CN1241940C

CN1241940C - 新型胶原蛋白样蛋白clac、其前体和它们的编码基因

Info

Publication number: CN1241940C
Application number: CNB018077323A
Authority: CN
Inventors: 岩坪威; 桥本唯史; 永井康雄
Original assignee: BF Research Institute Inc
Current assignee: R&amp D Management Co., Ltd.
Priority date: 2000-02-14
Filing date: 2001-02-14
Publication date: 2006-02-15
Anticipated expiration: 2021-02-14
Also published as: US20110137013A1; US7514542B2; ATE490979T1; US20100004433A1; DE60143608D1; AU2001232275A1; EP1270588B1; CA2400117C; JP4249927B2; EP1270588A1; US20040250304A1; US8173775B2; US20090280530A1; EP1270588A4; WO2001058943A1; CA2400117A1; CN1422280A; US7888076B2

Abstract

本发明提供存在于脑淀粉样蛋白中的新型人胶原蛋白样蛋白CLAC及其前体CLAC-P；它们的编码基因；小鼠CLAC-P的cDNA及其推定氨基酸序列；所述蛋白的特异性抗体；以及应用所述化合物诊断、治疗和预防阿耳茨海默氏病的方法。

Description

新型胶原蛋白样蛋白CLAC、其前体和它们的编码基因

本发明涉及淀粉样蛋白中的人型胶原蛋白样蛋白(CLAC)及其前体(CLAC-P)，它们在阿耳茨海默氏病患者脑中累积并形成老年斑；以及涉及其编码基因。本发明进一步涉及小鼠型CLAC-P的cDNA和氨基酸序列。本发明还涉及开发以下方法：通过抑制淀粉样蛋白累积机制治疗阿耳茨海默氏病的方法；通过抑制细胞损伤治疗阿耳茨海默氏病的方法以及诊断阿耳茨海默氏病的方法。

发明背景

阿耳茨海默氏病是痴呆性神经变性性疾病，其特征在于形成老年斑和神经纤维退变以及神经元退变。阿耳茨海默氏病最突出的特征是老年斑，老年斑是主要由以下组分沉积组成的病变：β-淀粉样蛋白前体蛋白(βAPP)产生的淀粉样蛋白-β肽(Aβ)(Biochem Biopys ResCommun 122，1131(1984))、载脂蛋白E(Brain Res 541，163(1984))和补体组分C1q(Acta Neuropathol 57，239(1982))。非Aβ淀粉样蛋白组分例如上述载脂蛋白E(Nature 372，92(1994))和C1q(J Neurosci Res 46，58(1996))的作用是促进Aβ自身聚集并形成淀粉样蛋白纤维。Aβ由40-42个氨基酸组成，包括神经元在内的各种细胞分泌Aβ，正常浓度下它对细胞无毒性。然而，浓度增高时，Aβ聚集而且对神经元具有毒性(Science 250，279(1990))。已知在这个过程中，若干分子例如RAGE(Nature 382，685(1996))和清除剂受体A(Nature 382，716(1996))出现在细胞表面上，这些分子起聚集的Aβ受体作用。由此可见，淀粉样蛋白聚集、累积和对细胞产生毒性在阿耳茨海默氏病神经元退变过程中起非常重要的作用；所以，抑制上述过程是对阿耳茨海默氏病的有效治疗方法。

Aβ淀粉样蛋白累积是阿耳茨海默氏病的突出特征，然而，已知仅仅Aβ累积不足以对神经元产生毒性以及发生阿耳茨海默氏病(J.neurosci.17，7053(1997))。另一方面，据所述事实推测，促进老年斑淀粉样蛋白累积过程的蛋白质(如载脂蛋白E)的遗传多态性是发生阿耳茨海默氏病的高危因素(Science 261，921(1993))。已经指出，淀粉样蛋白中未知蛋白组分可显著影响淀粉样蛋白的累积和神经元损伤；然而，仍未鉴定出有关组分。

发明概述

在考虑上述因素的情况下，本发明者制备了抗从阿耳茨海默氏病患者脑提取的淀粉样蛋白组分的小鼠单克隆抗体，在这些抗体中，意外发现了选择性染色老年斑淀粉样蛋白而且生化性识别50-100kD新型蛋白的单克隆抗体。

本发明者进而根据这些发现研究了淀粉样蛋白沉积，发现了一种新型的人胶原蛋白样阿耳茨海默氏病淀粉样蛋白斑组分(CLAC)，成功获得CLAC的完整结构，而且克隆了编码完整CLAC及其前体(CLAC-P)的新型基因。本发明者进一步测定了小鼠型CLAC-P的cDNA序列而且推测了其氨基酸序列。

本发明涉及：

(1)包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸868-2493的核苷酸序列的CLAC DNA，

(2)包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸113-654的氨基酸序列的CLAC，

(3)编码在(2)定义的CLAC中***、缺失或取代一个或多个氨基酸的蛋白的DNA，所述编码蛋白具有下列特性：

(a)累积在阿耳茨海默氏病老年斑淀粉样蛋白组分中，以及

(b)具有促进Aβ聚集的作用，

(4)在严格条件下与(1)定义的DNA杂交而且编码具有下列特性的蛋白的DNA，

(a)累积在阿耳茨海默氏病老年斑淀粉样蛋白组分中，

(b)具有促进Aβ聚集的作用，

(5)(3)或(4)定义的DNA编码的蛋白，

(6)包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸532-2493的核苷酸序列的CLAC-P DNA，

(7)包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的CLAC-P，

(8)编码(7)定义的CLAC-P中***、缺失或取代一个或多个氨基酸的蛋白的DNA，所述编码蛋白在细胞表面起Aβ受体作用，

(9)在严格条件下与(6)定义的DNA杂交而且编码起细胞表面Aβ受体作用的蛋白的DNA，

(10)(8)或(9)定义的DNA编码的蛋白，

(11)其中在SEQ ID NO：2所示的氨基酸141-146或氨基酸589-597区段中缺失或取代一个或多个氨基酸的(10)定义的蛋白，

(12)包含(1)、(3)和(4)任一项定义的DNA的表达载体，

(13)(12)定义的载体转化的转化体，

(14)一种生产重组蛋白的方法，该方法包括在能够表达(12)定义的表达载体的条件下培养(13)定义的转化体，

(15)包含(6)、(8)和(9)任一项定义的DNA的表达载体，

(16)(15)定义的载体转化的转化体，

(17)一种生产重组蛋白的方法，该方法包括在能够表达(15)定义的表达载体的条件下培养(16)定义的转化体，

(18)一种转化体，它保藏在国际专利生物保藏单位国立高级工业科技研究所(National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)，保藏号为FERM BP-7438，

(19)(18)定义的转化体包含的CLAC-P基因，

(20)一种生产重组蛋白的方法，该方法包括在能够表达其中包含CLAC-P基因的载体的条件下培养(18)定义的转化体，

(21)特异性结合(2)或(5)定义的蛋白的抗体，

(22)为单克隆抗体9D2的(21)定义的抗体，

(23)一种筛选CLAC活性抑制剂的方法，该方法包括使用(2)或(5)定义的蛋白，

(24)一种可通过(23)定义的筛选方法获得的CLAC活性抑制剂，

(25)一种检测CLAC的方法，该方法包括使用(21)定义的抗体，

(26)一种治疗、延迟恶化或预防阿耳茨海默氏病的方法，该方法包括使用(21)定义的抗体或(24)定义的CLAC活性抑制剂，

(27)一种(25)定义的方法，其中所述抗体为单克隆抗体9D2，

(28)一种(26)定义的方法，其中所述抗体为单克隆抗体9D2，

(29)一种纯化CLAC的方法，该方法包括使用单克隆抗体9D2，

(30)一种特异性结合(7)、(10)和(11)任一项定义的蛋白的抗体，

(31)一种(30)定义的抗体，它为单克隆抗体9D2，

(32)一种筛选CLAC-P活性抑制剂的方法，该方法包括使用(7)、(10)和(11)之一定义的蛋白，

(33)一种可通过(32)定义的筛选方法获得的CLAC-P活性抑制剂，

(34)一种检测CLAC-P的方法，该方法包括使用(30)定义的抗体，

(35)一种治疗、延迟恶化或预防阿耳茨海默氏病的方法，该方法包括使用(30)定义的抗体或(33)定义的CLAC-P活性抑制剂，

(36)一种(34)定义的方法，其中所述抗体为单克隆抗体9D2，

(37)一种(35)定义的方法，其中所述抗体为单克隆抗体9D2，

(38)一种纯化CLAC-P的方法，该方法包括使用单克隆抗体9D2，

(39)一种诊断阿耳茨海默氏病的试剂盒，该试剂盒包括可检测性标记的单克隆抗体9D2，

(40)一种转基因动物，其中(1)、(3)、(4)、(6)、(8)和(9)任一项定义的DNA人工***所述染色体中或从所述染色体缺失。

附图简述

图1A和1B分别显示CLAC-P cDNA核苷酸序列及其相应的推定氨基酸序列。

图2显示表达CLAC-P的HEK293细胞的9D2免疫染色(左图，A)和表达CLAC-P的HEK293细胞膜部分的蛋白质印迹(右图，B)。

图3显示小鼠CLAC-P的cDNA核苷酸序列。

图4显示小鼠CLAC-P的推定氨基酸序列。

优选实施方案详述

本发明的第一方面为包含编码CLAC的SEQ ID NO：1所示核苷酸868-2493核苷酸序列的DNA。

本发明的第二方面为具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸113-654氨基酸序列的CLAC。

本发明的新型淀粉样蛋白分子CLAC和CLAC-P可利用抗体的特异性相互作用检测，见实施例2介绍。也可以检测其部分氨基酸序列、cDNA序列及其氨基酸序列。下面简要介绍这些方法。

例如可以应用下述方法检测CLAC和CLAC-P：

应用通过已知方法(例如蔗糖密度梯度离心和尿素提取)从阿耳茨海默氏病患者大脑部分纯化的不溶性组分即老年斑淀粉样蛋白组分，免疫小鼠例如BALB-C小鼠，然后获得抗体，最好为单克隆抗体。采用如此获得的抗体，按照下面(i)或(ii)介绍的方法可检测CLAC和CLAC-P：

(i)从阿耳茨海默氏病患者获取的脑皮质用10％***固定后，对组织切片进行免疫染色，检测老年斑中的CLAC或CLAC-P，或者

(ii)用Tris-缓冲液和十二烷基硫酸钠提取从阿耳茨海默氏病患者获取的脑皮质后，将如此形成的沉淀物溶解于70％甲酸中，获得淀粉样蛋白组分。对淀粉样蛋白组分进行SDS电泳和蛋白质印迹，检测到CLAC或CLAC-P为50-100kDa的多肽。

使用的抗体优选为实施例1介绍的单克隆抗体9D2。

例如使用下列步骤(i)到(v)可检测本发明CLAC的部分氨基酸序列：

(i)用Tris-缓冲液和十二烷基硫酸钠(SDS)提取从阿耳茨海默氏病患者获取的脑皮质后，将如此形成的沉淀物溶解于70％甲酸中。将获得的淀粉样蛋白组分进行反相高效液相色谱(HPLC)，进行分级分离以与Aβ肽分开，

(ii)通过凝胶过滤柱分别分离50kDa和100kDa的多肽，

(iii)应用蛋白酶例如赖氨酰内肽酶、Asp-N或胰蛋白酶部分水解所述多肽，

(iv)通过反相HPLC分离肽部分，

(v)应用氨基酸序列分析仪测定所述肽氨基酸序列。

例如应用包括下列步骤(i)和(ii)的方法可获得CLAC前体(即CLAC-P)的cDNA核苷酸序列：

(i)使用合成寡核苷酸混合物(简并引物)作为引物，利用聚合酶链式反应(PCR)由人脑互补DNA(cDNA)文库克隆编码部分CLAC蛋白的cDNA，所述引物相当于编码如上所述获得的CLAC部分氨基酸序列的一部分的核苷酸序列，例如以下序列的一部分：Gly Glu GlnGly Asp Gln Gly Pro Arg Met Val Phe Pro Lys Ile Asn His Gly Phe LeuSer Ala Asp Gln Gln Leu Ile Lys(SEQ ID NO：11)，

(ii)使用步骤(i)获得的核苷酸序列作为模板，重复本领域已知的“快速扩增cDNA末端”的方法。

此外，按照标准方法将上述核苷酸序列翻译为氨基酸序列也可以获得推定的完整氨基酸序列。

如此获得的人CLAC-P cDNA序列见SEQ ID NO：1。该序列具有编码654个氨基酸组成的CLAC-P的ORF(开放读框)(核苷酸532-2493)，而654个氨基酸的CLAC-P的推定完整氨基酸序列见SEQ IDNO：2。

另一方面，采用得自小鼠或大鼠脑的cDNA文库，合成相当于适当选自人CLAC-P核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸并将其用作引物，进行PCR方法可以获得小鼠或大鼠CLAC-P cDNA及其氨基酸序列。

本发明CLAC具有以下作用：(a)累积在阿耳茨海默氏病老年斑淀粉样蛋白中，(b)促进Aβ聚集。

本发明CLAC促进Aβ聚集的作用可用各种方法评价，例如下列方法(i)或(ii)：

(i)150μM合成Aβ(1-42)肽[意味着该肽由N-末端氨基酸1-42组成]和适量纯化CLAC在室温下混合并温育0-5天。反应混合物以15,000xg离心15分钟，沉淀物悬浮于10μl PBS溶液。加入适量硫黄素T，用荧光光度计进行分析。λ激发波长为440nm，λ发射波长为482nm。所获得的荧光与仅与Aβ(1-42)温育(无纯化CLAC)获得的荧光进行比较。

