CN1110323A - 新多肽和编码它们的脱氧核糖核酸 - Google Patents

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Abstract

在原B细胞中生产并分泌本发明多肽，因此可 将其用于与生血细胞增殖不足或不正常、神经增强或 抑制、免疫增强和抑制有关的疾病如炎性疾病(类风 湿性关节炎、溃疡性结肠炎等)，骨髓移植后的生血干 细胞减少，化疗后的白细胞减少，血小板减少，B淋巴 细胞减少和T淋巴细胞减少，贫血，传染性疾病，癌 症，白细胞增多，爱滋病，神经变性性疾病(阿尔茨海 默症，多发性硬化等)，预防或治疗神经损伤、骨代谢 紊乱(骨质疏松等)或组织修复。

Description

本发明涉及由人原B细胞系生产的新多肽及编码它们的DNA。
本发明涉及由生血细胞生产的新多肽和编码它们的DNA。已经知道许多种类来自生血细胞的生长和分化因子，如白细胞介素（IL）。
该事实说明，除已发现的已知的分泌性因子外，也可从中分泌具有相似或新功能的因子。
本发明人已将其注意力放在这方面并试图找出由生血细胞生产的新因子（多肽）。本发明人通过使用小鼠SDF-1（基质衍生的因子1;描述于日本专利申请No.522098）cDNA作为探针的交叉杂交进行筛选，因此得到由人原B细胞生产的人SDF-1（2种，α和β），从而完成本发明。
用计算机对与本发明多肽具有相同或高度同源序列的多肽和编码它们的DNA进行了检索，但未发现这样的多肽和DNA。因此，已证明，本发明多肽和为其编码的DNA是新的。
1）具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的多肽，
2）编码上述（1）多肽的DNA，
3）具有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的DNA，和
4）具有SEQ ID No.3所示核苷酸序列的DNA，
5）具有SEQ ID No.5所示氨基酸序列的多肽，
6）编码上述（5）的多肽的DNA，
7）具有SEQ ID No.6所示核苷酸序列的DNA，和
8）具有SEQ ID No.7所示核苷酸序列的DNA。
本发明涉及具有SEQ ID No.1或5所示氨基酸序列的基本上纯化的形式的多肽，其同系物或该序列的片段或片段的同系物，及编码所述多肽的DNA。更具体地，本发明涉及具有SEQ ID No.2或3，和6或7所示核苷酸序列的DNA，及具有可选择性地与SEQ ID No.2或3，和6或7所示核苷酸序列杂交的片段的DNA。
通常，基本上纯化形式的SEQ ID No.1或5多肽组成了制剂中的多肽，该制剂中90%以上如95%，98%或99%的多肽是SEQ ID No.1或5。
SEQ ID No.1或5的多肽同系物与SEQ ID No.1的多肽通常有至少70%，优选至少80或90%，最佳至少为95%的同源性，即至少20，优选的至少30，例如40，60或80个以上邻接氨基酸区域内相同，所述多肽同系物是指下文中所述本发明多肽。
通常，SEQ ID No.1或5的片段或其同系物的长度至少为10，优选的至少为15，如20，25，30，40，50或60个氨基酸，并且包括在本文所用术语“本发明的多肽”中。
能选择性与SEQ ID No.2或3，和6或7的DNA杂交的DNA，与SEQ ID No.2或3的DNA有至少70%，优选至少80%或90%，最佳至少为95%的同源性，即其相同性覆盖了至少20，优选的至少30，如40，60或100或更多个邻接核苷酸的区域。所述DNA也包括在术语“本发明的DNA”中。
SEQ ID No.2或3，6或7DNA的片段的长度为至少15，优选的至少20，例如25，30或40个核苷酸，并且也包括在本文所用的术语“本发明的DNA”中。
本发明进一步的实施方案将提供含有本发明DNA的复制和表达载体。所述载体可以是例如质粒，病毒或噬菌体载体，它们配有复制原点，选择性地具有所述DNA表达所需的一个启动子，及任选地含有启动子调节子。所述载体可含有一个或多个选择性标记基因，例如氨苄青霉素抗性基因。可在体外使用所述载体，例如生产相应于所述DNA的RNA，或用于转染或转化宿主细胞。
本发明的另一个实施方案提供用所述载体转化或转染的宿主细胞，所述载体用于本发明DNA的复制和表达，包括SEQ ID No.2或3，和6或7或其开放阅读框架。可以选择与载体相容的细胞，可以是如细菌，酵母，昆虫或哺乳动物的。
本发明的再一实施方案提供生产多肽的方法，包括在有效表达本发明多肽的条件下，培养本发明的宿主细胞。此外，优选的是，在表达本发明多肽，然后由宿主细胞生产的条件下，完成所述方法。
也可将本发明的DNA以反义方向***上述载体，以便生产反义RNA。也可以用合成的方法生产反义RNA。可以在控制细胞中本发明多肽水平的方法中使用所述的反义RNA。
本发明也提供抗本发明多肽的单克隆或多克隆抗体。本发明还提供生产抗本发明多肽的单克隆或多克隆抗体的方法。通过用本发明多肽或其片段作为免疫原的常规杂交瘤技术，制备单克隆抗体也可以用常规方法制备多克隆抗体，包括用本发明多肽接种宿主动物，如大鼠或兔，然后回收免疫血清。
本发明也提供药物组合物，含有与药物学可接受的稀释剂和/或载体结合在一起的本发明多肽或其抗体。
本发明多肽包括缺失了部分氨基酸序列的多肽（例如，多肽仅有在SEQ ID No.1或5所示氨基酸序列中，表现生物活性所必需的序列），由其它氨基酸替代了部分氨基酸序列的多肽（如，由具有相似特性的氨基酸替代的那些）和将其它氨基酸加入或***其部分氨基酸序列后得到的多肽，以及具有SEQ ID No.1或5所示氨基酸序列的那些。
