CN1224471A - 一种制备β－内酰胺抗生素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备β－内酰胺抗生素的方法,其中一种N－取代的β－内酰胺具有如分子式(Ⅰ)所示的通式结构,其中R0是H或C1－3烷氧基;Y是CH2、O、S或S的一种氧化形式,Z是(a)、(b)、(c)或(d),其中R1可以是H,羟基,卤素,C1－3烷氧基,选择性地取代的、选择性地含有一个或多个杂原子的、饱和或不饱和的、支链或直链的C1－5烷基,优选地是甲基选择性地取代的、选择性地含一个或多个杂原子的C5－8环烷基,选择性地取代的芳基或芳杂环,或选择性地取代的苄基;X是(CH2)m－A－(CH2)n,其中m和n相同或不同,且为0、1、2、3或4等的整数之一,A是CH=CH、C≡C、CHB、C=O选择性地取代的N、O、S或S的选择性地氧化形式,同时B可以是H、卤素、羟基、C1－3烷氧基、或选择性地取代的甲基,该N－取代的β－内酰胺亦可以一种盐形式存在,其与至少一种二羧酸酰基转移酶或其同工酶接触,并在至少一种青霉素酰基转移酶或其同工酶存在下与一种前体物质反应以得到β－内酰胺的一种侧链。

Description

一种制备β-内酰胺抗生素的方法
发明领域和背景
本发明涉及了一种制备β-内酰胺抗生素的方法。
β-内酰胺类抗生素如青霉素类和头孢菌素类抗生素均含有很多化合物，且有它们各自的活性特点。通常，β-内酰胺抗生素含有一个母核，即所谓β-内酰胺母核，该母核以其初级氨基基团通过一个线性酰胺键与所谓的侧链连接。
β-内酰胺母核在半合成青霉素和头孢菌素抗生素的制备过程中是一种非常重要的中间体。这些半合成青霉素类和头孢菌素类的制备路线大多是从发酵产物如青霉素G、青霉素V和头孢菌素C开始，它们可转换成相应的β-内酰胺母核，例如：K.Matsumoto在Bioprocess.Techn.(1993,16:67-88)、J.G.Shewale和H.Sivaraman在生物化学方法(Process Biochemistry,1989,8月：146-154)、T.A.Savidge在工业抗生素的生物技术Biotechnology of Industrial Antibiotics)E.J.Vandamme编)Marcel Dekker(纽约，1984)或J.G.Shewale等在国际生物化学方法(Process Biochemistry International,1990,6月：97-103)中所公开的一种方法。
被用作好几种抗生素前体物质的β-内酰胺母核的实例有：6-氨基青霉烷酸(penicillanic acid)(6-APA)、7-氨基头孢烷酸(cephalosporanic acid)(7-ACA)、3-氯-7-氨基去乙酸基去甲基头孢烷酸(7-ACCA)、7-氨基去乙酰基头孢烷酸(7-ADAC)和7-氨基去乙酸基头孢烷酸(7-ADCA)。
β-内酰胺母核通过偶联一个合适的侧链而转化成预期的抗生素，如除了其它之外的EP0 339 751、JP53005185和CH 640 240中所述。通过侧链和β-内酰胺母核的不同组合，可以获得许多不同的青霉素类和头孢菌素类抗生素，它们均有其各自的活性特点。
例如，D-(-)-苯基甘氨酸或其合适的衍生物(如：一种酰胺或酯)可以被结合到7-ACA、7-ACCA、7-ADCA和6-APA的任何一种上而分别形成头孢菌素Ⅲ、头孢克罗、头孢氨苄或氨苄西林。其它经常可用作侧链的例子有：D-(-)-4-羟基苯基甘氨酸、2-氰基乙酸和2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-甲氧基亚氨基乙酸。
