CN1225278A - 体内染色组合物,其制法及用于确认发育异常组织的方法 - Google Patents

Abstract

合成、分离和确定甲苯胺蓝O(“TBO”)的两个构象异构体N－脱甲基和N,N－脱甲基衍生物的方法。体内生物染料组合物,包括TBO的构象异构体和这些N－和N,N－脱甲基衍生物。这些异构体与这些脱甲基衍生物的比例为至少6∶1。确定发育异常口腔组织的改进方法,包括将这种在液体载体中的TBO产物应用于口腔细胞。确定含有TBO构象异构体和它们的N－和N,N－脱甲基衍生物的TBO产物的HPLC方法。流动相包括有机酸化合物的水溶液。

Description

体内染色组合物，其制法及用于确认发育异常组织的方法

本申请以我在1997年11月13日申请的国际申请PCTUS/97/20981和我在1998年7月6日申请的美国专利申请09/110788号为基础要求多个公约优选权。

本发明涉及新的适于人体内局部使用的生物染色组合物。

具体地说，本发明涉及新的甲苯胺蓝O(“TBO”)染色产品，以一定比例含有TBO和特定TBO衍生物的产品。

另一方面，本发明涉及制备TBO组合物的新方法，所述组合物包括这些新的TBO产品，如我的在先国际申请所述。

此外，本发明涉及改进的制备方法，TBO的产量更高，制备起来更经济，生产设备的制造能力更高，如我的USA申请所公开的那样。

另一方面，本发明涉及这种新的TBO组合物在体内使用，来确定怀疑发育异常即不正常组织的方法。

另一个进一步的方面，本发明涉及组合物，用其在体内诊断的方法，和制备它的方法。该组合物特别适于确定怀疑为发育异常的口腔组织，特别是癌症及癌症前期的组织。

另一方面，本发明涉及新的经合成、分离鉴定和回收的TBO的N脱甲基产物。

另一方面，本发明涉及分析含有构象异构体和其他结构相关的化合物的TBO产物的HPLC方法。

从下面说明书连同权利要求和附图的详细说明中，本领域技术人员将明了本发明的多种实施方式以及实践意义。

图1是254nmHPLC曲线图，描绘已知的和可商购的TBO产物组合物的典型特征峰值。

图2是254nmHPLC曲线图，描绘本发明典型的TBO产物组合物的特征峰值。

图3是生产流程图，描绘我所发现的制备TBO产物包括本发明的新TBO产物组合物的方法。

多数口腔疾患是外伤导致的。但其他的口腔疾患则是发育异常的组织，其中一些可能是良性的，另一些则可能是癌症的或癌症前期的。此外，许多发育异常的组织非常小，容易在常规的外表检查中被牙科医生忽略。

体内诊断试验是已知的确认和描述怀疑为发育异常口腔组织的方法。在授予Mashbergd的美国专利4321251和授予Tucci等人的美国专利5372801中描述了这一筛选试验。近来，已经开发了试剂盒使诊断人能更快更容易地进行该试验，成为其他常规牙科检查过程的一部分，从而在患者并无症状或当发育异常疾患还非常小而通常的外部检查容易忽视其的情况下一次就确认和/或描述被怀疑的部位。一旦由Mashberg方法确认了被怀疑发育异常疾患，可提取活组织检查试样进行组织检查，从而确定该疾患是否是恶性的或癌症前期的。进行这一试验的试剂盒包括由Zila公司许可的、以适宜的量和浓度预混的染色和漂清溶液，可从加拿大由Germiphene公司以ORASCAN^TM商标购得，和从英国、澳大利亚由Stafford-Miller公司以“ORASCREEN^”商标购得。

已经发现可从卖主处商购的现有技术TBO产品中的有机染料含量相当低。典型地，代表这些现有技术产品中的TBO构象异构体的254nmHPLC峰的结合面积(参见实施例3,HPLC方法)只有代表全部TBO和TBO相关成分(即TBO的两个构象异构体加最多到六个TBO相关成分)的254nm HPLC峰的结合面积的约2％-75％。

参见图1,HPLC峰7和峰8代表TBO的两个构象异构体(此处为氯化物盐)： HPLC峰5和峰6被确认为TBO的两个构象异构体的N-脱甲基衍生物：

HPLC峰2和峰3被确认为TBO的两个构象异构体的N,N-脱甲基衍生物：

HPLC峰1和峰4代表的化合物的准确结构尚未确定。

在任何情形下，峰1-4代表的化合物在图1代表的典型现有技术TBO组合物中的存在量高于在本发明中的(见图2)，而峰5-8代表的化合物的存在量则低于在本发明TBO产品中的存在量。现有技术(图1)中，峰5和峰6代表的TBO构象异构体的两个N-脱甲基衍生物以较高的量存在，典型地为有机染料含量的20％以上，高于在本发明TBO产品中的存在量。

1989年11月30日授予Dandliker等人的美国专利418055举例说明了TBO的传统生产方法。此合成是三个氧化反应步骤：(1)氧化N,N-二甲基-对-苯二胺，例如用重铬酸钾，得到2-氨基-5-二甲基氨基苯基硫代磺酸；(2)用邻-甲苯胺缩合硫代磺酸，形成相应的吲哒胺硫代磺酸；和(3)吲哒胺硫代磺酸的闭环反应，例如在氯化锌存在下，于沸腾温度下约30分钟，得到TBO。然后将反应混合物冷却，将闭环反应得到的TBO产物复合并盐析出来，例如用氯化钠和氯化锌处理，沉淀出TBO复合物，例如TBO/AnCl₂复合物。可以通过重复进行重溶解和重沉淀进行纯化，例如在热的氯化锌水溶液中重溶解和用氯化钠/氯化锌重沉淀。