如熟知的，有一种到6种密码子编码一种氨基酸（例如，已知有一种密码子编码Met，6种密码子编码亮氨酸（Leu））。因此，可以改变DNA的核苷酸序列，以编码具有相同氨基序列的多肽。
在（2）和（6）中说明的本发明的DNA包括一组编码SEQ ID No.1和5所示多肽的各种核苷酸序列。通过改变核苷酸序列，提高多肽的生产率成为可能。
（3）和（7）中说明的DNA是（2）和（6）中所示DNA的具体实施，并且是天然形式的序列。
（4）和（8）中所示的DNA表示带有非转译区的（3）和（7）中说明的DNA序列。
信号肽是一个疏水区，紧位于转译起始氨基酸Met的下游。据推测，在本发明多肽中的信号肽位于SEQ ID No.1或5所代表的氨基酸序列中从1位Met到21位Gly的区域。对于生物活性表达所必需的区域相当于缺失了信号肽的SEQ ID No.1和5的氨基酸序列部分，即成熟蛋白质部分。因此，信号肽决不与活性有关。
可以按下列方法制备含有SEQ ID No.3或7中所示核苷酸序列的DNA，即：
（Ⅰ）从生产本发明多肽的细胞（如人原B细胞系）中分离mRNA，
（Ⅱ）从由此得到的mRNA制备第一条链（单链cDNA），接着制备第二条链（双链cDNA）（cDNA的合成）。
（Ⅲ）将由此得到的cDNA***到适当的噬菌体载体中，
（Ⅳ）将重组噬菌体转染至宿主细胞（构建cDNA文库），
（Ⅴ）用小鼠SDF-1 cDNA作为探针，用噬菌斑杂交筛选cDNA文库，
（Ⅵ）制备含有所得阳性克隆的噬菌体DNA，接着将切出的cDNA亚克隆至质粒载体中，然后制备限制酶图谱。
（Ⅶ）确定用限制酶切出的各片段的核苷酸序列，接着配成全长序列。
详细地说明，在用适当的刺激剂（如IL-1等）刺激人原B细胞系后或不刺激的情况下，按Okayama，H等人的方法（见Enzymology，Vol.154，p3，1987中描述的方法）完成步骤（Ⅰ）。
分泌本发明多肽的细胞的实例优选的是人原B细胞系FLEB14。该人细胞系FLEB14。可以由京都大学，药物学校，药物化学系第1课题组提供。
步骤（Ⅱ），（Ⅲ）和（Ⅳ）是制备cDNA文库的连续步骤，主要按Glubler & Hoffman（Gene，Vol.25，pp.263，1983）的方法，稍微加以改动，来完成。
许多已知的质粒载体（例如pB322，pBluescript等），噬菌体载体（例如λgt10，λDASHⅡ等）可作为步骤（Ⅲ）中使用的载体的实例，噬菌体载体λgt10（43.3kbp，Stratagene）是优选的。
步骤（Ⅳ）中所用的宿主细胞优选的是大肠杆菌NM514（Stratagene）。
可以按Molecular Cloning中描述的方法（由SamBrook，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.，编写，1989由Cold Spring Habor Laboratory Press出版）完成步骤（Ⅴ）和（Ⅵ）。
可以按Maxam-Gilbert方法或双脱氧终止方法完成步骤（Ⅶ）中的测序。
必须确认得到的cDNA覆盖了全部或几乎全部长度的完整mRNA。可以通过使用cDNA作为探针的Northern分析（参见Molecular Cloning）完成这些确认。
如果从杂交带得到的mRNA的大小与cDNA的大小几乎相同，则认为cDNA几乎是全长的。
一旦确定了SEQ ID No.2，3，6，7中所示的核苷酸序列，则可通过化学合成，PCR方法或用本发明的DNA片段作为探针进行杂交，得到本发明的DNA。此外，通过将***有本发明DNA的载体DNA转化到适当的宿主中，然后培养转化体，可以得到所需量的本发明DNA。
可经下列方法制备本发明多肽（SEQ ID No.1或5中所示）：
（1）从生物体或培养细胞中分离并纯化，
（2）化学合成，或
（3）用生物技术，
优选的用（3）中描述的方法。
用生物技术制备多肽时，表达***的实例是例如细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞表达***。
例如，通过将起始密码子（ATG）加至编码成熟蛋白DNA的5′末端，将由此得到的DNA连至适当启动子（如trp启动子，lac启动子，IPL启动子，T7启动子等）的下游，然后，将其***在大肠杆菌菌株中发挥功能的载体（如pBR322，pUC18，pUC19等）中以制备表达载体，从而完成在大肠杆菌中的表达。
若使用细胞的信号肽（如pelB的信号肽），也可在同质中生产所需的多肽。此外，也很容易生产与其他多肽的融合蛋白。
此外，通过例如，将SEQ ID No.3或6中所示的DNA***适当载体（如反录病毒载体，***状瘤病毒载体，牛痘病毒载体，SV40载体，等）中适当启动子（如SV40启动子，LTR启动子，金属硫蛋白启动子等）的下游，以得到表达载体，用由此得到的表达载体转染适当的哺乳动物细胞（如猴COS-7细胞，中国仓鼠CHO细胞，小鼠人细胞等），然后在适当的培养基中，培养转化体以便在培养基中得到所需的多肽，从而可完成在哺乳动物细胞中的表达。用常规的生化方法可分离并纯化由此得到的多肽。
在原B细胞中生产并分泌本发明的多肽，这样可将其用于治疗与生血细胞增殖不足或不正常、神经增强或抑制、免疫增强和抑制有关的疾病，例如发炎性疾病（类风湿性关节炎，溃疡性结肠炎），骨髓移植后的生血干细胞减少症（hematopoietic stemcytopenia），化疗后的白细胞减少，血小板减少，B淋巴细胞减少及T细胞减少，贫血，传染性疾病，癌症，白细胞增多，爱滋病，神经变性性疾病（阿尔茨海默症，多发性硬化等），预防并治疗神经元损伤，预防或治疗骨代谢紊乱（骨质疏松症，等）或组织修复。