或者(ii)免疫化学或生物化学鉴定发现：过量表达人CLAC-P基因的转基因小鼠与过量表达阿耳茨海默氏病突变βAPP基因的小鼠交配获得小鼠的脑中更多β淀粉样蛋白斑，而仅过量表达阿耳茨海默氏病突变βAPP基因的转基因小鼠的脑中β淀粉样蛋白斑较少；或者免疫化学或生物化学鉴定发现：过量表达阿耳茨海默氏病突变βAPP基因的CLAC-P基因敲除的小鼠较少β淀粉样蛋白斑，而仅过量表达阿耳茨海默氏病突变βAPP基因的转基因小鼠β淀粉样蛋白斑更少。

本发明第三方面是编码变异CLAC蛋白的DNA，其中在CLAC氨基酸序列中***、缺失或取代一个或多个氨基酸，所述变异CLAC蛋白(a)累积在阿耳茨海默氏病老年斑淀粉样蛋白组分中，以及(b)促进Aβ聚集。

在此，***、缺失或取代一个或多个氨基酸可以人工或天然发生。例如应用基因工程已知方法如定点诱变(M.J.Zoller等，Method inEnzymology，100，468(1983))或者PCR方法(Molecular Cloning 2nd Ed.Ch.15，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))可以产生所述突变。另外，所述***、缺失或取代一个或多个氨基酸可以在体内发生。本发明CLAC变异蛋白包括各种变异体，例如剪接变异体和等位基因变异体。此外，本发明CLAC变异蛋白包括具有上述(a)和(b)作用的CLAC部分肽。本发明CLAC变异蛋白还包括其中一个或多个氨基酸发生(人工或天然)化学修饰的蛋白质。所述修饰包括例如乙酰化、酰胺化、酰化、添加糖链、磷酸化、硫酸化、添加脂质、卤化、形成盐等。此外，CLAC变异蛋白中还可存在20种天然L-氨基酸以外的氨基酸(例如D-氨基酸、人工氨基酸)。编码所述CLAC变异蛋白的DNA序列与编码所述原CLAC的DNA序列(本发明的第一方面)的同源性至少为50％，优选至少70％，更优选至少80％，最优选至少90％。

在此，同源性是指两种核苷酸序列或氨基酸序列之间的匹配程度，以百分率表示。目前，可用计算机软件程序例如Smith-Waterman算法、FASTA或BLAST程序确定同源性。

本发明第四方面是在严格杂交条件下与SEQ ID NO：3定义的DNA杂交而且编码具有下列特性的蛋白的DNA：(a)累积在阿耳茨海默氏病老年斑淀粉样蛋白组分中，以及(b)具有促进Aβ聚集的作用。在此，“严格条件”是指例如只有当核苷酸序列同源性90％以上才发生杂交的条件。严格条件实例为：在包含以下组分的溶液中于42℃温育过夜：50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhart’s溶液、10％硫酸萄聚糖和20μg/ml变性剪切鲑精DNA，然后在0.1×SSC中于65℃洗涤。应用例如Molecular Cloning 2nd Ed.Ch.11，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)等介绍的已知方法进行杂交和洗涤。

本发明第五方面是以下DNA编码的蛋白质：

(i)编码在SEQ ID NO：4所示的CLAC蛋白中***、缺失或取代一个或多个氨基酸的变异CLAC蛋白的DNA，所述变异CLAC蛋白：(a)累积在阿耳茨海默氏病老年斑淀粉样蛋白组分中，以及(b)具有促进Aβ聚集的作用；或者

(ii)在严格杂交条件下与SEQ ID NO：3所示DNA杂交的DNA，该DNA编码(a)累积在阿耳茨海默氏病老年斑淀粉样蛋白组分中，并且(b)促进Aβ聚集的蛋白。

所述蛋白包括具有上述(a)和(b)作用的变异CLAC蛋白以及与CLAC具有高度同源性的氨基酸序列的蛋白。具体这种蛋白包括例如上述变异CLAC蛋白、CLAC部分肽以及大鼠或小鼠CLAC等。

在本说明书中，第二方面的CLAC和第五方面的变异CLAC可以总称为“CLAC”。

本发明第六方面为包含SEQ ID NO：1所示核苷酸532-2493的核苷酸序列的CLAC-P DNA。

本发明第七方面是包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的CLAC-P。

本发明CLAC-P起细胞表面Aβ受体的作用。

本发明CLAC-P作为β淀粉样蛋白受体的作用可用各种方法评价，例如下列方法：

持续表达CLAC-P的HEK293细胞和对照细胞培养至融合状态，然后加入在试管中预温育60分钟的10μM Aβ(1-42)，温育60分钟。所收集的细胞用SDS样品缓冲液通过超声破碎溶解，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，应用抗-Aβ抗体进行蛋白质印迹，然后可测定与细胞结合的Aβ量。

Aβ通过CLAC-P与细胞结合的细胞毒性可用以下方法评价：例如，应用脂质方法使已经诱导分化为神经细胞的PC 12细胞瞬时表达CLAC-P，加入已经预温育1小时的Aβ(1-42)，再温育1小时。然后用10％甲醛固定细胞，应用TUNEL染色对显示凋亡的细胞核进行染色，然后比较它与不表达CLAC-P的PC12细胞的阳性细胞比例。或者，每孔加入3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯酚四唑溴化鎓(MTT)试剂，然后可用分光光度计测定掺入活细胞中MTT试剂量并进行比较。

本发明第八方面是编码在CLAC-P中***、缺失或取代一个或多个氨基酸的CLAC-P变异蛋白的DNA，所述变异CLAC-P蛋白作为细胞表面Aβ受体起作用。

在此，***、缺失或取代一个或多个氨基酸可以人工或天然发生。例如应用基因工程已知方法如定点诱变(M.J.Zoller等，Methods inEnzymology，100，468(1983))或者PCR方法(Molecular Cloning 2nd Ed.Ch.15，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))可以产生所述突变。另外，所述***、缺失或取代一个或多个氨基酸可以在体内发生。本发明变异CLAC-P蛋白包括各种变异体，例如剪接变异体和等位基因变异体。此外，本发明CLAC-P变异蛋白包括起细胞表面Aβ受体作用的CLAC-P部分肽。本发明CLAC-P变异蛋白还包括其中一个或多个氨基酸发生(人工或天然发生)化学修饰的蛋白质。所述修饰包括例如乙酰化、酰胺化、酰化、添加糖链、磷酸化、硫酸化、添加脂质、卤化、形成盐等。此外，CLAC-P变异蛋白中还可存在20种天然L-氨基酸以外的氨基酸(例如D-氨基酸、人工氨基酸)。编码所述CLAC-P变异蛋白的DNA序列与编码所述原CLAC-P的DNA序列(本发明的第六方面)的同源性至少为50％，优选至少70％，更优选至少80％，最优选至少90％。

本发明第九方面是在严格条件下与SEQ ID NO：1所示DNA杂交的DNA，它编码起细胞表面Aβ受体作用的蛋白。

本发明第十方面是以下DNA编码的蛋白质：

(i)编码在CLAC-P中***、缺失或取代一个或多个氨基酸的CLAC-P变异蛋白的DNA，所述变异CLAC-P蛋白起细胞表面Aβ受体作用；或者

(ii)在严格杂交条件下与SEQ ID NO：1所示DNA杂交的DNA，该DNA编码起细胞表面Aβ受体作用的蛋白。

所述蛋白包括起细胞表面Aβ受体作用的变异CLAC-P蛋白以及与CLAC-P具有高度同源性的氨基酸序列的蛋白。具体这种蛋白包括例如上述CLAC-P变异蛋白、CLAC-P部分肽以及大鼠或小鼠CLAC-P等。

进而，本发明第十一方面是本发明CLAC-P的剪接变异体。本发明CLAC-P剪接变异体的实例为其中缺失或取代位于氨基酸141-146的1-6个氨基酸的SEQ ID NO：2所示的多肽；或者其中缺失或取代位于氨基酸589-597的1-9个氨基酸的SEQ ID NO：2所示的多肽；或者同时存在上述两种缺失或取代的SEQ ID NO：2所示的多肽。所述多样性似乎是因为可变选择性剪接形成多种信使RNA所致。

在本说明书中，第七方面的CLAC-P、第十方面的CLAC-P变异蛋白和第十一方面的CLAC-P剪接变异体可总称为“CLAC-P”。

本发明第十二方面是包含本发明第一、第三或第四任一方面的DNA的表达载体。本发明第十三方面是用所述表达载体转化的转化体。本发明第十四方面是生产重组蛋白的方法，该方法包括在能够表达所述载体的条件下培养所述转化体。如此产生的重组蛋白也属于本发明范畴。所述重组蛋白是本发明任何一种CLAC或者(a)累积在阿耳茨海默氏病老年斑淀粉样蛋白组分中，而且(b)促进Aβ聚集的CLAC变异蛋白。

本发明第十五方面是包含本发明第六、第八或第九任一方面的DNA的表达载体。本发明第十六方面是用所述表达载体转化的转化体。本发明第十七方面是生产重组蛋白的方法，该方法包括在能够表达所述载体的条件下培养所述转化体。如此产生的重组蛋白也属于本发明范畴。所述重组蛋白是本发明CLAC-P或者起细胞表面Aβ受体作用的CLAC-P变异蛋白。涉及上述方面的多方面中，本发明涉及其中***了包含CLAC-P编码基因的载体的HEK293细胞转化体(保藏于国际专利生物保藏单位即国立高级工业科技研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology，AISTTsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)，保藏号为FERM BP-7438)。因此，本发明还涉及包含在上述保藏菌株中的CLAC-P基因。再一方面，本发明涉及生产重组蛋白的方法，该方法包括在能够表达其中包含CLAC-P基因的所述载体的条件下培养所述转化菌株。本发明也包括如此产生的重组蛋白。

重组蛋白可用本领域已知的方法产生，例如Molecular Cloning2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)介绍的方法。典型方法介绍如下：

适合整合上述DNA的载体包括但不限于大肠杆菌的pBR322(Gene，2，95(1977))、pBR325(Gene，4，121(1978))、pUC12(Gene，19，259(1982))、pUC13(Gene，19，259(1982)、pUC118、pUC119(Methodsin Enzymology，153，3(1987)、芽孢杆菌属(Bacillus)的pUB110(Biochemical and Biophysical Research Communication，112，678(1983))。可使用其它可在宿主内复制及保持的载体。

整合上述DNA的方法包括例如Molecular Cloning p.239，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1982)介绍的方法。

如此获得的质粒可导入合适宿主，例如埃希氏菌属( Escherchia)和芽孢杆菌属( Bacillus)菌株。

埃希氏菌属菌株实例包括但不限于大肠杆菌K12DH1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，60，160(1986))、M103(Nucleic Acids Research，9，309，(1981))、JA221(Journal of Molecular Biology，120，517(1978))、HB101(Journal of Molecular Biology，41，459(1969)、C600(Genetics，39，440(1954))。

转化方法包括例如Molecular Cloning p.249，Cold Spring HarborLaboratory Press(1982)介绍的氯化钙方法、或者氯化钙/氯化铷方法。

使用本领域已知的方法从如此获得的转化体中选择需要的克隆，例如集落杂交法(Gene，10，63(1980))和DNA测序法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，560(1977)；Nucleic Acids Research，9，309(1981))。

如上所述获得保有携带含本发明蛋白克隆基因的DNA的载体的微生物。

然后，从所述微生物分离获得所述质粒。

分离方法包括但不限于碱法(H.C.Birmbiom等，Nucleic AcidsResearch，1，1513(1979))。

具有含本发明蛋白克隆基因的DNA的质粒可以不经过处理即使用，或者用限制酶切割后使用。

将本发明蛋白克隆基因连接入适合表达的载体的启动子下游，可以获得表达载体。用所述表达载体转化的宿主优选为动物细胞，优选载体包括用于动物细胞的表达质粒(例如pcDNA I、pdKCR-dhfr等)。适用于例如细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞的载体均可使用，只要它们适合产生本发明重组蛋白，所述载体是本领域众所周知的。

所述基因在5’末端可以含有ATG起始密码子(以及任选含有编码合适信号肽的核苷酸序列)，或者在3’末端可以含有TAA、TGA或ATAG(优选TGA)终止密码子。进而，启动子与所述基因上游连接以便进行表达。

与宿主匹配的任何表达载体均可用于本发明。

当宿主为动物细胞时，可以使用SV40来源的启动子、逆转录病毒(不限于这些)来源的启动子，优选使用SV40启动子。

动物细胞包括但不限于猴COS-7细胞、中国苍鼠卵巢细胞(CHO细胞)、成神经细胞瘤细胞、胶质细胞、成纤维细胞。优选细胞为表达并分泌丰富本发明蛋白的细胞，特别优选的细胞为人胚胎肾脏成纤维细胞293。