已知的是以前的工作人员用TBO对发育异常进行体内确认时，使用的是上述的现有技术TBO产品，即TBO的构象异构体加N-脱甲基和N,N-脱甲基衍生物的量低于染色组合物的80％的组合物，且其中构象异构体的两个N-脱甲基衍生物构成染料组合物的约20％以上。根据我的信息，以前的工作人员不知道他们的“TBO”产品的准确组成，生产者不能再现性地制备出现有技术的TBO产品。事实上，TBO质量的文献描述普遍为简单的“色值良好的甲苯胺蓝”。生物染料委员会规定了一种分析滴定方法仅仅用来测定材料中的“有机染料成分”。现有技术中对这种模糊定义“TBO”的使用带来的结果是不规则的临床报告以及在获得生产和销售这种用于人的诊断过程的产品所必须的正规许可所面临的严重问题。

简短地说，实现本发明的新组合物是一种TBO产物，其中包括TBO的构象异构体和这些构象异构体的N-脱甲基衍生物，TBO异构体与它们的N-脱甲基衍生物的比例是这样的，即代表TBO异构体的254nm HPLC峰的结合面积与代表它们的N-脱甲基衍生物的峰的结合面积(根据实施例3中HPLC方法测定)之比是至少约6∶1。因此，如图2所示，代表TBO构象异构体的254nm HPLC峰(峰7和8)的结合面积是代表它们相应的N-脱甲基衍生物的254nm HPLC峰(峰5和6)的结合面积的至少约六倍。在本发明优选的实施方案中，峰5,6,7,8代表的成分等于产品中有机染料含量的至少约95％。在最优选的实施方案中，峰8(254nm)的面积代表产品中有机染料含量的至少58％。

本发明还涉及体内确认人体发育异常组织的方法，包括将上述新TBO产品用于人体组织的步骤。

本发明的另一实施方案是再现生产包括上述新TBO产物的TBO组合物的新的一般方法，其中在Dandliker合成的闭环步骤(第三步)之前将复合剂加入到反应混合物中，优选在方法的第一氧化步骤(图3,11)之前加入。

现有技术中Dandliker方法包括以下步骤

在第一反应混合物中氧化N,N-二甲基-对-亚苯基二胺离子，得到第一中间体，2-氨基-5-二甲基氨基苯基硫代磺酸，

氧化第一中间体，在第二反应混合物中用邻-甲苯胺缩合该氧化物，得到第二中间体，吲哒胺硫代磺酸，

在第三反应混合物中氧化第二中间体使吲哒胺闭环，形成溶解于第三反应混合物的TBO反应产物，

向所述的第三反应混合物中引入复合剂，形成TBO复合产物，和

从所述第三反应混合物中分离所述的TBO复合物。

我对这一现有Dandliker方法的改进包括，在第三反应混合物形成之前，优选在第二反应混合物形成之前加入复合剂。

根据更进一步和目前优选的、特别适于生产本发明新TBO产物组合物的实施方案，氧化步骤中反应混合物的温度保持在不高于约10℃。

在另一进一步和目前优选的、特别适于改进TBO产品的质量的实施方案中，氧化步骤中反应混合物的pH值保持在如下范围：第一反应混合物约2.8-3.8(优选3.3)，第二反应混合物约3.1-4.1(优选3.6)和第三反应混合物约3.0。

在另一优选的实施方案中，改进了我的如上简述新方法大幅提高TBO产物的产量。

如图1所示，典型的以前可商购的TBO有两个代表TBO的构象异构体的254nm HPLC峰(峰7和8)，和两个已发现是构象异构体的脱甲基衍生物的254nm HPLC峰(峰5和6)。在这个典型的现有技术产品中，TBO的构象异构体与它们的N-脱甲基衍生物的量的比例即构象异构体与N-脱甲基衍生物的峰面积的比小于4∶1。在分离出的现有技术TBO产物中偶尔存在有较高的比例，接近或超过6∶1，但这样的产物的相对量尚不知道或认为不重要。现有技术生产方法在任何情况下都不能再现制备这样的比例较高的TBO产物。

根据最近的临床试验的一般需要，被用于确认发育异常组织人体诊断方法(一般根据Mashberg方法)的TBO中TBO构象异构体与N-脱甲基衍生物的254nm HPLC峰面积的比例至少为约6∶1，即，254nm HPLC峰7和8的结合面积必须至少比254nm HPLC峰5和6的结合面积大六倍。

非常需要提供符合人体诊断试验方法需要的TBO产物组合物，其中构象异构体的254nm HPLC峰的面积与它们的脱甲基衍生物的面积比为至少6∶1。此外，非常需要提供能可靠和再现地制备具有这种一定TBO异构体与TBO脱甲基衍生物比例的TBO产品，并能可靠和再现制造其他TBO产品并提高产量和普遍纯度的生产方法。

