CN1251766C - 肿瘤基因开关药物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肿瘤基因开关药物的是由一段序列特异的decoy核酸组成的药物，此类核酸可在细胞内特异地结合某些癌基因的转录调控因子，阻抑这些癌基因的过度表达，从而抑制肿瘤细胞生长，可发展成为肿瘤基因治疗的药物。

Description

肿瘤基因开关药物

技术领域：

肿瘤治疗药物。

背景技术：

从分子水平来看，肿瘤是涉及多基因活动异常的疾病，每种组织癌变或每种细胞表型都涉及数十乃至数百种基因活动。把哪个基因作为治疗靶点仍不明确。但现在已初步明晰，肿瘤的发生是多步骤多阶段进行的。与某一细胞表型相关基因群的活动是按时空有序进行的，有级联式表达规律，处于级联式下游的功能基因的活动是受上游的调控基因所控制。因此，通过改变上游的调控基因的活动异常，仍可以控制整个下游基因群的活动，进而使细胞表型从恶性表型恢复至良性表型，达到治愈肿瘤的目的。

上游的调控基因即是表达细胞核因子(DNA结合蛋白)的基因，包括肿瘤发生相关的原癌基因和抑癌基因。由于某些外界因素作用下，原癌基因激活而过度表达和抑癌基因的失活。即调控基因发生失控紊乱，本身表达调控失常，并引发其他下游基因调控及表达失常的连锁反应，导致肿瘤发生，因此，原癌基因、抑癌基因是肿瘤基因治疗的重要靶点。

肿瘤细胞一个特征是原癌基因过度表达，其中c-myc在髓性白血病、B淋巴瘤、T淋巴瘤、肉瘤等多种肿瘤均有高表达，并在白血病、乳腺癌、胃癌、小细胞肺癌、结肠癌、神经细胞瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞癌均有不同程度的扩增。在人肝癌细胞低甲基化引起过度表达。c-fos在骨肉瘤、淋巴瘤等过度表达。c-jun在小细胞性肺瘤和非小细胞性肺癌、结肠直肠癌高表达。在肿瘤的启动、促瘤阶段，有c-myc、c-jun的高表达(与肿瘤发生有关)。

肿瘤细胞另一特征：失去细胞周期特异性，失去对细胞增殖信号的反应能力，而c-myc过度表达是细胞增殖的前提之一。MYC-MAX异二聚体结合于E-box，激活本身及下游通讯基因CYC25A等表达，形成细胞增殖表型，并与E2F共同作用，激活cyclinA、cyclin E，在细胞周期中G1→S期的转化是起关键作用。c-myc还可活化端粒酶的表达，在促进肿瘤形成上起重要作用。c-jun和c-fos在RAS信号传导途径的下游核相中起重要作用。(被称为早期快速反应基因或第三信使)。c-myc和c-fos在细胞分化中起重要作用。此外，c-myc、c-fos、c-un在细胞凋亡、基因组稳定、细胞成熟中有重要作用。因此，改变c-myc、c-fos、c-jun的调控异常，从而可以改变恶性增殖表型为良性表型，

原癌基因和抑癌基因在正常细胞和肿瘤细胞同时存在，不同的是两类细胞中的表达程度不同，肿瘤细胞是原癌基因过度表达，是正常细胞的2～10倍，且抑癌基因失活。这说明基因的表达调控出现了异常，这种异常是基因的调控区上顺反式因子结合状态及数量的发生了改变，如何消除这种异常，改变基因调控状态，目前世界上有一种新的策略即转录因子“诱饵”(decoy)的方法，用特异性的DNA序列结合转录调控因子(包括原癌基因上增强子上的转录激活因子和抑癌基因沉默子上的转录抑制因子)，改变调控基因的表达状态，从而改变细胞表型。

人们在DNA与蛋白质相互作用关系的基础研究中，已发现并证实：体外合成一段序列特异的短链DNA，可与细胞核蛋白提取物中某一种因子结合，在聚丙烯酰胺电泳中产生凝胶阻抑现象，为现在decoy核酸发展成为药物提供了实验基础。自从90年代来，Bielinska(1990)提出用双链寡聚核酸调控基因表达以来，decoy核酸己首先用于在治疗心血管药物开发，用E2F因子的decoy核酸治疗静脉搭桥术后血管的内膜增生(Mann.et al1999)已进入临床，用NF-Kappaβ的decoy核酸防治心肌梗塞(S8wa.1997.Tounita.1998)，还有AGE、SRF的decoy核酸等。decoy核酸应用于肿瘤治疗刚处于起步阶段，如：CREB因子的decoy核酸(Cho-chong 1999)已在多种肿瘤细胞株及动物模型开展。ER的decoy核酸(PivaR et al 2000)用于抑制乳腺癌细胞生长。NF-Kappa β的decoy核酸(Sharma.HW eta1)在小鼠纤维瘤体内外试验取得一定抑制效果。