已知酶促制备β-内酰胺抗生素的方法均涉及β-内酰胺母核的制备及随之将其偶连到一种合适的侧链上。可参考的酶促合成方法有：T.A.Savidge，工业抗生素生物技术(E.J.Vandamme编)Marcel Dekker，纽约1984；J.G.Shewale等人，国际生物化学方法，1990 6月：97-103；E.J.Vandamme，应用微生物学进展(Advances in AppliedMicrobiology),21,(1977),89-123和E.J.Vandamme,EnzymeMicrob.Technol.,5,(1983):403-416。另外，在EP0 532 341、EP0 540 210、WO93/08287、WO95/04148和WO95/04149中也公开一些新的路线，这些路线报道了7-ADCA和7-ACA的直接发酵生产。
这些方法的一个缺点是侧链的偶连反应起始于β-内酰胺母核，而该母核必须在偶连反应之前就被分离。在分离β-内酰胺母核时通常应用结晶的方法进行，这可损失高达10％的理论产量。由于β-内酰胺母核的两性特点，它易溶于任意pH值的水溶性体系中，因而所产的β-内酰胺母核有大部分损失在结晶母液中。
本发明克服了上述缺点，即引入侧链的反应中起始于一种不同的物质而非β-内酰胺母核。
                      发明概述
本发明的一个目标是提供一种制备β-内酰胺抗生素的方法，其中引入侧链的反应中起始于一种不同的物质而非β-内酰胺母核。
本发明的另一个目标是提供一种制备β-内酰胺抗生素的方法，该方法可以很方便地与已知起始于一些发酵产物如青霉素G或头孢菌素C的酶促方法组合起来。
本发明的另一个目标是提供一种制备β-内酰胺抗生素的方法，该方法是一种清洁、有效、经济易行的方法，换句话说，该方法不导致废水问题或涉及昂贵的化学物质。
上述目标的要求能在一种制备β-内酰胺抗生素的方法中得以满足，其中N-取代的β-内酰胺，有如分子式(Ⅰ)所示的通式结构：
Figure A9880052200061
其中R0是H或C1-3烷氧基；Y是CH2、O、S或是S的一种氧化形式；Z是
Figure A9880052200062
其中R1是H，羟基，卤素，C1-3烷氧基，选择性地取代的选择性地含有一个或多个杂原子的、饱和或不饱和的、支链或直链的C1-5烷基，优选地是甲基，选择性地取代的、选择性地含一个或多个杂原子的C5-8环烷基，选择性地取代的芳基或芳杂环，或选择性地取代的苄基；且
X是(CH2)m-A-(CH2)n，其中m和n相同或不同，且应为0、1、2、3或4的整数之一，且A是CH=CH、C≡C、CHB、C=O、选择性地取代的N、O、S或S的选择性地氧化形式，同时B是H、卤素、羟基、C1-3烷氧基或选择性地取代的甲基，
或者该N-取代的β-内酰胺的一种盐的形式，其与至少一种二羧酸酰基转移酶或其同工酶接触，在至少一种青霉素酰基转移酶或其同工酶存在下与一种前体物质反应以得到β-内酰胺抗生素的一种侧链。
令人惊奇的是，通过β-内酰胺抗生素侧链的引入可有效地制备β-内酰胺类抗生素。引入侧链的反应是从一种N-取代的β-内酰胺开始的，且应用了两种具有不同底物的酶。本发明方法中在应用第二个酶之前不需要回收中间产物，即第一个酶促反应的产物。
因为N-取代的β-内酰胺也可从发酵产物中获得，如：青霉素G、青霉素V、头孢菌素C、己二酰基-7-ADCA、3-羧基乙基硫代丙酰基-7-ADCA、2-羧基乙基硫代乙酰基-7-ADCA、3-羧基乙基硫代丙酰基-7-ADCA、己二酰基-7-ACA、3-羧基乙基硫代丙酰基-7-ACA、2-羧基乙基硫代乙酰基-7-ACA和3-羧基乙基硫代丙酰基-7-ACA，本发明的一个较大优点在于可以通过酶促反应从这些发酵产物开始制备β-内酰胺抗生素，而不必分离β-内酰胺母核中间体，这样的分离会损失大量发酵产物。
如本发明的方法是一种洁净的且高度特异性的方法。这意味着没有或几乎没有副产物产生因而不会导致废水和/或纯化问题。而且，如本发明的方法不需要应用复杂而昂贵的试剂，因为通常这些试剂具有敏感性而很难处理。