图2描绘了本发明典型组合物的254nmHPLC分析图，从中可以看出TBO构象异构体与N-脱甲基衍生物的峰面积比大于约6∶1，即由254nm的结合面积表明为6.68∶1。HPLC峰7和8比峰5和6的结合面积大6.68倍。普遍纯度由HPLC和燃烧试验确定，定义为[100减燃烧残渣的百分数]乘以本发明TBO产物的HPLC纯度(即，峰5,6,7和8的峰面积之和除以总的峰面积)，至少为大于75％，与之相比大多数现有技术组合物的为2-10％。偶尔，现有技术中可得到纯度较高的产品，但不能再现。

根据我的发明，在2-位有环上甲基(如参见式Ⅰ)的峰(峰3,6和8)面积与在4-位有环上甲基(如参见式Ⅱ)的峰(峰2,5,7)的面积比为约2.5∶1。相反，据我所知，现有技术产品的此比例不大于1.5∶1。

据我所知现有技术产品中尚无这种峰7+8面积∶峰5+6面积比例高同时峰3+6+8∶峰2+5+7面积比也高的。因为峰8是TBO峰的主要峰，其结构被广泛接受为TBO结构，故峰3,6和8比峰2,5和7要优选。当然，峰7和8比峰5和6要优选，而峰5和6又比峰2和3要优选。故在本发明的最优选的实施方案中，所得产品同时满足了上述两个比例要求。

图3是制备TBO产品的方法的工艺流程图，所述产品满足根据Nashberg方法进行临床使用的常规需要。

图3合成方法的起始原料10是可商购的高纯度N,N-二甲基-对-亚苯基二胺：

第一种反应混合物的形成：

氧化11起始原料10的水溶液，优选在低于10℃，特别是低于约5℃下，与适宜的氧化剂12，如重铬酸钾12反应，在有酸、硫酸铝和试剂13(据信用于中间体复合，在本方法较后步骤中用来复合TBO组合物成分)如氯化锌的存在下进行。然后加入硫代磺酸离子14，如硫代磺酸钠，形成含有第一中间体2-氨基-5-二甲基氨基苯基硫代磺酸的第一反应混合物15：第二种反应混合物的形成：

然后，在缩合步骤18中第一反应混合物15进一步反应，优选在不高于约10℃的温度下与附加的氧化剂16如重铬酸钾和邻-甲苯胺盐酸盐17反应，在第二反应混合物19中形成第二中间体，一种缩合产物，吲哒胺硫代磺酸：

第三种反应混合物的形成：

然后，第二反应混合物19进一步氧化21，优选加入适宜的氧化剂22，如重铬酸钾，在不高于约10℃的温度下进行。跟着加入硫酸铜、氯化锌复合剂及酸，并加热至100℃使吲哒环闭环，在第三反应混合物24中形成TBO。此时，从第三反应混合物中分离TBO并提纯。TBO的分离/纯化：

举例来说，在本发明方法的优选实施方案中，用适宜的复合剂25如氯化锌进行复合24，将TBO从第三反应混合物中沉淀出来形成复合的TBO-氯化锌复盐。从液相中将沉淀过滤26出来并用氯化钠溶液27洗涤。经洗涤的滤饼在临界¹体积的水29中重溶解28，形成TBO溶液30，然后过滤31除去未溶解的固体32a并将其丢弃。然后向滤液32中加入氯化锌、临界²体积/氯化钠浓溶液33再将TBO-氯化锌复盐沉淀出来，如图所示(只表示了一种构象异构体)

从混合物中过滤分离出TBO-氯化锌复盐，产生TBO-氯化锌/TBO氯化物滤饼34。[¹如果使用太多的水会阻止TBO的分离。如果水太少(1)不能使全部的TBO溶解，降低产率及(2)降低产品的纯度。²如果使用的氯化钠太少，就不能将全部产物盐析出来，降低产率。如果氯化钠的量太大，会使杂质随TBO一起沉淀出来降低产物的纯度。]

如虚线35所示，TBO滤饼可被重溶解、过滤、重沉淀和重分离多次，获得理想的纯度并制得TBO。然后，经提纯的最终滤饼复合物产物34经干燥35，如用传统的对流炉和/或真空炉，干燥的滤饼36经粉碎和混合37，得到最终的TBO产品38。最终的TBO产品中含有TBO的氯化锌复盐(式Ⅹ)和TBO的氯化物盐(式Ⅰ和Ⅱ)。

在第三反应混合物形成之前即吲哒胺硫代磺酸氧化之前引入复合剂，复合所得TBO反应产物以形成TBO-复合物，制得一种TBO构象异构体与其N-脱甲基产物的比例有所改进的TBO复合产物。如果在第三反应混合物形成之前引入复合剂，就可以得到至少6∶1的比例。当然，本领域技术人员将会知道，要获得这种异构体与脱甲基衍生物的改进比例在某些程度上还依赖于其他操作参数的控制。在下面的本发明方法的优选实施方案的描述中将对此进行讨论，这些参数对提高TBO-复合产物的产率和纯度均是理想的。但是，即使如此控制其他的改进产率和纯度的参数，也得不到异构体与N-脱甲基产物的理想改进比例，也得不到甲基在2位与甲基在4位的峰的理想改进比例，除非至少在第三反应混合物形成之前，即吲哒胺硫代磺酸的氧化之前加入复合剂将所得的TBO产物复合。

目前，我相信较早加入复合剂，即在第三反应混合物形成之前加入将改进最终产物的异构体：N-脱甲基衍生物比例，因为起始原料和/或硫代磺酸和/或吲哒胺硫代磺酸复合物的较早形成对脱甲基化具有明显的位阻作用。换句话说，由于尺寸和结构的加大，复合物形成位阻(可能有电荷影响)将N-甲基保护起来不致氧化脱甲基。由于三个反应步骤全都包括氧化和可能的脱甲基化，这种复合物越早形成越好，这就是我之所以建议复合剂近可能早使用的原因。