在上述活性中，在实验室试验中，可以确定，小鼠SDF-1α刺激小鼠髓样前体细胞系DA1G的增殖。从而表明人SDF-1α也有相同的活性。
另外，可以用抗本发明多肽的多克隆或单克隆抗体确定生物体中所述多肽的量，并因此可用于研究所述多肽与疾病间的关系的目的，或用于诊断疾病的目的等。用所述多肽或其片段作为抗原，通过常规方法可以制备其多克隆和单克隆抗体。
在本发明多肽的制备中，可以用本发明DNA作为一种重要且必需的模板，期望其拥有各种用途或用于基因疾病的诊断和治疗（基因缺陷性疾病的治疗和通过抑制经反义DNA（RNA）表达的多肽进行治疗等）。另外，用本发明的DNA作为探针可以分离基因组DNA。相似地，可以分离人体或其它生物体的与本发明DNA有高度同源性的基因。
在原B细胞中生产并分泌本发明的多肽，因此，可将其用于与生血细胞增殖不足或不正常;神经元增强或抑制，免疫增强和抑制有关的疾病，例如，发炎性疾病（类风湿性关节炎，溃疡性结肠炎等），骨髓移植后的生血干细胞减少，化疗后的白细胞减少，血小板减少，B淋巴细胞减少及T淋巴细胞减少，贫血，传染性疾病，癌症，白细胞增多，爱滋病，神经变性性疾病（阿尔茨海默症，多发性硬化，等），预防或治疗神经元损伤，预防或治疗骨代谢紊乱（骨质疏松症，等）或组织修复。
通常通过口服或肠胃外施用，优选的经口服、静脉内或心室内，全身地，或部分地施用本发明的多肽。
根据年龄、体重、症状，所需的治疗效果，施用途径和治疗期等确定施用剂量。在成年人中，每人每剂的口服剂量通常在100μg和100mg之间，可达每天数次，肠胃外施用为10μg和100mg之间，可达每天数次。
如上文提到的，根据各种条件确定使用的剂量。因此，也存在使用低于或高于上述剂量范围的情况。
可以以固体组合物，液体组合物或其它组合物经口服，以注射剂、搽剂或栓剂等经肠胃外施用，来施用本发明的化合物。
用于口服的固体组合物包括压片剂，丸剂，胶囊，可分散粉末、颗粒。胶囊包括软胶囊和硬胶囊。
在所述组合物中，将一种或多种活性化合物与至少一种惰性稀释剂（如乳糖，甘露醇，葡萄糖，羟丙基纤维素，微晶纤维素、淀粉、聚乙烯吡啶烷酮，硅铝酸镁等）混合。组合物也可含有，象通常实践的那样，除惰性稀释剂以外的附加物质：如润滑剂（如硬脂酸镁等），崩解剂（如纤维素甘醇酸钙等）稳定剂（如血清白蛋白，乳糖，等），及溶解助剂（如精氨酸，天冬氨酸等）。
如果需要，可以用一种胃或肠物质胶膜（如糖，明胶，羟丙基纤维素或邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素等）或两种以上胶膜包被片剂或丸剂。另外，包衣可包括在可吸收物质如明胶胶囊内的外壳。
其它口服组合物包括可用已知方法制备并含有一种或多种活性化合物的喷剂组合物。喷剂组合物可含有除惰性稀释剂外的附加物质：如稳定剂（亚硫酸钠等），等渗缓冲剂（氯化钠，柠檬酸钠，柠檬酸等）。为了制备所述的喷剂组合物，如可以用美国专利No.2，868，691或3，095，355（全文引入本文作为参考）中描述的方法。
注射剂可以含有除惰性稀释剂外的附加成分：如防腐剂，湿润剂，乳化剂，分散剂，稳定剂（如人血清白蛋白，乳糖，等），和助剂，如溶解助剂（精氨酸，天冬氨酸，等），
例如，通过挡住细菌的滤器过滤，或在组合物中掺入稳定剂或照射将组合物灭菌。如，经冻干也可以将它们加工成无菌固体组合物的形式，在即将使用前，将其溶解于用于注射的无菌水或一些其它无菌稀释剂中。
肠胃外施用的其它组合物包括含有一种或多种活性化合物并可用已知方法制备的外用液体，皮肤搽剂（软膏等），经***施用的栓剂和***栓剂。
实施例
下列实施例是为了说明而不是限制本发明。
实施例1：人细胞系FLEB14的Northern分析：
将人原B细胞系FLEB14细胞（参见Katamine S.等人，Nature309，369（1984））匀浆。将匀浆物与寡聚-dT纤维素一起保温。洗涤后，洗脱poly（A）RNA（Vennstorm，B等人，Cell，28，135（1982））。在1.0%琼脂糖凝胶中电泳1μg的多聚（A）RNA，然后吸印到硝酸纤维素膜上。
在39℃，50%甲酰胺，5×SSC，0.1%SDC，0.1%SDS，5×Denhaldt's，0.1mg/ml鲑精DNA中，将该膜与32P-标记的小鼠SDF-1（在日本专利申请No.5-22098中描述为SEQ ID No.3;在SEQ ID No.9中列出了该序列;由于从小鼠发现了另一种SDF-1，所以现在称该因子为SDF-1α）cDNA杂交，在50℃，用0.3M NaCl，30mM柠檬酸钠，0.1%SDS洗涤，然后放射自显影。3.5kb和1.9kb mRNA被杂交。
实施例2：由人原B细胞系mRNA制备cDNA
用常规方法（参见Molecular Cloning：Sambrood，J.，Fritsh，E.F.，& Maniatis，T，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））从人原B细胞系FLEB14细胞构建cDNA文库。用Time Saver cDNA合成盒（Pharmacia）合成cDNA。
用反转录酶和寡聚-dT引物，从FLEB14多聚（A）-RNA（5μg）合成第一条链。然后用DNA聚合酶I，合成双链cDNA。
将cDNA与EcoRI-NotI衔接头连接：
AATTCGCGGCCGCT
GCGCCGGCGAP
