CN1237170C - 自然杀伤细胞的增殖方法 - Google Patents
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Abstract
人自然杀伤细胞的增殖方法，包括将外周血单核细胞和人Wilms肿瘤细胞株HFWT进行混合培养的工序。例如，使用从人个体分离出的外周血单核细胞，可以使该人个体本身的自然杀伤细胞增殖，可以有效地使保持高细胞杀伤活性的自然杀伤细胞增殖。
Description
技术领域
本发明涉及人的免疫***细胞的制备方法。
背景技术
动物体内的自然杀伤细胞(以下，本发明说明书中有时省略为“NK细胞”)是承担一部分免疫反应的淋巴细胞系的细胞。该细胞具有各种各样的功能，特别是由于对肿瘤细胞具有很强的杀伤活性，所以被认为是体内清除已经肿瘤化的或正在肿瘤化的异常细胞的免疫监视***的重要成员。因此，将该细胞有效地用于肿瘤治疗的研究很早就开始了。
例如，将大量的淋巴因子之一的白细胞介素-2(以下本发明说明书中有时省略为“IL”)加到培养液中，培养外周血单核细胞(以下记为PBMC)，对于人而言，PBMC培养1周左右，所谓的淋巴因子活化的杀伤淋巴细胞(以下有时省略为“LAK细胞”)开始增殖，而人们都知道其中含有很多NK细胞。从Rosenberg等人的研究(Rosenberg，S.A.，et al.，N.Engl.J.Med.313，pp.1485-1492，1985)以来，LAK细胞在肿瘤的过继免疫疗法中被广泛使用。另外也知道LAK细胞对感染症也有效，作为对付用抗生素难于治疗的感染症的措施已引起人们注意。然而为了使LAK细胞大量增殖需要进行2周以上的长时间培养，这往往会造成NK细胞的细胞杀伤活性大幅度下降，所以通过培养LAK细胞获得NK细胞不是一个好的措施。
NK细胞的表面上存在NK活性抑制受体(以下省略为“NKIR细胞”)，如果存在与该受体结合的分子，NK细胞的细胞杀伤活性会受到抑制(Gumperz，J.E.and Parham，P.，Nature，378，pp.245-248，1995)。一般来说，在正常细胞的表面有主要组织相容性抗原I类(以下有时称之为“MHC-I”)分子表达，它们起着识别自己和非己的重要作用，但由于在MHC-I分子群中存在可结合NKIR的分子，所以通常测定NK细胞的细胞杀伤活性时，将人慢性白血病细胞株K562作为靶细胞进行活性测定。这是由于K562细胞几乎不表达MHC-I分子。然而当要杀伤K562细胞时，NK细胞还要被活化、增殖。
最近，Strominger组开发了大量获得NK细胞的方法，即对细胞表面几乎不表达MHC-I的人B细胞株721.221进行放射线照射，使其成为丧失***能力的状态，然后将其与PBMC一起混合培养5～6天，从中精制NK细胞，再继续培养，可大量获得NK细胞。利用该方法从骨髓瘤患者获得的NK细胞可以杀死不表达MHC-I的患者自己骨髓瘤细胞(Porgador，A.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，94，pp.，13140-13145，1997)。另外该方法虽然在使NK细胞增殖上很简便，但作为NK细胞的靶细胞使用的721.221细胞株与K562细胞一样实际上虽然少但有MHC-I表达(Hay，R.，American Type CultureCollection，personal communication)，所以与K562细胞相比，对使NK细胞增殖并不是特别有效。
另一方面，人NK细胞的细胞杀伤活性测定采用以下的标准方法，即以K562细胞作为靶细胞，预先使它以无机盐形式摄入放射性51Cr，用放射线测定仪测定K562细胞死掉时游离到细胞外的51Cr的量。由于即使大量加入杀伤靶细胞的细胞(即效应细胞)，但因为51Cr只从被杀死的K562细胞游离，所以该方法是灵敏度高、特异性强的方法。但也存在着避免不掉的处理放射性物质带来的危险的缺点。