根据本发明进一步和最优选的实施方案，如上述我以前的美国专利申请所公开的，由于向第一反应混合物中引入硫代磺酸离子形成第一中间体，并保持反应混合物在约10℃的较低温度下，在升高温度至较高温度之前持续在这一较低温度下进行反应，我的上述方法的产率明显提高。因此，在吲哒胺硫代磺酸中间体的生产中，包括氧化含有氧化剂的反应混合物中的N,N’-二甲基-对-亚苯基二胺，引入硫代磺酸离子，然后升高温度至较高温度将近30分钟，形成溶于反应混合物的吲哒胺硫代磺酸溶液，通过在升高温度形成吲哒胺硫代磺酸反应混合物溶液之前保持氧化-硫代磺酸化混合物的温度等于或低于约10℃将近30分钟，使得从整个方法得到TBO产物的总产率大幅提高。

实施例

下面实施例举例说明了本发明的实施，以便本领域技术人员制造和使用新的TBO组合物，用这种新TBO组合物实践新诊断方法，实践制备TBO组合物的新方法和本发明的许多实施方案，并向本领域技术人员描述目前已知的实施本发明的各实施方案的最好方式。这些实施例仅作为举例说明，对发明的范围不作限制，发明范围仅由所附权利要求定义。

实施例1

制备方法

本实施例详细说明符合GMP条件一般要求、以普通工业规模批量生产TBO染料产品的准确方法。

原料溶液的制备

仪器/器材：

A、Ohaus IP15KS天平

B、AnD HV150KAI天平

C、Fairbanks H90-5150天平

D、OHAUS WB25/1-20W天平

E、Cole Parmer(51201-30)和Thermolyne(S25535)搅拌器

F、取样器，如钢匙，取样筒等

G、Erlyenmeyer烧瓶、烧杯、坛和其他适宜的玻璃器具

H、制备溶液的标签安全要求

处理化学试剂时应按照MSDS指南穿戴安全防护服装，如手套、安全眼镜、实验室服装和面罩。原料溶液制备方法

向1364.2g(±5.5g)盐酸中加入1364.2g(±5.5g)USP纯水。搅拌直至溶液澄清。

向1779.1g(±7.0g)硫酸铝十六水合物中加入2548.9g(±10.0g)USP纯水。搅拌直至溶液澄清。

向7384.6g(±30.0g)氯化锌中加入2786.7g(±11.0g)USP纯水。搅拌直至溶液澄清。

向2102.9g(±8.0g)重铬酸钾中加入25203.8g(±100g)USP纯水。搅拌直至溶液澄清。

向1526.6g(±6.0g)硫代硫酸钠五水合物中加入2043.6g(±8.0g)USP纯水。搅拌直至溶液澄清。

向509.7g(±2.0g)硫酸铜五水合物中加入1613.1g(±6.0g)USP纯水。搅拌直至溶液澄清。

向600.0g(±2.0g)硫酸中加入600.0g(±2.0g)USP纯水。搅拌直至溶液澄清。

向70.4kg(±250g)氯化钠中加入234.4kg(±850g)USP纯水。搅拌直至溶液澄清。

合成

合成仪器和器材

LFE控制板(3000)

20加仑有盖夹层玻璃管线提纯罐(E71224)

两个100加仑有盖夹层玻璃管线提纯罐(P1,PT-001)(P2,L-13621)

FTS循环冷却器(RC96C032)和500加仑冷却储罐(500CST)

三个带有旋转轴和叶轮的Caframo混合器(BDC-1850)(R1,18500961)(P1,18501148)(P2,18501173)

Lightning混合器(L1U08)(201550)

三个热交换器(Gardner Machinery)(R1,01960763)(P1,01960764)(P2,08950727)

三个12KW夹层液流循环器(Watlow,BLC726C3S20)

三个循环泵(Sta-Rite,JBHD-62S,C48J2EC15)

Masterflex数字式蠕动泵(A94002806)

Masterflex蠕动泵(L95003320)

Cole Parmer蠕动泵(B96002074)

Neutsche过滤装置(70-2038,43421-1)

两个Buchner过滤装置(Z11,624-6,Z10,441-8)

西门子真空泵(F2BV2)

60加仑有盖玻璃管线收集器(86854,E164-1186)

空气压缩机(DF412-2)(9502312538)

液流控制器(3-5500)(69705069190)

六个容量控制器(3-5600)(#1,69705069191,#2,69705069199,#3,69705069194,#4,69705058829,#5,69705058805,#6,69705069195)

六个流量传感器(#1,69704295165,#2,69704024995,#3,69704024994,#4,69704025027,#5,69612178606,#6,69703120990)

四个薄膜式泵(M1)

四个平压装置(A301H)(#2,15557,#3,15561,#4,15558,#5,15559)

四个空气调节器(CFR10)

四个电磁阀(与空气调节器一起使用)

四个低液流传感器(FS-500)

三个电磁阀(EASM5V16W20)

空气过滤器/调节器(T1R)PTFE/F06R113AC

过滤介质，聚乙烯(7211-1)

过滤介质，Whatman级52

PharMed管(-18,-82,-90)

pH计；Hanna9321(1303675)及Orion620(001911)

分光光度计20(3MU7202070)

