CN102719432B - 特异性抑制肿瘤凋亡抑制基因Bcl2的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA及其应用 - Google Patents
特异性抑制肿瘤凋亡抑制基因Bcl2的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药领域,公开了特异性抑制肿瘤凋亡抑制基因Bcl2的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA及其应用。所述的asiRNA是通过如下方法设计,并经化学合成得到的:从Bcl2基因对称性小核酸干扰分子siRNA出发,通过将siRNA正义链或反义链5’或3’端裁减1-5nt碱基,并于每条链3’端用两个脱氧核糖核酸dTdT突出的核苷酸,形成两条链碱基长度不一致,每条链3’端有两个脱氧核糖核酸dTdT呈单链悬挂,能诱发RNA干扰的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA。本发明asiRNA较之常规的siRNA更加稳定,抑制Bcl2表达的活性更强,可在制备抗肿瘤药物中应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及特异性抑制肿瘤凋亡抑制基因Bcl2的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA及其应用。
背景技术
癌症是人类健康的第二大杀手,目前临床上使用化疗药物过程中经常出现抗药性,癌细胞往往杀不死,肿瘤经常复发转移而导致死亡。其中很重要的原因之一是这部分癌细胞中的凋亡抑制基因(Bcl2基因)高表达,使肿瘤细胞抗凋亡而不死亡,从而常出现肿瘤复发转移。因此抑制肿瘤Bcl2基因表达的作用是提高化疗药物疗效、彻底杀死癌细胞和防止肿瘤复发转移的重要途径之一。国外已经有采用反义寡核苷酸技术抑制肿瘤Bcl2基因的创新药物(G3139)进入三期临床研究,但是对慢性淋巴细胞白血病和黑色素瘤的三期临床研究结果不理想而没有得到美国FDA的批准,对食道癌、多发性骨髓瘤、***癌、小细胞肺癌、乳腺癌、肠癌的三期临床研究还在进行中,这可以证明对Bcl2基因的作用靶点没有问题,只是反义寡核苷酸技术敏感性可能低于小核酸干扰技术药物,疗效仍需要提高。而一般文献报道认为小核酸干扰技术药物比反义寡核苷酸技术敏感性要高10-1000倍,毒副作用却明显减小,因此国际上已经出现用小核酸干扰技术药物取代反义寡核苷酸技术药物的趋势。
目前小核酸干扰技术(RNAi)是生物科技和创新药物研究中最热门的领域之一,它已经吸引了许多大型制药公司的投资。2006年赢得诺贝尔医学奖的科学成果就是以小核酸干扰技术为基础的。科学界普遍认为,通过利用小核酸干扰技术,有可能产生出前景不错的治疗药物,用于治疗癌症这类采用通常技术难以提高疗效的疾病。目前国际上已有12个对称性小核酸干扰siRNA药物进入一到三期临床试验,但是绝大部分是外用和局部给药,只有二项是全身静脉给药,其中靶向肿瘤相关基因核糖核苷酸还原酶M2亚基的CALAA-01对称小核酸干扰药物和抑制肝癌相关基因的ALN-VSP,已被FDA批准进入肿瘤静脉给药的I期临床试验。总体来说,对称小核酸干扰siRNA药物在稳定性和静脉给药技术的递药***上也还存在部分技术瓶颈性问题。而不对称小核酸干扰研究起步更晚,2008年12月,Sun et al在NATUREBIOTECHNOLOGY上最早提出了新一代不对称RNA干扰技术。而采用化学合成修饰的不对称小核酸干扰药物asiRNA,设计简便、作用迅速、效果明显,稳定性好,活性更稳定,毒副作用更小,更容易进入肿瘤细胞达到靶向抑制作用,因此应用前景更好。经CCK8法、qRT-PCR法、流式细胞仪检测、细胞毒性检测、生长曲线测定、荷瘤小鼠药效学和生存率实验、靶向肿瘤分布实验等,这种asiRNA抑制Bcl2表达的作用更明显,并明显抑制肿瘤生长,延长荷瘤小鼠生存期。与以往药物和siRNA比较,asiRNA是一种作用机理新颖、高效快速、特异稳定、靶向性好、副作用小新的抗肿瘤药物分子。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足,提供特异性抑制肿瘤凋亡抑制基因Bcl2的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA。
本发明的另一目的是提供该asiRNA的应用。
特异性抑制肿瘤凋亡抑制基因Bcl2的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA,所述的asiRNA是通过如下方法设计,并经化学合成得到的:从Bcl2基因对称性小核酸干扰分子siRNA出发,通过将siRNA正义链或反义链5’或3’端裁减1-5nt碱基,并于每条链3’端用两个脱氧核糖核酸dTdT突出的核苷酸,形成两条链碱基长度不一致,每条链3’端有两个脱氧核糖核酸dTdT呈单链悬挂,具有14-21nt的能诱发RNA干扰的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA。
所述的asiRNA优选自下列七种asiRNA的其中一种或几种:
A:5’GG AGG CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’