对此，作为细胞杀伤性T淋巴细胞(以下有时称之为“CTL”)的活性测定方法，本发明人提出了以粘附性细胞作为靶细胞的结晶紫染色法(以下有时也称之为“CV法”)(Liu，S.Q.，et al.，Nature Medicine1，pp.267-271，1995)。该方法由于将靶细胞与效应细胞混合培养后，将细胞彼此分离，对存活下来的靶细胞用结晶紫染色，然后用比色法进行定量，所以不需要放射性物质，非常安全。
然而由于K562是悬浮性细胞，一旦与同样是悬浮性细胞的效应细胞混合，只分离靶细胞非常困难，所以在人NK细胞的活性测定中存在着CV法不适用的问题。如果利用具有象K562细胞对NK细胞那样高的灵敏度，而且有粘附性的靶细胞，适宜用CV法，但这样的报道到目前为止还未见到。
发明内容
本发明的课题在于提供比以往知道的方法效率更高的NK细胞增殖法。更具体来说，本发明的课题在于提供与以往方法相比，效率在2倍以上，并可从PBMC有选择地使NK细胞增殖，获得保持高的细胞杀伤活性状态的NK细胞的方法。另外本发明课题也提供通过具有上述特点的方法所生产的人NK细胞、以及与以往方法相比安全性更高的人NK细胞的细胞杀伤活性测定方法。
本发明人为了解决上述课题不懈努力，结果发现在作为NK细胞的靶细胞的细胞群中，从许多的人培养细胞株群中筛选出在细胞培养中即使添加作为MHC-I表达诱导剂的干扰素γ(以下有时称之为“IFNg”)，MHC-I分子表达也没有增加的细胞株，在使用这样细胞株中的特定细胞株时，可以获得比K562细胞株更高的NK细胞增殖效果。本发明正是根据该发现完成的。
就是说，本发明提供包括对外周血单核细胞和人Wilms肿瘤细胞株HFWT进行混合培养工序在内的使人自然杀伤细胞增殖的方法。按照本发明的优选方案，可以提供使用从人个体、优选肿瘤患者分离出的外周血单核细胞，使该个体自身的自然杀伤细胞增殖的上述方法；使用预先丧失增殖能力的人Wilms肿瘤细胞HFWT的上述方法；以及在白细胞介素-2存在下进行培养的上述方法。
例如，按照本发明的方法，通过将从肿瘤患者外周血分离的外周血单核细胞与人Wilms肿瘤细胞株HFWT一起培养，可以在保持原有高的细胞杀伤活性的基础上使患者本人的NK细胞大量增殖。另外，本发明还提供包含使用通过这些方法制备的人自然杀伤细胞，以及用从肿瘤患者分离的外周血单核细胞，按照上述方法增殖的该肿瘤患者自身的自然杀伤细胞在内的用于该肿瘤患者的肿瘤治疗剂。
从另外的观点来说，本发明提供人自然杀伤细胞的细胞杀伤活性的测定方法，即包括对外周血单核细胞和人Wilms肿瘤细胞株HFWT进行混合培养，对培养后存活下来的靶细胞进行染色的工序在内的方法，如果按照该方法的优选方案，可以提供在染色中使用结晶紫的上述方法。按照这些方法可以不使用放射性物质，准确而简便地测定人NK细胞的细胞杀伤活性。
附图的简单说明
图1表示按照本发明的方法使用健康人1(40岁、女)的PBMC有选择地培养NK细胞的结果。
图2表示按照本发明的方法使用健康人2(27岁、男)的PBMC有选择地培养NK细胞的结果。
图3表示使用在例1的实验3中得到的培养淋巴细胞群，进行细胞杀伤试验的结果。
图4表示在有选择性培养NK细胞过程中添加白细胞介素的效果。图中ILs表示在培养中使用4种白细胞介素时的结果，IL-2表示只添加白细胞介素-2时的结果。
图5是作为在有选择培养NK细胞过程中添加白细胞介素的效果，表示包括从健康人2和3得到的NK细胞的淋巴细胞群的细胞杀伤活性的图。
图6表示使用肿瘤患者的PBMC按照本发明的方法有选择地使NK细胞增殖培养的结果。
图7表示使用肿瘤患者的PBMC，以K562细胞或HFWT细胞作为靶细胞进行增殖培养时进行细胞杀伤试验的结果。
实施发明的最佳方案