为了转化动物细胞，进行例如Virology，52，456(1973)介绍的方法。

因此，获得含有本发明蛋白编码DNA的载体转化的转化体。

当使用其宿主为埃希氏菌属菌株或芽孢杆菌属菌株的转化体时，液体培养基是合适的，液体培养基含有转化体生长必需的碳源、氮源、矿物质等。碳源实例包括但不限于葡萄糖、糊精、可溶淀粉和蔗糖；氮源实例包括但不限于无机或有机物质，例如铵盐、硝酸盐、玉米浆、玉米淀粉、蛋白胨、酪蛋白、肉膏、大豆粉和马铃薯提取物；矿物质实例包括但不限于氯化钙、磷酸氢二钠和氯化镁。酵母提取物、维生素、生长促进因子等也可以加入所述培养基。所述培养基的pH优选约6-8。

用于培养埃希氏菌属菌株的培养基优选为例如含有葡萄糖和酪蛋白氨基酸的M9培养基(Journal of Experiments in Molecular Genetics，431-433，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1972)。必要时，可以在所述培养基中加入诸如3β-吲哚丙烯酸的试剂，使得所述启动子发挥作用。

当宿主为埃希氏菌属菌株时，常常在约15-43℃下培养约3-24小时。必要时，可以增加通气和/或搅拌操作。

当宿主为芽孢杆菌属菌株时，常常在约30-40℃下培养约6-24小时。必要时，可以增加通气和/或搅拌操作。

当培养其宿主是动物细胞的转化体时，培养基实例包括但不限于MEM培养基(Science，122，501(1952))、DMEM培养基(Virology，8，396(1959))、RPMI 1640培养基(The Journal of American MedicalAssociation，199，519(1967))和199培养基(Proceeding of the Society forthe Biological Medicine，731(1950))。上述培养基中可加入5-20％胎牛血清。所述培养基的pH优选约6-8。常常于约30-40℃进行培养，必要时，增加通气和/或搅拌操作。

其中整合有本发明CALC-P或CLAC基因的上述诱导型表达载体不仅可用于大规模生产所述载体(将所述载体导入诸如大肠杆菌的细菌中)或者用于在各种细胞中产生本发明重组蛋白，而且可以如下所述用于制备转基因动物。

如上所述，CLAC-P是CLAC前体(CLAC是其片段型)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

在SEQ ID NO：2的氨基酸112(Arg)和氨基酸113(Glu)之间裂解，使CLAC-P加工为片段型CLAC。因此，氨基酸113(Glu)至氨基酸654(Lys)为CLAC的氨基酸序列。CLAC的第一个氨基酸Glu通常环化为焦谷氨酸残基。

CLAC-P受体内加工酶作用转化为CLAC。本发明包括所述加工酶。例如用以下任何一种方法可以鉴定所述加工酶。

(i)对于表达CLAC-P的培养细胞分泌或产生的CLAC而言，获取液体培养物或所述细胞周围产生的细胞外基质，进行氨基酸分析，然后与CLAC-P进行比较，确定切割位点，或者

(ii)在表达CLAC-P的细胞中加入已知蛋白酶抑制剂，然后利用CLAC蛋白下降量作为指标，分析液体培养物或细胞外基质中的CLAC蛋白产量，或者

(iii)在CLAC-P基因的核苷酸序列中导入突变，改变已知蛋白酶切割必需的氨基酸，而且表达所述突变基因。然后利用CLAC蛋白下降作为指标，分析液体培养物或细胞外基质中的CLAC蛋白产量，或者

(iv)进一步在表达CLAC-P的培养细胞中导入编码已知蛋白酶的cDNA，然后利用CLAC蛋白增加作为指标，分析液体培养物或细胞外基质中的CLAC蛋白产量，或者

(v)在缺乏已知蛋白酶的培养细胞中表达编码CLAC-P的cDNA，并进行培养。然后利用CLAC蛋白下降作为指标，分析液体培养物或细胞外基质中的CLAC蛋白产量。

用上述方法鉴定的加工酶包括但不限于弗林转化酶。

所述蛋白酶抑制剂包括但不限于弗林转化酶竞争性抑制剂癸酰-RVKR-氯甲基酮及其类似化合物。表达CLAC-P的培养细胞可用于有效、敏感地筛选抑制CLAC产生或分泌的物质，因为表达CLAC-P的培养细胞产生并分泌大量CLAC。例如在包含受试物质的培养基中培养本发明转化细胞，然后检测或定量对CLAC产生或分泌的抑制作用，可以筛选所述物质。在所述筛选方法中，应用合适方法，例如使用CLAC特异性抗体的蛋白质印迹方法，可以检测和定量所述受试物质引起所述细胞产生或分泌CLAC的变化。

具体来说，例如将本发明转化细胞接种入多孔板中，在含有血清的DMEM培养基中培养所述细胞至融合。用无血清培养基(含0.5％牛血清白蛋白的DMEM)洗涤所述培养细胞后，在相同培养基中加入受试物质，培养所述细胞一定时间(例如24小时)。应用蛋白质印迹方法定量培养上清液或与多孔板结合的细胞外基质中含有的CLAC量。与没有所述受试物质的试验组比较CLAC含量，或者比较诱导CLAC产量和/或分泌量下降的受试物质浓度，评价所述受试物质对CLAC产生和/或分泌的抑制作用。

因为本发明转化细胞可以传代培养，而且可以产生或分泌丰富CLAC-P和/或CLAC，所以它们可用于进行高效、高再现性筛选。因此，所述转化细胞可优选用于筛选抑制CLAC产生或分泌的物质。而且，总是可以获得大量稳定克隆细胞，使得筛选更稳定、更有效。所述筛选鉴定的抑制CLAC产生和分泌的物质也属于本发明范畴。

培养细胞可以表达大量CLAC，而且例如通过不限于以下的方法(i)、(ii)或(iii)进行纯化：

(i)稳定表达CLAC-P的HEK293细胞(ATCC CRL-1573)在含有10％FBS的DMEM培养基中培养3天，然后当细胞达到半融合时，在不含FBS的DMEM中培养48小时，之后回收培养液。培养液用50mM Tris-HCl(pH8.6)于4℃透析过夜，然后以250,000xg离心30分钟。沉淀物溶解于0.1M醋酸，加样在DEAE柱上。用0M至1MNaCl(0.1M增量)逐步洗脱。所有流分用0.1M醋酸进行透析，例如采用特异性抗体9D2通过免疫印迹进行鉴定，然后阳性流分用作纯化CLAC流分(关于通用方法，参见Fichard等，J.Biol.Chem.，272，30083(1997))。

(ii)稳定表达CLAC-P的HEK293细胞在含有10％FBS的DMEM培养基中培养3天，然后当细胞达到半融合时，在不含FBS的DMEM中培养48小时，之后回收培养液。培养液用50mM Tris-HCl(pH8.6)于4℃透析过夜，然后以250,000xg离心30分钟。沉淀物溶解于0.15M醋酸，再用含2M尿素的20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄(pH7.2)(PB/U溶液)透析过夜，之后以250,000xg离心30分钟，加样在肝素柱上。用0M至1M NaCl(0.1M增量)逐步洗脱。所有流分用PB/U进行透析，例如采用特异性抗体9D2通过免疫印迹进行鉴定，然后阳性流分用作纯化CLAC流分(关于通用方法，参见Mizuno等，J.Biol.Chem.，120，934(1996))。或者

(iii)使CLAC特异性抗体(例如9D2(1mg/ml)预先结合至NHS活化的载体例如Affigel 10(Bio-Rad)上，获得抗体柱。持续表达CLAC-P的HEK293细胞在含有10％FBS的DMEM培养基中培养3天，然后当细胞达到半融合时，在不含FBS的DMEM中培养48小时，之后回收培养液。用50％饱和硫酸铵沉淀所述培养基中的蛋白质。沉淀蛋白溶于IP缓冲液(含0.5％SDS和0.5％NP-40的TSI溶液[50mM Tris(Gibco BRL)、150mM NaCl(Kanto Kagaku)、0.5mM DIFP(Wako Junyaku)、0.5mM PMSF(Boehringer Mannheim)、1mM EGTA(Wako Junyaku)、1μg/ml木瓜蛋白酶抑制剂(antipain)(Sigma)、1μg/ml亮抑蛋白酶肽(Wako Junyaku)、1μg/ml胃蛋白酶抑制剂(Sigma)、1μg/ml TLCK(Sigma)]，通过0.45μm滤膜过滤。加样于上述抗体柱上。用含有0.1％Triton X-100的0.2M甘氨酸-HCl(pH2.6)进行洗脱。洗脱流分用作纯化CLAC(关于通用方法，参见Hirako等，J.Biol.Chem.，273，9711(1998))。

因此，本发明再一方面是用单克隆抗体9D2纯化CLAC的方法。

产生单克隆抗体9D2的杂交瘤已经保藏于国际专利生物保藏单位国立高级工业科技研究(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)，保藏号为FERMBP-7437。

本发明又一方面是特异性结合本发明CLAC-P或CLAC的抗体。

例如使用下列方法可以获得CLAC-P或CLAC特异性抗体。

根据CLAC和CLAC-P的氨基酸序列，合成诸如以下肽的肽类：

NC-1：Glu Pro Arg Ser Glu Asp Pro Thr Pro Ala Glu Gln His Cys(SEQ ID NO：2的氨基酸14-27)(SEQ ID NO：3)

NC-2：Gly Cys Asn His Gly Phe Leu Ser Ala Asp Gln Gln Leu IleLys(SEQ ID NO：2的氨基酸171-183，在氨基酸171之前加入了Gly和Cys)(SEQ ID NO：4)

NC2-2：Cys Lys Gly Glu Gln Gly Asp Gln Gly Pro Arg Met Val PheXaa Lys(SEQ ID NO：2的氨基酸155-169，在氨基酸155之前加入了Cys)(Xaa为羟脯氨酸)(SEQ ID NO：5)

NC3：Asp Tyr Asn Gly Asn Leu His Glu Ala Leu Gln Arg Ile ThrCys(SEQ ID NO：2的氨基酸430-443，在氨基酸443之后加入了Cys)(SEQ ID NO：6)

NC4：Leu Gly Pro Asp Gly Leu Pro Met Pro Gly Cys Trp Gln Lys(SEQ ID NO：2的氨基酸641-654)(SEQ ID NO：7)。

然后，与KLH(匙孔血蓝蛋白，keyhole Limpet Hemocyanin)结合的肽用作免疫兔的抗原。使用ELISA方法评价所获得的血清与抗原肽的反应性，从而获得抗血清。抗血清与结合了抗原肽的Affigel结合，仅特异性抗原可以亲合纯化。

如上所述也可以使用本发明第十一方面的剪接变异体。

特异性结合本发明CLAC-P或CLAC的抗体可以为多克隆抗体或单克隆抗体，优选单克隆抗体。特别优选的抗体为上述9D2单克隆抗体。

部分所述抗体特异性结合CLAC或CLAC-P。部分所述抗体抑制CLAC或CLAC-P作用或功能。因此，本发明再一方面是使用所述抗体检测CLAC或CLAC-P的方法。这种检测方法适用于诊断阿耳茨海默氏病。所述抗体可用本领域已知标记物标记，例如放射性标记物(如⁹⁹Tc)、荧光标记或酶性标记。所述标记抗体可注射入活的动物体内，然后进行扫描成像。或者，检测并定量上述抗体与活检样品或尸体解剖样品中的CLAC或CLAC-P蛋白的结合。

因此，本发明又一方面为阿耳茨海默氏病诊断试剂盒，该试剂盒包含检测性标记的CLAC或CLAC-P特异性抗体。该试剂盒组分可以直接注射入活的人体内，然后扫描成像。所述试剂盒组分也可以与活检样品或尸体解剖样品反应。优选抗体为单克隆抗体9D2。标记物包括但不限于放射性标记物(如⁹⁹Tc)、荧光标记或酶性标记，可以根据使用方法、使用目的、应用部位等选用标记物。所述标记物是本领域技术人员周知的。本发明诊断试剂盒可以由包含各组分的独立容器组成，或者由包含若干组分的若干容器组成。一般来说，所述试剂盒附有合适说明书。

本发明再一方面为筛选抑制CLAC或CLAC-P作用和/或功能的CLAC或CLAC-P活性抑制剂的方法。因为，所述抑制剂随后具有诸如抑制Aβ累积的作用，所以，它可以用作阿耳茨海默氏病的治疗药物。

使用例如下列方法(i)、(ii)或(iii)可以筛选所述抑制剂：

(i)对于影响CLAC与β-淀粉样蛋白结合或促进淀粉样蛋白聚集的物质，将受试物质加入合成Aβ(1-42)肽和适量CLAC中，混合，混合物在室温下温育0-5天，然后评估对与硫黄素T发荧光的淀粉样蛋白纤维形成的抑制作用。或者，对过量表达人CLAC-P基因的转基因小鼠与过量表达阿耳茨海默氏病突变βAPP基因的转基因小鼠交配获得的小鼠或者对过量表达阿耳茨海默氏病突变βAPP基因的转基因小鼠口服、静脉内或脑室内给予受试物质。通过免疫组化或生物化学方法检测，比较其与没有给予受试物质的小鼠脑中β-淀粉样蛋白斑，从而评价脑中的β-淀粉样蛋白斑下降情况。

(ii)对于通过CLAC-P抑制与细胞β-淀粉样蛋白结合的物质，培养稳定表达CLAC-P的HEK293细胞和对照细胞，加入已经在试管中预温育60分钟的10μM Aβ(1-42)和受试物质。然后，再温育混合物60分钟，最后可以评价与回收细胞结合的Aβ量。

(iii)对于通过CLAC-P抑制与细胞结合的Aβ的细胞毒性，例如应用脂质方法使通过NGF分化为神经元的PC12细胞瞬时表达CLAC-P。然后加入已经预温育1小时的Aβ(1-42)和受试物质，之后，对所述细胞进行TUNEL染色，评价对细胞凋亡的抑制作用，或者应用MTT试剂评价活细胞增加量。