Fisher科技真空炉(9502-033)

VWR1370FM压力空气炉(1370FM)

Dust/Mist面罩

Thomas Wiley实验室用磨(3375-E10)

Patterson-Kelley混合器(Blendmaster,C416578)

OHAUS TS4KD天平

OHAUS IP15KS天平

Mettler AG104天平

AnD HV150KA1天平

Fairbanks H90-5150天平

OHAUS AS123打印机

OHAUS AS142打印机

AD-8121多功能打印机

Citizen iDP 3540点阵打印机

Hewlett Packard HPLC(1050)

超声清洗机(8892-DTH,QCC9601005C)

K型热电偶温度记录仪(KTx,6292753,6355146)

Erlenmeyer烧瓶(8L,6L,4L,1L)

烧杯(8L,6L,500mL,250mL)

坛(4L,10L,50L)

HDPE转筒(55加仑，100加仑)

容量烧瓶(100mL)

塑料漏斗

Pastuer移液管和球管和Volumetric移液管(10mL,5mL)和球管

风箱(25mL,50mL)

称量纸

刮勺

包装材料(容器，盖，标签)

原料溶液

合成：步骤1

2-氨基-5-二甲基氨基苯基硫代磺酸的合成：

检查USP水***的完整性。向反应器中加入称量过的USP级纯水(28000g±100.0g)并以190±10RPM搅拌。在水分散开时记录USP水的导电性。

加入N,N-二甲基-1,4-亚苯基二胺(5.128mol,720.0g±3.0g)。物料应以粉末的形式(无团块)加入。搅拌10分钟(±5分钟)。

加入盐酸(6N,1136.9g±5.0g)。搅拌15分钟(±5分钟)。

按照SOP#LM-007校准pH计。用塑料取样器取将近10mL反应混合物试样。标明试样号#.IPS1a。检测pH值并记录。pH值必须在2.8-3.8@25℃±5℃。

加入硫酸铝十六水合物(4328.0g±21.0g)。以275±10RPM搅拌10分钟(±5分钟)。

加入氯化锌溶液(3641.5g±18.0g)。冷却至4℃±1℃。

一旦温度(PV1)为4℃±1℃，在20分钟(±5分钟)的时间里加入(6532.4g±32.0g)重铬酸钾溶液。添加完成后搅拌20分钟(±5分钟)，然后将主菜单的设定点(SP1)改为25.0℃。

温度达到20.0℃±3.0℃时加入硫代硫酸钠五水合物溶液(3570.2g±18.0g)。在25℃下搅拌溶液30分钟(±5分钟)。

将设定点改为60℃。当温度(PV1)达到60.0℃±3.0℃时搅拌反应混合物5分钟(±3分钟)，将LFE控制仪上的设定点改为10.0。

当温度达到13.0℃±2.0℃时用塑料取样器取约10ml反应混合物试样。标明试样号#.IPS1b。检测pH并记录。pH必须为3.1-4.1@25℃±5℃。

合成：步骤2

吲哒胺硫代磺酸的合成

称量出邻-甲苯胺(604.0g±2.5g)并在冰浴中冷却至18℃±3℃。向邻-甲苯胺中缓慢加入盐酸(6N,1230.7g±5.0g)。从冰浴中取出邻-甲苯胺盐酸盐并将溶液冷却至38℃±3℃。将溶液加入反应混合物中搅拌5分钟(±3分钟)。

在20分钟(±5分钟)时间里加入重铬酸钾溶液(6532.4g±32.0g)。添加完毕时搅拌10分钟(±5分钟)。

将控制仪设定点(SP1)改为60.0。反应混合物的温度达到60.0℃±3℃时搅拌混合物25分钟(±5分钟)。将形成含有绿色吲哒胺的沉淀。

用移液管取约10mL反应混合物试样。标明试样号#.IPS2。记录溶液颜色。

合成：步骤3

甲苯胺蓝O和甲苯胺蓝O氯化锌复盐的合成

将LFE控制仪的设定点设至7.0。当反应混合物的温度达到10.0℃±3℃时以20分钟(±5分钟)的时间里加入重铬酸钾溶液(6532.4g±32.0g)。添加完毕后搅拌20分钟。

以20分钟(±5分钟)时间加入重铬酸钾溶液(5225.9g±26.0g)。添加完毕后搅拌20分钟(±5分钟)。

用移液管量取约10mL反应混合物试样。标明试样号#.IPS3。

加入氯化锌溶液(3641.5g±18.0g)。以350±10RPM搅拌20分钟(±5分钟)。

加入硫酸铜五水合物(2122.8g±10.0g)。搅拌15分钟(±5分钟)。

用移液管取约10mL反应混合物试样。标明试样号#.IPS4。

将控制仪设定点(SP1)改为100.0。当反应混合物温度达到67.0℃±3℃时开始加入硫酸溶液至pH2.9±0.3，通过加入等分试样(500mL,250,125mL，等)。个个添加过程完毕时搅拌5-10分钟，检测pH。

反应混合物温度达到100.0℃±3℃时搅拌混合物35±5分钟。

将控制仪设定点(SP1)改为35.0。当反应混合物温度达到70.0℃±3℃时用移液管取约10mL反应混合物试样。标明试样号#.IPS5。

将控制仪设定点(SP1)改为2.5。在4小时内冷却至2.5℃并在2.5℃±2.0℃下保持4-18小时。

用移液管取约10mL反应混合物试样。标明试样号#.IPS6。记录溶液颜色。检测pH值并记录。用0.45微米滤纸过滤试样。取约100毫克沉淀溶解在约100mL HPLC水中。用0.45微米滤纸过滤溶液。标明试样号#.IPS7并用RP-HPLC甲苯胺蓝O分析方法分析试样。见实施例3。记录结果。