本发明的方法是使人NK细胞增殖时，其特征为以人的Wilms肿瘤细胞株HFWT作为靶细胞与人PBMC进行混合培养。按照本发明的方法有选择地使PBMC中的NK细胞增殖成为可能。人的Wilms肿瘤细胞株HFWT以细胞编号RCB0665寄存在理化研究所(日本国埼玉县和光市广泽2番1号)的细胞开发银行(日本国筑波市高野台三丁目1番1号)，通过申请可以获得。
在本发明的方法中，培养方法并没有特别限定，但通常可以按照下述方法进行培养。在通常的动物细胞培养用培养基中添加血清或血浆和支持淋巴细胞增殖的增殖因子，加入从人外周血分离的PBMC，将该培养物添加到HFWT细胞后进行培养。添加到培养基中的血清或血浆的种类没有特别限定，可以使用来自市售的各种动物的产品，来自人时优选AB血型的，更优选来自采集PBMC的本人的。浓度为1至30体积％左右。另外也可以使用能支持淋巴细胞增殖的无血清状态培养基。
理想的增殖因子是白细胞介素-2(IL-2)，也可以使用从PBMC中使淋巴细胞增殖那样的细胞因子组合，或刺激淋巴细胞增殖的植物凝集素类，或使用由从另一人个体(与采取PBMC的对象者不同的个体)采取的PBMC实施增殖能力丧失处理后的产物代替增殖因子。使增殖能力丧失的方法没有特别限定，可以使用放射线照射或丝列霉素C处理等同行都知道的方法。优选添加的IL-2的浓度为10～2,000国际单位/ml。
PBMC与HFWT细胞的比例没有特别限定，做到10∶1左右最好。作为靶细胞的HFWT细胞由于是粘附性细胞，一般来说优选使用保持原有粘附状态、实施丧失增殖能力处理后的细胞。另外也可以将上述的细胞从粘附状态物理性的剥落等成为悬浮状态使用。而如果NK细胞活化后处于旺盛增殖的状态，由于作为靶细胞的HFWT细胞被NK细胞迅速杀死，这种状态下使用靶细胞时，没有必要事先使其增殖能力丧失。PBMC的培养时没有特别限定，优选培养5天以上。虽然NK细胞一直维持着高活性状态进行增殖，在NK细胞直至自然丧失增殖能力之前期间可继续培养。
本发明提供人自然杀伤细胞的细胞杀伤活性的测定方法，其特征是：将人Wilm’s肿瘤细胞株HFWT和人自然杀伤细胞进行混合培养，然后对培养后存活下来的靶细胞进行染色。该方法一般根据知道的方法(Liu，S.Q.，et al.，Nature Medicine 1，pp.267-271，1995)实施，可以将NK细胞作为效应细胞，将HFWT细胞作为靶细胞。染色时优选使用结晶紫。由于HFWT细胞是粘附性细胞，所以如果按照本发明的方法可以不使用放射性物质而准确且简便地测定人NK细胞的活性。
实施例
以下通过实施例对本发明进行更具体地说明，但本发明的范围并不限定于下述的实施例。以下实施例用的细胞株是对寄存在理化研究所细胞开发银行的人肿瘤细胞株209株进行筛选，其中慢性骨髓白血病细胞株K562(细胞编号RCB0027)、Wilms肿瘤细胞株HFWT(细胞编号RCB0665)、骨髓瘤细胞株HMV-I1(细胞编号RCB0777)、几乎不表达MHC-I分子(但可确认后两者有与K562细胞同种程度的微量的MHC-I的表达)，这些细胞在通过同行都知道的流式细胞测量法确认在培养过程中即使实施24小时添加IFNg处理，MHC-I表达完全没有增强的基础上使用。
已知在K562细胞内存在许多变异体，原始株(Lozzio，C.B.andLozzio，B.B.，Blood，45，pp.321-334，1975)通过IFNg处理可诱导MHC-I表达。而且本实施例使用的K562细胞是从原始株变异来的，即便通过IFNg处理，原来MHC-I极低表达状态也没有变化。而Higashino细胞是从经病理诊断确定为脑肿瘤的组织由理化研究所传代培养的细胞，它是在通常培养下平时就强烈表达MHC-I和MHC-II的细胞。该细胞用作与几乎不表达MHC-I的细胞株的比较对照。
例1：健康人的NK细胞的选择培养