然后磷酸化，用玻璃粉（Geneclean Ⅱ DNA纯化盒，可从Bio101得到）从0.8%琼脂糖凝胶中回收长于800bp的cDNA。
实施例3：制备cDNA文库并交叉杂交
将得到的cDNA与含有用磷酸酶处理过的EcoRI臂的λgt10噬菌体载体（可从Stratagene得到）连接。
用体外包装药盒LAMDA INN（可从Nihon gene得到）的方法完成体外包装。用重组噬菌体转染宿主大肠杆菌NM514（可从Stratagene得到）。得到含1×106噬菌斑的cDNA文库。将1×106个cDNA文库的λgt10噬菌斑转染至硝酸纤维素膜上。在39℃，50%甲酰胺，5×SSD，0.1%SDS，5×Denhaldt's，0.1mg/ml鲑精DNA中，将该膜与32P-标记的小鼠SDF-1αcDNA（SEQ ID No.9中所示，与实施例1中所用的相同）杂交，在50℃，用0.3M NaCl，30mM柠檬酸钠，0.1%SDS洗涤并放射自显影。得到40个阳性克隆。
实施例4：分离阳性克隆
用常规方法（参见Cell Technology Experimental Protocol.pp8，Shuujun-sha出版），从9个阳性克隆中制备噬菌体DNA。用NotI消化噬菌体DNA。用琼脂糖凝胶电泳测量***cDNA的长度。8个克隆的长度是1.9kb，1个克隆的长度是3.5kb。因此认为这两种类型的克隆几乎是来自Northern分析结果的，全长的人SDF-1α和SDF-1βcDNA。
从1.9kb的8个克隆中，捡出一个克隆的cDNA，3.5kb长的克隆用NotI消化，然后经琼脂糖电泳，切出片段，将其亚克隆至质粒pBluescript的NotI位点。
实施例5：制备限制酶图谱并测序
制备人SDF-1（1.9kb）的限制酶图谱（示于图1）。将每个限制酶片段cDNA亚克隆至pBluescript，然后确定每个***片段两末端约300bp的核苷酸序列。组合这些序列，确定全长的核苷酸序列（SEQ ID No.3中所示）。
确定来自全长cDNA核苷酸序列的开放阅读框架和氨基酸序列，结果列于SEQ ID No.1。与已知的信号肽进行比较，将得到的N-末端的30-40个氨基酸与已知的信号肽比较，推测出本发明多肽的信号肽，并在SEQ ID No.4列出了所得的序列（参见Von Heuane，G.Nucleic Acids Res.14，4683，（1986））。用与上述相同的方法，得到3.5kb克隆的限制酶图谱（列于图2），全长的核苷酸序列（列于SEQ ID No.7），开放阅读框架（列于SEQ ID No.6），氨基酸序列（列于SEQ ID No.5）以及含信号肽的序列（列于SEQ ID No.8）。
3.5kb克隆与1.9kb克隆的推测的氨基酸序列彼此很相似。因此，将1.9kb克隆命名为SDF-1α，3.5kb克隆命名为SDF-1β。
用荧光测定仪（由Applied Biosystem Inc.提供），经循环序列法确定核苷酸序列。由DNA测序仪（Model 373，由Applied Biosystem Inc.提供）完成核苷酸序列的阅读。
在数据库（GENBANK和EMBL用于DNA检索，NBRF和SWISSPROT用于氨基酸序列检索）中，用计算机检索SDF-1α和1β核苷酸序列与推测的氨基酸序列的同源性。确认本发明的cDNA编码新多肽。
实施例6：构建用于制备表达载体的质粒载体
使用表达载体pUC-SRαML-1（在欧洲专利申请No.559428中公开了该载体本身和其制备方法）的衍生物。***下列两种片段以构建该衍生物：即分别在多克隆位点中的PstI和SacI之间***片段T7
5'  GTAATACGACTCACTATAGGGGAGAGCT  3'  (SEQ ID NO. 12)
3'  ACGTCATTATGCTGAGTGATATCCCCTC   5'  (SEQ ID NO. 13)
在SpeI和KpnI位点之间***片段SP6
5'  CTAGTCTATAGTGTCACCTAAATCGTGGGTAC  3'  (SEQ ID NO. 14)
3'  AGATATCACAGTGGATTTAGCAC  5'  (SEQ ID NO. 15)
用PstI和SacI消化pUC-SRαML1载体，将所得的消化物经琼脂糖凝胶电泳制备，并回收约4.1kbp的片段，此后经BAp（细菌碱性磷酸酶）处理除去5′-末端的磷酸基团。将磷酸化的DNA片段T7与从pUC-SRαML1得到的约4.1kbp片段相连接，并使其成环状。另外用SpeI和KpnI消化所得的载体，使所得的消化产物进行琼脂糖凝胶电泳制备，并回收约4.1kbp的片段，此后经BAp（细菌碱性磷酸酶）处理除去5′-末端的磷酸基团。将磷酸化的DNA片段SP6与由此制备的约4.1kbp片段相连，使其形成环状。用该方法构建的质粒载体称为pUC-SRαML2（见图3）。
实施例7：构建表达载体
对于hSDF-1α，合成引物X，Y和YH。引物X，Y和YH的序列如下：
用由此合成的寡核苷酸X和Y作为引物，将hSDF-1α质粒进行PCR扩增。由此得到的PCR片段含有一个位于5′与起始密码子相连的序列，即相当于本领域专业人员熟知的Kozac序列和编码由hSDF-1α蛋白质组成的蛋白质分子的cDNA。用SalI和NotI消化该PCR片段，并分离纯化所得的消化物，然后***至实施例6中制备的pUC-SRαML2的SalI-NotI位点以得到表达载体pUC-SRαML2-hSDF-1αA。
