CH640240A5 - Preparation of penicillins and cephalosporins from precursors obtained by hydrolysis of natural penicillins/cephalosporins, using enzymatic complexes immobilised on solid carriers - Google Patents

Abstract

The present patent describes the semisynthesis of penicillins (amoxicillin) and cephalosporins (cefalexin) from precursors (6-APA and 7-ADCA) obtained by enzymatic hydrolysis of natural penicillins and cephalosporins and the preparation of enzymatic complexes (penicillin-amidase and penicillin-acylase) immobilised on solid carriers. The immobilisation is effected on powder, fibres or film of regenerated cellulose, swollen by treatment with alkali and activated with CNBr. The hydrolysis of the natural penicillins and the semisynthesis are effected by percolating the precursors in defined buffers at controlled pH and temperature. The novelty of the present patent resides in the type of immobilisation of the penicillin-amidase and penicillin-acylase, which makes it possible to use purified enzymes and, owing to the immobilisation, to work with continuous flow. The specified support (cellulose) is inexpensive, easily available and reusable. It is therefore economically more advantageous than a support based on dextrans, which are more costly and cannot be re-used. <IMAGE>

Description

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RIVENDICAZIONI

1. Procedimento di fabbricazione di penicilline e di cefa-losporine semisintetiche caratterizzato dal fatto che i precursori, acido 6-ammino-penicillanico ed acido 7-ammino-de-acetossicefalosporanico, ottenuti da penicilline e rispettivamente da cefalosporine naturali per idrolisi del legame ami-dico mediante reazione enzimatica con enzimi immobilizzati su matrici solide, vengono acilati mediante reazione enzimatica, con acilasi immobilizzate su matrici solide. 1. Manufacturing process of penicillins and semisynthetic cephalosporins characterized by the fact that the precursors, 6-amino-penicillanic acid and 7-amino-de-acetoxy-cephalosporanic acid, obtained from penicillins and respectively from natural cephalosporins by hydrolysis of the amine bond I say by enzymatic reaction with enzymes immobilized on solid matrices, they are acylated by enzymatic reaction, with acylases immobilized on solid matrices.

2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che le matrici solide sono costituite da polveri cellulosiche, fibre cellulosiche o film di cellulosa. 2. Process according to claim 1, characterized in that the solid matrices are constituted by cellulosic powders, cellulosic fibers or cellulose films.

3. Procedimento secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che l'immobilizzazione degli enzimi sulle matrici solide avviene dopo trattamento con agenti rigonfianti e attivazione con CNBr e percolazione della soluzione enzimatica. 3. Process according to claim 2, characterized in that the immobilization of the enzymes on the solid matrices takes place after treatment with swelling agents and activation with CNBr and percolation of the enzymatic solution.

4. Procedimento secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che la soluzione enzimatica può avere attività amidasica o acilasica. 4. Process according to claim 3, characterized in that the enzymatic solution can have amidasic or acylase activity.

5. Procedimento secondo le rivendicazioni 2-4, caratterizzato dal fatto che l'enzima immobilizzato con- attività amidasica, è impiegato per idrolizzare penicilline a 6-APA. 5. Process according to claims 2-4, characterized in that the enzyme immobilized with amidasic activity is used to hydrolyze penicillins to 6-APA.

6. Procedimento secondo le rivendicazioni 2-5, caratterizzato dal fatto che l'enzima immobilizzato con attività acilasica è impiegato per sintetizzare derivati del 6-APA come Amoxicillina e derivati dell'acido 7-Ammino-deacetossi-cefalosporanico come cefaloxina. 6. Process according to claims 2-5, characterized in that the enzyme immobilized with acylase activity is used to synthesize 6-APA derivatives such as Amoxicillin and 7-Amino-deacethoxy-cephalosporanic acid derivatives such as cephaloxin.

Stato della tecnica State of the art

Sin da quando furono ottenute le prime penicilline per via fermentativa, la molecola base è stata manipolata in sva-riatissimi modi, così da ottenere un larghissimo numero di composti simili a quelli naturali e non pochi hanno assunto una rilevante importanza terapeutica. Ever since the first penicillins were obtained by fermentation, the basic molecule has been manipulated in many different ways, so as to obtain a very large number of compounds similar to the natural ones and quite a few have assumed a significant therapeutic importance.

Tutti gli sforzi tesi alla sintesi totale per via chimica hanno trovato il maggior ostacolo nella chiusura del ciclo lattamico; questo problema, seppur risolto, fa sì che la sintesi totale non sia attualmente un processo industrialmente valido. I metodi correnti per la produzione di penicilline semisintetiche si possono perciò ridurre a due fondamentali: microbiologico e chimico. Noi ci limiteremo a considerare quelli relativi a due classi di composti, e cioè ampicillina e derivati, oxacillina e derivati. All efforts aimed at total chemical synthesis have found the greatest obstacle in closing the lactam cycle; this problem, even if solved, means that the total synthesis is not currently an industrially valid process. The current methods for the production of semisynthetic penicillins can therefore be reduced to two fundamental ones: microbiological and chemical. We will consider only those relating to two classes of compounds, namely ampicillin and derivatives, oxacillin and derivatives.