令人惊奇的是，在如本发明的方法中没有发生明显的酶抑制效应。直到现在，人们仍然认为由于一种酶抑制效应，在制备β-内酰胺抗生素时使用一种或两种酶以转移酰基是不可能的。在酰基转移反应过程中通常认为可形成苯基乙酸或苯氧乙酸，这些酸对特定的酶来说是抑制剂，如：U.Schomer等人在应用和环境微生物学(Applied and EnvironmentMicobiology),(2,1984:307-312)和A.L.Margolin等人在Biochim.Biophys.Acta,(1980),616:283-289中所述。
如本发明的方法中起始物质是N-取代的β-内酰胺，其具有如分子式(Ⅰ)所示的通式结构或其盐形式。在上面分子式(Ⅰ)各种符号定义中，S的一种氧化形式是指这样一些基团，如：氧化硫和砜。通过选择性的取代烷基、环烷基、芳香基、芳杂环和苄基，这样含有如从1-3个碳原子的烷基基团被取代的基团被制备。选择性取代的氮原子包括伯、仲和叔氨基基团，其可被如从1～3个碳原子的烷基取代。选择性取代的甲基包括一个甲基和各种取代了的甲基基团如：-CHpDq，其中D是一种卤素，且p和q是加和等于3的整数。
期望分子式(Ⅰ)包含N-取代的β-内酰胺，而这些N-取代的β-内酰胺是基于任何一种公开于“头孢菌素和青霉素，化学和生物学”，E.H.Flynn编，Academic出版社，1972,151-166和“β-内酰胺有机化学”，G.I.Georg编，VCH,1992,89-96中的β-内酰胺母核，此处引入作为参考。起始物优选的是这样一些物质，其中R1是CH2-E或CH=CH-E基团，其中E是H，羟基，卤素，C1-3烷氧基，选择性地取代的、选择性地含有一个或多个杂原子的、饱和或不饱和的、支链或直链的C1-5烷基，选择性地取代的、选择性地含一个或多个杂原子的C5-8环烷基，选择性地取代的芳基或芳杂环，或选择性地取代的苄基。
作为N-取代的β-内酰胺起始物质的合适的盐包括任何无毒性的盐，如：一种碱金属盐(如钠或钾)，一种碱土金属盐(如钙或镁)，一种铵盐，或一种有机碱盐(如三甲基胺、三乙基胺、吡啶、甲基吡啶、二环己基胺，N,N’-二苄基二乙烯基二胺)。
具有分子式(Ⅰ)所示通式的作为N-取代的β-内酰胺的起始物质可以通过酶促反应来制备，如在EP0 532 341、WO95/04148或WO95/04149中公开的一种方法所述。优选的起始物为N-戊二酰基、N-琥珀酰基、N-己二酰基、N-3-(羧甲基硫代)丙酰基、N-反式-β-氢化己二烯二酰基、N-庚二酰或N-3,3’-硫代二丙酰基β-内酰胺或其盐的形式。这样一些基于二羧酸的起始物质可以被那些本发明中所用的酶有效地转化。
更优选的起始物质是N-取代的6-氨基青霉烷酸(6-APA)、N-取代的7-氨基头孢烷酸(7-ACA)、N-取代的3-氯-7-氨基去乙酸基去甲基头孢烷酸(7-ACCA)、N-取代的7-氨基去乙酰基头孢烷酸(7-ADAC)或N-取代的7-氨基去乙酸基头孢烷酸(7-ADCA)，这些N-取代的β-内酰胺可产生最具有活性的β-内酰胺抗生素。
在根据本发明方法中与N-取代的β-内酰胺接触的一种合适的二羧酸酰基转移酶是一种从许多天然产生的微生物(如真菌和细菌)中分离获得的酶。可以通过监测一些合适底物的水解情况来筛选这样的具有期望的二羧酸特异性的酶的微生物。这样一些合适底物可以是如一些发色团，如琥珀酰基-、戊二酰基-或己二酰基-对-硝基苯胺。相应的N-取代的β-内酰胺水解也可以用作鉴别所需要的酶。已发现这些酶所依赖的适宜pH范围在约是6(优选的约是7)到约是9(优选的约是8)之间。