另外，用合成的寡核苷酸X和YH作为引物，将hSDF-1α质粒进行PCR反应。由此得到的PCR片段含有位于5′端与起始密码子相邻的序列，即相当于本领域专业人员熟知的Kozac序列，和编码由hSDF-1α蛋白质和与其c-末端相连的6个组氨酸（His）残基组成的蛋白质分子的cDNA。用SalI和NotI消化该PCR片段，分离并纯化所得的消化产物，然后***至实施例6中制备的pUC-SRαML2的SalI-NotI位点以得到表达载体pUC-SRαML2-hSDF-1αB。
对于hSDF-1β，合成引物Z和ZH。引物Z和ZH的序列如下：
Figure 941170675_IMG3
用由此合成的寡核苷酸X和Z作为引物，将hSDF-1β进行PCR反应。由此得到的PCR片段含有位于5′端与起始密码子相邻的序列，即相当于本领域专业人员熟知的Kozac序列，和编码由hSDF-1β蛋白质组成的蛋白质分子的cDNA。用SalI和NotI消化该PCR片段，分离并纯化所得的消化产物，然后***至实施例6中制备的pUC-SRαML2的SalI-NotI位点以得到表达载体pUC-SRαML2-hSDF-1βA。
另外，用合成的寡核苷酸X和ZH作为引物，将hSDF-1β质粒进行PCR扩增。由此得到的PCR片段含有位于5′端与起始密码子相邻的序列，即相当于本领域专业人员熟知的Kozac序列和编码由hSDF-1β蛋白质和与其C-末端相连的6个组氨酸（His）残基组成的蛋白质分子的cDNA。用SalI和NotI消化该PCR片段，分离并纯化所得的消化产物，然后***至实施例6中制备的pUC-SRαML2的SalI-NotI位点以得到表达载体pUC-SRαML2-hSDF-1βB。
分别将由此构建的pUC-SRαML2-hSDF-1αA，pUC-SRαML2-hSDF-1αB，pUC-SRαML2-hSDF-1βA和pUC-SRαML2-hSDF-1βB质粒转染至大肠杆菌菌株DH5中，从100ml所得转化体的培养物中回收，然后用CsCl密度梯度离心纯化两次。
实施例8：在COS细胞中表达
用二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖方法（J.Immunology，Vol.136，P.4291，1986），分别将质粒DNA制品pUC-SRαML2，pUC-SRαML2-hSDF-1αA，pUC-SRαML2-hSDF-1αB，pUC-SRαML2-hSDF-1βA和pUC-SRαML2-hSDF-1βB导入COS-7细胞（Cell，Vol.23.P.175，1981）。
即，将约1.8×106个COS-7细胞接种至含50ml液体培养基（Dulbecco′s改良MEM培养基并补充了10%去除补体的胎牛血清）的225cm2容积的烧瓶（由Corning生产）中。在二氧化碳培养箱中（37℃，5%CO2）过夜培养后，随后除去培养上清液，向每个烧瓶中加入12mlDNA混合液（Dulbecco's改良MEM培养基，并补充了各15μg的每种质粒DNA，50mM Tris-HCl缓冲液（PH7.4）和400μg/ml的DEAE-葡聚糖），然后在5%CO2气体中，于37℃培养3小时。此后，用15ml氯喹溶液代替DNA混合液（Dulbecco's改良MEM培养基，并且添加了150μM氯喹和7%去除补体的胎牛血清），接着再培养3小时。
除去氯喹溶液后，将上述的液体培养基（50ml）加至每个烧瓶中，然后在5%CO2空气中，于37℃培养72小时，发现在每个烧瓶中，细胞几乎都长成单层。除去培养上清液后，用无血清的液体培养基（商标：SFM-101;可从Nissui Pharmaceutical Co.Ltd.得到）洗涤每个烧瓶中的细胞，然后加入25ml相同的无血清液体培养基，然后继续培养72小时。此后，回收所得的培养上清液，并经膜滤器（商标：STERIVEX-GS;可从Millipore Corp.得到）过滤以除去细胞和细胞碎片。将由此得到的培养上清液于4℃贮存以备后用。期望已用含hSDF-1α和βcDNA***片段的质粒转化的COS细胞培养上清液含有相当于hSDF-1α和β的多肽的表达并分泌的成熟蛋白质部分。
实施例9：表达的确证
用离心浓缩滤器（商标：Centricon-10;可从Millipore Corp.得到）将实施例8中得到的各2ml的每种转化COS细胞的培养上清液浓缩至体积为100μl。将各1μl由此浓缩的每种样品与相同体积用于SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）的载样缓冲液（0.125 M Tris-HCl缓冲液（pH6.8），4%十二烷基磺酸钠和30%甘油）混合，然后在90℃，将混合物处理3分钟，然后进行SDS-PAGE电泳。
如果hSDF-1αB和βB在蛋白质的C末端导入有His六聚体，则不仅将其相应的COS细胞培养上清液而且将其纯化产物均经SDS-PAGE分析。
用金属螯合物亲和层析法（Biotechnology，Vol.9.P.273，1991），利用His与各种过渡性的金属离子可形成复合化合物的功能，完成蛋白质的纯化。即，将由COS细胞得到的培养上清液（350ml）与一定量（该数量可使盐的终浓度为1M）的氯化钠水溶液混合，使所得的混合物流过用4ml锌结合的螯合琼脂糖（Sepharose）（商标：Chelating Sepharose Fast-Flow;可从Pharmacia购买）填装的柱，以便将蛋白质吸附在树脂上。用含1M氯化钠水溶液和0.4M咪唑的50mM磷酸盐缓冲液（pH7.0）洗脱保留在柱上的蛋白质。然后，将所得洗脱液浓缩至100μl体积，将部分浓缩样品经SDS-PAGE分析。用SDS10/20梯度凝胶完成SDS-PAGE分析，分别检测相当于hSDF-1α和hSDF-1β分子量的产物。