研究将HFWT细胞作为靶细胞时，是否可有选择地使健康人PBMC中的NK细胞增殖。
<方法>
1.靶细胞的培养
将1×105个靶细胞接种到24孔板的各个孔中。作为靶细胞可以使用Higashino、HFWT、K562、HMV-II，作为培养基使用添加了10％胎牛血清的Ham F12培养基。将这些细胞培养过夜后，照射50Gy的X光线，用PBS(-)洗涤3次，作为靶细胞用。
2.PBMC的制备
按照同行人都知道的方法(Kawai，K.，et al.，Cancer Immunol.Immunother.35，pp.225-229，1992)从健康人的30ml外周血分离PBMC。而此时采集的血浆用PBS(-)稀释成2倍后，在以下的培养中使用。使用浓度在2倍稀释状态下，体积比为10％(即血浆5％)。
3.PBMC的培养
将悬浮于每一孔添加2ml血浆的RHAMα培养基(Kawai，K.，etal.，Cancer Immunol.Immunother.35，pp.225-229，1992)的1×106个PBMC接种在靶细胞上。向培养基中添加IL-1(终浓度167国际单位/ml，以下同样表示终浓度)、IL-2(67国际单位/ml)、IL-4(67国际单位/ml)、IL-6(134国际单位/ml)。然后将其于37℃的二氧化碳气体培养箱中进行培养。
4.流式细胞
用同行都知道的方法，用分别与细胞表面抗原特异结合的单克隆抗体对培养的悬浮细胞群进行荧光染色，通过FACS(ベクトンデイツキンンン公司生产)进行解析。这里使用的单克隆抗体中，抗CD3抗体用于识别T细胞，抗CD56抗体用于识别NK细胞。
5.细胞数的计算
细胞数是使用タタイ式血球计数板计测的。
6.细胞杀伤活性的测定
根据已经报道的方法(Liu，S.Q.，et al.，Nature Medicine1，pp.267-271，1995)，通过CV法测定培养的淋巴细胞的杀伤活性。在本实施例中，使在向活的靶细胞中添加淋巴细胞前的靶细胞染色后的吸光度为100％。因此在经24小时温育后，在作为对照的只有靶细胞的孔(效应细胞与靶细胞的比(以下为E/T比)为0的孔)中，由于靶细胞增殖，所以细胞杀伤活性超过100％，这表明本实验中靶细胞本身是正常的。
<结果>
表1的实验1和实验2以及图1给出了使用健康人1(40岁、女)的PBMC得到的结果，表1的实验3以及图2给出了从健康人2(27岁、男)得到的结果。
表1
| 靶细胞 | 表面抗原不同的细胞的比例(％) | |
| CD3+CD56- | CD3-DD56+ | |
| 实验1(培养13天)无HigashinoHFWTK562 | 58.296.019.847.8 | 5.40.254.617.6 |
| 实验2(培养14天)无HigashinoHFWTHMV-II | 60.984.87.355.0 | 13.05.475.918.9 |
| 实验3(培养13天)无HigashinoHFWT | 74.495.112.4 | 7.21.764.6 |
本实施例中使用的4种IL组合，适用于诱导培养具有同时识别杀伤MHC-I分子和抗原肽这样性质的CTL(Liu，S.Q.，et al.，CancerImmunol Immunotherapy，39，pp.279-285，1994)。健康人的PBMC通常含有8～25％的NK细胞，就象表1所表示的那样，用CD3+CD56-表示的T细胞在以Higashino细胞作为靶细胞时虽然可达到96％，但用CD3-CD56+表示的NK细胞在使用了健康人1的PBMC的实验1中几乎消失了，而实验2也只变为5.4％了。另外在以表面上几乎没有MHC-I分子的HFWT细胞作为靶细胞时，T细胞的比例反而大幅度下降，NK细胞的比例可上升到54.6％。这一比例也明显比以同样表面上几乎没有MHC-I分子的K562细胞作为靶细胞时的结果(17.6％)高。即使在实验2也没有改变这一倾向，NK细胞的比例在以HFWT细胞为靶细胞时达到75.9％，也比同样表面上几乎没有MHC-I分子的HMV-II细胞作为靶细胞时(18.9％)明显地高。