已发现可以产生二羧酸酰基转移酶的生物有：产碱菌属(Alcaligenes)，节杆菌属(Arthrobacter)，无色杆菌属(Achromobacter)，黑曲霉属(Aspergillus)，不动杆菌属(Acinetobacter)，芽孢杆菌属(Bacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas)。尤其是下列微生物种类可以产生极为合适的二羧酸酰基转移酶：木糖氧化产碱菌(Achromobacter xylosooxidans)，粘节杆菌(Arthrobacter viscosis)，节杆菌CA128，芽孢杆菌CA78，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ATCC53667，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)J1，拟青霉(Paecilomyces)C2106，缺陷假单胞菌(Pseudomonas diminuta)N176，缺陷假单胞菌V22，少动假单胞菌(Pseudomonas paucimobilis)，缺陷假单胞菌BL072，假单胞菌菌株C427，假单胞菌SE83，假单胞菌SE495，卵状假单胞菌(Pseudomonasovalis)ATCC950，丛毛单胞菌属(Comamonas sp)SY77，假单胞菌GK16，假单孢菌SY-77-1，假单胞菌A14，泡囊假单胞菌(Pseudomonasvesicularis)B965，丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)，恶臭假单胞菌(Ps putida)ATCC17390，铜绿假单胞菌(Ps aeroginosa)NCTC10701，普通变形菌(Proteus vulgaris)ATCC9634，莓实假单胞菌(Ps fragi)DSM3881和枯草芽孢杆菌(B.Subtilus)IFO3025。
可以任何合适的方式从这些微生物中获得二羧酸酰基转移酶，例如：如在US4,774,179中所述从假单胞菌SE83菌株获取该酶的方法。一些酶如SE83或SY77二羧酸酰基转移酶的基因可以表达在不同的适宜的宿主中，如大肠杆菌(E.coli)。如Matsuda等人在细菌学杂志(J.Bacteriology),1987,169:5818-5820中和US5,457,032分别对SE83菌株SY77菌株所述。
从上述来源分离获得的酶通常称作戊二酰基酰基转移酶。但是该酶的侧链特异性并不局限于戊二酰基侧链，而也可适用于更小和更大的二羧酸侧链。一些二羧酸酰基转移酶也表达出γ-戊二酰基转肽酶活性，故而它们有时也被归于γ-戊二酰基转肽酶类。
在根据本发明的方法中，一种合适的与N-取代的β-内酰胺接触的合适的青霉素酰基转移酶是一种从许多天然产生的微生物(如真菌和细菌)中分离获得的酶。在类似于期望的一种二羧酸酰基转移酶的监测测试中可筛选到产生期望的特异性的酶的微生物。这些酶所存在的适宜PH范围约是4(优选的约是5)到约是7(优选的约是6)之间。
已发现可产生青霉素酰基转移酶的微生物有：醋杆菌属(Acetobacter)，气单胞菌属(Aeromonas)，产碱菌属(Alcaligenes)，芽孢杆菌属，头孢属(Cephalosporium)，埃希氏菌属(Escherichia)，Aphanocladium，黄杆菌属(Flavobacterium)，克吕沃尔氏菌属(Kluyvera)，不动菌属(Mycoplana)，精朊杆菌属(Protaminobacter)，普罗威登斯菌属(Providentia)，假单胞菌属或黄单胞菌属(Xanthomonas)等种类。从Acetobacter pasteurioanum，粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、大肠杆菌、雷氏普罗威登斯菌(Providentia rettgeri)和柑橘黄单胞菌(Xanthomonas citrii)中获得的酶已经证明适用于本发明的方法。文献中青霉素酰基转移酶也被认为是青霉素酰胺酶。