3’dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’;
B:5’CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’
3’dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’;
C:5’G CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’
3’dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’;
D:5’GG CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’
3’dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’;
E:5’AGG CUG GGAUGC CUU U dTdT 3’
3’dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’;
F:5’G AGG CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’
3’dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’;
G:5’CGGAGG CUG GGAUGC CUU U dTdT 3’
3’dTdT C UCC GAC CCU ACG GAA A 5’;
进一步优选F:5’G AGG CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’
3’dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’。
或者,所述的特异性抑制肿瘤凋亡抑制基因Bcl2的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA优选通过如下方法设计,并经化学合成得到的:从Bcl2基因对称性小核酸干扰分子siRNA出发,通过将siRNA正义链或反义链5’或3’端裁减1-5nt碱基,于每条链3’端用两个脱氧核糖核酸dTdT替代3’端突出的核苷酸,并采用胆固醇、硫代、甲基化、磷酸化、氟代对正义链或/和反义链进行化学修饰,形成两条链的碱基长度不一致,每条链3’端有两个脱氧核糖核酸dTdT呈单链悬挂,具有14-21nt的能诱发RNA干扰的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA。
所述的特异性抑制肿瘤凋亡抑制基因Bcl2的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA进一步优选下列九种asiRNA的其中一种或几种:
H:5’chol-GAGGCUGGGAUGCCUUUdTdT 3’
3’dTdTGCCUCCGACCCUACGGAAA 5’;
I:5’chol-G-s-A-s-G-s-GCUGGGAUGC-s-C-s-(FU)-s-(FU)-s-(FU)dTdT 3’
3’dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’;
J:5’chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(FU)(FU)(FU)dT-s-dT 3’
3’dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’;
K:5’chol-GAGGC(FU)GGGA(FU)GCC(FU)(FU)(FU)dT-s-dT 3’
3’dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’;
L:5’chol-G-s-A-s-GGCUGGGAUGCC(FU)(FU)(FU)dT-s-dT 3’
3’dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’;
M:5’chol-G-s-A-s-GGC(FU)GGGA(FU)GCC(FU)(FU)(FU)dT-s-dT 3’
3’dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’;
N:5’chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(mU)(mU)(mU)dT-s-dT 3’
3’dT-s-dT G-s-C-s-C-s-(mU)-s-C-s-CGACCCUACGGAAA-P 5’;
O:5’chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(mU)(mU)(mU)dT-s-dT 3’
3’dT-s-dTGCC(mU)CCGACCC(mU)ACGGA(mA)A 5’;
P:5’chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(mU)(mU)(mU)dT-s-dT 3’