序列表
（1）一般资料：
（ⅰ）申请人
（A）名称：Qno Pharmaceutical Co.，Ltd.
（B）街道：1-5，Doshomachi 2-chome
（C）城市：Chuo-ku，Osaka-shi
（D）州：Osaka
（E）国家：Japan
（F）邮政编码（ZIP）：541
（ⅱ）发明题目：新多肽及编码它们的DNA
（ⅲ）序列数：20
（2）SEQ ID No：1的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：89个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）几何结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：1
Figure 941170675_IMG4
（2）SEQ ID No：2的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：267个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）几何结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA到mRNA
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：2；
Figure 941170675_IMG6
（2）SEQ ID No：3的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：1856个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）几何结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA到mRNA
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：3;
（2）SEQ ID No：4的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：1856个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）几何结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA到mRNA
（Ⅴ）来源：
（A）生物：Homo Sapiens
（H）细胞系：FLEB14
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：CDS
（B）位置：80..349
（C）鉴别方法：利用与某些其它模式的相似性
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：信号肽
（B）位置：80..142
（C）鉴别方法：利用与已知序列或已建立的一致序列的相似性
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：成熟肽
（B）位置：143..346
（C）鉴别方法：利用与已知序列或已建立的一致序列的相似性
（ⅸ）序列描述：SEQ ID No：4：
Figure 941170675_IMG8
Figure 941170675_IMG9
（2）SEQ ID No：5的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：93个氨基酸
（B）类型：氨基酸
（D）几何结构：线性
（ⅱ）分子类型：蛋白质
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：5
Figure 941170675_IMG10
（2）SEQ ID No：6的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：279个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）几何结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA到mRNA
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：6：
（2）SEQ ID No：7的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：3526个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）几何结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA到mRNA
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：7：
Figure 941170675_IMG12
Figure 941170675_IMG14