就刚从健康人2的外周血制备的PBMC来看，CD3+CD56-的T细胞为55.4％，而CD3-CD56+的NK细胞为13.2％。如表1的实验3所示，培养13天后，以Higashino细胞作靶细胞时，T细胞占95.1％，几乎无NK细胞；相反，以HFWT细胞作靶细胞时，NK细胞增加到64.6％。而且，如图1所示，来自健康人1的PBMC的细胞增殖在以Higashino细胞和HFWT细胞作为靶细胞时明显比以HMV-II细胞作为靶细胞时以及没有靶细胞时高。而健康人2的情形(图2)是：来自PBMC的细胞以HFWT细胞作为靶细胞比以Higa shino细胞作为靶细胞时能更有效地增殖。
另外图3给出了使用在实验3中得到的培养淋巴细胞群进行细胞杀伤实验的结果。以Higashino细胞作为靶细胞得到的培养淋巴细胞群由于是将4种IL组合后进行培养，预料会变成CTL，实际上该淋巴细胞群能极有效地杀死在进行细胞杀伤活性测定时作为靶细胞存活下来的Higashino细胞。即便在E/T为0时(即只有靶细胞时)，24小时内靶细胞增殖到147％的条件下，E/T为2时存活下来的靶细胞为47.6％。E/T为8时存活下来的靶细胞却仅有7.5％。此时E/T比例越低存活下来的靶细胞的比例就会变得越高，可以看出明显的用量依赖关系。但是，当细胞杀伤活性测定时的靶细胞是活的HFWT细胞时，以Higashino细胞为靶细胞得到的淋巴细胞群没有将HFWT细胞全部杀死，表明这样得到的培养淋巴细胞群是典型的CTL。
另一方面，以HFWT细胞作为靶细胞得到的培养淋巴细胞群能极有效地杀死活的HFWT细胞。E/T为2时存活下来的靶细胞为18.5％。而E/T为8时存活下来的靶细胞下降到-9.2％(负值是测定误差所至)。此时E/T比例越低存活下来的靶细胞的比例就会变得越高，可以看出明显的用量依赖关系。因此通过以细胞杀伤活性测定时存活下来的HFWT细胞作为靶细胞可以准确地测定NK细胞的细胞杀伤活性。
另外，在该培养淋巴细胞群中含有12.4％的T细胞，明显低于活的HFWT细胞，但由于也杀Higashino细胞，所以可推定其中不只是含有NK细胞，而且也含有一些CTL。E/T为2时存活下来的靶细胞为60.5％，而E/T为8时存活下来的靶细胞变成了21.8％。因此，由这些实验表明，如果以HFWT细胞作为靶细胞，可以从PBMC中选择性地、而且有效地使保持高的细胞杀伤活性的NK细胞增殖。
例2：有选择培养NK细胞时所必需的白细胞介素
例1显示，将丧失增殖能力的HFWT细胞作为靶细胞，可以从健康人的PBMC有选择地增殖培养NK细胞，在培养中使用了4种IL。在本例子中使用了只添加对淋巴细胞来说最低限度需要的IL-2的培养基，以HFWT细胞作为靶细胞对NK细胞进行有选择地培养。方法除了添加到培养基中的IL的种类改变之外其它与例1完全一样。但是只添加IL-2时的浓度为500国际单位/ml。另外，在研究用流式细胞法培养的细胞群时，为了识别NK细胞，除了抗CD56抗体外也使用了抗CD16抗体。
如图4所示，对取自健康人1、健康人2和健康人3(56岁，男)的全部的PBMC都以HFWT细胞作为靶细胞进行培养时，无论是添加4种IL，还是只添加IL-2，增殖大致相同。如图4(C)所示，取自健康人3的PBMC不使用靶细胞，而且在只添加IL-2的培养中，细胞增殖变得很慢。