提纯：步骤1

用适宜的过滤介质(Whatman级52)对反应混合物试样进行过滤。

当反应器空着的时候称量24.0kg±150.0g 30％NaCl溶液并加入24.0kg±150.0g USP水(记录分散水的导电性)。关闭反应器的底阀并向其中加入15％NaCl溶液。短暂地搅拌溶液。当过滤完成时向过滤装置中加入NaCl溶液漂清滤饼。将滤液收集在同一容器中并标明#.HW1(有害废物1)。

按照废物处理规程处理滤液(#.HW1)。

检查100加仑夹层玻璃管线提纯罐#1的状况，确保已经标明“清洁”、日期和签名。给提纯罐装上HDPE盖，Caframo搅拌器，搅拌轴，桨叶和***塑料热电偶孔中的热电偶探头。检查底阀关闭、出口盖紧。

给提纯罐标明#.P1A(提纯1A)。

称量190.0kg±1.0kgUSP水，注入HDPE容器中(记录分散水的导电性)，将水移至提纯罐1。以350RPM搅拌混合物。当用NaCl洗涤滤饼完成后边搅拌边将滤饼加入到提纯罐1中。

搅拌混合物2-4小时。取约50mL试样(从底阀)。作上标记#.IPS8。记录溶液颜色。

将提纯罐1的LFE控制仪设定在75.0(SP1)。

当混合物温度(PV1)达到75.0℃±3℃时，将控制仪的设定点改为40.0。

在40℃下以350RPM搅拌混合物12-36小时。

取约50mL试样(由底阀)。标明试样号#.IPS9。记录溶液颜色。检测pH并记录。用1.0mL移液管量取1.0mL试样并在100mL容量烧瓶中稀释到100mL。标明试样号#.IPS9A。然后用10.0mL移液管量取10.0mL此溶液并在100mL容量烧瓶中稀释到100mL。标明试样号#.IPS9B。用分光光度计20+测量这些试样的吸收。记录结果。试样9B的吸收应≥0.220。

提纯：步骤2

在过滤装置中用过滤介质将混合物过滤。将滤液收集在有盖的Tared HDPE容器中。

检查100加仑夹层玻璃管线提纯罐#2的状况，确保已经标明“清洁”日期和签名。给提纯罐装上HDPE盖，Caframo搅拌器，搅拌轴，桨叶和***塑料热电偶孔中的热电偶探头。检查底阀已标明“清洁”、关闭(水平位置)、出口盖紧。

给提纯罐标明#.P2A(提纯2A)，日期和签名。

当过滤完成时称量容器和溶液。扣除容器重量。记录溶液重量。计算溶液体积。

(TBO溶液重量g)(100.0mL TBO溶液/100.42gTBO溶液)=TBO溶液的mL

将滤饼标明#.HW2(有害废物2)并按废物处理规程处理。

称量等于上面记录溶液体积的30％NaCl溶液，注入清洁的HDPE容器，用下式：

(TBO溶液的mL)(116.91gNaCl溶液/100.0mL NaCl溶液)=NaCl溶液g

样品≈10mL的过滤试样，检测pH。标明#.IPS10。pH必须3.0-4.0。将滤液(重量)转至提纯罐2。以350RPM搅拌溶液。

加入氯化锌溶液(1636.3g±6.5g)。

将NaCl溶液(重量)移入提纯罐2。

将提纯罐2的LFE控制仪设定在75.0(SP1)。

当混合物温度(PV1)达到75.0℃±3℃时，将控制仪的设定点改为5.0。

在6小时时间内冷却至5℃并保持在5℃±4.0℃4-24小时。

取约50mL试样(从底阀)。标明试样号#.IPS11.PT2.。

制作方法：

Ⅰ．过滤

在过滤装置中用配衡过滤介质(Whatman级52)过滤混合物。

称量12kg±50g 30％氯化钠溶液，用12kg±50g USP水稀释(记录分散水的导电性)。向布氏漏斗中直接加入15％氯化钠溶液洗涤滤饼。过滤完毕时小心移出装有甲苯胺蓝O产物的滤纸。

按废物处理规则处理#.HW3(有害废物3)。

ⅱ．干燥

将TBO产物放入干燥箱，在50.0℃±3.0℃干燥5±1小时。给干燥箱标明#.PRE-DRY。

从强制空气干燥箱中取出产物，放入真空箱。在45.0℃±3.0℃@28”Hg±2”Hg下干燥10±2小时。给干燥箱标明#.DRY。

ⅲ．称重

取出产物并称量甲苯胺蓝O和滤纸重量。扣除滤纸重量并记录TBO重量。

用不锈钢刮勺小心地从滤纸上除下产物。戴上Dust/Mist面罩。称量甲苯胺蓝。

ⅳ．粉碎

将产物移到“甲苯胺蓝O完成区”。检查Thomas Wiley实验室磨的状况，确保已经标明“清洁”、日期和签名。使用0.5mm筛网。将清洁的容器连到输送槽上。舱室的门必须关闭和锁住。