（2）（2）SEQ ID No：8的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：3526个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）几何结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA到mRNA
（ⅵ）来源：
（A）生物：Homo Sapiens
（B）细胞系：FLEB14
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：CDS
（B）位置：80..361
（C）鉴别方法：利用与某些其它模式的相似性
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：信号肽
（B）位置：80..142
（C）鉴别方法：利用与已知序列或已建立的一致序列的相似性
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：成熟肽
（B）位置：143..358
（C）鉴别方法：利用与已知序列或已建立的一致序列的相似性
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：8：
Figure 941170675_IMG15
Figure 941170675_IMG17
Figure 941170675_IMG18
（2）SEQ ID No：9的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度1797个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）几何结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA到mRNA
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：9：
Figure 941170675_IMG20
（2）SEQ ID No：10的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：14个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：双链
（D）几何结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：10
AATTCGCGGC CGCT
（2）SEQ ID No：11的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：10个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：双链
（D）几何结构：线性
（ⅱ）分子类型：cDNA
（ⅸ）特征：
（A）名称/关键词：misc-特征
（B）位置：1
（D）其它资料/标记＝磷酸化的
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：11
AGCGGCCGCG
（2）SEQ  ID  No：12的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：28个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：双链
（D）几何结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（合成的）
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：12
GTAATACGAC  TCACTATAGG  GGAGAGCT 28
（2）SEQ ID No：13的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：28个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：双链
（D）几何结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（合成的）
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：13
GTCCCCTATA  GTGAGTCGTA  TTACTGCA 28
（2）SEQ ID No：14的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：32个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：双链
（D）几何结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（合成的）
（ⅹⅰ）序列描述SEQ ID No：14
CTAGTCTATA  GTGTCACCTA  AATCGTGGGT  AC 32
（2）SEQ ID No：15的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：23个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：双链
（D）几何结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（合成的）
（ⅹⅰ）序列描述SEQ ID No：15
