在其他组织中表达量少。而OB-RS在各种组织中均有不同程度的表达，以肺和肾等组织中表达最高。两种OB-R的结构和表达谱的差异决定了两者功能上有所不同。目前认为，肥胖抑素的作用主要由OB-RL介导。

肥胖症的一种病因是由于肥胖抑素基因缺陷而导致肥胖抑素合成受阻或活力丧失，但这种肥胖抑素基因缺陷所致的肥胖症发病率是极低的。大多数肥胖症可能对肥胖抑素抵抗(leptin resistance)所致。现在认为肥胖抑素抵抗主要有两种原因：A.肥胖抑素由血液通过血脑屏障进入下丘脑的过程受阻，从而使脂肪组织分泌的肥胖抑素不能有效地通过血脑屏障，然而，中枢神经***对肥胖抑素仍是敏感的。由此可推测，能够自由通过血脑屏障的OB-R激活剂可能对治疗这种肥胖症有重要价值。B.肥胖抑素受体或受体后的因子发生功能下降或丧失，从而导致抵抗现象。与肥胖抑素受体及下游信号传导途径中任一环节的功能下降或丧失都可能与肥胖症发病有关。可见，OB-R是肥胖症发病的重要环节之一，同时也是治疗和预防肥胖症的重要靶位点[Tartaglia LA.J Bio Chem 1997；272：6093]。

最近，有学者克隆到一个与OB-R基因相关的基因。该基因含有一个396bp的开放阅读框(ORF)，编码131个氨基酸的蛋白质，命名为OB-RGRP(OB-R Gene relatedprotein，译为“肥胖抑素受体基因相关蛋白”)。OB-RGRP的前2个外显子的序列(164bp)与OB-R的5′-非翻译区序列同源性为100％，但165bp以后的序列与OB-R完全不同[Bailleul B，et al.Nucleic Acids Res 1997；25：2752]。因此作者提出，OB-RGRP与OB-R属于同一个基因座位，由同一个启动子所控制，经不同的外显子剪接过程而形成不同的转录产物。

对OB-RGRP进行同源性比较分析，发现与线虫的C30B5.2蛋白较高的同源性。有两个结构域(domain)高度同源：(1)从+9至+27位的结构域1，该结构域由高度疏水和非极性氨基酸组成；(2)从+65至+88位的结构域2。这些结构域可能是跨膜结构。在许多细胞因子受体(包括OB-R)家族中，在跨膜结构的近端有一个Pro-X-Pro序列(式中，X表示任一氨基酸残基)位于一组疏水性残基之后，这一序列称为box1。如果两个Pro被Ser替代，则受体介导的JAK2酪氨酸磷酸化消失。在OB-RGRP中也存在一个类似的box1(Pro₄₆-Ile-Pro₄₈)。目前已知，OB-RL能够引导JAK/STAT信号传导途径，但OB-RS则不能引导此传导途径。而且两种OB-R都含有box1序列，因此这说明box1尚不足以激活JAK/STAT***。但是两种OB-R在肥胖抑素的刺激下都能诱导下游信号分子基因的表达，这提示OB-RGRP可能是肥胖抑素信号传导过程中一个重要的协同蛋白，尤其是对OB-RS介导的信号传导。

由于OB-R属于I类细胞因子受体家族，与OB-R结构和功能相似和信号传导途径类同的其他I类细胞因子如干扰素、白细胞介素6受体等可能也有类似的协同蛋白。

但是，在本申请之前，没有发表或公开过本发明所涉及的新的肥胖抑素受体相关蛋白及编码序列。

本发明的第一个目的是提供一种新的核酸编码序列，该核酸序列编码肥胖抑素受体相关蛋白家族的一个新成员，本发明新的人基因被命名为OB-RGRP2。

本发明的第二个目的是提供一种新的肥胖抑素受体相关蛋白，该蛋白被命名为OB-RGRP2蛋白。

本发明的第三个目的是提供利用重组技术生产所述新的人OB-RGRP2核酸序列和多肽的方法。

本发明的第四个目的是提供人OB-RGRP2核酸序列和多肽的应用。

本发明的第五个目的是提供针对OB-RGRP2的抗体。

在本发明的一个方面，提供了一种分离的核酸分子，它包括：编码具有人OB-RGRP2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID No.1中85-480位的核苷酸序列至少有70％的同源性；或者该核苷酸序列能够在高度严紧条件下与SEQ ID No.1中85-480位的核苷酸序列杂交。较佳地，该核苷酸序列编码具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该核苷酸序列具有SEQ ID No.1中85-480位的序列。