健康人1的PBMC，用当初只有8.0％的CD3-CD56+表示的NK细胞比例，在培养14天后追加靶细胞进行再刺激时，即使作为IL只添加IL-2培养，在培养17天后也达到了77.3％。没有进行这样的再刺激的健康人2的PBMC的场合，在培养13天后，即使在只添加IL-2的培养中，用CD3-CD56+表示的NK细胞比例也达到90.7％，而用CD16+表示的NK细胞比例为79.1％，用CD16+CD56+表示的NK细胞比例为78.2％。即使是健康人3，这样的倾向也没有变，在培养13天后，即使在只添加IL-2的培养中，用CD3-CD56+表示的NK细胞比例也达到74.9％，而用CD16+表示的NK细胞比例为76.5％，用CD16+CD56+表示的NK细胞比例达到75.7％。
图5给出了从健康人2和3得到的几乎都变成了NK细胞的淋巴细胞群的细胞杀伤活性的结果。此时存活下来的靶细胞是HFWT。无论是健康人2还是健康人3的场合都得到了活性非常高的NK细胞，在以HFWT细胞作为靶细胞有选择地对PBMC中的NK细胞进行培养时添加的IL只用IL-2就可以，可以有选择地高效地使保持原有高细胞杀伤活性的NK细胞增殖。
例3：从肿瘤患者的PBMC中有选择地对NK细胞进行增殖培养
在例1和例2中使用了健康人的PBMC，而在本例子中使用肿瘤患者的PBMC，研究能否有选择地对NK细胞进行增殖培养。实验按照例1方式进行，但作为培养PBMC时的靶细胞使用HFWT细胞或K562细胞，作为IL只添加IL-2，，浓度为500国际单位/ml。研究用流式细胞法培养的细胞群时，为了识别NK细胞，除了使用抗CD56抗体外，还追加使用了抗CD16抗体。患者(51岁、男)为诊断为gliosarcoma的脑肿瘤患者，是采集了在例1和例2中使用的Higashino细胞的本人。
图6给出了结果。来自PBMC的淋巴细胞的增殖用HFWT细胞作为靶细胞比K562细胞好。从1×106个细胞开始，累计增殖的淋巴细胞数的最高值在以K562细胞作为靶细胞时为3.05×107个，而以HFWT细胞作为靶细胞时达到15.6×107个。表2给出了来自PBMC的细胞群的组成。
表2
| 靶细胞 | 表面抗原不同的细胞的比例(％) | ||
| CD3+CD56- | CD3-CD56+ | CD16+CD56+ | |
| 培养13天HFWTK562 | 0.41.9 | 83.881.5 | 54.751.7 |
无论是在以K562细胞为靶细胞进行增殖培养，还是以HFWT细胞作为靶细胞增殖培养的任一场合，用CD3-CD56+表示的NK细胞比例在82％左右，而用CD16+CD56+表示的NK细胞比例在53％左右，两种场合几乎一样。得到的淋巴细胞群的细胞杀伤活性在以活的HFWT细胞作为靶细胞进行测定时，结果无论是以K562细胞还是以HFWT细胞作为靶细胞增殖培养的淋巴细胞群都有非常强的细胞杀伤活性(图7)。
产业上利用可能性
与以往方法相比通过本发明可以更有效地对人NK细胞进行增殖培养，可很容易地得到大量的NK细胞。以肿瘤患者的PBMC作为材料通过本发明得到的NK细胞，由于不存在排斥反应等问题可以返回到该患者本人的体内，适用于肿瘤治疗和感染症治疗。
Claims (6)
1.一种人的自然杀伤细胞的增殖方法，其特征在于，包括将人外周血单核细胞和人Wilms肿瘤细胞株HFWT进行混合培养的工序。
2.权利要求1记载的方法，其中，人个体是肿瘤患者。
3.权利要求1～2中任一项记载的方法，其中，使用预先已丧失增殖能力的人的Wilms肿瘤细胞株HFWT。
4.权利要求1～2中任一项记载的方法，其中，是在有白细胞介素-2存在下进行培养的。
5.一种方法，是人自然杀伤细胞的细胞杀伤活性的测定方法，其特征在于，包括将人的Wilms肿瘤细胞株HFWT与人的自然杀伤细胞进行混合培养，对培养后存活的靶细胞进行染色的工序。
6.权利要求5记载的方法，其中，在染色中使用结晶紫。
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Granted publication date: 20060118 Termination date: 20131116 |