因而，本发明再一方面是筛选所述抑制剂的方法，所述方法包括使用的CLAC或CLAC-P。

所述抑制剂包括但不限于CLAC或CLAC-P拮抗剂、与CLAC或CLAC-P具有相似结构的多肽或者其它低分子化合物。

某些特异性结合本发明CLAC或CLAC-P的抗体抑制CLAC或CLAC-P的作用和/或功能。然后，所述抗体可以抑制Aβ在脑中累积，因此可以治疗、阻止或预防阿耳茨海默氏病。

所以，本发明另一方面是治疗、阻止或预防阿耳茨海默氏病的方法，所述方法包括给予所述抑制剂或抗体。所述抑制剂或抗体可以单独给予或者用合适载体如纯化水或盐水给予。给药途径包括静脉内途径和脑室内途径，优选静脉内途径。给药剂量通常为1μg-100mg/kg，然而根据给药途径、所治疗疾病的严重程度、患者情况等，所述剂量可以改变。

用于上述方法的合适抗体为单克隆抗体9D2。

本发明还包括通过抑制CLAC或CLAC-P本身产生而对阿耳茨海默氏病具有治疗作用的物质。筛选所述物质的方法实例如下：

对于通过减少CLAC或CLAC-P产生而具有治疗作用的物质，如下进行筛选：在含有受试物质的培养基中培养本发明转化细胞，检测或定量CLAC的产量或分泌量。在所述筛选方法中，使用合适方法，例如采用CLAC特异性抗体蛋白质印迹方法，可以检测和定量所述受试物质引起所述细胞产生或分泌CLAC变化。

具体来说，例如将所述转化细胞接种在多孔板中，在含有血清的DMEM培养基中培养至融合。用无血清培养基(含0.5％牛血清白蛋白的DMEM)洗涤所述细胞后，在相同培养基中加入受试物质，然后温育一定时间(例如24小时)。通过蛋白质印迹方法定量所述培养上清液或细胞外基质中含有的CLAC量。最后，与不含所述受试物质的试验组比较CLAC量或者诱导CLAC产量和/或分泌量下降的受试物质浓度，评价所述受试物质对CLAC产生和/或分泌的抑制作用。本发明也包括所述筛选方法。

进一步应用例如包括以下(i)、(ii)或(iii)任何步骤的方法可以鉴定和/或获得与CLAC或CLAC-P反应而且具有生理作用的肽分子：

(i)在酵母细胞中表达两种基因库，所述基因库为其中人CLAC-P基因与DNA结合蛋白基因融合的基因库以及其中转录激活蛋白基因与人脑cDNA融合的基因库，最后应用双杂交方法获得显示阳性反应的基因。

(ii)使人脑提取物通过已经结合有人CLAC-P或CLAC重组蛋白的柱，洗脱结合蛋白，然后进行氨基酸序列分析。

(iii)使人脑提取物通过已经固定有人CLAC-P的柱，洗脱与人CLAC-P或CLAC一起结合在所述柱上的蛋白，最后进行氨基酸序列分析。

所述肽分子也可以用于治疗、阻止或预防阿耳茨海默氏病。因此，本发明也包括所述肽分子及其鉴定和/或获得方法。

影响CLAC-P和/或CLAC的分泌和/或产生的蛋白也可以用于治疗、阻止或预防阿耳茨海默氏病的方法。例如可以如下鉴定出所述蛋白：使表达CLAC-P的培养细胞表达人cDNA文库，通过有限稀释选择表达单一cDNA的克隆，评价所述细胞克隆分泌的CLAC量变化，然后鉴定出所导入的基因。因此，本发明也包括所述蛋白及其鉴定方法。

本发明再一方面是其中将CLAC DNA或CLAC-P DNA中任何一种导入染色体或者使染色体缺失其中任何一种DNA的转基因动物。转基因动物为其中通过重组DNA方法导入外源基因的动物。转基因动物具有不能通过常规培育方法获得的特性。获得转基因动物的方法是本领域技术人员周知的。一般来说，转基因动物应用包括以下步骤的方法获得：克隆包含所要导入DNA的基因，使所述基因与在需要器官及需要时间表达的启动子连接，将所述构建物导入受精卵，将受精卵移植入假孕雌性动物。使适当选择表达调节序列或使表达调节序列突变，可以获得其中人工调节本发明CLAC或CLAC-P表达的转基因动物。转基因动物也包括基因敲除动物。所述转基因动物可用于调节本发明CLAC或CLAC-P的功能或表达、研究其中涉及CLAC或CLAC-P的疾病发展、筛选及开发药物等。优选所述转基因动物为人类以外的动物。

可以克隆人类以外的其他动物的CLAC-P和CLAC。例如使用需要动物的cDNA文库，应用与上述方法相似的方法扩增基因，可以克隆需要动物的CLAC-P和CLAC基因，最后可以推定其氨基酸序列(关于小鼠CLAC-P基因的克隆，参见本说明书的实施例7)。

实施例

参照以下实施例介绍本发明。不应将实施例解释为限制本发明。

实施例1：制备单克隆抗体9D2

(1)部分纯化老年斑淀粉样蛋白

从阿耳茨海默氏病患者脑皮质切取灰质，以包含1M蔗糖(KantoChemicals)的TSI溶液[50mM Tris(Gibco BRL)，150mM NaCl(KantoChemicals)、0.5mM DIFP(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)、0.5mM PMSF(Boehringer Mannheim)、1mM EGTA(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)、1μg/ml木瓜蛋白酶抑制剂(Sigma)、1μg/ml亮抑蛋白酶肽(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)、1μg/ml胃蛋白酶抑制剂(Sigma)、1μg/ml TLCK(Sigma)]，用陶式匀浆器(Matsushita ElectricIndustrial)匀浆，以260,000xg于4℃离心(Hitachi Koki)30分钟。

获得的沉淀物重悬浮于含有1M蔗糖的TSI溶液中，通过非连续蔗糖密度梯度离心(Am.J.Pathol.，148 1517(1996))分级分离收集1.5M蔗糖/2.2M蔗糖介面细胞。

收集的介面细胞用DNA酶I(Wako Junyaku)于37℃处理3小时，悬浮于包含1％Triton-X 100和5M尿素(Nacalai Tesque)的TSI溶液中，去除红细胞(capillaries)(J.Neurochem.， 58 1953(1992))，于4℃离心机离心(100,000xg)30分钟。

获得的沉淀用作淀粉样蛋白。

(2)制备抗体

将老年斑淀粉样蛋白悬浮于含有1％SDS的50mM Tris溶液，用完全弗氏佐剂(Sigma)乳化，接种在小鼠趾垫(BALB-C，7周，雄性)[J.Exp.Med.， 169 1693(1989)]。

免疫后25天，取出后肢***，取出的淋巴细胞放入RPMI培养基。使淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞(PAI细胞株)融合，从而制得杂交瘤。将杂交瘤悬浮于HAT培养基，分散入96孔板(Greiner)中，并培养10天。

(3)筛选单克隆抗体

从各个孔收集杂交瘤上清液，在老年斑淀粉样蛋白涂片上选择淀粉样蛋白染色阳性的抗体(Am.J.Pathol.， 148 1517(1996))。

从288个杂交瘤克隆中选择出最强阳性的单克隆抗体9D2。应用小鼠抗体同种型试剂盒(Amersham)鉴定所述单克隆抗体的同种型为IgG1。9D2抗体产量最高的杂交瘤称为杂交瘤9D2，2001年1月30日保藏于国际专利生物保藏单位国立高级工业科技研究(AISTTsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)，保藏号为FERM BP-7437。

令人惊奇地发现，所述抗体强烈而且特异性地与阿耳茨海默氏病未知蛋白(在本说明书中称为CLAC-P和CLAC)结合。尤其是单克隆抗体9D2与CLAC-P和CLAC的特异性结合最强。此外，单克隆抗体9D2的特征在于它强烈与其中CLAC-P氨基酸113 Glu变为焦谷氨酸的肽片段Xaa Ala Pro Ser Glu Cys(SEQ ID NO：29)反应。

实施例2介绍对所述未知蛋白(即CLAC-P和CLAC)编码基因的克隆、测序等。

实施例2：克隆人CLAC-P基因

从阿耳茨海默氏病患者脑皮质切取20g灰质，用TSI溶液以陶式匀浆器匀浆，以260,000xg于4℃离心20分钟。获得的沉淀物悬浮于加有1M蔗糖的TSI溶液中，在4℃的离心机中以260,000xg离心20分钟。获得的沉淀物悬浮于含有0.32M蔗糖的TSI溶液中，去除红细胞，在4℃的离心机中以260,000xg离心20分钟。用匀浆器以含有2％SDS(Nacalai Tesque)TSI溶液匀浆所获得的沉淀，在4℃离心机中以260,000xg离心20分钟。应用超声粉碎仪(Branson)以70％甲酸(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)破碎获得的沉淀，在4℃的离心机中以260,000xg离心20分钟。上清液用冷冻干燥仪(Tomy)冷冻干燥，然后悬浮于6M盐酸胍(Nacalai Tesque)水溶液，在4℃离心机中以260,000x离心20分钟。加入70％甲酸(上清液的1/100体积)，采用Aquapore RP300柱(2.1×30mm，Applied Biosystems)通过RP-HPLC(Hewlett-Packard)进行分离[J.Biol.Chem.， 267 17047(1992)]。

采用SDS-PAGE通过免疫印迹方法选择单克隆抗体9D2阳性流分(Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 94 2025(1997))，发现用大约30％乙腈(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)洗脱出所述流分。冻干所述9D2阳性流分后，将所述流分悬浮于6M盐酸胍水溶液，通过还原性羧基-甲基化方法(J.Biol.Chem.， 238 622(1963))还原，应用TSKgelSuperSW3000柱(4.6×600mm，Tosoh)通过凝胶过滤性HPLC分离。应用赖氨酰内肽酶API(水解无色杆菌蛋白酶I)或者Asp-N(BoehringerMannheim)消化在免疫印迹方法中与9D2抗体强烈反应的约35kDa的流分[J.Biol.Chem.， 267 17047(1992)]。采用Superspher Select B柱(2.1×125mm，Merck)通过RP-HPLC分离消化物，获得肽图谱。

应用TOF(飞行时间)型质谱仪(Bruker-Franzen Analytik)和氨基酸测序仪(Applied Biosystems)分析通过肽图谱获得的部分[J.Biol.Chem.，274 7368(1999)]，选择与质谱仪获得的部分具有相同分子量的部分氨基酸序列。

所获得的序列如下(上面部分为氨基末端；下面部分为羧基末端)：

API酶消化获得(其中Hyp为羟脯氨酸)

Ile Asn His Gly Phe Leu Ser Ala Asp Gln Gln Leu Ile Lys(SEQ IDNO：8)，和

Gly Glu Gln Gly Asp Gln Gly Hyp Arg Met Val Phe Pro Lys(SEQID NO：9)。

Asp-N酶消化获得

Asp Gln Gly Pro Arg Met Val Phe Pro Lys Ile Asn His Gly Phe LeuSer Ala(SEQ ID NO：10)。

结果获得为9D2抗原部分氨基酸序列的下列28个氨基酸的氨基酸序列：

Gly Glu Gln Gly Asp Gln Gly Pro Arg Met Val Phe Pro Lys Ile

Asn His Gly Phe Leu Ser Ala Asp Gln Gln Leu Ile Lys(SEQ IDNO：11)

根据该序列，采用简并引物经PCR方法(聚合酶链式反应)克隆9D2抗原部分cDNA。所用的引物设计如下：

5′-aar ggi gar car ggi gay car ggi cc-3′(SEQ ID NO：12)

5′-agc tgc tgr tci gcd gav agr aab cc-3′(SEQ ID NO：13)

5′-agc tgc tgr tci gcr ctv agr aab cc-3′(SEQ ID NO：14)

其中I为肌苷，r为a或g；Y为c或t；d为a、g或t；v为a、g或c。

采用人脑Marathon-Ready cDNA文库(CLONTECH)作为模板，在PCR仪器中(TaKaRa)用LA Taq(TaKaRa)扩增80 bp cDNA片段-40个如下循环：95℃加热变性30秒，58℃退火30秒，72℃合成DNA 1分钟。将该片段亚克隆入pBluescript II KS+(Stratagene)，采用Themo测序试剂盒(Amersham)经自动测序仪(Li-COR)测序。

基于所述片段的序列，利用PCR重复RACE方法，克隆包含CLAC-P ORF(可读框)的CLAC-P DNA。所用的特异性引物如下：

5′-tag ctg ctg gtc ggc gct gag gaa gcc a-3′(SEQ ID NO：15)

5′-aag ggg gaa cag ggg gac cag ggg ccg a-3′(SEQ ID NO：16)

5′-tcg gaa aca cca tcc tcg gcc cct ggt c-3′(SEQ ID NO：17)

5′-cat ggc ttc ctc agc gcc gac cag cag c-3′(SEQ ID NO：18)

5′-cgc cgc ctg att aag ggt gac caa gga c-3 (SEQ ID NO：19)

5′-aag agg gcc acc tgg gga cac agg gaa a-3′(SEQ ID NO：20)

5′-acc ctt ggg gcc gtt ctc tcc agc gtc t-3′(SEQ ID NO：21)