在本发明的另一方面，提供了一种分离的OB-RGRP2多肽，它包括：具有SEQID No.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽具有SEQ ID No.2氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供了含有上述核酸分子的载体。

在本发明的另一方面，提供了用所述载体转化的宿主细胞。

在本发明的另一方面，提供了具有人OB-RGRP2蛋白活性的多肽的制备方法，该方法包括：

(a)将编码具有OB-RGRP2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成OB-RGRP2蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸85-480位的序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成OB-RGRP2蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达OB-RGRP2蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有OB-RGRP2蛋白活性的多肽。

在本发明的另一方面，提供了能上述的OB-RGRP2多肽特异性结合的抗体

本发明所提供的新的与肥胖抑素受体相关的蛋白，被命名为OB-RGRP2。一方面，OB-RGRP2作为肥胖抑素(OB-R)的协同蛋白，能促进肥胖抑素的信号传导；另一方面OB-RGRP2具有协同其它I类细胞因子受体的作用，在细胞的发育和分化、代谢、调节免疫功能等方面都有重要功能。OB-RGRP2的功能异常可引起肥胖症、造血***的疾病、糖尿病、免疫功能的紊乱、恶性肿瘤等。抗OB-RGRP2的抗体可用于诊断或治疗与OB-RGRP2相关的疾病。

本发明的特征之一是一种分离的或纯化的核酸(多聚核苷酸)序列，这种核酸序列编码具有SEQ ID NO：2所示氨其酸序列的OB-RGRP2多肽。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中85-480位序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。较佳地，该核酸序列与SEQ ID NO：1所示的序列基本上相同。本发明所说的“基本上相同”是指同源性至少80％，较佳地至少90％，更好地至少95％，最好至少99％。

本发明的多聚核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA，基因组DNA，或人工合成的DNA。DNA可以是单链或双链。单链的DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列(85-480bp)相同或者是简并变异体。在本发明中，“简并变异体”是指编码具有SEQ ID NO：2序列的蛋白质或肽但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

本发明还包括了分离或纯化的、在严紧条件下能与SEQ ID NO：1序列(尤其是开放阅读框序列)杂交的核酸片段。在本发明中，”核酸片段”的长度至少含10个核苷酸，较佳地至少20个核苷酸，更佳地至少40个核苷酸，最佳地至少60个核苷酸。“杂交”是指与一段特异的核酸序列结合。如本领域技术人员所知的那样，“严紧条件”通常是指：(1)低离子强度和高温度下的杂交和洗脱，比如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加用变性剂，比如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/O.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少95％，更好地至少97％时才发生杂交。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)，以便确定和/或分离出编码OB-RGRP2的多聚核苷酸。

本发明的多聚核苷酸的编码区序列可以是如SEQ ID NO：1所示的编码区序列的等位基因变异体。已有技术已经表明，等位基因变异体是多聚核苷酸中一个或多个(通常为1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的替代、缺失或***所形成的替换形式，还包括在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸所形成的替换形式。这些替换形式基本上不改变所编码的蛋白或多肽的功能。

在本发明的一个实例中，提供了具有SEQ ID No.1所示序列的核酸分子，其中，开放阅读框位于85-480位核苷酸。

本发明还提供了分离或纯化的OB-RGRP2多肽，比如具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

在本发明中，术语“OB-RGRP2蛋白和/或多肽”指有OB-RGRP2蛋白活性的SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多肽。该术语还包括具有与人OB-RGRP2蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。如本领域技术人员熟知的那样，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括OB-RGRP2蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与OB-RGRP2 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗OB-RGRP2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含OB-RGRP2多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还提供了OB-RGRP2多肽的可溶性片段。通常，该片段具有OB-RGRP2多肽序列的至少约10个连续氨基酸，较佳地至少约30个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供了OB-RGRP2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然OB-RGRP2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还可以包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。

在本发明中，“OB-RGRP2的保守性变异多肽”指与SEQ ID No.2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