发明内容：

本发明的目的之一是提供肿瘤基因开关药物，其特征是一系列序列特异的decoy核酸，可特异性结合各自转录调控因子。下调过度表达的癌基因c-fos、c-jun、c-myc，从而抑制肿瘤细胞的恶性增殖，达到***的目的。

本发明的另一目的是提供含有本发明decoy核酸药物组合物。

本发明的另一目的是本发明decoy核酸用于制备抗肿瘤药物的用途。

本发明的目的可以通过以下措施来达到：

肿瘤基因开关药物的设计是将转录因子特异结合的序列作为药物decoy核酸的核心序列，并适当增加核心序列的侧翼长度，使其易形成空间结构，以加强药物的稳定性及与靶因子的亲和力。

药物KGCD101A系列是为调控原癌基因C-FOS的过度表达而设计的。根据原癌基因C-FOS的调控区结合了多个因子，如：SRF、CREB、AP-1、SIF因子等，其中CREB因子的结合位点CRE增强子序列STGACGTMR(序列1)作为药物decoy核酸的核心序列，竞争结合CREB，下调原癌基因C-FOS的表达。例如：药物KGCD101a(序列6)由34个核苷酸组成，含此核心序列，并具有发夹结构。另如：药物KGCD101a-1也可以是由含此核心序列的序列7和序列8组成，48个核苷酸，两个序列结合成双链过程中形成十字形结构。药物KGCD101a-2是由序列7与序列9形成T形结构。总之，这类decoy核酸药物，可以设计为以STGACGTMR为核心序列，核苷酸总数为15-55个。并易形成发夹、假结、茎环、哑铃、十字多种二级结构的短链DNA分子。

药物KGCD101B和KGCD101C系列是为调控多种原癌基因而设计的。FOS-JUN形成异源二聚体，成为AP-1转录激活因子，其结合于多个基因的顺式元件STGASTMA(序列2)上，激活多种基因的表达。采用该序列为药物decoy核酸的核心序列，下调含AP-1增强子基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的生长。例如：药物KGCD101b由序列10和序列11构成的，含此核心序列，核苷酸总数为42个的双链DNA分子。药物KGCD101b-1(序列12)，有35个核苷酸并含此核心序列，具有发夹结构。药物KGCD101b-2(序列13)有42个核苷酸并含此核心序列，具有哑铃结构，可用连接酶使5′和3′端连接成闭环，以增加药物稳定性。药物KGCD101C由序列14和序列15组成，其核苷酸总数为42个，含此核心序列，具有十字形结构。药物KGCD101c1由序列16和序列17组成，其核苷酸总数为44个，含此核心序列，具有十字形结构。总之，这类decoy核酸药物，可以设计为以STGASTMA(序列2)为核心序列，核苷酸总数为15-55个‘并易形成发夹、假结、茎环、哑铃、十字多种二级结构的短链DNA分子。

药物KGCD102系列是为调控原癌基因c-jun而设计的。根据c-jun自身活化表达的作用。c-jun蛋白结合自身基因的增强子序列TTACCTCA(序列3)，该序列作为药物KGCD102系列的decoy核酸的核心序列，下调c-jun表达。例如药物KGCD102(序列18)为含此核心序列，核苷酸总数为37个，具有发夹结构的此类decoy核酸药物之一。另有药物KGCD102-1(序列19)为40个核苷酸，具有发夹结构。药物KGCD102-2(序列20)为38个核苷酸，具有哑铃结构。药物KGCD102-3(序列21和序列22)为54个核苷酸，具有茎环结构。总之，这类decoy核酸药物，可以设计为以TTACCTCA(序列3)为核心序列，核苷酸总数为15-55个，并易形成发夹、假结、茎环、哑铃、十字多种二级结构的短链DNA分子。