5′-cac ctt gtt ctc cag gtt ctc cct tag g-3′(SEQ ID NO：22)

5′-gaa tac cag gac cta agg gag aac ctg g-3′(SEQ ID NO：23)

5′-ggc ccc aag ggt gac aca ggc gaa aag g-3′(SEQ ID NO：24)

5′-ccc tcc ttt ccc tgc gtg ctt ctt cag c-3′(SEQ ID NO：25)

5′-tct cgg ctt cgc ttc cca ccc tct aca c-3′(SEQ ID NO：26)

5′-gga gat tct gga atg ccg ggt cca cag g-3′(SEQ ID NO：27)

5′ ctt cta tca tag gcc cac cag gcc cac c-3′(SEQ ID NO：28)

采用人脑Marathon-Ready cDNA文库(CLONTECH)作为模板，在PCR仪器中(TaKaRa)用LA Taq(TaKaRa)扩增所述片-35个如下循环：95℃加热变性30秒，58℃退火1分钟，72℃合成DNA 1分钟，然后加入嵌套引物-30个如下循环：95℃加热变性30秒，60℃退火1分钟，72℃合成DNA 5分钟。将所获得的片段亚克隆入pBluescript II KS+，采用Thermo测序试剂盒经自动测序仪测序。

因此获得新型蛋白CLAC-P的cDNA(SEQ ID NO：1)。根据所述核苷酸序列推定ORF的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。所述DNA和氨基酸序列见图1。

CLAC-P cDNA包含编码654个氨基酸长度的ORF(图1，SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2)。CLAC-P是II型单一跨膜蛋白的新型蛋白。其氨基末端位于胞质侧，其羧基末端位于细胞外侧。氨基酸序列在细胞外区域中含有3个胶原蛋白样重复序列Gly-Xaa₁-Xaa₂(G为甘氨酸；Xaa₁和Xaa₂为任何氨基酸)。使用RT-PCR方法研究了各种人组织中的mRNA表达，发现在脑和睾丸中特异性表达。根据推定氨基酸序列制备的抗体肽使阿耳茨海默氏病患者脑中老年斑染色，发现衍生自所获得的cDNA的蛋白片段在老年斑淀粉样蛋白中累积。

实施例3：使用持续表达人CLAC-P人转化细胞分析CLAC-P淀粉样蛋白β肽的受体功能

如下所述制备整合入了CLAC-P基因的质粒DNA：改变CLAC-P基因，以便HindIII在CLAC-P的5’UTR区段位置-40以及在3’UTR区段自第一个终止密码子的位置+100进行切割。使改变的CLAC-P基因整合入具有CMV启动子的pcDNA3.1/Hygro(+)(invitrogen)的多克隆位点的HindIII-BamHI区段。

HEK293细胞以3.0-5.0×10⁵细胞/孔浓度加入6孔板，培养24小时。然后，制备溶液A：1μg质粒DNA/100μl Opti-MEM(Gibco BRL)，溶液B：10μl LipofectAMINE(Gibco BRL)/100μl Opti-MEM，将其混合在一起，温育30分钟，之后在混合物中加入800μl Opti-MEM至1ml(DNA-Lipofectamine复合物)(每孔)。从细胞中去除DMEM，用Opti-MEM(1×)洗涤细胞，然后在每孔中加入1ml DNA-Lipofectamine复合物，并培养6小时。再后加入1ml包含20％FBS的DMEM，再培养24小时。所述培养基替换为DMEM后，再培养24小时。然后将每孔中的细胞重新平板接种入10cm培养皿，在含有133μg/ml潮霉素(Wako Junyaku)的DMEM中进行选择培养。选择培养10-14天后，生长的细胞用作其中导入了需要质粒的多克隆细胞株。多克隆细胞株进一步通过有限稀释方法克隆，获得了15个单克隆细胞株。采用CLAC-P蛋白特异性抗体经免疫印迹方法分析所述单克隆细胞株的表达情况。选择出3个最高表达细胞株，称为9D2-1、9D2-2和9D2-11，在随后实验中使用它们。细胞株9D2-1为持续表达人CLAC-P的HEK293细胞转化体，2001年1月30日保藏于国际专利生物保藏单位国立高级工业科技研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)，保藏号为FERM BP-7438。

将用聚L-赖氨酰(Sigma，10μg/ml)预包被的盖玻片放入10cm培养皿中，在其上加入细胞，进行培养，导入基因，回收盖玻片。盖玻片用PBS溶液(2×)洗涤，然后用含有4％低聚甲醛(TAAB)的PBS溶液在室温下固定30分钟。再用PBS溶液(2×)洗涤，用含有0.5％TritonX-100、0.3％BSA(牛血清白蛋白，Sigma)的PBS溶液在室温下渗入并封闭30分钟。去除溶液，加入用含0.3％BSA的PBS溶液稀释(1/1000)的抗体，在室温下反应2小时。用PBS(3×)洗涤后，加入用含有0.3％BSA的PBS溶液稀释的FITC-结合的抗兔抗体(Jackson)作为二抗，然后在室温下避光反应1小时。用PBS(3×)洗涤后，用包囊剂对所述样品进行包囊，利用荧光显微镜(AX-80，Olympus)观测。在细胞膜***中、尤其是内质网、高尔基氏体和细胞表面膜中观测到CLAC-P分布。

用TS溶液洗涤在10cm培养皿中培养的稳定表达CLAC-P单克隆HEK293细胞株后，以TSI溶液通过刮细胞器回收细胞株。用多稳元件式(polytron)匀浆器(Hitachi koki)破碎细胞，然后于1,000xg、4℃离心7分钟。收集上清液，于2,000xg、4℃离心30分钟。沉淀作为线粒体和溶酶体使用。上清液进一步于100,000xg、4℃超速离心60分钟。回收为微粒体的沉淀，并进行分析，回收作为细胞质部分的上清液并进行分析。如图2右图(B)所示，在表达CLAC-P细胞的膜部分中特异性检测到表达的80kDa全长CLAC-P蛋白。

持续表达人CLAC-P的HEK293细胞和仅持续表达pcDNA3.1载体的对照细胞在10cm培养皿中培养，当细胞达到融合时，加入于37℃预温育60分钟10μM Aβ(1-42)(Bachem)，温育一定时间。温育后，去除含有Aβ的培养上清液，用PBS(3×)洗涤细胞，然后应用刮细胞器收集细胞，在微量离心机(TOMY)中以7,000rpm离心沉淀5分钟。在细胞沉淀中加入样品缓冲液，超声溶解，采用BCA蛋白测定试剂盒(Piearce)定量蛋白。

将含有各样品的蛋白量调节至一定水平，加入2-巯基乙醇(终浓度为1％)，加热10分钟。应用15％Tris-Tricine凝胶经SDS-PAGE分离蛋白，以150mA在一定条件下使蛋白转移到硝酸纤维膜(Hybon-ECL，Amersham)3小时。转移膜在pBS中加热10分钟，然后在1％脱脂乳(Difco)-PBS中于室温下封闭30分钟，与用相似封闭液稀释的不同抗体于室温下反应2小时，或者于4℃反应过夜。将所述膜在室温下与二抗(抗小鼠或抗兔Ig，辣根过氧化物酶结合的完整抗体(Amersham))溶液性反应，用PBS-T(含有0.1％Tween 20的PBS)洗涤(3×)，每次10分钟，然后用相似封闭液稀释。在PBS-T中洗涤10分钟(3×)后，利用ECL试剂盒(Amersham)使其暴露于Hyperfilm-ECL(Amersham)，最后检测Aβ结合情况。表达人CLAC-P的细胞的Aβ结合量(1-42)为30ng/mg蛋白，仅表达载体的细胞的Aβ结合量为6ng/mg蛋白。上述结果显示Aβ结合量增加5倍，说明在细胞表面表达的人CLAC-P起Aβ受体的作用。

实施例4：来自阿耳茨海默氏病病人大脑淀粉样蛋白的CLAC的氨基酸序列以及与9D2抗体的反应性

对按照实施例2介绍的(1)方法从阿耳茨海默氏病病人大脑纯化的CLAC进行氨基酸分析，然而不可能分析所述蛋白，因为其氨基末端是封闭的。合成其中氨基酸113 Glu被焦谷氨酸(Xaa)取代的相当于CLAC-P氨基酸113-118的肽Xaa Ala Pro Ser Glu Cys(SEQ IDNO：29)。该肽通过Cys残基与KLH结合，然后结合肽用作免疫原产生抗体(此后该抗体称为PyroG)。根据Neuron，14 457(1995)介绍推断，抗原PyroG特异性识别与合成肽KLH结合侧相对应的氨基末端结构。也就是说，当使用SDS-PAGE进行免疫印迹方法时，PyroG不与按照实施例3方法培养细胞表达获得的全长重组CLAC-P蛋白反应。但是，使Xaa Ala Pro Ser Glu Cys肽固定在微孔板上(按照EMBOJ.，11，2895(1992)方法)，采用PyroG抗体作为一抗通过间接过氧化物酶方法进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。发现ELISA测定阳性。此外，在免疫印迹方法中，如上所述从阿耳茨海默氏病病人大脑获得的CLAC与PyroG阳性反应。进一步使Xaa Ala Pro Ser Glu Cys与9D2抗体预混合吸收9D2抗体活性(按照Neuron，13，45(1994))，减弱了9D2抗体和来自阿耳茨海默氏病病人大脑的CLAC在免疫印迹方法中的阳性反应，以及减弱了9D2抗体对阿耳茨海默氏病患者脑组织样本的免疫组化染色。上述事实表明，阿耳茨海默氏病患者大脑淀粉样蛋白的CLAC起始于CLAC-P的氨基酸113，而且氨基酸113为焦谷氨酸，9D2抗体可以识别发生了这种改变的CLAC蛋白。

实施例5：CLAC与β淀粉样蛋白(Aβ)的体外结合

CLAC与Aβ体外结合按照Webster等的方法(Am.J.Pathol.，150，1531(1997))进行。

在含有10％FBS和潮霉素的DMEM中选择培养实施例3获得的持续表达人CLAC-P的转化体(细胞株9D2-1)4天，收集培养上清液。使50μl(0.1mg/ml)合成Aβ(1-42)(Bachem)固定在96孔板(Greiner)各孔中，在干燥器中干燥。然后用含有1％明胶(Wako Junyaku)的PBS-T封闭小时，用PBS-T洗涤10分钟(3×)，加入获得的培养上清液。同样加入实施例3使用的对照HEK293细胞培养上清液。在室温下反应1小时后，用PBS-T洗涤10分钟(5×)，然后在室温下与用相似封闭缓冲液(1/5000)稀释的抗CLAC抗体反应1小时。用PBS-T洗涤10分钟(5×)后，在室温下与用相似封闭溶液(1/5000)稀释的二抗(抗兔Ig，辣根过氧化物酶结合的完整抗体(Amersham))反应1小时。用PBS-T洗涤10分钟(5×)后，用TMB试剂(Kirkegard&Perry Laboratories)显色。

作为10次实验的结果，分泌CLAC的持续表达CLAC-P的转化体培养上清液的颜色是不分泌CLAC的对照HEK293的约50倍，说明CLAC在体外明显结合Aβ(p＜0.0001)。

实施例6：CLAC对Aβ聚集的影响

在含有潮霉素和10％FBS的DMEM培养基中选择培养实施例3获得的持续表达人CLAC-P的转化体(细胞株9D2-1)3天，在不含FBS的DMEM中从半融合开始培养4天，然后收集培养上清液。上清液于2,000×g离心后，加样于DEAE柱(Whatman)，通过的流分再加样于肝素柱(Amersham)上。用含有2M尿素(Nacalai Tesque)的PBS溶液(PB-U溶液)充分洗涤柱后，用含有1M NaCl的PB-U溶液洗脱，洗脱液对PBS溶液进行透析。如此获得的溶液用作纯化CLAC粗制品，由对照HEK293细胞获得的溶液用作对照。

按照LeVine的标准方法(Methods in Enzymology，309，274)进行Aβ聚集实验。

在3.6μM合成Aβ(1-42)(Bachem)中加入100μl纯化CLAC粗制品或对照HEK293细胞的溶液，通过0.22μM过滤后，于37℃反应1天。在反应混合物中加入400μl含有3μM硫黄素T的甘氨酸-氢氧化钠溶液(10μM，pH＝8.5)，以荧光光度计(Hitachi F-2000)(激发波长442nm；检测波长496nm)检测荧光。

8次实验证实，纯化CLAC粗制品聚集的Aβ比对照HEK293细胞的溶液的高60倍，该结果具有显著意义(p＜0.0001)。

实施例7：克隆小鼠CLAC-P cDNA

小鼠脑Marathon-Ready cDNA文库(CLONTECH)用作模板，通过PCR方法克隆小鼠CLAC-P cDNA。根据人CLAC-P cDNA序列制备下列引物：

5’-GGG ATC AAG GAG CCA CTA AGA TCA TAG A-3’引物1(SEQID NO：30)

5’-GGG CCT ATG ATA GAA GGA CCC TGT GGA C-3’引物2(SEQID NO：31)

5’-CTA CAA CGG CAA CCT CCA CGA AGC CTT-3’引物3(SEQ IDNO：32)

5’-TCT CCC TTT ATC CCC GGA AGT C-3’引物4(SEQ ID NO：33)