                     表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；	Leu

在本发明中，“分离的或纯化的”是指物质已从其原始环境中被分离出来(如果是天然物质，原始环境就是天然环境)。例如，在活体细胞中处于天然状态下的多聚核苷酸和多肽是未分离和纯化的，但如果同样的多聚核苷酸或多肽与天然状态中同时存在的其他物质中分开，就是分离或纯化的。

本发明还包括含有SEQ ID NO：1中开放阅读框序列的核酸分子或其变异体或其片段的载体，还包括用该载体进行遗传工程改造的宿主细胞，以及用DNA重组技术获得的本发明的蛋白或多肽产物。

本发明还提供了诊断与OB-RGRP2功能异常相关的疾病的方法，其中包括(但不限于)检测组织或细胞中OB-RGRP2的表达或OB-RGRP2基因的突变。通过测定组织或细胞中OB-RGRP2的mRNA水平或蛋白水平可以判断OB-RGRP2的表达。

本发明还提供了治疗与OB-RGRP2功能异常相关的疾病的方法，其中包括(但不限于)给细胞施用有效量的复合物，以激活或抑制OB-RGRP2的产生或活性。该复合物的种类包括：化合物；与OB-RGRP2结合的配体、多肽或抗体；反义寡核苷酸；核酶(Ribozyme)；以及它们的混合物。

克隆本发明的OB-RGRP2基因的方法是本领域中熟练人员所常用的。一种可行的途径是利用来源于哺乳动物组织(如胚胎脑或肝或肺等)细胞的mRNA经逆转录方式合成cDNA，并构建相应的cDNA文库，再从文库中获得含OB-RGRP2基因的克隆。

提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，有关的试剂盒也可从商业途径获得。构建cDNA文库的方法也是常规的方法(Sambrook，et al，Molecular Cloning，aLaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。另外还可直接从商业途径(如Clontech)获得多种组织的cDNA文库。

从cDNA文库中获得OB-RGRP2基因，包括(但不限于)以下两种技术路线：一是先筛选文库含有OB-RGRP2 cDNA克隆，再对这些阳性克隆进行DNA序列分析；二是先测定文库中所有克隆的***DNA片段的5′和3′序列，然后再找出含有OB-RGRP2 cDNA的克隆，并进行全长cDNA的序列分析。

筛选文库的方法包括(但不限于)：(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)标志基因的功能显现或丧失；(3)测定OB-RGRP2的转录物的水平；(4)应用免疫学技术或测定生物学活性检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单独使用，也可多种方法组合应用。

在第(1)种方法中，杂交所用的探针是与OB-RGRP2 DNA片段(如SEQ ID No.1所示序列的片段)的任何一部分相同，探针的长度至少10个连续核苷酸，较好是至少约20-30个连续核苷酸，更好是至少约50-60个连续核苷酸，最好是至少约100个核苷酸。探针的长度通常为5kb以内，较佳地2kb以内，更佳地1kb以内，最佳地500bp以内。DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。

在第(4)种方法中，检测OB-RGRP2基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹法、放射免疫沉淀法、酶联免疫吸附法(ELISA)等进行。

DNA序列的测定可用常规的双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS，1977，74：5463-5467)，而测序所用的引物可已知的cDNA序列(如SEQ ID No.1的序列)设计。

为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。

如果未能获得完整的5′端编码序列(这在cDNA克隆中是经常遇到的问题)，则需要进行RACE(cDNA末端快速扩增技术)。

一旦获得全长的cDNA序列，则可用计算机对序列进行分析，如开放阅读框的位置、可能的信号肽、跨膜结构及其基因或蛋白结构的同源性比较等。

此外，在获得了全长cDNA序列，就可以用常规方法设计和合成有关引物，通过PCR扩增法而获得本发明蛋白的编码序列。

本发明的OB-RGRP2多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的OB-RGRP2蛋白或多肽。一般来说有以下步骤：

(a)将编码具有OB-RGRP2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成OB-RGRP2蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸85-480位的序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成OB-RGRP2蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达OB-RGRP2蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有OB-RGRP2蛋白活性的多肽。

在步骤(a)中，所用的编码具有OB-RGRP2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可以是具有SEQ ID No.1编码区的DNA片段或其变异体。