3’dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’;
更进一步优选:
J:5’chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(FU)(FU)(FU)dT-s-dT 3’
3’dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’;
或P:5’chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(mU)(mU)(mU)dT-s-dT 3’
3’dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’;
其中,chol为胆固醇修饰、s为硫代修饰、m为甲基化修饰、P为磷酸化修饰、F为氟代修饰。
所述的特异性抑制肿瘤凋亡抑制基因Bcl2的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA在制备抗肿瘤药物中的应用。
有益效果:本发明提供的从siRNA设计裁减碱基和用化学合成法合成正义链与反义链长度不一致的能诱发RNA干扰的不对称小核酸干扰asiRNA,并采用胆固醇、或/和硫代、或/和甲基化、或/和磷酸化、或/和氟代碱基化学修饰正义链或/和反义链的碱基,使不同结构的asiRNA较之对称的siRNA更加稳定,抑制Bcl2表达的活性更强,毒副作用更小,更容易进入肿瘤细胞达到靶向抑制作用。本发明asiRNA可以用于全身静脉给药,制备成稳定、有效、低毒的抑制肿瘤Bcl2基因表达的不对称小核酸干扰基因治疗药物。
附图说明
图1:转染不同siRNA和asiRNA后,qRT-PCR检测HeLaB2细胞中Bcl-2mRNA的相对表达量。其中:control为转染不相关siRNA的阴性对照,15/21-19/21,为正义链缩短的不对称siRNA,分别对应表1中的B-F;21/21为常规对称siRNA。
图2:流式细胞仪检测不同Bcl2-asiRNA对HelaB2细胞中的Bcl2蛋白的抑制效率。其中15/21-19/21对应的样品同图1。21/19为反义链缩短的不对称asiRNA,对应表1中G。
图3:CCK8检测不同Bcl2-asiRNA对HelaB2细胞增殖抑制效率。各组代表的样品同图1。
图4:CCK8检测Bcl2-asiRNA(19/21)和常规siRNA(21/21)对HelaB2细胞毒性影响,其中Bcl2-asiRNA(19/21)对应表1中的F,siRNA及asiRNA的浓度分别为0.33nM,3.3mM,33nM和330nM,以药物浓度对细胞活性作图。
图5:Bcl2-asiRNA(表1中F)及siRNA(21/21)与顺铂联合使用对HelaB2细胞体外抑制作用。其中各组如下:1:Lipo 2000转染19/21asiRNA组;2:Lipo 2000转染21/21siRNA组;3:Lipo2000转染19/21asiRNA+低剂量顺铂(1微克)组;4:Lipo 2000转染21/21siRNA+低剂量顺铂组;5:低剂量顺铂(1微克)单独组;6:增倍剂量顺铂(2微克)组。
图6:Bcl2-asiRNA和siRNA对化疗药物顺铂耐药的HelaB2细胞生长的影响,HelaB2组未不进行任何转染的对照,Control组为转染不相关siRNA的阴性对照,19/21为正义链19bp的asiRNA(表1中的F),21/21为常规对称siRNA。纵坐标为顺铂耐药HelaB2细胞的个数。
图7:流式细胞仪检测不同修饰的Bcl2-asiRNA对HelaB2细胞中的Bcl2蛋白的抑制效率。其中Control为转染不相关siRNA的阴性对照;19M0/21-19M6/21M2分别代表对正义链19bp的asiRNA进行不同方式的修饰,具体修饰方式对应表1中的H-P。
图8:静脉注射修饰的Bcl2-asiRNA(19M2/21,表1中的J)对荷H22肝癌小鼠肿瘤体积的抑制曲线。其中:NS为尾静脉注射生理盐水的空白对照组;CTX为腹腔注射30mg/kg CTX的阳性对照组;脂质体空白为尾静脉注射单独脂质体递送***的阴性对照;脂质体-Bcl2-asiRNA-M2为将经过修饰的Bcl2-asiRNA经脂质体递送***包裹后,尾静脉注射后的小鼠肿瘤体积的抑制效果。
图9:静脉注射修饰的Bcl2-asiRNA(19M2/21,表1中的J)对荷H22肝癌小鼠生存率的影响。各组注射情况和样品同图8。
图10:静脉注射修饰的Bcl2-asiRNA(表1中的P)在荷人肝癌裸鼠各器官的分布及靶向肿瘤作用,采用表1中P样品用荧光Cy5标记,在样品注射1h进行活体成像定量观察各器官asiRNA残留量(图10a)并在1h处死动物取出内脏进行活体成像观察(图10b),图10b中从左向右依次为心、肝、脾、肺、肾、肿瘤。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语,除非有另外说明,一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例,并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解,这些实施例只是为了举例说明本发明,而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中,未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物,均在首次出现时标明,其后所用相同引物,均以首次标明的内容相同。