利用引物1和2，使用PremixLATaq(TaKaRa)经PCR仪器(TaKaRa)扩增约330bp的cDNA片段-40个如下循环：95℃加热变性45秒，42℃退火45秒，72℃合成DNA 3分钟。然后在PremixLATaq中加入作为模板的反应混合物(1∶50)，利用引物2和3，进行嵌套式PCR-35个如下循环：95℃加热变性45秒，51℃退火45秒，72℃合成DNA 3分钟。因此获得约300bp的片段。纯化该片段，通过TA克隆方法亚克隆入pBluescript II KS+(Stratagene)中，采用自动测序仪(Li-COR)测序(SEQ ID NO：50)。

根据人CLAC-P检索，在GenBank中发现了与人CLAC-P具有高度同源性的来自成年小鼠睾丸的约70bp的序列(Av264752，SEQ IDNO：51)。根据该序列和前面获得的序列，合成新的引物：

5’-CGA ATA TAT GGC TAA AAT AAG AAC GGT C-3’引物5(SEQID NO：34)

5’-CTG GCA AAC CGG TGT CTC CTT TCT CTC-3’引物6(SEQ IDNO：35)

5’-ACG GTC AGG GAG GCA CCT TTA GAG TGC A-3’引物7(SEQID NO：36)

5’-CTC TCC TTT TAC TCC ATT GGC ACC CGG C-3’引物8(SEQ IDNO：37)

5’-ACG GTC AGG GAG GAA GCT TTA GAG TGC A-3’引物9(SEQID NO：38)

5’-TCA ACT CCG GGG ATC CCT GGA GAG CCT T-3’引物10(SEQID NO：39)

首先，应用引物5和6，进行PCR反应-38个如下循环：95℃加热变性45秒，55℃退火45秒，72℃合成DNA 3分钟。该反应混合物用作模板，利用引物7和8，在相同条件下进行PCR扩增约1200bp的片段。纯化该片段，用合成的引物4作为染料引物，采用自动

测序仪分析核苷酸序列。根据该核苷酸序列制备下列引物：

5’-GGG ACC ATT TTC TCG AGC ATC TCC CTT T-3’引物11(SEQID NO：40)

5’-AAA ATG GTC CCA AAG GTG ATA CAG GAG-3’引物12(SEQID NO：41)

采用使用引物5和6经PCR获得的反应混合物作为模板，利用引物9和11，进行PCR反应-38个如下循环：95℃加热变性45秒，56℃退火45秒，72℃合成DNA 3分钟。用XhoI和HindIII消化如此获得约560bp的片段。将XhoI-HindIII片段亚克隆入pBluescript IIKS+，鉴定核苷酸序列(SEQ ID NO：52)。此外，采用使用引物5和6经PCR获得的反应混合物作为模板，利用引物10和12，进行PCR反应-38个如下循环：95℃加热变性45秒，56℃退火45秒，72℃合成DNA 3分钟。用XhoI和HindIII消化如此获得约550bp的片段。应用TA克隆方法将XhoI-HindIII片段亚克隆入pBluescript II KS+，鉴定核苷酸序列(SEQ ID NO：53)。

接下来，根据上述序列进行RACE(快速扩增cDNA末端)方法。使用下列引物：

5’-TGC ACT CTA AAG GTG CCT CCC TGA CCG T-3’引物13(SEQID NO：42)

5’-GAC CGT TCT TAT TTT AGC CAT ATA TTC G-3’引物14(SEQID NO：43)

5’-TGG TAA CCT CCA TGA GGC CTT ACA GAG A-3’引物15(SEQID NO：44)

5’-GAG AGA AAG GAG ACA CCG GTT TGC CAG-3引物16(SEQID NO：45)

5’-GGC TGG ATG CTC CTT GCC AAT TGG GA-3’引物17(SEQ IDNO：45)

5’-TGG GAC CTG ATG GGT TAC CTA TGC CTG-3’引物18(SEQ IDNO：46)。

采用小鼠脑Marathon-Ready cDNA文库(CLONTECH)作为模板，进行PCR反应-重复循环：95℃加热变性45秒，59℃退火45秒，72℃合成DNA 5分钟。所述反应混合物进行嵌套式PCR-重复循环：95℃加热变性45秒，60℃退火45秒，72℃合成DNA 5分钟，从而扩增片段。将片段通过TA克隆方法亚克隆入pBluescript II KS+中，鉴定核苷酸序列(SEQ ID NO：54、55和56)。

根据上述DNA片段确定小鼠CLAC-P cDNA的序列(图3及SEQID NO：48)。根据该cDNA序列推定ORF的氨基酸序列(图4及SEQID NO：49)。小鼠CLAC-P cDNA编码666个氨基酸(全长)。其与人CLAC-P cDNA的同源性约83％，氨基酸水平同源性约90％。小鼠CLAC-P的分子结构基本与人CLAC-P相同，它为II型单一跨膜蛋白，在细胞外区段存在3个胶原蛋白样重复序列。而且在胶原蛋白样序列中鉴定出发生剪接改变的序列(图4，下划线；SEQ ID NO：49)。

本发明的工业实用性

本发明获得的新型胶原蛋白样蛋白CLAC在阿耳茨海默氏病老年斑淀粉样蛋白中累积，促进阿耳茨海默氏病老年斑淀粉样蛋白主要组分β-淀粉样蛋白聚集。CLAC前体CLAC-P作为跨膜蛋白分布在细胞膜表面，起结合β-淀粉样蛋白至细胞表面的受体作用。因此，CLAC-P参与阿耳茨海默氏病发展。CLAC-P可用于预防、阻止及治疗阿耳茨海默氏病。

序列表自由文本

SEQ ID NO：5

Xaa为羟脯氨酸。

SEQ ID NO：9

Xaa为羟脯氨酸。

SEQ ID NO：12

设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

r为g或a。i为肌苷。y为t或c。

SEQ ID NO：13

设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

r为g或a。i为肌苷。v为a、g或c。d为a、g或t。

SEQ ID NO：14

设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

r为g或a。i为肌苷。v为a、g或c。

SEQ ID NO：15

设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：16

设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：17

设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：18

设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：19

设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：20

设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：21

设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：22

设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：23

设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：24

设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：25

设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：26

设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：27

设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：28

设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：29

Xaa为焦谷氨酸。

SEQ ID NO：30

设计用于扩增小鼠CLAC-P DNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：31

设计用于扩增小鼠CLAC-P DNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：32

设计用于扩增小鼠CLAC-P DNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：33

设计用于扩增小鼠CLAC-P DNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：34

设计用于扩增小鼠CLAC-P DNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：35

设计用于扩增小鼠CLAC-P DNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：36

设计用于扩增小鼠CLAC-P DNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：37

设计用于扩增小鼠CLAC-P DNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：38

设计用于扩增小鼠CLAC-P DNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：39

设计用于扩增小鼠CLAC-P DNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：40

设计用于扩增小鼠CLAC-P DNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：41

设计用于扩增小鼠CLAC-P DNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：42

设计用于扩增小鼠CLAC-P DNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：43

设计用于扩增小鼠CLAC-P DNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：44

设计用于扩增小鼠CLAC-P DNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：45

设计用于扩增小鼠CLAC-P DNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：46

设计用于扩增小鼠CLAC-P DNA片段的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：47

设计用于扩增小鼠CLAC-P DNA片段的寡核苷酸引物。

序列表

<110>Takeshi Iwatsubo.

Tadafumi Hashimoto，

BF Research Institute.Inc.

<120>新型胶原蛋白样蛋白、其前体和它们的编码基因

<130>662339

<160>56

<210>1

<211>2076

<212>DNA

<213>人

<400>1

ccgcgacttc ggcttcgcga gtagcattgg ttccttgggt ttatttcgtt ttcctctctc 60

ttctccacct tagtcgcccc tttcgcgctg cgctgtagcg tgctctcaca gcctttttgc 120

cttgaactga atgcaggtgg gaaacaggtc ggcgtgccga aagacaccga gtaggtagaa 180

ataaggcaaa ctcacagagg cgcaacaggt ccggtcctcc gtggccaggg cgagccgcgg 240

ccccgcgtgg cgcctcggcc gttgccctcg gaccctgagc ggccactgtt ggggccctcg 300

aaagaggtgt cggtcctctg ggagtcggaa gagctgtctg ggtgggtttc gtcttgcttt 360

ttaccccacc gccacccagt ccccggacgg agggtgcttt tcacttccag ctgggaggag 420

agaagaaagc ggggatggtg cacgcctgcg ggtctggacg ctgagcaagg caggggatta 480

tttgaggtgt agagggtggg aagcgaagcc gagacggccg accccgccac gatgctgctg 540

aagaagcacg cagggaaagg agggggccgg gagcccagat ccgaggaccc gacccctgcc 600

gaacagcatt gttcccggac catgcccccg tgtgccgtcc tggcggccct cctgtcagtg 660

gtggccgtgg tgtcttgcct gtacctgggt gtgaaaacca acgacctcca ggcgaggatc 720

gccgctctcg aatccgccaa aggggccccc tccattcatc tgctgcctga taccctggat 780

cacctcaaga ctatggtgca agagaaagtg gagcgacttc tggctcagaa atcctatgaa 840

catatggcta aaataagaat cgcaagagaa gcaccttcag aatgtaactg cccagcaggc 900

cctccaggga aacgaggtaa gagaggccga agaggagaat ctggtcctcc tggacagcct 960

ggtcctcagg gccctcctgg tccaaaaggc gataagggag aacaaggtga tcagggacct 1020

aggatggtgt ttcctaaaat caatcatggg tttctctctg ctgatcagca gctcattaaa 1080

cgccgcctga ttaagggtga ccaaggacag gcagggcctc caggaccccc tggccctcca 1140

ggcccaagag ggccacctgg ggacacaggg aaagatggcc cccgtggaat gccaggagta 1200

cccggtgaac caggaaagcc aggagaacaa ggcttgatgg gtcctctagg gcctccggga 1260

caaaagggtt ctattggagc acctggaatt ccagggatga atgggcaaaa gggtgagccc 1320

gggttgcctg gagcagtagg acagaatgga ataccaggac ctaagggaga acctggagaa 1380

caaggtgaaa agggagacgc tggagagaac ggccccaagg gtgacacagg cgaaaagggt 1440

gaccctggat catctgctgc aggaattaag ggagaacctg gggaatctgg tcgtccaggg 1500

caaaagggtg aaccagggct tcctgggctt cctggacttc cggggataaa gggagaacca 1560

ggtttcattg gtcctcaagg agaaccaggc ttaccaggtt taccaggaac aaaaggtgaa 1620

cggggggaag cagggcctcc tggaagaggt gagcgagggg aacctggagc ccccggacca 1680

aaggggaaac aaggtgaatc aggaactaga ggcccaaagg ggtcaaaggg ggatcgtgga 1740

gaaaaagggg actctggagc tcagggacca aggggtccac ctggtcaaaa aggggatcaa 1800

ggagccacta agatcataga ctacaacggc aacctccacg aagccttaca gaggattacc 1860

accttaactg tcacgggtcc ccctggacct cctggacctc aaggactaca agggccaaag 1920

ggagagcagg gatctccagg aatcccagga atggatggag agcagggact caaaggctca 1980

aagggagaca tgggggaccc aggtatgaca ggtgaaaaag gaggaattgg acttcctgga 2040

ttaccgggag ccaatggaat gaaaggagaa aaaggagatt ctggaatgcc gggtccacag 2100

ggtccttcta tcataggccc accaggccca ccaggtcccc atggcccacc tggccccatg 2160

ggacctcatg gacttcctgg accaaagggt acagatggtc ctatgggacc ccatggccct 2220

gcaggtccca aaggagaaag aggtgaaaaa ggagctatgg gagagcctgg accaagaggg 2280

ccctatgggc tgcctgggaa agatggagag cctggtcttg atggcttccc tggtccacgg 2340

ggtgagaagg gtgatctagg agaaaaggga gaaaagggat tccgtggcgt taagggggaa 2400

aaaggggagc caggccagcc tggcctggat gggctggatg ccccttgcca attggggcca 2460

gatggcttac ccatgcctgg ctgttggcaa aagtgatgaa tctaaccttt caagcatgaa 2520

gttgtgtata taagggtcca tttttaatat ttatagttga aaactgaatt gcagatttta 2580

caagtctgag atatgtttac atagggc 2607

<210>2

<211>654

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Leu Leu Lys Lys His Ala Gly Lys Gly Gly Gly Arg Glu Pro Arg

1 5 10 15

Ser Glu Asp Pro Thr Pro Ala Glu Gln His Cys Ser Arg Thr Met Pro

20 25 30

Pro Cys Ala Val Leu Ala Ala Leu Leu Ser Val Val Ala Val Val Ser

35 40 45

Cys Leu Tyr Leu Gly Val Lys Thr Asn Asp Leu Gln Ala Arg Ile Ala

50 55 60

Ala Leu Glu Ser Ala Lys Gly Ala Pro Ser Ile His Leu Leu Pro Asp

65 70 75 80

Thr Leu Asp His Leu Lys Thr Met Val Gln Glu Lys Val Glu Arg Leu

85 90 95

Leu Ala Gln Lys Ser Tyr Glu His Met Ala Lys Ile Arg Ile Ala Arg

100 105 110

Glu Ala Pro Ser Glu Cys Asn Cys Pro Ala Gly Pro Pro Gly Lys Arg

115 120 125

Gly Lys Arg Gly Arg Arg Gly Glu Ser Gly Pro Pro Gly Gln Pro Gly

130 135 140

Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Glu Gln Gly Asp

145 150 155 160

Gln Gly Pro Arg Met Val Phe Pro Lys Ile Asn His Gly Phe Leu Ser

165 170 175

Ala Asp Gln Gln Leu Ile Lys Arg Arg Leu Ile Lys Gly Asp Gln Gly

180 185 190

Gln Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Pro

195 200 205

Pro Gly Asp Thr Gly Lys Asp Gly Pro Arg Gly Met Pro Gly Val Pro

210 215 220

Gly Glu Pro Gly Lys Pro Gly Glu Gln Gly Leu Met Gly Pro Leu Gly

225 230 235 240

Pro Pro Gly Gln Lys Gly Ser Ile Gly Ala Pro Gly Ile Pro Gly Met

245 250 255

Asn Gly Gln Lys Gly Glu Pro Gly Leu Pro Gly Ala Val Gly Gln Asn

260 265 270

Gly Ile Pro Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Glu Gln Gly Glu Lys Gly