“表达调控序列”包括至少一个启动子、至少一个终止密码子和其他任何对于载体核酸序列的合适转录和随后翻译所必需或优选的DNA序列，例如前导序列、增强子等。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

表达载体的一个重要特征是含有适当的启动子和翻译控制元件。多种表达载体可从商业途径得到。常用的载体包括(但不限于)：质粒、噬菌体、粘粒、酵母表达载体、病毒、Ti质粒等，但最常用的载体首选质粒。常用的宿主细胞包括(但不限于)：细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞或植物细胞等，但最常用的宿主细胞为细菌，尤其是大肠杆菌。另一个较常用的表达***是哺乳动物细胞系，如Hela细胞系、COS细胞系或CHO细胞系等。

可用本领域中熟练人员已知的方法构建含OB-RGRP2编码序列的重组表达载体。这些方法包括：体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(参见：Sambrook，et al，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)。

重组的OB-RGRP2蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗OB-RGRP2功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或拮抗OB-RGRP2功能的抗体、多肽或其它配体。例如，抗体可用于激活或抑制OB-RGRP2的功能。此外，用表达的重组OB-RGRP2蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的、能抑制或刺激OB-RGRP2功能的多肽分子。

本发明还提供了能特异地与OB-RGRP2结合的抗体或抗体片段。抗体片段有Fab、Fab′、F(ab′)₂或Fr片段。抗体可以是单链的、人源化的或嵌合的抗体。

有多种方法可用于生产针对OB-RGRP2抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于)：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。

抗OB-RGRP2的抗体可用于免疫组织化学技术，以检测活检样本中的OB-RGRP2的存在与否。与OB-RGRP2结合的单克隆抗体还可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪OB-RGRP2的位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于相关细胞的定位，如判断肿瘤细胞是否有转移等。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与OB-RGRP2相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断OB-RGRP2的产生或活性。

抗体也可被设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如OB-RGRP2高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素、蓖麻蛋白、红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP(N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯)攻击抗体上的氨基基团，通过二硫键的交换作用而将毒素结合于抗体上。这种杂交抗体可用于杀灭OB-RGRP2阳性细胞。

多克隆抗体的生产可用OB-RGRP2蛋白或多肽免疫动物，如家兔、小鼠和大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，其中包括(但不限于)弗氏佐剂等。

OB-RGRP2单克隆抗体可用杂交瘤技术生产(Kohler and Milstein.Nature，1975.256：495-497)。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison et al，PNAS，1985，81：6851)。此外，已有的生产单链抗体的技术(美国专利No.4946778)，也可用于生产抗OB-RGRP2的单链抗体。

能与OB-RGRP2结合的多肽分子，可通过对由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库进行筛选而获得。

OB-RGRP2多聚核苷酸还可用于OB-RGRP2相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，OB-RGRP2多聚核苷酸可用于检测OB-RGRP2的是否表达或OB-RGRP2的表达是否异常(如在疾病状态下)。如OB-RGRP2 DNA序列可用于对活检样本的杂交以判断OB-RGRP2的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法、Northern印迹法和原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。另外，用OB-RGRP2特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(PCR)体外扩增也可检测OB-RGRP2的转录产物。其中特异性的引物可以根据SEQ ID No.1序列进行设计，其长度通常为15-60个核苷酸，较佳地为20-50个核苷酸，更佳地为25-40个核苷酸。

另外，检测OB-RGRP2基因的突变也可用于诊断OB-RGRP2相关的疾病。OB-RGRP2突变的形式包括：点突变、易位、缺失、重组以及与正常野生型OB-RGRP2 DNA序列相比的其他任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有时会影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法和Western印迹法可间接地判断基因有无突变。

OB-RGRP2多聚核苷酸还可用于多种治疗用途。基因治疗技术可用于治疗由于OB-RGRP2的无表达或异常的/无活性的OB-RGRP2的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的OB-RGRP2，用于抑制内源性的OB-RGRP2活性。例如，一种变异的OB-RGRP2可以是截短的、缺失了信号传导功能域的OB-RGRP2。因此，这种变异的OB-RGRP2虽可与下游的底物结合，但缺乏信号传导活性。这样，重组的基因治疗载体就用于治疗OB-RGRP2表达或活性异常所致的疾病。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将OB-RGRP2基因转移至细胞内。构建携带OB-RGRP2基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)。另外，重组OB-RGRP2基因可被包装在脂质体中而转移至细胞内。