关闭漏斗底部的滑动开关，打开漏斗盖，加入试样。盖上漏斗盖。开启磨，轻轻打开滑动开关。缓慢将试样装入磨的舱室使磨不至于慢下来或堵住。

粉碎完全时小心地从输送槽上取出瓷瓶。

ⅴ．混合

检查Patterson-Kelly实验室混合器的状况，确保已经标明“清洁”、日期和签名。

将甲苯胺蓝O产物移至混合器容器中并关闭盖子。设定时间为15分钟±5分钟。

ⅵ．测试

作产物试样以备测试。用RP-HPLC甲苯胺蓝O分析方法分析试样。记录结果。

实施例2

临床试验方法

临床试验溶液的制备

此实施例描述实施例1的TBO产物用于鉴别口腔发育异常的用途。

将实施例1的TBO产物、覆盆子香精(IFF覆盆子IC563457)，醋酸钠三水合物缓冲剂和H₂O₂(30％USP)防腐剂(见US专利5372801)溶解在纯水(USP)、冰醋酸和SD18乙醇中，制得TBO试验溶液，其组成如表A所列：

            表A成分                       重量％TBO产物                    1.00香精                        .20缓冲剂                     2.45防腐剂                      .41醋酸                       4.61乙醇                       7.48水                        83.85

                     100.00

在纯水中用1wt％的醋酸预漂洗和后漂洗试验溶液，准备好苯甲酸钠防腐剂和覆盆子香精。

临床方法

给患者披上围布以便保护衣物。估计会有痰，故给患者提供一个10oz的杯子，咳出物可倾倒于有害废物容器或可直接倒进洗涤盆下水道中央以免污染洗涤盆。将可能被污染的环境表面或物品罩起或从试验区移走。

进行口腔癌的目视检查，不使用任何会使软组织产生划痕或切口的器械。用预染色在软组织和牙齿上作出标记。

让患者用约15ml预漂洗溶液漱口约20秒然后吐出，吐去过多的唾液使口腔环境恒定。然后再用预漂洗溶液重复此步骤。

然后，患者用水漂洗和漱20秒，吐出。

然后，患者用30mlTBO试验溶液漂洗和漱口1分钟，吐出。

患者用15ml后漂洗溶液漂洗20秒，吐出。然后重复这一步。

患者用水漂洗和漱口20秒，吐出。然后重复这一步。

对口腔进行观察，必要时使用适宜的软组织检测技术，包括退缩(retraction)、平衡光(well-balanced lighting)和放大。预计的疾患处被染上蓝色，记录位置、大小、形态、颜色和表面特征。

为了减少错误的阳性结果，请患者在10-14天后返回重复上述检测方法。在这一期间让时间去治愈任何第一次检查时存在的溃疡或创伤或刺激病源。第二次检查之后，在第一次检查确定的预计区域出现的阳性染色被认为是癌或癌症前期的表示，应进行活组织检查来确认这一结论。

早期无核红细胞染上蓝色，经常为点彩或块状图样。但是，舌背上的不规则***缝被染上蓝色是正常的，不表示阳性。保持蓝色但不认为是阳性的其他区域包括每颗牙齿的牙斑、牙龈边缘，从舌背保留的染色移走的染料在软腭上形成的渗出染色，以及容易确诊的溃疡。在任何情况下，当某一疾患被高度怀疑但用本检测不呈阳性染色时，无论如何都要进行活组织检查。

实施例3

HPLC方法

本实施例描述一种分析TBO试样的方法，可在确认、分析和提纯试验中使用。

仪器和器材

乙腈，HPLC级

冰醋酸，试剂级

乙酸铵，试剂级

去离子水，适宜于进行HPLC分析的

pH计，配有标准pH4.0和7.0缓冲剂

实验室玻璃器皿，包括容量瓶和移液管

超声浴

分析天平

磁性搅拌器

压缩氦

有0.45微米尼龙过滤器的过滤装置

100μL注射器

HPLC色谱仪和辅助设备，包括

Hewlett Packard系列1050泵，或能够isocratic高压液流的等效设备

Hewlett Packard系列1050二级管阵列探测器，或相当的波长UV探测器

Hewlett Packard Vectra系列3磁盘驱动器(计算机控制器)配有超VGA 1280显示器和激光打印机或等效的积算记录仪

Prodigy,5μ,QDS(3)100A,2.5cm×4.6mm，或等效的HPLC柱

固定环形注射器(10或20μL)

柱加热器

流动相的制备

将0.77g乙酸铵移到1000mL容量瓶中制得1升0.01M乙酸铵溶液。加水，混合至溶解并用水稀释至刻度。将0.010M乙酸铵溶液移到Earlenmeyer烧瓶中，用磁性搅拌器搅拌。使用事先用pH4.0和7.0缓冲剂校准的pH计，用乙酸将溶液的pH值调节到3.3和3.6之间。用0.45μL过滤器将溶液过滤。用Millipore过滤装置通过0.45μ尼龙过滤器过滤乙腈，并向搅拌的乙酸铵水溶液中精确加入250mL。将盛装此流动相的容器放在HPLC泵的入口处，用氦清扫5-10分钟。