275 280 285

Asp Ala Gly Glu Asn Gly Pro Lys Gly Asp Thr Gly Glu Lys Gly Asp

290 295 300

Pro Gly Ser Ser Ala Ala Gly Ile Lys Gly Glu Pro Gly Glu Ser Gly

305 310 315 320

Arg Pro Gly Gln Lys Gly Glu Pro Gly Leu Pro Gly Leu Pro Gly Leu

325 330 335

Pro Gly Ile Lys Gly Glu Pro Gly Phe Ile Gly Pro Gln Gly Glu Pro

340 345 350

Gly Leu Pro Gly Leu Pro Gly Thr Lys Gly Glu Arg Gly Glu Ala Gly

355 360 365

Pro Pro Gly Arg Gly Glu Arg Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly Pro Lys

370 375 380

Gly Lys Gln Gly Glu Ser Gly Thr Arg Gly Pro Lys Gly Ser Lys Gly

385 390 395 400

Asp Arg Gly Glu Lys Gly Asp Ser Gly Ala Gln Gly Pro Arg Gly Pro

405 410 415

Pro Gly Gln Lys Gly Asp Gln Gly Ala Thr Lys Ile Ile Asp Tyr Asn

420 425 430

Gly Asn Leu His Glu Ala Leu Gln Arg Ile Thr Thr Leu Thr Val Thr

435 440 445

Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu Gln Gly Pro Lys Gly

450 455 460

Glu Gln Gly Ser Pro Gly Ile Pro Gly Met Asp Gly Glu Gln Gly Leu

465 470 475 480

Lys Gly Ser Lys Gly Asp Met Gly Asp Pro Gly Met Thr Gly Glu Lys

485 490 495

Gly Gly Ile Gly Leu Pro Gly Leu Pro Gly Ala Asn Gly Met Lys Gly

500 505 510

Glu Lys Gly Asp Ser Gly Met Pro Gly Pro Gln Gly Pro Ser Ile Ile

515 520 525

Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro His Gly Pro Pro Gly Pro Met Gly

530 535 540

Pro His Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Thr Asp Gly Pro Met Gly Pro

545 550 555 560

His Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Glu Lys Gly Ala Met

565 570 575

Gly Glu Pro Gly Pro Arg Gly Pro Tyr Gly Leu Pro Gly Lys Asp Gly

580 585 590

Glu Pro Gly Leu Asp Gly Phe Pro Gly Pro Arg Gly Glu Lys Gly Asp

595 600 605

Leu Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Phe Arg Gly Val Lys Gly Glu Lys

610 615 620

Gly Glu Pro Gly Gln Pro Gly Leu Asp Gly Leu Asp Ala Pro Cys Gln

625 630 635 640

Leu Gly Pro Asp Gly Leu Pro Met Pro Gly Cys Trp Gln Lys

645 650

<210>3

<211>14

<212>PRT

<213>人

<400>3

Glu Pro Arg Ser Glu Asp Pro Thr Pro Ala Glu Gln His Cys

1 5 10

<210>4

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

Gly Cys Asn His Gly Phe Leu Ser Ala Asp Gln Gln Leu Ile Lys

1 5 10 15

<210>5

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>Xaa是羟脯氨酸

<400>5

Cys Lys Gly Glu Gln Gly Asp Gln Gly Pro Arg Met Val Phe Xaa Lys

1 5 10 15

<210>6

<21l>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

Asp Tyr Asn Gly Asn Leu His Glu Ala Leu Gln Arg Ile Thr Cys

1 5 10 15

<210>7

<211>15

<212>PRT

<213>人

<400>7

Leu Gly Pro Asp Gly Leu Pro Met Pro Gly Cys Trp Gln Lys

1 5 10 15

<210>8

<211>14

<212>PRT

<213>人

<400>8

Ile Asn His Gly Phe Leu Ser Ala Asp Gln Gln Leu Ile Lys

1 5 10

<210>9

<211>14

<212>PRT

<213>人

<220>

<223>Xaa是羟脯氨酸

<400>9

Gly Glu Gln Gly Asp Gln Gly Xaa Arg Met Val Phe Pro Lys

1 5 10

<210>10

<211>18

<212>PRT

<213>人

<400>10

Asp Gln Gly Pro Arg Met Val Phe Pro Lys Ile Ash His Gly Phe Leu Ser Ala

1 5 10 15

<210>11

<211>28

<212>PRT

<213>人

<400>11

Gly Glu Gln Gly Asp Gln Gly Pro Arg Met Val Phe Pro Lys Ile Asn

1 5 10 15

His Gly Phe Leu Ser Ala Asp Gln Gln Leu Ile Lys

20 25

<210>12

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增人CLAC-PcDNA片段的寡核苷酸引物。r是g或a。i是肌苷。y是t、u或c。

<400>12

aarggigarc arggigayca rggicc 26

<210>13

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增人CLAC-PcDNA片段的寡核苷酸引物。r是g或a。i是肌苷。v是a、g或c。d是a、g或t。

<400>13

agctgctgrt cigcdgavag raabcc 26

<210>14

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增人CLAC-PcDNA片段的寡核苷酸引物。r是g或a。i是肌苷。v是a、g或c。

<400>14

agctgctgrt cigcrctvag raabcc 26

<210>15

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>15

tagctgctgg tcggcgctga ggaagcca 28

<210>16

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>16

aagggggaac agggggacca ggggccga

<210>17

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>17

tcggaaacac catcctcggc ccctggtc 28

<210>18

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>18

catggcttcc tcagcgccga ccagcagc 28

<210>19

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>19

cgccgcctga ttaagggtga ccaaggac 28

<210>20

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>20

aagagggcca cctggggaca cagggaaa 28

<210>21

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>21

acccttgggg ccgttctctc cagcgtct 28

<210>22

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>22

caccttgttc tccaggttct cccttagg 28

<210>23

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>23

gaataccagg acctaaggga gaacctgg 28

<210>24

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>24

ggccccaagggtgacacaggcgaaaagg 28

<210>25

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>25

ccctcctttc cctgcgtgct tcttcagc 28

<210>26

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>26

tctcggcttc gcttcccacc ctctacac 28

<210>27

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>27

ggagattctg gaatgccggg tccacagg 28

<210>28

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增人CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>28

cttctatcat aggcccacca ggcccacc 28

<210>29

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>Xaa是焦谷氨酸。

<400>29

Xaa Ala Pro Ser Glu Cys

1 5

<210>30

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增小鼠CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>30

gggatcaagg agccactaag atcataga 28

<210>31

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增小鼠CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>31

gggcctatga tagaaggacc ctgtggac 28

<210>32

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增小鼠CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>32

ctacaacggc aacctccacg aagcctt 27

<210>33

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增小鼠CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>33

tctcccttta tccccggaag tc 22

<210>34

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增小鼠CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>34

cgaatatatg gctaaaataa gaacggtc 28

<210>35

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增小鼠CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>35

ctggcaaacc ggtgtctcct ttctctc 27

<210>36

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增小鼠CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>36

acggtcaggg aggcaccttt agagtgca 28

<210>37

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增小鼠CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>37

ctctcctttt actccattgg cacccggc 28

<210>38

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增小鼠CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>38

acggtcaggg aggaagcttt agagtgca 28

<210>39

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增小鼠CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>39

tcaactccgg ggatccctgg agagcctt 28

<210>40

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增小鼠CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>40

gggaccattt tctcgagcat ctcccttt 28

<210>41

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增小鼠CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>41

aaaatggtcc caaaggtgat acaggag 27

<210>42

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增小鼠CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>42

tgcactctaa aggtgcctcc ctgaccgt 28

<210>43

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增小鼠CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>43

gaccgttctt attttagcca tatattcg 28

<210>44

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增小鼠CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>44

tggtaacctc catgaggcct tacagaga 28

<210>45

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增小鼠CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>45

gagagaaagg agacaccggt ttgccag 27

<210>46

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增小鼠CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>46

ggctggatgc tccttgccaa ttggga 26

<210>47

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计用于扩增小鼠CLAC-P cDNA片段的寡核苷酸引物。

<400>47

tgggacctga tgggttacct atgcctg 27

<210>48

<211>2298

<212>DNA

<213>小鼠

<400>48

cccggcgcca cacagtcccc ggccggaggg tgcttttcac tcctagctgg aaggggagaa 60

agaatctgga ggacggtcgg tccacgcctg ctgatccgga cgccgagcca cgcgcaggtc 120

catctctaag cccgggctcc gactctacca actagttgtg cagccgcagg gactgaactt 180

tggaggaacc gacccttcct ctcattctaa gattactgga ggagatagaa ggtggaaggc 240

gtagcggagg ccagcgaccc cgccacaatg ttggtgaaga agcttgcagg gaaaggaggg 300

ggacgagagt ctggatcaga agatccgcgc cccttgggac agcgttgtgc cggcaccatg 360

ccctcgtgca cggccctggc gaccctcttg tcagtggttg ctgtggcttt ctgtttttat 420

cttggggtga aaaccaacga cctccaggcg aggattgttg ctcttgaatc tgctaaaggg 480

accccttcct tccatccgct gtctgacacc gtggatgagc tgaaggcaat ggttcaggag 540

aaagtggagc gtctcttggc tcagaaatcc tacgaatata tggctaaaat aagaacggtc 600

agggaggcac ctttagagtg caactgccca gcaggtcctc cagggaaacg agggaagaga 660

ggccgaagag gagaatctgg tcctcctggt cagcctggtc ctcagggccc tcctggtcca 720

aaaggtgata agggagaaca aggtgatcag ggacctcgga tggtgtttcc taaaatcaat 780

cacggctttc tctctgctga tcagcagctc attaaacgcc ggctgattaa gggtgaccaa 840

ggacaggcag ggcctccagg acctccaggc cctcctggtc caagaggccc acctggggac 900

acaggaaagg acggcccccg aggaatgcca ggagtacctg gtgaaccagg aaaaccagga 960

gaacaaggct tgatgggacc tctggggcct ccaggacaaa agggttccat tggagcacct 1020

gggaccccag gcatggatgg gcaaaagggt gagcctggat cacctggagc agccgggcag 1080

agtggactac caggacctaa gggagaacct ggaaaagaag gagaaaaggg agatgctgga 1140

gaaaatggtc ccaaaggtga tacaggagaa aagggtgacc ctggatcatc tgctgcagga 1200

attaagggag aacctggaga atctggccgc ccggggcaga agggtgaacc agggctgcct 1260

gggctgcctg gacttccggg aataaaggga gaaccaggct tcattggtcc tcaaggagaa 1320

ccagggttac cagggctacc aggaacaaaa ggtgatcgtg gggaggcggg gcctcctgga 1380

agaggtgaac gaggagatcc tggagccccg gggccaaagg ggaagcaagg tgaatcagga 1440

gctagaggcc cgaaggggtc aaagggtgat cgtggagaca aaggagactc tggcgctctg 1500

ggaccacggg gtccacctgg acaaaagggg gatccaggag ccacagagat catagactac 1560

aatggcaacc tccatgaggc cttacagaga attaccacct taactgtcac gggcccccct 1620

ggacctcctg gacctcaagg actacaaggg ccaaagggtg agcaaggctc tccaggaatc 1680

cccggagttg atggagaaca gggactcaaa ggctccaagg gagacatggg ggacccaggt 1740

gtgccaggtg aaaaaggagg actgggactt cctggattgc cgggtgccaa tggagtaaaa 1800

ggagagaaag gagacaccgg tttgccaggt cctcaggggc cttctatcat aggcccacca 1860

ggccctccag gtccccatgg cccacctggt cccatggggc cccatggact tcctggacca 1920

aagggagcat ctggcttaga cggaaagcca ggatcccggg gtgcagatgg tcctatagga 1980

ccccacggcc ctgcaggacc caaaggagaa agaggagaga aaggagctat gggagagcct 2040

ggacccagag ggccctatgg gctgcctggc aaagatggag aacctggtct tgatggcttc 2100

cctggtcctc gaggcgagaa gggtgacctg ggagaaaagg gagaaaaggg attccgtggc 2160

gttaaggggg aaaaggggga gccaggccag cctggcctgg atgggctgga tgctccttgc 2220

caattgggac ctgatgggtt acctatgcct ggctgctggc aaaagtgatg aatctaacct 2280

tccgagcatg aagttgtg 2298

<210>49

<211>666

<212>PRT

<213>小鼠

<400>49

Met Leu Val Lys Lys Leu Ala Gly Lys Gly Gly Gly Arg Glu Ser Gly

1 5 10 15

Ser Glu Asp Pro Arg Pro Leu Gly Gln Arg Cys Ala Gly Thr Met Pro

20 25 30

Ser Cys Thr Ala Leu Ala Thr Leu Leu Ser Val Val Ala Val Ala Phe

35 40 45

Cys Phe Tyr Leu Gly Val Lys Thr Asn Asp Leu Gln Ala Arg Ile Val

50 55 60

Ala Leu Glu Ser Ala Lys Gly Thr Pro Ser Phe His Pro Leu Ser Asp

65 70 75 80

Thr Val Asp Glu Leu Lys Ala Met Val Gln Glu Lys Val Glu Arg Leu

85 90 95

Leu Ala Gln Lys Ser Tyr Glu Tyr Met Ala Lys Ile Arg Thr Val Arg

100 105 110

Glu Ala Pro Leu Glu Cys Asn Cys Pro Ala Gly Pro Pro Gly Lys Arg

115 120 125

Gly Lys Arg Gly Arg Arg Gly Glu Ser Gly Pro Pro Gly Gln Pro Gly

130 135 140

Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Glu Gln Gly Asp

145 150 155 160

Gln Gly Pro Arg Met Val Phe Pro Lys Ile Asn His Gly Phe Leu Ser

165 170 175

Ala Asp Gln Gln Leu Ile Lys Arg Arg Leu Ile Lys Gly Asp Gln Gly

180 185 190

Gln Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Pro

195 200 205

Pro Gly Asp Thr Gly Lys Asp Gly Pro Arg Gly Met Pro Gly Val Pro

210 215 220

Gly Glu Pro Gly Lys Pro Gly Glu Gln Gly Leu Met Gly Pro Leu Gly

225 230 235 240

Pro Pro Gly Gln Lys Gly Ser Ile Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Met