药物KGCD103a系列是为调控原癌基因C-MYC而设计的。根据C-MYC与自身增强子TCTCTTA(序列4)序列结合，将此核心序列作为decoy核酸药物的基本组成，下调C-MYC基因表达。例如：药物KGCD103a由序列23：和序列24形成的：双链DNA组成，52个核苷酸含此核心序列。药物KGCD103a-1(序列25)有含此核心序列的35个核苷酸，发夹结构。药物KGCD103a-2由序列26和序列27形成的：茎环结构组成，43个核苷酸含此核心序列。药物KGCD103a-3由序列28和序列29形成的锤形结构组成，36个核苷酸含此核心序列。总之，这类decoy核酸药物，可以设计为以TCTCTTA(序列4)为核心序列，核苷酸总数为15-55个，并易形成发夹、假结、茎环、哑铃、十字多种二级结构的短链DNA分子。

药物KGCD103b是为调控控制细胞周期的相关基因而设计的。根据MYC-MAX异源二聚体促进细胞增殖，使细胞失去周期特异性，顺式元件RACCACGTGGTY(序列5)作为decoy核酸的核心序列，体外合成并导入细胞，与基因本身的顺式元件竞争结合MYC-MAX复合二聚体，抑制下游基因表达，改变恶性增殖表型。例如：药物KGCD103b(序列30)为32个核苷酸，含此核心序列。药物KGCD103b-1由序列31和序列32形成的十字结构，47个核苷酸，含此核心序列。总之，这类decoy核酸药物，可以设计为以RACCACGTGGTY(序列5)为核心序列，核苷酸总数为15-55个，并易形成发夹、假结、茎环、哑铃、十字多种二级结构的短链DNA分子。

decoy核酸药物经DNA全自动合成仪合成，硫代化，脱保护，纯化和冻干，溶于水中，定量定性测定分析后，进行体外筛选和药效试验，用NCI-H460肺癌细胞作为筛选体系，将细胞加入96孔培养板，用RPMI 1640完全培养液培养24h后，加入脂质体和上述decoy核酸，继续于37℃，5％CO₂中培养48h。用SRB比色法测定细胞的成活率。筛选结果表明六种decoy核酸对NCI-H460细胞都有不同程度的抑制作用，其中KGCD101a和KGCD102的抑制作用最大。这些decoy核酸都可开发成为抗肿瘤药物。

本发明的优点：

decoy核酸与反义核酸不同，结构上的差异为：反义核酸为单链线性寡聚核酸，decoy核酸可形成双链并具二级结构；作用位点的差异；反义核酸互补于基因的转录产物mRNA的某段序列，decoy核酸结合于基因转录调控因子(蛋白质)上；用量上的差异：一个拷贝基因转录出200～300条mRNA，且mRNA具有瞬时性，需反义核酸药量大，而一个拷贝基因上转录调控因子仅1～数个，需decoy核酸药量少。

因decoy核酸的核心序列在6～12个碱基对之间，链短易降解，双链不稳定，常温下易解链。无二级空间结构不易与蛋白结合，因而设计药物时需适当增加碱基，加长链长，增强稳定性及与转录因子的亲和性，其中以回文结构、发夹、十字、茎环、哑玲状等结构最佳，因此decoy核酸被设计成含有上述核心序列的15～55碱基之间，可合成出单链，自交形成双链及其二级结构，也可各合成两条单链，杂交形成双链。因核酸在细胞内极易被核酸酶降解失去活性，因此需修饰保护，以增强抗降解能力，提高稳定性。硫代修饰为最常见的保护基团。

综上所述，本发明所述的五类decoy核酸对肿瘤细胞均有抑制作用，在抗肿瘤药物开发上有相当大的应用前景，本发明的decoy核酸药物可以与药用载体合，药用载体包括生理盐水等常用载体和缓冲液及脂质体、聚合物等。

附图说明：

图1：KGCD系列的decoy核酸对肿瘤细胞NCI-H460的生长抑制图

图2：KGCD101a和KGCD102decoy核酸对各种细胞的生长抑制图

图3：KGCD101a和KGCD102decoy核酸对肿瘤细胞NCI-H460的

半致死剂量(IC₅₀)图

如图1所示：将肺癌细胞株NCI-H460分为阳性对照组、阴性对照组、空白对照组和六种KGCD系列的decoy核酸实验组，分别接种于含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液中的96孔培养板，接种数量为2-3×10⁴/孔，培养24小时后，更换成无血清培养液，空白对照组仅加入0.6μl/孔空脂质体，其余均加入0.6μl/孔脂质体和终浓度为200nM的不同decoy核酸，处理5小时后，更换成含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液，在37℃、5％CO₂条件下培养48小时后，用SRB染色，酶标仪于λ_510nm测定其OD值，并计算细胞存活率，以空白对照组数值为100％，作出细胞生长抑制图.。从图1中可见：CRE代表阳性对照组的试验结果，C代表阴性对照组的试验结果，其余的6组均为KGCD系列decoy核酸实验组的试验结果，这6组KGCD系列decoy核酸对NCI-H460细胞均显示出不同程度的抑制作用，其中以KGCD101a和KGCD102的抑制率最高。