实施例1
本发明利用基因库中寻找靶向肿瘤凋亡抑制基因Bcl2mRNA的1组siRNA(序列为:正义链5’CGGAGGCUGGGAUGCCUUU 3’(SEQ ID NO.1),反义链3’GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’(SEQ ID NO.2))为基础,通过将siRNA正义链或反义链的5’或3’端裁减1个、或2个、或3个、或4个、或5个碱基,形成两条链碱基长度不一致,每条链3’端有两个脱氧核糖核酸dTdT呈单链悬挂,具有14-21nt的能诱发RNA干扰的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA。或者在此基础上并采用胆固醇、或/和硫代、或/和甲基化、或/和磷酸化、或/和氟代碱基化学修饰正义链、或/和反义链的碱基、磷酸骨架、核糖,形成两条链碱基长度不一致,每条链3’端有两个脱氧核糖核酸dTdT呈单链悬挂,具有14-21nt的经化学修饰的能诱发RNA干扰的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA。所设计的asiRNA见表1,并委托广州锐博公司专业合成机构商业合成。
表1、Bcl2-asiRNA的编号、序列、名称、修饰类型
chol为胆固醇修饰、s为硫代修饰、m为甲基化修饰、P为磷酸化修饰、F为氟代修饰。
实施例2
本发明使用LipofectAMINETM2000(Lipo 2000)脂质体(Life Techonolobies,产品货号:11668-019,商标为Inivitrogen)进行转染表1所述B-F部分Bcl2-asiRNA片段,转染后72小时进行沉默效应测定。所有操作都按照说明书进行。将合成的常规的21/21siRNA(序列为正义链5’CGGAGGCUGGGAUGCCUUUdTdT 3’反义链3’dTdTGCCUCCGACCCUACGGAAA 5’,即在SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2两条链的3’端均加上了dTdT呈单链悬挂,与asiRNA的3’端保持一致)作为阳性对照,siRNA和asiRNA粉末用DEPC水溶解,配成20nM的储备溶液。转染操作前一天,用含小牛血清、青霉素、链霉素的DMEM细胞培养基将高表达Bcl2的人***细胞HeLaB2细胞(购于中国医学科学院中国协和大学肿瘤研究所)接种至24孔板中,于37℃,含5%CO2的培养箱进行培养,当细胞的密度达到50%时,弃去原培养基,用不含小牛血清和青霉素、链霉素的DMEM培养基洗一次,并加入500mL不含小牛血清和青霉素、链霉素的DMEM培养基。用50μl不含血清培养基的Opti-MEM稀释20pmol siRNA/asiRNA(加入细胞中的RNA终浓度为33nM),轻轻混匀并室温放置5分钟。用50μl不含血清培养基的Opti-MEM稀释1μl Lipo2000,轻轻混匀并室温放置5分钟。将上述两溶液轻轻混匀,室温孵育20分钟后,把混合液加入到24孔板中,即在将100μl siRNA/asiRNA-Lipo 2000混合液加入含有细胞及培养液的培养板相应孔中,轻轻混匀。此时各培养孔中的溶液总体积达到600μl/孔,加入细胞中的RNA终浓度达到33nM。将培养板置于37℃,含5%CO2的培养箱进行培养。培养4~6小时后,将孔中含有siRNA/asiRNA-Lipo2000混合液的培养基移去,并更换新鲜的含小牛血清、青霉素和链霉素的DMEM培养基500μl,72小时后,每孔用冷的PBS清洗细胞2次。每孔加入500μl Trizol试剂,用枪头反复吹打,使细胞脱离细胞培养板,并充***解,将此细胞裂解后的溶液移入新的1.5ml Eppendorff管中,每2个孔合成一个管中,即每管细胞裂解液的量为1ml。充分涡旋20秒,室温静置5分钟。每管加入200μl(200μl/1ml Trizol)冷的三氯甲烷,充分涡旋20秒,室温静置5分钟。4℃,12,000rpm离心15分钟。离心后的样品共分为三层(上层水相,中间为混合相,下层酚相),用枪头轻轻吸去上层水相至一新的无酶的Eppendorff管,注意不要吸取中间层,以避免蛋白污染。加入与吸取液等体积的异丙醇,并上下颠倒5~1次,温和混匀,放置于-20℃中,静置30分钟。在超速低温离心机中,4℃,12,000rpm离心15分钟。可见有白色沉淀位于管底,去掉上清,加入1ml冷的75%乙醇,用手指轻弹管壁,可见白色沉淀上浮。4℃,12,000rpm离心5分钟,去掉乙醇,37℃烘干。加入DEPC水,约25μl。55℃水浴溶解10分钟。取出2μl,检测RNA浓度和纯度。将所有样品浓度调整至100μg/ml,进行逆转录实验。按照如下配制5μl的反应体系,并且所有操作均在冰上进行:
将样品放入PCR仪中,按程序:37℃(15min)→85℃(5s)进行逆转录。按照Takara公司的SYBR Green Realtime RCR Mster Mix使用说明书进行如下操作:各取逆转录好的cDNA样品1μl,用灭菌去离子水稀释20倍每个样品设三个复孔,按照以下配制20μl反应体系:
将样品依次加入到PCR板(Axygen)相应孔中,贴膜(Axygen)并压紧。按如下程序进行扩增反应:95℃变性15s,52℃退火15s,72℃延伸45s,共40个循环。PCR反应时的引物:基因Bcl2的引物序列为:上游引物F-Primer:5′-GGTCATGTGTGTGGAGAGC-3′(SEQ ID NO.3);下游引物R-Primer:5′-GATCCAGGTGTGCAGGTG-3′(SEQ ID NO.4)。实验中采用Beta-actin为内参基因,该基因的引物序列为:上游引物F-Primer:5′-AGTTGCGTTACACCCTTTC-3′(SEQID NO.5);下游引物R-Primer:5′-CCTTCACCGTTCCAGTTT-3′(SEQ ID NO.6)。设定对照组(control,为转染不相关siRNA)中Bcl2的mRNA的量为100%,其余各组的量与对照组的比值即可反映蛋白的相对表达量,qRT-PCR检测不同Bcl2-asiRNA对HelaB2细胞中的Bcl2mRNA的抑制效率的实验结果见图1。通过图1可见,与对照组相比,各组Bcl2-asiRNA对细胞中的Bcl2mRNA均有一定的抑制效果,其中19/21的抑制效果较siRNA有明显提高。
实施例3
按照实施例2的实验方法进行转染操作,将合成的21/21siRNA作为阳性对照(序列与实施例2相同),转染表1所述的B-G的asiRNA片段,浓度同样为33nM,转染HeLaB2细胞后72小时,弃去原培养液,用PBS洗一次,并用胰酶将细胞消化下来,移入Eppendoff管中,1200rpm离心5分钟,弃去上清。加入1ml PBS,混匀,1200rpm离心5分钟,弃去上清。对细胞进行计数,调整细胞浓度,使每个样品的细胞数为105个。每个样品中加入500μl 4%的多聚甲醛,混匀,室温放置20分钟以对细胞进行固定。1200rpm离心5分钟,弃去多聚甲醛。加入1ml PBS洗一次。加入500μl破膜剂,室温静置15分钟。离心弃去上清,留约80μl液体。加入20μl抗体,4℃,避光孵育30分钟。加入500μl破膜剂洗两次。PBS重悬到300μl。上流式细胞仪检测。本实验每个样品分别做3个重复样品。设定对照组(control,为转染不相关siRNA)中Bcl2的蛋白量为100%,其余各组的量与对照组的比值即可反映蛋白的相对表达量。流式细胞仪检测不同Bcl2-asiRNA对HelaB2细胞中的Bcl2蛋白的抑制效率的试验结果见图2。通过图2可见,相比于对照组,各组Bcl2-asiRNA对细胞中的Bcl2蛋白水平均有一定的抑制效果,其中19/21的抑制效果比siRNA明显提高。
实施例4
HeLaB2肿瘤细胞接种在96孔板上,当细胞密度达到50%时,按照实施例2方法进行转染表1所述的B-F部分的asiRNA和阳性对照21/21siRNA片段(序列与实施例2相同),转染浓度为33nM。72小时后,吸去培养基,按照CCK-8试剂盒说明书,每孔加100μl单独DMEM培养液和10μl CCK-8试剂,置于37℃培养箱中继续培养2小时,并用酶标仪进行OD450的检测。由于细胞数量与OD450的值成正比,所以OD450的值即可以反映细胞的数量。设定转染不相关siRNA的阴性对照组(control)的OD值为100%,其余各组的OD值的相对值即可反映各组细胞中的相对水平。因此CCK8检测不同Bcl2-asiRNA对HelaB2细胞增殖抑制效率结果见图3。由图3可见各组Bcl2-asiRNA对细胞增殖水平均有一定的抑制效果,其中19/21的抑制效果比siRNA明显提高。
实施例5
按照实施例2方法进行转染操作,转染21/21siRNA(序列与实施例2相同)和表1中的F片段转染前一天,将HeLaB2细胞转接至96孔板中,待到细胞密度生长至50%覆盖率时,弃去原培养基,用DMEM培养基洗一次,每孔加入100μl不含小牛血清、青霉素和链霉素的DMEM的养基。用25μl不含血清培养基的Opti-MEM稀释50pmol siRNA/asiRNA(加入细胞中的终浓度为330nM),轻轻混匀并室温放置5分钟。用20μl Opti-MEM稀释5μl Lipo2000,轻轻混匀并室温放置5分钟。将上述两溶液轻轻混匀,并将此混合物分别3个10倍比稀释(此后加入细胞中的终浓度分别为33nM,3.3nM,0.33nM),室温放置20分钟。混合液分别加入到96孔板中,每孔加50μl,轻轻混匀。加入细胞中的终浓度分别为330nM,33nM,3.3nM和0.33nM,每个浓度至少做3个平行孔。将培养板置于37℃,含5%CO2的培养箱进行培养。培养4~6小时后,移去含siRNA/asiRNA-lipo2000混合物的培养基,每孔加入100μl含小牛血清、青霉素链霉素的DMEM培养基。继续培养72小时后,吸去培养基,按照CCK-8试剂盒说明书,每孔加100μl单独DMEM培养液和10μl CCK-8试剂,置于37℃培养箱中继续培养2小时,并用酶标仪进行OD450的检测。按照以下公式进行细胞活力的计算:
其中,As为实验组OD值(含细胞、siRNA/asiRNA),Ab为空白组的OD值(不含细胞和siRNA/asiRNA),Ac为不经过转染的对照组的OD值(含细胞,不含siRNA/asiRNA),最终求出细胞活力为50%时的药物浓度,即为IC50。Bcl2-siRNA的IC50值为(69.59±4.53)nM,Bcl2-/asiRNA中的19/21(表1中F)对HeLaB2细胞的IC50值为(55.11±2.41)nM。CCK8检测Bcl2-asiRNA和siRNA对HelaB2细胞毒性影响的试验结果见图4。由图4可见,在浓度很低及很高的情况下,Bcl2的asiRNA和siRNA对HelaB2细胞毒性基本没有差异,而当浓度在0.3nM到30nM之间时,Bcl2的asiRNA对细胞的毒性小于siRNA。
实施例6
本实施例进一步验证表1的F序列的一种asiRNA能否与化疗药物联合使用提高疗效。按照实施例2方法进行转染操作,Bcl2-asiRNA采用表1的F序列,21/21siRNA(序列与实施例2相同)。实验分为以下几组:1:Lipo 2000转染19/21asiRNA组;2:Lipo 2000转染21/21siRNA组;3:Lipo 2000转染19/21asiRNA+低剂量顺铂(1微克)组;4:Lipo 2000转染21/21siRNA+低剂量顺铂组;5:低剂量顺铂(1微克)单独组;6:增倍剂量顺铂(2微克)组;7、空白对照组。转染前一天将处于对数生长期的HelaB2细胞接种至96孔板,待到细胞密度生长至50%覆盖率时,组1-4均按实施例2中所述方法用Lipo 2000进行转染,组5、6仅进行接种后不进行转染。转染24h后,组3、4、5分别加入1微克顺铂,组6加入2微克顺铂。转染72h后,按实施例4中所述方法进行CCK-8检测。设定空白对照组OD值为100%,其余各组的OD值的相对值即可反映各组细胞的相对抑制水平。Bcl2-asiRNA及Bcl2-siRNA与顺铂联合使用对HelaB2细胞体外抑制作用实验结果见图5。由图5可见Bcl2-asiRNA单独使用及与顺铂联用时抑制效率均比Bcl2-siRNA升高;asiRNA与低剂量顺铂联合组的抑制效率与单独顺铂两倍剂量组差不多。证明该序列asiRNA能在体外同化疗药物顺铂联合使用提高对癌细胞的抑制效率并降低化疗药物的剂量。
实施例7
本实施例进一步验证表1的F序列的一种asiRNA能否对化疗药物已经耐药后的癌细胞起抑制效果。按实施例2和下面的方案进行siRNA(21/21)(序列同实施例2相同)和asiRNA(19/21,表1中的F)的连续多次细胞转染,分别将1×105/ml对数生长期顺铂耐药的HeLaB2/DDP单细胞悬液接种至24孔培养板中,在37℃,5%CO2细胞培养箱中培养,实验分组为HeLaB2/DDP不加处理组、转染Bcl2-/asiRNA组、转染siRNA组。各组细胞分别在铺板后的第4、11、15、26天重新铺24孔板,分别在1、7、13、21、27天进行转染,使用Lipo 2000脂质体每次待细胞长到汇合率为30%-40%时进行转染,吸去培养液,用不含青霉素、链霉素和小牛血清的DMEM培养基洗1次,然后进行转染,在转染前,加入无血清和青霉素、链霉素的DMEM培养基400μl/孔。把广州锐博生物科技有限公司合成的siRNA(21/21)和asiRNA(19/21),20nmol/支(冻干粉),以1ml无RNA酶的纯水溶解,溶液中双链RNA的浓度即为20μM。接下来取20μM双链RNA 0.5μl,加入50μl Opti-MEM混合稀释,室温无菌条件下放置5分钟。另一eppendorf管中加入0.5μl Lipo 2000,用50μl Opti-MEM混合稀释,室温无菌条件下放置5分钟。两eppendorf管合并混合后室温无菌条件下放置20分钟。待溶液稍变稠后移入24孔板中,即每孔再加入101μl Lipo 2000-双链RNA的复合物,这样每孔中的转染液体总量约为500μl。37℃,5%CO2下培养4小时,吸出Lipo 2000-双链RNA的复合物,每孔再加入含有10%小牛血清的DMEM培养基500μl继续培养。37℃5%CO2下培养48小时。每次转染24小时后,将细胞培养基换成含顺铂的细胞培养基,每次作用2-4天,顺铂浓度逐次增加,依次为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg/ml,于第30天撤出顺铂压力。分别于第4、11、15、26、30、35天进行细胞计数,绘制生长曲线。表1中的F的Bcl2-asiRNA和siRNA对化疗药物顺铂耐药的HelaB2细胞生长的影响试验结果见图6。由图6可见化疗药物顺铂已经耐药后,Bcl2的asiRNA及siRNA仍可以抑制顺铂耐药的HelaB2细胞的生长,并且在作用第35天,asiRNA的抑制效果比siRNA更明显,两者有统计学差异(p<0.05),说明本发明asiRNA对Bcl2的抑制更具长效性。
实施例8
本实施例进一步验证不同化学修饰后的asiRNA的体外抑制效果。按实施例2中的方法处理细胞及转染不同修饰的Bcl2-asiRNA,按实施例3中的方法及操作进行流式细胞仪检测几种不同修饰的Bcl2-asiRNA对HelaB2细胞中的Bcl2蛋白的抑制效率。其中Control为转染不相关siRNA的阴性对照;19M0/21-19M6/21M2分别代表用胆固醇、硫代、甲基化、磷酸化、氟代碱基化学修饰正义链或/和反义链的碱基的asiRNA,修饰部位和序列分别对应表1中的序列H-P。每个样品分别做3个重复样品。结果见图7。由图可见各种不同修饰的Bcl2的asiRNA之间相比,19M2/21比其他修饰方式的asiRNA抑制效果好。
实施例9