245 250 255

Asp Gly Gln Lys Gly Glu Pro Gly Ser Pro Gly Ala Ala Gly Gln Ser

260 265 270

Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Lys Glu Gly Glu Lys Gly

275 280 285

Asp Ala Gly Glu Asn Gly Pro Lys Gly Asp Thr Gly Glu Lys Gly Asp

290 295 300

Pro Gly Ser Ser Ala Ala Gly Ile Lys Gly Glu Pro Gly Glu Ser Gly

305 310 315 320

Arg Pro Gly Gln Lys Gly Glu Pro Gly Leu Pro Gly Leu Pro Gly Leu

325 330 335

Pro Gly Ile Lys Gly Glu Pro Gly Phe Ile Gly Pro Gln Gly Glu Pro

340 345 350

Gly Leu Pro Gly Leu Pro Gly Thr Lys Gly Asp Arg Gly Glu Ala Gly

355 360 365

Pro Pro Gly Arg Gly Glu Arg Gly Asp Pro Gly Ala Pro Gly Pro Lys

370 375 380

Gly Lys Gln Gly Glu Ser Gly Ala Arg Gly Pro Lys Gly Ser Lys Gly

385 390 395 400

Asp Arg Gly Asp Lys Gly Asp Ser Gly Ala Leu Gly Pro Arg Gly Pro

405 410 415

Pro Gly Gln Lys Gly Asp Pro Gly Ala Thr Glu Ile Ile Asp Tyr Asn

420 425 430

Gly Asn Leu His Glu Ala Leu Gln Arg Ile Thr Thr Leu Thr Val Thr

435 440 445

Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu Gln Gly Pro Lys Gly

450 455 460

Glu Gln Gly Ser Pro Gly Ile Pro Gly Val Asp Gly Glu Gln Gly Leu

465 470 475 480

Lys Gly Ser Lys Gly Asp Met Gly Asp Pro Gly Val Pro Gly Glu Lys

485 490 495

Gly Gly Leu Gly Leu Pro Gly Leu Pro Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly

500 505 510

Glu Lys Gly Asp Thr Gly Leu Pro Gly Pro Gln Gly Pro Ser Ile Ile

515 520 525

Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro His Gly Pro Pro Gly Pro Met Gly

530 535 540

Pro His Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Ala Ser Gly Leu Asp Gly Lys

545 550 555 560

Pro Gly Ser Arg Gly Ala Asp Gly Pro Ile Gly Pro His Gly Pro Ala

565 570 575

Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Glu Lys Gly Ala Met Gly Glu Pro Gly

580 585 590

Pro Arg Gly Pro Tyr Gly Leu Pro Gly Lys Asp Gly Glu Pro Gly Leu

595 600 605

Asp Gly Phe Pro Gly Pro Arg Gly Glu Lys Gly Asp Leu Gly Glu Lys

610 615 620

Gly Glu Lys Gly Phe Arg Gly Val Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly

625 630 635 640

Gln Pro Gly Leu Asp Gly Leu Asp Ala Pro Cys Gln Leu Gly Pro Asp

645 650 655

Gly Leu Pro Met Pro Gly Cys Trp Gln Lys

660 665

<210>50

<211>245

<212>DNA

<213>小鼠

<400>50

acagagaatt accaccttaa ctgtcacggg cccccctgga cctcctggac ctcaaggact 60

acaagggcca aagggtgagc aaggctctcc aggaatcccc ggagttgatg gagaacaggg 120

actcaaaggc tccaagggag acatggggga cccaggtgtg ccaggtgaaa aaggaggact 180

gggacttcct ggattgccgg gtgccaatgg agtaaaagga gagaaaggag acaccggttt 240

gccag 245

<210>51

<211>73

<212>DNA

<213>小鼠

<400>51

agaaatccta cgaatatatg gctaaaataa gaacggtcag ggaggcacct ttagagtgca 60

actgcccagc agg 73

<210>52

<211>502

<212>DNA

<213>小鼠

<400>52

actgcccagc aggtcctcca gggaaacgag ggaagagagg ccgaagagga gaatctggtc 60

ctcctggtca gcctggtcct cagggccctc ctggtccaaa aggtgataag ggagaacaag 120

gtgatcaggg acctcggatg gtgtttccta aaatcaatca cggctttctc tctgctgatc 180

agcagctcat taaacgccgg ctgattaagg gtgaccaagg acaggcaggg cctccaggac 240

ctccaggccc tcctggtcca agaggcccac ctggggacac aggaaaggac ggcccccgag 300

gaatgccagg agtacctggt gaaccaggaa aaccaggaga acaaggcttg atgggacctc 360

tggggcctcc aggacaaaag ggttccattg gagcacctgg gaccccaggc atggatgggc 420

aaaagggtga gcctggatca cctggagcag ccgggcagag tggactacca ggacctaagg 480

gagaacctgg aaaagaagga ga 502

<210>53

<211>495

<212>DNA

<213>小鼠

<400>53

aaaagggtga ccctggatca tctgctgcag gaattaaggg agaacctgga gaatctggcc 60

gcccggggca gaagggtgaa ccagggctgc ctgggctgcc tggacttccg ggaataaagg 120

gagaaccagg cttcattggt cctcaaggag aaccagggtt accagggcta ccaggaacaa 180

aaggtgatcg tggggaggcg gggcctcctg gaagaggtga acgaggagat cctggagccc 240

cggggccaaa ggggaagcaa ggtgaatcag gagctagagg cccgaagggg tcaaagggtg 300

atcgtggaga caaaggagac tctggcgctc tgggaccacg gggtccacct ggacaaaagg 360

gggatccagg agccacagag atcatagact acaatggcaa cctccatgag gccttacaga 420

gaattaccac cttaactgtc acgggccccc ctggacctcc tggacctcaa ggactacaag 480

ggccaaaggg tgagc 495

<210>54

<211>572

<212>DNA

<213>小鼠

<400>54

cccggcgcca cacagtcccc ggccggaggg tgcttttcac tcctagctgg aaggggagaa 60

agaatctgga ggacggtcgg tccacgcctg ctgatccgga cgccgagcca cgcgcaggtc 120

catctctaag cccgggctcc gactctacca actagttgtg cagccgcagg gactgaactt 180

tggaggaacc gacccttcct ctcattctaa gattactgga ggagatagaa ggtggaaggc 240

gtagcggagg ccagcgaccc cgccacaatg ttggtgaaga agcttgcagg gaaaggaggg 300

ggacgagagt ctggatcaga agatccgcgc cccttgggac agcgttgtgc cggcaccatg 360

ccctcgtgca cggccctggc gaccctcttg tcagtggttg ctgtggcttt ctgtttttat 420

cttggggtga aaaccaacga cctccaggcg aggattgttg ctcttgaatc tgctaaaggg 480

accccttcct tccatccgct gtctgacacc gtggatgagc tgaaggcaat ggttcaggag 540

aaagtggagc gtctcttggc tcagaaatcc ta 572

<210>55

<211>427

<212>DNA

<213>小鼠

<400>55

gtcctcaggg gccttctatc ataggcccac caggccctcc aggtccccat ggcccacctg 60

gtcccatggg gccccatgga cttcctggac caaagggagc atctggctta gacggaaagc 120

caggatcccg gggtgcagat ggtcctatag gaccccacgg ccctgcagga cccaaaggag 180

aaagaggaga gaaaggagct atgggagagc ctggacccag agggccctat gggctgcctg 240

gcaaagatgg agaacctggt cttgatggct tccctggtcc tcgaggcgag aagggtgacc 300

tgggagaaaa gggagaaaag ggattccgtg gcgttaaggg ggaaaagggg gagccaggcc 360

agcctggcct ggatgggctg gatgctcctt gccaattggg acctgatggg ttacctatgc 420

ctggctg 427

<210>56

<211>47

<212>DNA

<213>小鼠

<400>56

gctgctggca aaagtgatga atctaacctt ccgagcatga agttgtg 47

Claims

1.一种胶原蛋白样蛋白CLAC，它由SEQ ID NO：2所示的氨基酸113-654的氨基酸序列构成。

2.一种编码在权利要求1的CLAC中***、缺失或取代一个至九个氨基酸的蛋白质的DNA，所述编码蛋白具有下列特性：

(a)累积在阿耳茨海默氏病老年斑淀粉样蛋白组分中，

(b)具有促进Aβ聚集的作用。

3.编码权利要求1或2的蛋白的DNA。

4.权利要求3的DNA，它由SEQ ID NO：1所示核苷酸868-2493的核苷酸序列构成。

5.一种胶原蛋白样蛋白前体蛋白CLAC-P，它由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列构成。

6.一种编码在权利要求5的CLAC-P中***、缺失或取代一个至九个氨基酸的蛋白质的DNA，所述编码蛋白起细胞表面Aβ受体作用。

7.编码权利要求5或6的蛋白的DNA。

8.权利要求7的DNA，它由SEQ ID NO：1所示核苷酸532-2493的核苷酸序列构成。

9.权利要求6定义的蛋白质，它是在SEQ ID NO：2所示的氨基酸141-146区段缺失或取代一个至六个氨基酸或者在氨基酸589-597区段缺失或取代一个至九个氨基酸的蛋白质。

10.一种表达载体，它包含权利要求3或4的DNA。

11.一种转化体，它是权利要求10的载体转化的转化体。

12.一种制备重组CLAC的方法，该方法包括在能够表达权利要求10的表达载体的条件下培养权利要求11的转化体。

13.一种表达载体，它包含权利要求7或8的DNA。

14.一种转化体，它是权利要求13的载体转化的转化体。

15.权利要求14转化体，它保藏在国际专利生物保藏单位国立高级工业科技研究所，保藏号为FERM BP-7438。

16.一种制备重组CLAC和/或CLAC-P的方法，该方法包括在能够表达权利要求13的表达载体的条件下培养权利要求14的转化体。

17.一种筛选权利要求1或2的蛋白促进Aβ聚集的抑制剂的方法，该方法包括让权利要求1或2的蛋白在有和无受试物质的情况下与Aβ反应，选择出抑制所述蛋白促进Aβ聚集的受试物质。

18.一种抗体，它特异性结合权利要求1、2、5、6、9任一项的蛋白。

19.权利要求18的抗体，它为杂交瘤FERM BP-7437所产生的单克隆抗体。

20.一种筛选降低Aβ与表达权利要求5、6、9任一项的蛋白的细胞结合量的物质的方法，该方法包括让所述细胞在有和无受试物质的情况下与Aβ反应，选择出降低Aβ与所述细胞结合量的受试物质。

21.一种筛选权利要求5、6、9任一项的蛋白的细胞毒性抑制剂的方法，该方法包括让表达权利要求5、6、9任一项的蛋白的细胞在有和无受试物质的情况下与Aβ反应，选择出抑制所述细胞毒性的受试物质。

22.一种检测CLAC或CLAC-P的方法，该方法包括使用权利要求18定义的抗体。

23.权利要求18的抗体在制备用于治疗、延迟恶化或者预防阿耳茨海默氏病的药物中的用途。

24.权利要求22定义的方法，其中所述抗体为杂交瘤FERMBP-7437所产生的单克隆抗体。

25.权利要求23的用途，其中所述抗体为杂交瘤FERM BP-7437所产生的单克隆抗体。

26.一种纯化CLAC和/或CLAC-P的方法，该方法包括使用杂交瘤FERM BP-7437所产生的单克隆抗体。

27.一种诊断阿耳茨海默氏病的试剂盒，它包括检测性标记的杂交瘤FERM BP-7437所产生的单克隆抗体。

28.一种筛选权利要求1或2的蛋白产生或分泌的抑制剂的方法，该方法包括在有和无受试物质的情况下培养表达权利要求5、6、9任一项的蛋白的细胞，定量测定权利要求1或2的蛋白的产量或分泌量，选择出抑制权利要求1或2的蛋白产生或分泌的受试物质。