二羧酸酰基转移酶和青霉素酰基转移酶不但可以游离酶形式应用，而且适用于任何固定化酶形式，例如：已在EP0 222 462和WO97/04086中描述。进行根据本发明的方法时，两种酶可以固定化在一种载体上，也可以固定化在不同的载体上。另外，可以应用一种或两种酶的同工酶，其中这些酶的性质如：pH依赖性、热稳定性或特异性活性可因为化学修饰或交联而被影响，但在本发明方法所涉及的酶中，它们的活性尽管在数量上发生了改变，但在本质上并没有发生显著改变。同样，可以应用同工酶如：可以通过经典的方法或DNA重组方法获得的一些突变体或其它一些衍生物，酶生物活性部分或杂合体。作为本领域技术人员普通知识的一部分，在有些情况下本发明方法可有益地进行化学或其它修饰。
在如本发明的方法中，用于制备β-内酰胺抗生素侧链的前体物质可以是任何能被上述青霉素酰基转移酶所识别的化合物，并且这些化合物可导致产生该类β-内酰胺抗生素。优选地，所用底物选自下述基团：D-(-)-苯基甘氨酸，D-(-)-4-羟基苯基甘氨酸，D-(-)-2,5-二氢化苯基甘氨酸，2-噻吩基乙酸，2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-甲氧基亚氨基乙酸，α-(4-吡啶基硫代)乙酸，3-噻吩丙二酸或2-氰基乙酸及它们的衍生物，因为由这些底物产生具有高度活性的β-内酰胺抗生素。这些底物的合适衍生物是酯或酰胺，其中侧链分子是通过一种酯或酰胺键连接到一个C1-C3的烷基基团上。
在如本发明的方法中，二羧酸酰基转移酶、β-内酰胺抗生素侧链前体物质和青霉素酰基转移酶可以一起或分别添加到N-取代的β-内酰胺起始物质中。优选地，这些酶一起添加到N-取代的β-内酰胺和其侧链前体物质中。
在本发明的一个优选的实施方案中，应用了一种对那些一次或两次出现在反应混合物中的任何中间体都不需进行分离和/或纯化的方法。这样就没有产物在分离或纯化过程中损失。
在本发明的一个高度优选的实施方案中，应用了一种所谓的“一罐法”(one-pot process)。所谓“一罐法”是指整个操作过程都在一个反应罐中完成的方法。换言之，根据本发明方法，基本上大多数反应物都没有在任何按本发明的方法进行的反应过程中被移出反应罐之外。这种实施方案的优点对本领域技术人员是显而易见的。
如本发明的方法中所应用的条件取决于许多参数，特别是：反应物种类、反应物浓度、反应时间、滴定剂、温度、pH、酶浓度和酶的形态。如果是要使用特定的二羧酸酰基转移酶和青霉素酰基转移酶将特定的N-取代β-内酰胺转化成特定的β-内酰胺抗生素，本领域普通技术人员可以恰当地选择优化的反应条件。
然而，在本发明方法中已发现最适反应温度在0-80℃之间，优选地在10-50℃之间。依本发明制备β-内酰胺抗生素的最适pH值在4.5-9.0之间。基于这一点，我们需注意高度优选如本发明的方法在水溶液体系中进行，因此可克服导致废液问题的有机溶剂的使用。而且，已经证明二羧酸酰基转移酶和青霉素酰基转移酶在水溶性体系中催化该转化反应最有效。
通常，在每步中每公斤反应混合物中反应试剂的量范围在0.01(优选地为0.5)和3摩尔(优选地为2摩尔)之间。
选择合适的酶浓度使总反应时间不超过4小时。要使10毫摩尔底物在1小时内转化为产物，大概需要用500-3000个酶反应单位，其中一个酶反应单位定义为在实际操作的条件下1分钟内转化1微摩尔底物成为产物所需要的酶量。通常，为在1小时转化特定数量的底物，酶浓度优选地为50-300KU/mol之间。然而，为弥补在反应过程中所损失的活性通常应用超大剂量的酶。
合适的滴定剂是无机酸和无机碱，如：盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化铵等，或有机酸，如：甲酸、乙酸、琥珀酸、己二酸、戊二酸等。根据反应的规模和滴定剂的溶解性，滴定剂浓度在0.01-8M之间变化。
当然本发明也包括通过上述公开的方法获得的一种β-内酰胺抗生素。
现在通过下述非限制性的实施例来阐述本发明。
                    实施例定义和方法酶活性