上述实施例已经在体外筛选比较了不经过化学修饰的asiRNA 19/21有效性明显优于siRNA21/21,而不同化学修饰的asiRNA之间比较,19M2/21抑制效果最突出。由于不经过化学修饰的siRNA和asiRNA在体内实验中容易被RNA酶降解。而经过不同化学修饰的siRNA和asiRNA虽然体外活性受到一定影响,但是能耐受RNA酶而提高体内实验的稳定性。因此采用含80%小牛血清的DMEM培养基和2国际单位的RNA酶在37度对表1中P、H-M正义链不同修饰的asiRNA与不修饰的asiRNA(表1的A-G)及不修饰的siRNA(21/21,序列同实施例2相同)进行抗RNA酶稳定性比较研究,方法:将上述不同修饰及不修饰的asiRNA及siRNA各20ul(20nmol)分别加入到80ul小牛血清中,37℃孵育,分别在1h,2h,4h,8h,12h,24h,48h取10ul上述血清,加入3ul loading buffer,上样进行琼脂糖电泳。根据电泳条带判定其稳定性。结果显示在4h时不经修饰的siRNA及各种未经修饰的asiRNA均已发生降解,其中21/21siRNA 已基本全部降解,各asiRNA 的条带亮度如下:19/21>18/21>17/21>16/21>15/21>20/21>21/19;19M0/21在12h时已基本完全降解;在24h时19M1/21,19M3/21,19M4/21,19M5/21均已发生部分降解,其中条带亮度19M5/21>19M4/21>19M3/21>19M1/21;48h时19M2/21>19M6/21发生部分降解,条带亮度19M2/21>19M6/21。由上述结果得出能耐受小牛血清和RNA酶的能力和稳定性从高到低排序为:19M2/21>19M6/21>19M5/21>19M4/21>19M3/21>19M1/21>19M0/21>19/21>18/21>17/21>16/21>15/21>20/21>21/19>21/21。而本实施例只是选择了稳定性排在前面的19M2/21和19M6/21两种经过化学修饰的asiRNA,分别进行动物体内实验以证明它们的体内稳定性、体内抗肿瘤效果和肿瘤分布情况。
雄性昆明种小鼠,约8周龄,体重20±1g,购自南京江宁青龙山实验动物中心,用颗粒饲料喂养在21±2℃的环境中,使其自由取食和饮水,实行12小时的白天和黑夜循环。小鼠肝癌H22肝癌腹水细胞(由中科院上海药物研究所实验动物中心)37℃复苏后每只小鼠腹腔注射0.3ml,7天后接种第二代。取第二代腹水,用生理盐水调整细胞浓度为5×106个/ml,每只小鼠前肢右侧腋下皮下注射0.2mL,约1×106个瘤细胞。小鼠自由进食,正常喂养。小鼠接种后随机分为四组:生理盐水组(NS)、化疗药物环磷酰胺CTX组、脂质体空白组及脂质体-BCL2-asiRNA(19M2/21)组,其中BCL2-asiRNA(19M2/21)对应表1中的J序列。接种后次日开始给药,asiRNA的给药剂量为1mg/kg,NS、脂质体空白组及脂质体-BCL2-asiRNA组,连续尾静脉给药14天(0.4ml/只),CTX(30mg/kg)在接种后的第2、4、6、8、10、12天经腹腔注射给药。在给药的第5、第10、第15和第20天用游标卡尺测量肿瘤的长和宽,并通过以下的公式计算肿瘤的体积:a*b2*0.5(a为长,b为宽)。各组肿瘤体积曲线如图8。由图8可见脂质体-BCL2-asiRNA组小鼠的肿瘤体积明显小于其他组,可说明表1中的J的BCL2-asiRNA在体内有良好的抑瘤效果。
进一步进行体内实验证明这种化学修饰的asiRNA 19M2/21能否进入动物体内起延长荷瘤小鼠生存期的作用。雄性昆明种小鼠接种、分组、具体给药方式及剂量均同上。整个治疗过程中小鼠自由进食饮水,并观察记录小鼠的生活状态和生存情况,从接种肿瘤细胞次日开始计算天数,到第60天为止,60天以上生存时间也按照60天计算。各组小鼠的生存曲线如图9,由图可见脂质体-BCL2-asiRNA(表1中的J)组小鼠的生存时间明显比阳性对照药CTX和生理盐水组长,说明BCL2-asiRNA在体内具有明显延长荷瘤小鼠生存期的效果。
本实验将稳定性比较好的19M6/21,对应表1中P序列的BCL2-asiRNA通过脂质体递送***尾静脉注射入BALB/c荷瘤裸鼠体内,并观察其在裸鼠体内的分布情况,样品用荧光Cy5标记,给药前现配,取脂质体复合物2ml与荧光标记的BCL2-asiRNA 20nmol混合摇匀,室温孵化20min。BALB/C裸鼠(SPF级,上海斯莱克实验动物有限责任公司),雄性,体重18-20g,移植性肿瘤为SMMC-7721肝癌。将浓度为5×106个(0.2mL/只)的人肝癌细胞SMMC-7721细胞(由上海市肿瘤研究所提供)注入BLBA/c裸鼠的颈背部皮下。待肿瘤长到40-50mm3时开始动物实验。取配制好的受试药物,尾静脉注射(0.3ml/只)荷瘤裸鼠,在不同时间点进行活体成像观察,在1h处死动物取内脏进行荧光定量;将剩余的0.2ml脂质体复合物-BCl2-asiRNA-Cy5混合物稀释成六个浓度用活体成像进行定量,做浓度与荧光强度的标准曲线,最后根据活体成像仪指示的数据定量计算主要脏器心肝脾肺肾的siRNA残留剂量。所用仪器为in-vivo imaging system(Maestro,Cambridge Research & Instrument)和荧光分光光度计(LS55,美国Perkin Elmer),实验结果见图10,结果显示在不同时间点Bcl-2-siRNA-Cy5在BLBA/c荷瘤裸鼠的各主要脏器中均有分布,通过1h的荧光定量看到Bcl-2-siRNA-Cy5大量聚集在肿瘤组织中,有明显的肿瘤靶向作用。