CACGATTTAG GTGACACTAT AGA 23
（2）SEQ ID No：16的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：44个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）几何结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（合成的）
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：16
AATATAGTCG ACCACCAT GA ACGCCAAGGT CGTGGTCGTG CTGG 44
（2）SEQ ID No：17的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：37个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）几何结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（合成的）
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：17
CGGCGGACTA GTTTACTTGT TTAAAGCTTT CTCCAGG 37
（2）SEQ ID No：18的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：55个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）几何结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（合成的）
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：18
GCCGCCACTA GTTTAGTGGT GGTGGTGGTG GTGCTTGTTT AAAGCTTTCT CCAGG 55
（2）SEQ ID No：19的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：39个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）几何结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（合成的）
（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID No：19
CGGCGGACTA GTTCACATCT TGAACCTCTT GTTTAAAGC 39
（2）SEQ ID No：20的资料：
（ⅰ）序列特征：
（A）长度：57个碱基对
（B）类型：核酸
（C）链型：单链
（D）几何结构：线性
（ⅱ）分子类型：DNA（合成的）
（ⅹⅰ）序列描述SEQ ID No：20
GCCGCCACTA GTTCAGTGGT GGTGGTGGTG GTGCATCTTG AACCTCTTGT TTAAAGC 57
附图的简要描述：
图1…图1列出了人SDF-1α cDNA的限制酶图谱。
图2…图2列出了人SDF-1β cDNA的限制酶图谱。

Claims (20)

1、一种含有SEQ  ID  No∶1所示氨基酸序列的基本上纯化的多肽，其同系物或该序列片段或片段的同系物。
2、根据权利要求1的多肽，包含有SEQ ID No：1所示的氨基酸序列。
3、编码权利要求1多肽的DNA。
4、根据权利要求3的DNA，含有SEQ ID No：2所示的核苷酸序列或能与SEQ ID No：2选择性地杂交的其片段。
5、根据权利要求3的DNA，含有SEQ ID No：3所示的核苷酸序列或能与SEQ ID No：3选择性地杂交的其片段。
6、一种复制和表达载体，含有权利要求3到5任一权项所述的DNA。
7、用权利要求6的复制及表达载体转化或转染的宿主细胞。
8、一种生产多肽的方法，包括在可有效表达权利要求1或2多肽的条件下，培养权利要求7的宿主细胞。
9、一种抗权利要求1或2的多肽的单克隆或多克隆抗体。
10、一种药物组合物，含有权利要求1或2的多肽或权利要求9的抗体及药物学可接受的稀释剂和/或载体。
11、一种含有SEQ ID No：5所示氨基酸序列的基本上纯化的多肽、其同系物或所述序列的片段或片段的同系物。
12、根据权利要求11的多肽，含有SEQ ID No：5所示的氨基酸序列。
13、编码权利要求11多肽的DNA。
14、根据权利要求13的DNA，含有SEQ ID No：6所示的核苷酸序列或能与SEQ ID No：6选择性杂交的其片段。
15、根据权利要求13的DNA，含有SEQ ID No：7所示的核苷酸序列或能与SEQ ID No：7选择性杂交的其片段。
16、一种复制及表达载体，含有权利要求13到15中任一权项所述的DNA。
17、用权利要求16的复制及表达载体转化或转染的宿主细胞。
18、一种生产多肽的方法，包括在可有效表达权利要求11或12的多肽的条件下，培养权利要求17的宿主细胞。
19、一种抗权利要求11或12的多肽的单克隆或多克隆抗体。
20、一种药物组合物，含有权利要求11或12的多肽或权利要求19的抗体以及药物学可接受的稀释剂和/或载体。
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