抑制OB-RGRP2mRNA翻译的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)和核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何常规合成RNA或DNA的技术获得，如已广泛应用的固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术。反义RNA分子也可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得，其中该DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，例如增加两侧的序列长度，使寡核苷酸应用磷酸硫酯键而非磷酸二酯键。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法是本领域中已知的各种常规技术，其中包括(但并不限于)：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

在附图中，图1为本发明的人OB-RGRP2与OB-RGRP的氨基酸序列的同源比较图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似的氨基酸用“+”标出。

图2为本发明的人OB-RGRP2与线虫的C30b5的氨基酸序列的同源比较图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似的氨基酸用“+”标出。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，(比如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件)，或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1：OB-RGRP2基因的克隆

用异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎脑总RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiegene)从总RNA中分离poly(A)mRNA。2微克poly(A)mRNA经逆转录形成cDNA.用UniZAPxR载体试剂盒(购自Stratagene)将cDNA片段定向***到载体的多克隆位点上，转化DH5细菌形成cDNA文库。共获得3028个克隆。用双脱氧法测定所有克隆的5′和3′末端的序列。将测定的cDNA序列与已有的公共DNA序列数据库进行比较，结果发现有一个克隆(018e11)的DNA序列与人OB-RGRP的同源性达70.2％。通过合成一系列引物对018e11克隆所含的DNA序列进行双向测定。计算机分析表明，018e11克隆所含的全长cDNA是一个新的DNA序列(如SEQ ID No.1所示)，从第85bp至480bp有一个396bp的ORF，编码一个新的由131氨基酸构成的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。该蛋白质被命名为OB-RGRP2蛋白。

OB-RGRP2含有131个氨基酸，与OB-RGRP的长度完全相同。蛋白质水平的同源性分析表明，OB-RGRP2与OB-RGRP相同性为67％，相似性为80％(图1)。与线虫的C30b5蛋白相同性为48％，相似性为78％(图2)。结构分析表明，OB-RGRP2存在两个主要由疏水性氨基酸组成的结构域(9-27位和65-88位)，它们被推定为跨膜结构，因而OB-RGRP2为跨膜蛋白。在结构域1区存在一个LRRs基序，该基序富含亮氨酸，其功能主要参与蛋白-蛋白之间的相互作用。在结构域1的下游，还存在一个Pro-X-Pro的基序(SEQ ID No.2中第46-48位氨基酸Pro Ile Pro)，该基序与Jak2的功能有关。上述结果表明，OB-RGRP2与OB-RGRP同属于一个基因家族，具有OB-RGRP相似的功能，即作为OB-R的协同蛋白促进肥胖抑素的信号传导；另外，还可能具有协同其它细胞因子受体的作用，因而其功能比OB-RGRP更为广泛。在细胞的发育和分化、代谢、调节免疫功能等方面都有重要作用。

本发明的人OB-RGRP2除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人OB-RGRP2还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人OB-RGRP2的N端与人OB-RGRP的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。

针对本发明人OB-RGRP2的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。

例如，本发明人OB-RGRP2核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人OB-RGRP2的表达水平或者抑制人OB-RGRP2的过度表达。本发明的人OB-RGRP2蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人OB-RGRP2缺失、无功能或异常而导致的有关病症，尤其是一些与肥胖有关的病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。

实施例2：用RT-PCR方法克隆OB-RGRP2

用胎脑细胞总RNA为模板，以oligo-dT为引物进行逆转录反应合成cDNA，用Qiagen的试剂盒纯化后，用下列引物进行PCR扩增：正向引物F15’-CCGCCGTAGCGCGTCTTG-3’位于SEQ ID No.1的起始处；反向引物R1：5’-GCATAGCAATTATTTTCCAG-3’位于SEQ ID No.1的1532-1551bp。扩增反应的条件：在50μl的反应体积中含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/LMgCl2，200μmol/L dNTP，25pmol引物，2.5U的Taq DNA聚合酶。在PE9600型DNA热循环仪上按下列条件反应25个周期：94℃ 30秒；55℃，30秒；72℃ 2分钟。在RT-PCR时同时设β-actin为阳性对照和模板空白为阴性对照。扩增产物QLAGEN试剂盒纯化后，用TA克隆试剂盒连接到pCR载体上(Invitrogen)，并测定DNA序列。结果PCR产物的DNA序列与SEQ ID NO：1的1-1551bp完全相同。