青霉素G酰基转移酶活性的定义如下：一个单位(U)对应于在标准条件下每分钟水解1微摩尔青霉素G所需的酶量，标准条件是指：100g/l青霉素G钾盐，0.05M磷酸钾缓冲液，pH8.0,28℃。
二羧酸酰基转移酶活性的定义如下：一个单位(U)对应于在标准条件下每分钟水解1毫摩尔N-己二酰基-7-ADCA所需的酶量，标准条件是指：10mM N-己二酰基-7-ADCA,100mM Tris缓冲液，pH8.0,37℃。pH测定
使用了配备一个自动滴定管和一个Brother M1509打印设备的一个Mettler DL21滴定仪。HPLC分析针对阿莫西林：色谱柱：Chromsphere C18,5Mm(100×3.0nm)溶剂：25％乙氰溶于12mM磷酸钾缓冲液(含有0.2％的十二烷基硫酸钠)流速：1ml/min检测波长：214nm针对头孢氨苄：色谱柱：Chromsphere C18,3Mm(100×4.6mm)溶剂：29％乙氰溶于14mM磷酸二氢钾缓冲液(含有磷酸，pH为3.0)流速：1ml/min检测波长：254nm
                      实施例1来自N-己二酰基-6β-氨基青霉烷酸和D-(-)-4-羟基苯基甘氨酸甲酯的阿莫西林
将获自假单胞菌SE83的二羧酸酰基转移酶(1.044g,96U/g)和获自大肠杆菌的青霉素酰基转移酶(0.80g,125U/g)添加到N-己二酰基-6-β氨基青霉烷酸二钾(0.71g，纯度为59％,1.0mmol)和D-(-)-4-羟基苯基甘氨酸甲酯(0.45g，纯度大于97％,2.4mmol)的水溶液中(10ml)。该混合物在室温下搅拌且pH通过应用1M氢氧化钠水溶液维持在6.9。可以运用HPLC分析来监测产物的形成。结果如表1所示：表1
时间(h) 己二酰基-6-APA(mM) 6-APA(mM) 阿莫西林(mM)
    00.51.0    1218180      01312     047
                    实施例2来自N-己二酰基-7-氨基-3-甲基-头孢-3-em-4-羧酸酯和D-(-)-苯基甘氨酸酰胺的头孢氨苄
将获自假单胞菌SE83的二羧酸酰基转移酶(4.00g,369U/g)和获自大肠杆菌的青霉素酰基转移酶(1.6g,250U/g)添加到N-己二酰基-7-氨基-3-甲基-头孢-3-em-4-羧酸酯(0.68g,纯度为97.1％,2.0mmol)和D-(-)-苯基甘氨酸酰胺(0.75g，纯度96％,4.8mmol)的水溶液中(20ml)。反应混合物起始pH为6.3，且在35℃下搅拌反应混合物，30分钟后(pH=6.8)HPLC分析显示形成了头孢氨苄。为了进行HPLC分析，从反应罐中取出0.5ml反应混合物离心后过滤，取出0.2ml加入pH为7的缓冲液直至50ml。结果如表2所示：表2
时间(h) 己二酰基-7-ADCA(mM) 7-ADCA(mM) 头孢氨苄(mM)
    00.5     9534     035     09.9
                      实施例3来自N-己二酰基-7-氨基-3-甲基头孢-3-em-4-羧酸酯和D-(-)-苯基甘氨酸酰胺的头孢氨苄
将获自假单胞菌SE83的二羧酸酰基转移酶(4.00g,369U/g)添加到N-己二酰基-7-氨基-3-甲基头孢-3-em-4-羧酸酯(0.68g，纯度为97.1％,2.0mmol)的水溶液中(20ml)。反应混合物在35℃进行搅拌，且pH通过应用2M氢氧化钾水溶液维持在8.0。大约1小时后反应物被过滤。D-(-)-苯基甘氨酸酰胺(0.75g，纯度96％,4.8mmol)和获自大肠杆菌的青霉素酰基转移酶(1.6g,250U/g)添加到该滤液中。反应体系维持在13℃，通过应用1M盐酸pH维持在7.5。经HPLC分析表明形成了头孢氨苄。为了进行HPLC分析，从反应罐中取出0.5ml反应混合物离心后过滤，取出0.2ml加入pH为7的缓冲液直至50ml。结果如表3所示：表3