如图2所示：用KGCD101a和KGCD102decoy核酸分别处理下述肿瘤细胞株NCI-H460(肺癌)，CNE(鼻咽癌)，U251(神经胶质瘤)，MCF-7(乳腺癌)，BEL-7402(肝癌)和正常细胞株：L-02(肝细胞)和NIH3T3，最浅色柱体代表阴性对照组(错配序列)，对各种细胞生长影响较小。而用KGCD101a和KGCD102decoy核酸对各种肿瘤细胞生长均有不同程度的抑制作用，其中对U251(神经胶质瘤)和NCI-H460(肺癌)抑制最大，而对正常细胞株的生长影响较小。

如图3所示：用不同浓度的KGCD101a和KGCD102的decoy核酸处理肿瘤细胞NCI-H460，由图可见：KGCD101a和KGCD102在较低浓度的条件下对NCI-H460细胞有抑制作用，它们的半致死量为30～50nM，而阴性对照组则对细胞生长无剂量差异。

具体实施方式：

实施例1decoy核酸药物的制备和分析

合成六种下述硫代decoy核酸药物：KGCD101a(序列6)，KGCD101b(序列10和序列11)KGCD101c：(序列14和序列15)，KGCD102：(序列18)，KGCD103a：(序列23和序列24)，KGCD103b(序列30)。

阴性对照序列：5′-TGTGGTCATGTGGTCATGTGTCA-3′

阳性对照序列：5′-TGACGTCATGACGTCATGACGTCA-3′

使用美国PE公司应用生物***部(Applied Biosystems)制造的391型DNA合成仪。以亚磷酰胺固相合成法合成硫代的所设计的decoy核酸。主要原料有：四种二异丙基β-氰乙基亚磷酰胺单体：腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、胸苷(T)，四种控制孔径玻璃粉(CPG)固相合成柱(A，G，C，T)。合成规模为10微摩尔。盖帽试剂分别为：乙酸酐/二甲基吡啶/四氢呋喃和1-甲基咪唑/四氢呋喃，硫代反应试剂：Beaucage试剂/乙腈，脱三苯甲基试剂：三氯乙酸/二氯甲烷，液体溶剂：乙腈和三氯甲烷。碱基单体溶于无水乙腈中，浓度为100毫摩尔，其它试剂浓度及用量均按照仪器手册进行。合成过程由仪器本身程序控制。合成产物用浓氨水(29％)收集在密封耐压的玻璃瓶中，于55℃处理15小时脱去核酸分子上各种碱基保护基团和氨基保护基团。脱保护结束后挥发脱去大部分氨气，冻干得白色粉末状粗品，重新溶于缓冲液中，用Pharmacia Source 30Q层析及AKTA层析***进行纯化。纯化样品G-15分子筛葡聚糖凝胶层析柱除盐，冻干，得白色絮状核酸纯品。储存于-20℃取少量样品进行分析：用毛细管电泳法测其纯度及分子量和高效液相层析法测纯度均为90％以上，DNA测序法测定序列完全正确，核磁共振法测硫代化程度大于98.5％。

实施例2六种KGCD系列decoy核酸对肺癌NCI-H460细胞的生长抑制

将肺癌细胞株NCI-H460分为阳性对照组、阴性对照组、空白对照组和六种KGCD系列的decoy核酸实验组，分别接种于含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液中的96孔培养板，接种数量为2-3×10⁴/孔，培养24小时后，更换成无血清培养液，空白对照组仅加入0.6μl/孔空脂质体，其余均加入0.6μl/孔脂质体和终浓度为200nM的不同decoy核酸，处理5小时后，更换成含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液，在37℃、5％CO₂条件下培养48小时后，用SRB染色，酶标仪于λ_510nm测定其OD值，并计算细胞存活率，以空白对照组数值为100％，作出细胞生长抑制图.。从图中可见：CRE代表阳性对照组的试验结果，C代表阴性对照组的试验结果，其余的6组均为KGCD系列decoy核酸实验组的试验结果，这6种KGCD系列decoy核酸对NCI-H460细胞均显示出不同程度的抑制作用，其中以KGCD101a和KGCD102的抑制率最高。