实施例3：重组OB-RGRP2的体外表达，分离和纯化

分别在OB-RGRP2基因的起始密码子处及终止密码子处设计了一对引物，其5’端分别带有BamHI和EcoRI酶切位点。以质粒018e11或市售的cDNA文库为模板进行PCR扩增获得OB-RGRP2基因编码区。经过酶切将扩增片段***表达载体pGEX-2T(购自Pharmacia Biotech)，并转化大肠杆菌E.coli DH5α，在含氨苄青霉素和IPTG的LB平板上，筛选白色的5个重组转化子进行DNA序列分析，结果与018e11中的基因编码区序列完全相同。该重组克隆能表达GST-OBRGRP2融合蛋白，克隆记为pOBRGRP2。

挑一环大肠杆菌DH5α(pOBRGRP2)菌株，接种于20ml LB培养基(含氨苄青霉素100微克/ml)，37℃振荡培养过夜作为种子液，取种子液按2％接种量转接于4升LB培养基，37℃振荡培养至菌体A₆₀₀＝0.7时(对数生长期)，加入IPTG至终浓度0..4mmol/L，再培养25℃培养12小时，离心收集菌体，用1×PBS洗用缓冲液A(16mMNa2HPO4，4mM NaH2PO4，pH6.5)按10ml/克菌体溶解，冰浴中超声破碎，离心后收集上清，上清液过谷胱甘肽-Sepharose 4B层析柱，用缓冲液A淋洗后，用含5mM还原型谷胱苷肽的洗脱液进行洗脱。洗脱液经SDS-PAGE显示约44kDa处有GST-OBRGRP2融合蛋白产物。

实施例4：抗OB-RGRP2抗体的产生

用多肽合成仪(PE-ABI)合成下述OB-RGRP2特异性的多肽：NH2-Leu-Pro-Ile-Val-Phe-Ala-Arg-Ala-His-Leu-COOH。将该多肽分别与血蓝蛋白和牛血清白蛋白偶合形成复合物，方法参见：Avrameas.Immunochemistry，1969；6：43。用4mg上述血蓝蛋白多肽复合物加上完全弗氏佐剂免疫家兔，15天后再用血蓝蛋白多肽复合物加不完全弗氏佐剂加强免疫一次。采用经15μg/ml牛血清白蛋白多肽复合物包被的滴定板做ELISA测定兔血清中抗体的滴度。用蛋白A-Sepharose从抗体阳性的家兔血清中分离总IgG。将多肽结合于溴化氰活化的Sepharose 4B柱上，用亲和层析法从总IgG中分离抗多肽抗体。免疫沉淀法证明纯化的抗体可特异性地与OB-RGRP2结合。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                          序列表(1)一般信息：(i)申请人：上海生元基因开发有限公司(ii)发明名称：新的肥胖抑素受体相关蛋白和编码序列、及制法和用途(iii)序列数目：2(2)SEQ ID NO.1的信息：(i)序列特征