时间(h) 己二酰基-7-ADCA(mM) 7-ADCA(mM) 头孢氨苄(mM)
    01.02.0      952.23.7     03214      0037

Claims (11)

1．一种制备β-内酰胺抗生素的方法，其中一种N-取代的β-内酰胺具有如分子式(Ⅰ)所示的通式结构
Figure A9880052200021
其中R0是H或C1-3烷氧基；Y是CH2、O、S、或S的一种氧化形式；Z是：
Figure A9880052200022
其中，R1是H，羟基，卤素，C1-3烷氧基，选择性地取代的、选择性地含有一个或多个杂原子、饱和或不饱和的、支链或直链的C1-5烷基，优选为甲基，选择性地取代的、选择性地含有一个或多个杂原子的C5-8环烷基，选择性地取代的芳基或芳杂环，或选择性地取代的苄基；且X是(CH2)m-A-(CH2)n，其中m和n相同或不同，且应为0、1、2、3或4的整数之一，且A是CH=CH、C≡C、CHB、C=O、选择性地取代的N、O、S或S的选择性地氧化形式，同时B是H、卤素、羟基、C1-3烷氧基或选择性地取代的甲基，
或者该N-取代的β-内酰胺的盐的形式，其与至少一种二羧酸酰基转移酶或其同工酶接触，并且在至少一种青霉素酰基转移酶或其同工酶存在下与一种前体物质反应以得到β-内酰胺抗生素的一种侧链。
2．如权利要求1的一种方法，其中没有中间体产物被分离和/或纯化。
3．如权利要求2的一种方法，该方法按“一罐法”进行。
4．如上述任何一个权利要求的一种方法，其中该N-取代的β-内酰胺为N-戊二酰基、N-琥珀酰基、N-己二酰基、N-3-(羧甲基硫代)丙酰基、N-反式-β-氢化己二烯二酰基、N-庚二酰基或N-3,3’-硫代二丙酰基β-内酰胺，或这些物质的盐的形式。
5．如上述任何一个权利要求的一种方法，其中该N-取代的β-内酰胺为N-取代的6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基头孢烷酸(7-ACA)、3-氯-7-氨基去乙酸基去甲基头孢烷酸(7-ACCA)、7-氨基去乙酰基头孢烷酸(7-ADAC)、7-氨基去乙酸基头孢烷酸(7-ADCA)，或者它们的盐的形式。
6．如上述任何一个权利要求的一种方法，其中该β-内酰胺抗生素的侧链前体物质为D-(-)-苯基甘氨酸、D-(-)-4-羟基苯基甘氨酸、D-(-)-2,5-二氢化苯基甘氨酸、2-噻吩基乙酸、2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-甲氧基亚氨基乙酸、α-(4-吡啶基硫代)乙酸、3-噻吩丙二酸或2-氰基乙酸，或者它们的酰胺或酯的形式。
7．如上述任何一个权利要求的一种方法，其中二羧酸酰基转移酶获自产碱菌属、节杆菌属、无色杆菌属、黑曲霉属、不动杆菌属、芽孢杆菌属或假单胞菌属的菌株。
8．如上述任何一个权利要求的一种方法，其中青霉素酰基转移酶获自醋杆菌属、气单胞菌属、产碱杆菌属、Aphanocladium、芽孢杆菌属、头孢属、埃希氏菌属、黄杆菌属、克吕沃尔氏菌属、不动菌属、精朊杆菌属、普罗威登斯菌属、假单胞菌属或黄单胞菌属的菌株。
9．如上述任何一个权利要求的一种方法，其中通过一种酶学方法由一种发酵产物起始得到该N-取代的β-内酰胺。
10．如权利要求9的一种方法，其中发酵产物可以是青霉素G、青霉素V、头孢菌素C、己二酰基-7-ADCA、3-羧基乙基硫代丙酰基-7-ADCA、2-羧基乙基硫代乙酰基-7-ADCA和3-羧基乙基硫代丙酰基-7-ADCA、己二酰基-7-ACA、3-羧基乙基硫代丙酰基-7ACA，2-羧基乙基硫代乙酰基-7-ACA和3-羧基乙基硫代丙酰基-7-ACA。
11．二羧酸酰基转移酶和青霉素酰基转移酶使一种N-取代的β-内酰胺转化为一种β-内酰胺抗生素的用途。
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