实施例3KGCD101a和KGCD102decoy核酸对各种细胞的生长抑制

用KGCD101a和KGCD102decoy核酸分别处理下述肿瘤细胞株NCI-H460(肺癌)，CNE(鼻咽癌)，U251(神经胶质瘤)，MCF-7(乳腺癌)，BEL-7402(肝癌)和正常细胞株：L-02(肝细胞)和NIH3T3，最浅色柱体代表阴性对照组(错配序列)，对各种细胞生长影响较小。而用KGCD101a和KGCD102decoy核酸对各种肿瘤细胞生长均有不同程度的抑制作用，其中对U251(神经胶质瘤)和NCI-H460(肺癌)抑制最大，而对正常细胞株的生长影响较小。

实施例4药物KGCD101a和KGCD102对NCl-H460细胞的半致死量(IC₅₀)

用不同浓度的KGCD101a和KGCD102(5-200nM)分别处理NCI-H460细胞，培养一定时间后，测其OD值。从如图3可以看出，KGCD101a和KGCD102在较低浓度的条件下对癌细胞有抑制作用，它们的半致死量为30～50nM，即为30～50μg/ml，远远低于抗肿瘤药物筛选的标准(IC₅₀≤10μg/ml)。

实施例5含decoy核酸的药物组合物

作为动物和人类体内给药的decoy核酸药物组合物组成如下：

decoy核酸KGCD101b：1mg/ml

生理盐水或磷酸缓冲液(PH 7.4)：适量

本发明其它儿种核酸也采用同样配方。

序列表

<110>叶青

<120>肿瘤基因开关药物

<160>32

<210>1

<211>9

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

stgacgtmr 9

<210>2

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

stgastma 8

<210>3

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ttacctca 8

<210>4

<211>7

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tctctta 7

<210>5

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

raccacgtgg ty 12

<210>6

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gcctgacgtc aggggacttt ccctgacgtc aggc 34

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gtttcgcggt gacgtcaccc tttc 24

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gaaagggacg tacgtccgcg aaac 24

<210>9

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

gaaaggcgcg aaac 14

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

cgcttgc tga ctcagccgga a 21

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

ttccggc tga gtcagcaagc g 21

<210>12

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

gatcg tgact cagcgcgatt ttcgcgc tga gtcac 35

<210>13

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

actctctcag tc tgactcat gctctcagca  tgagtcagac tg 42

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

ctcaacc tgga ctcagaaccc t 21

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

agggttcact cagtggttga g 21

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

ccggggctga ctcaggggca a 21

<210>17

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

ttgcccctaa cggttagccc cgg 23

<210>18

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

ttacctcatt acctcagccc gtgaggtaat gaggtaa 37

<210>19

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

ttacctcatt acctcattac ctcatgaggt aatgaggtaa 40

<210>20

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

gagcccgtcg ttacctcatc agcccgtgat gaggtaac 38

<210>21

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

ttacctcatt acgtcattac gtcattacct ca 32

<210>22

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

tgaggtaatg ataatgaggt aa  22

<210>23

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

tcaccatctc ttatgcggtt gaatag 26

<210>24

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

ctattcaacc gcataagaga tggtga 26

<210>25

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

tctcttatga ctaatctctt attagtcata agaga 35

<210>26

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

tctcttagct ctcttagcct ctctta 26

<210>27

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>27

taagagaggc taagaga 17

<210>28

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>28

gagtctctta ctcccgcgg  19

<210>29

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>29

ccgcgggtct cttagac 17

<210>30

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>30

cacggaacga gaccacgtgg tctcgttccg tg 32

<210>31

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>31

ttctctgacc acgtggtcct cttc 24

<210>32

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>32

gaagaggctc tcttagcaga gaa 23

Claims (4)

1.一种肿瘤基因开关药物，其特征是由序列30构成的寡聚脱氧核糖核酸组成。

2.根椐权利要求1所述的寡聚脱氧核糖核酸，其具有硫基、甲基、酰胺基中任意一种基团修饰的磷酸二酯键。

3.权利要求1所述的寡聚脱氧核糖核酸与生理盐水、磷酸缓冲液或脂质体组成的药物组合物。

4.权利要求1所述的寡聚脱氧核糖核酸在制备抗肿瘤药物中的应用。

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