(A)长度：2701bp

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA.(xi)序列描述：SEQ ID NO.11    CCGCCGTAGC  GCGTCTTGGG  TCTCCCGGCT  GCCGCTGCTG  CCGCCGCCGC51    CTCGGGTCGT  GGAGCCAGGA  GCGACGTCAC  CGCCATGGCA  GGCATCAAAG101    CTTTGATTAG  TTTGTCCTTT  GGAGGAGCAA  TCGGACTGAT  GTTTTTGATG151    CTTGGATGTG  CCCTTCCAAT  ATACAACAAA  TACTGGCCCC  TCTTTGTTCT201    ATTTTTTTAC  ATCCTTTCAC  CTATTCCATA  CTGCATAGCA  AGAAGATTAG251    TGGATGATAC  AGATGCTATG  AGTAACGCTT  GTAAGGAACT  TGCCATCTTT301    CTTACAACGG  GCATTGTCGT  GTCAGCTTTT  GGACTCCCTA  TTGTATTTGC351    CAGAGCACAT  CTGATTGAGT  GGGGAGCTTG  TGCACTTGTT  CTCACAGGAA401    ACACAGTCAT  CTTTGCAACT  ATACTAGGCT  TTTTCTTGGT  CTTTGGAAGC451    AAGGACGACT  TCAGCTGGCA  GCAGTGGTGA  AAAGAAATTA  CTGAACTATT501    GTCAAATGGA  CTTCCTGTCA  TTTGTTGGCC  ATTCACGCAC  ACAGGAGATG551    GGGCAGTTAA  TGCTGAATGG  TATAGCAAGC  CTCTTGGGGG  TATTTTAGGT601    GCTCCCTTCT  CACTTTTATT  GTAAGCATAC  TATTTTCACA  GAGACTTGCT 651    GAAGGATTAA  AAGGATTTTC  TCTTTTGGAA  AAGCTTGACT  GATTTCACAC701    TTATCTATAG  TATGCTTTTT  GTGGTGTCCT  GCTGAATTTA  AATATTTATG751    TGTTTTTCCT  GTTAGGTTGA  TTTTTTTTGG  AATCAATATG  CAATGTTAAA801    CACTTTTTTA  ATGTAATCAT  TTGCATTGGT  TAGGAATTCA  GAATTCCGCC851    GGCTCTATTA  CTGGTCAAGT  ACATCTTTTC  TCTTAAAATT  ATTTAGCCTC901    CATTATTACA  AAAAATTATA  AAAATAAGTT  TTCAGTCAGT  CAGGATGACA951    TCACTCCCAA  TGTTATGCAG  ACATACAGAC  GGTTGGCATA  CGTTATAGAC1001    TGTATACTCA  GTGCAAATAT  AGCTGCATTT  ATACCTCAGA  GGGGCCAAGT1051    GTTAATGCCC  ATGCCCTCCG  TTAAGGGTTG  TTGGTTTTAC  TGGTAGACAG1101    ATGTTTTGTG  GATTGAAAAT  TATTTTATGG  AATTGCTACA  GAGGAGTGCT1151    TTTCTTCTCA  ATTGTTAGAA  GAATTTATGT  TAAACTTTAA  GGTAAGGGTG1201    TAAAAACATT  TTTGAGATAA  GGTTTTTATT  TATGTTTATT  ATTGTTAGAG1251    TGAGTTGCAA  TGTGGGAAGA  AATGACATTG  AAATTCCAGT  TTTTGAATCC1301    TGTTTCTATT  TATAAGTGAA  ATTTGTGATC  TCCTATCAAC  CTTTCATGTT1351    TTACCCTGTT  AAAATGGACA  TACATGGAAC  CACTACTGAT  GAGGGACAGT1401    TGTATGTTTG  CATCATATAT  GCCAGAAAAC  CTTCCTCTGC  TTCCTCCTTT1451    TGACTTATTT  GGTATGTTGT  ATATATTACA  TAAAATAACT  TTTCAAATAT1501    AGTTTAATAA  CACTTAGAAG  TGTTTACTTA  CCTGGAAAAT  AATTGCTATG1551    CCGTACATTC  AGAGTGCCCC  CTCCCCTGCA  AGGCCTTGCC  ATGATTAACA1601    AGTAACTTGT  TAGTCTTACA  GATAATTCAT  GCATTAACAG  TTTAAGATTT1651    AGACCATGGT  AATAGTAGTT  CTTATTCTCT  AAGGTTATAT  CATATGTAAT1701    TTAAAAGTAT  TTTTAAGCCA  AGTTTCCTGT  ATACCTCTGA  ACTGTTTTGA1751    TTTTGAGTTC  ATCATGATAG  ATCTGCTGTT  TCCTTATAAA  AGGCATTTGT1801    TGTGTGAGTT  AATGCAAAGT  AGCCAAGTCC  AGCTATATAG  CAGCTTCAGA1851    AACATACCTG  ACCAAAAAAT  TCCCAGTAAC  CAGGCATGAT  CAATTTATAG1901    TGGTCGTTTA  CATCTAATAA  TTATCAGGAC  TTTTTTCAGG  AGTGGGTTAT1951    AAAAACATTC  AAGTTGGTCT  GACAGTATTT  TGTTAAGGAT  ATTTGTTTGT2001    ATGTTTATTC  AGTATACTTA  CATAAAAATT  ATTTCGCCAT  CAGCCAAAAC2051    TCAGTAATCA  TGACAGCTGT  CTGTTGTTTT  ATGAAGTTTA  TTTCTCAAGA2101    AAATGGGAAT  AAATTTGGGA  TTTGTTCAGC  TTTTTTACTA  AAGATGCCTA2151    AAGCCACAGG  TTTTATTGCC  TAACTTAAGC  CATGACTTTT  AGATATGAGA2201    TGACGGGAAG  CAGGACGAAA  TATCGGCGTG  TGGCTGGAGC  CTTCCCACTG2251    GAGGCTGAAA  GTGGCTTGTG  GTATTATAAT  GTTCAGATTT  CAAGAGGAAG2301    GTGCAGGTAC  ACATGAGTTA  GAGAGCTGGT  GAGACAGTTG  GGAACTCTTT2351    GTGCTTGTGA  TCTACTGGAC  TTTTTTTTTG  CAGGAAGTGC  ATTCTCTGGT2401    CCTTCCCTAT  TTTCTGTTCT  GGATGTCAGT  GCAGTGCACT  GCTACTGTTT2451    TATCCACTTG  GCCACAGACT  TTTTCTAACA  GCTGCGTATT  ATTTCTATAT2501    ACTAATTGCA  TTGGCAGCAT  TGTGTCTTTG  ACCTTGTATA  CTAGCTTGAC2551    ATAGTGCTGT  CTCTGATTTC  TAGGCTAGTT  ACTTGAGATA  TGAATTTTCC2601    ATAGAATATG  CACTGATACA  ACATTACCAT  TCTTCTATGG  AAAGAAAACT2651    TTTGATGATG  AAACAATAAA  GATTTTAAAT  ATCAAAAAAA  AAAAAAAAAA2701    A(2)SEQ ID NO.2的信息：(i)序列特征