TBO试样的制备

准确称出50mgTBO试样，移至100mL容量瓶中并用水稀释到刻度线。盖上烧瓶，超声30分钟并混合。这是约0.5mg/mL的储备液。

将10.0mL储备液移到100mL容量瓶中，用水稀释到刻度线并混合。给这一约0.05mg/mL稀释的TBO工作溶液作上适当的标签。

色谱条件

注射量-10或20μL

流速-约1.5mL/分钟

柱温-40℃

探测器波长-254nm

灵敏度和衰减设定：适宜于所使用的仪器

积分-相应面积

试样的HPLC分析

装配HPLC并用流动相使之达到平衡。用USPⅩⅩⅢ***适用性试验检验所得HPLC数据的精确度和准确度。

每次分析，计算以下参数：

精确度：最少对比五次注射的工作试样。相对标准误差(RSD)必须等于或小于2.0％。峰5-8的结合面积的RSD大于2.0％，但小于3.0％时作六次注射。

分辨率：计算试样的一个色谱图上峰7和8(主要的峰)的基线分辨率，用下面等式： $R=\frac{2(t_2-t_1)}{w_1+w_2}$

其中

t₁=峰7的保留时间，mm

t₂=峰8的保留时间，mm

w₁=峰7的峰宽，mm

w₂=峰8的峰宽，mm

峰7和8之间的分辨率必须大于1.5。

拖尾：测定峰的对称性确保峰下面的面积精确。计算试样的一个色谱图上峰7和8的拖尾因子(T)，用下面等式：

T=W_0.05÷2f

其中

W_0.05=从峰高的基线峰的5％处测定的峰宽

f=峰最大值与W_0.05处峰前部位之间的距离

T应是小于3的因子。

记录色谱，测定主要峰(5,6,7和8)以及所有出现在色谱上的杂质峰(所有的峰，除了前面的溶剂峰)的相应面积。

计算和其他HPLC测定

同一性(TBO药物与药产品)：

制备试样的色谱轮廓应当与图2色谱的轮廓(峰的存在和峰的强度)相同。

相关物质(药物)：

计算每种杂质峰(峰1、2、3和4所示的已知杂质加任何其他杂质的峰)的面积相对于色谱上所有峰的总面积的百分数。

TBO药物的分析：

按照针对杂质的方法，计算四个主要TBO峰(峰5-8)中每一个的百分数，即

经过对我的发明的如此描述，本领域技术人员能够理解和实施本发明，并确定了目前优选的最好方式。

Claims (12)

1．一种新的组合物，包括：

(A)甲苯胺蓝O的构象异构体；和

(B)所述异构体的N-脱甲基衍生物，

代表所述异构体的254nmHPLC峰的结合面积与代表所述N-脱甲基衍生物的峰的结合面积的比为至少约6∶1。

2．一种新的组合物，包括：

    (A)第一组成分，包括-2位上有环上甲基的甲苯胺蓝O的构象异构体，它的N-脱甲基衍生物和它的N,N-脱甲基衍生物；和

    (B)第二组成分，包括-4位上有环上甲基的甲苯胺蓝O的构象异构体，它的N-脱甲基衍生物和它的N,N-脱甲基衍生物；

代表所述第一组成分的254nmHPLC峰的结合面积与代表所述第二组成分的HPLC峰的结合面积的比为至少约25∶1。

3．一种新组合物，包括甲苯胺蓝O的构象异构体，其中-2位上有环上甲基的异构体(峰8)构成所述组合物的有机染料成分总量的至少58％。

4．在确认发育异常组织的方法中，将在液体载体中的权利要求1组合物用于人口腔组织的步骤。

5．在制备甲苯胺蓝O(“TBO”)的方法中，该方法包括如下步骤：

(A)在第一反应混合物中氧化N,N-二甲基-对-亚苯基二胺，形成第一中间体2-氨基-5-二甲基氨基苯基硫代磺酸，

(B)在第二反应混合物中用邻甲苯胺氧化所述第一中间体并缩合该氧化物，得到第二中间体吲哒胺硫代磺酸，

(C)氧化所述第二中间体使吲哒环闭合，得到溶于第三反应混合物中的含TBO的反应产物，

(D)向所述第三反应混合物中引入复合剂，形成溶于所述第三反应混合物中的TBO复合物产物，

(E)从所述第三反应混合物中沉淀所述TBO复合物产物，和

(F)从所述第三反应混合物中分离含有TBO的构象异构体和它的N-脱甲基和N,N-脱甲基衍生物的所述TBO复合物产物，

该改进的方法包括在所述第三反应混合物形成之前向反应混合物中引入所述复合剂。

6．权利要求5的方法，其中反应混合物的温度保持在不高于约10℃。

7．权利要求5的方法，其中反应混合物的pH值保持为：第一反应混合物中约2.8-3.8，第二反应混合物中约3.1-4.1和第三反应混合物中约3.0。

8．甲苯胺蓝O的构象异构体之一的N-脱甲基衍生物。

9．甲苯胺蓝O的构象异构体之一的N,N-脱甲基衍生物。

10．分析甲苯胺蓝O染色产品的HPLC方法，所述方法包括

制备流动相，

制备TBO样品溶液，

用流动相流动平衡HPLC柱，和

将样品溶液注射到HPLC柱中，

确认样品的染色成分和分析、测定所述试样的纯度的改进，所述改进包括将所述流动相制成包括有机酸水溶性盐的组合物。

11．权利要求5的方法，包括向所述第一反应混合物中引入硫代磺酸离子的步骤，其时保持所述第一反应混合物的温度不高于约10℃。

12．合成2-氨基-5-二甲基氨基苯基硫代磺酸的方法，包括在硫代硫酸根离子存在的情况下氧化N,N’-二甲基-对-亚苯基-二胺，其时保持反应混合物的温度不高于约10℃。

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