通常的药物筛选用体外实验就可以完成确认。但是基于RNA易被体内无处不在的RNase降解,RNA药物的筛选还需兼顾考察体内的稳定性、靶向性及抑瘤效果。本发明首先设计了一系列未经修饰的asiRNA,通过体外实验筛选出抑瘤效果明显优于siRNA,而且稳定性及抗RNase降解能力也显著高于siRNA的不对称asiRNA,并以此asiRNA为基础进行了不同的化学修饰,增强其抗RNase降解能力及稳定性、脂溶性、靶向性,并从中筛选出一系列稳定性强、体内抗肿瘤效果好和肿瘤靶向突出的经化学修饰的asiRNA,为开发新的RNAi类抗肿瘤药物奠定了坚实的基础。
Claims (1)
1. 特异性抑制肿瘤凋亡抑制基因Bcl2的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA,其特征在于所述的asiRNA是通过如下方法设计,并经化学合成得到的:从Bcl2基因对称性小核酸干扰分子siRNA出发,通过将siRNA正义链或反义链5’或3’端裁减1-5nt碱基,形成两条链碱基长度不一致,每条链3’端有两个脱氧核糖核酸dTdT呈单链悬挂,具有14-21nt的能诱发RNA干扰的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA,其序列如下:
5’ G AGG CUG GGA UGC CUU U dTdT 3’
3’dTdT GCC UCC GAC CCU ACG GAA A 5’;
或者,所述的asiRNA是通过如下方法设计,并经化学合成得到的:从Bcl2基因对称性小核酸干扰分子siRNA出发,通过将siRNA正义链或反义链5’或3’端裁减1-5nt碱基,并采用胆固醇、硫代、甲基化、磷酸化、氟代对正义链或/和反义链进行化学修饰,形成两条链的碱基长度不一致,每条链3’端有两个脱氧核糖核酸dTdT呈单链悬挂,具有14-21nt的能诱发RNA干扰的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA,其序列为:
5’chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(FU)(FU)(FU)dT-s-dT 3’
3’dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’;
5’chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(mU)(mU)(mU)dT-s-dT 3’
3’dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’;
其中,chol为胆固醇修饰、s为硫代修饰、m为甲基化修饰、F为氟代修饰。
2、权利要求1所述的asiRNA在制备抗肝癌药物中的应用。
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1580258A (zh) * | 2003-08-07 | 2005-02-16 | 江苏省基因药物工程技术研究中心 | 抑制人bc1-2基因表达的siRNA和表达质粒及其在制药中的应用 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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CN1587406A (zh) * | 2004-08-24 | 2005-03-02 | 暨南大学 | 抑制bc1-2基因表达的siRNA双链及其应用 |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
Asymmetric RNA duplexes mediate RNA interference in mammalian cells;Sun X et al.;《Nature Biotechnology》;20081231;Pages 1379-82 * |
Sun X et al..Asymmetric RNA duplexes mediate RNA interference in mammalian cells.《Nature Biotechnology》.2008,Pages 1379-82. |
不对称RNA干扰研究进展;陈旭等;《药学与临床研究》;20101031;第455-457页 * |
不对称小RNA干扰抑制HelaB2细胞中bcl-2基因的研究;陈旭;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20111015;全文 * |
陈旭.不对称小RNA干扰抑制HelaB2细胞中bcl-2基因的研究.《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》.2011,全文. |
陈旭等.不对称RNA干扰研究进展.《药学与临床研究》.2010,第455-457页. |
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