(A)长度：131个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：多肽(xi)序列描述：SEQ ID NO.21 Met Ala Gly Ile Lys Ala Leu Ile Ser Leu Ser Phe Gly Gly Ala16 Ile Gly Leu Met Phe Leu Met Leu Gly Cys Ala Leu Pro Ile Tyr31 Asn Lys Tyr Trp Pro Leu Phe Val Leu Phe Phe Tyr Ile Leu Ser46 Pro Ile Pro Tyr Cys Ile Ala Arg Arg Leu Val Asp Asp Thr Asp61 Ala Met Ser Asn Ala Cys Lys Glu Leu Ala Ile Phe Leu Thr Thr76 Gly Ile Val Val Ser Ala Phe Gly Leu Pro Ile Val Phe Ala Arg91 Ala His Leu Ile Glu Trp Gly Ala Cys Ala Leu Val Leu Thr Gly106 Asn Thr Val Ile Phe Ala Thr Ile Leu Gly Phe Phe Leu Val Phe121 Gly Ser Lys Asp Asp Phe Ser Trp Gln Gln Trp

Claims (10)

1.一种分离的核酸分子，其特征在于，它包括：编码具有人OB-RGRP2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID No.1中85-480位的核苷酸序列至少有70％的同源性；或者该核苷酸序列能够在高度严紧条件下与SEQ ID No.1中85-480位的核苷酸序列杂交。

2.如权利要求1所述的分子，其特征在于，该核苷酸序列编码具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽。

3.如权利要求1所述的分子，其特征在于，该核苷酸序列具有SEQ ID No.1中85-480位的序列。

4.一种分离的OB-RGRP2多肽，它包括：具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的核酸分子。

7.一种用权利要求6所述的载体转化的宿主细胞。

8.一种具有人OB-RGRP2蛋白活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将编码具有OB-RGRP2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成OB-RGRP2蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸85-480位的序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成OB-RGRP2蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达OB-RGRP2蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有OB-RGRP2蛋白活性的多肽。

9.一种能与权利要求4所述的OB-RGRP2多肽特异性结合的抗体。

10.一种核酸分子，它含有权利要求1所述的核酸分子中连续的10-2000核苷酸。

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