Sintesi per via microbiologica Microbiological synthesis

La preparazione di penicillina semisintetiche per via microbiologica ha preso il via delle prime osservazioni che l'aggiunta di opportuni precursori ai terreni di cultura poteva incrementare la produzione di penicillina. Aggiungendo derivati di acidi fenilcarbossilici variamente sostituiti, come precursori, si possono ottenere penicilline diverse da quelle naturali, durante una biosintesi per così dire pilotata. La base di questa tecnica è stata sviluppata particolarmente dal gruppo di ricerca dei Laboratori Lilly, che l'impiegarono per produrre svariate nuove penicilline (U.S. 2 479 295; U.S. 2 479 296; U.S. 2 479 297; U.S. 2 562 408; U.S. 2 562 410; U.S. 2 562 411). Una variante a questo metodo può essere considerata radiazione di 6-APA preformato, con un adatto derivato acilico, per via microbiologica (Takeda Chem. Ind.; Neth. 7 117 613). The preparation of semisynthetic penicillin by microbiological pathway started the first observations that the addition of suitable precursors to culture media could increase the production of penicillin. By adding variously substituted phenylcarboxylic acid derivatives, as precursors, penicillins other than natural ones can be obtained, during a biosynthesis, so to speak piloted. The basis of this technique was developed especially by the research group of the Lilly Laboratories, which used it to produce various new penicillins (US 2 479 295; US 2 479 296; US 2 479 297; US 2 562 408; US 2 562 410; US 2 562 411). A variant to this method can be considered radiation of preformed 6-APA, with a suitable acyl derivative, by microbiological means (Takeda Chem. Ind .; Neth. 7 117 613).

Notevole importanza hanno ovviamente i processi microbiologici che permettono di ottenere dalle penicilline naturali il 6-APA, usato come precursore nelle varie sintesi, ma questo esula dagli scopi di questa relazione. Obviously the microbiological processes that allow to obtain 6-APA from natural penicillins, used as a precursor in the various syntheses, obviously have considerable importance, but this is outside the scope of this report.

Sintesi chimiche Chemical synthesis

Il metodo più importante per la preparazione di penicilline semisintetiche per via chimica, è senza dubbio quello che prevede radiazione del 6-APA. The most important method for the preparation of semisynthetic penicillins by chemical means, is undoubtedly the one that involves 6-APA radiation.

5 Dato che a questo metodo si riconducono tutti i brevetti Beecham, è opportuno riassumerli per sommi capi: 5 Since all Beecham patents refer to this method, it is appropriate to summarize them in summary:

— procedimento per la preparazione di penicilline aventi la seguente formula generale: - procedure for the preparation of penicillins having the following general formula:

io K-MH-CH C i K-MH-CH C

I 1 l I 1 l

C,0 — N C- COO H C, 0 - N C- COO H

dove X è un gruppo acilico contenente fino a 20 atomi di 15 carbonio e la catena di atomi di carbonio può essere alicicli-ca, aromatica, eterociclica, con vari sostituenti; where X is an acyl group containing up to 20 15 carbon atoms and the chain of carbon atoms can be alicyclic, aromatic, heterocyclic, with various substituents;

— ottenute per reazione del 6-APA libero o protetto, con un derivato acilico; - obtained by reaction of free or protected 6-APA, with an acyl derivative;

— i gruppi funzionali del derivato acilico sono protetti. Tali 20 gruppi possono essere presenti come derivati facilmente trasformabili nei sostituenti voluti; - the functional groups of the acyl derivative are protected. These 20 groups can be present as derivatives which can be easily transformed into the desired substituents;

— il derivato acilico può essere alogenuro dell'acido, anidride o un'anidride mista. - the acyl derivative can be acid halide, anhydride or a mixed anhydride.

L'interesse destato da questi prodotti ha provocato un 25 fiorire di ricerche, per cui esistono innumerevoli modifiche e variazioni dei primi brevetti apparsi. Se a puro titolo di esempio consideriamo l'ampicillina e ci limitiamo al metodo che prevede l'acilazione del 6-APA con 'a-fenilglicina protetta, la sola protezione dell'a-fenilglicina è stata oggetto di 30 numerosi brevetti. Infatti sono stati proposti i seguenti gruppi protettivi: The interest aroused by these products has caused a flourishing of searches, for which there are innumerable modifications and variations of the first patents that have appeared. If, by way of example, we consider ampicillin and limit ourselves to the method which provides for the acylation of 6-APA with protected a-phenylglycine, the sole protection of a-phenylglycine has been the subject of 30 numerous patents. In fact, the following protective groups have been proposed:

— 2-Nitro-4-methoxyphenylsulfenyl - 2-Nitro-4-methoxyphenylsulfenyl

— 2,5-Oxazolidinedione 35 — o-Nitrophenylsulfenyl - 2,5-Oxazolidinedione 35 - o-Nitrophenylsulfenyl

— N-Carboxyanhydride - N-Carboxyanhydride

— p-Toluenesulfenyl - p-Toluenesulfenyl

— N-(l-Methyl-2-phenylc'arbomoylvinyl) anhydride - N- (l-Methyl-2-phenylc'arbomoylvinyl) anhydride

— N-Formyl - N-Formyl

40 — 2-Quinol-8-yl-carboylamino 40 - 2-Quinol-8-yl-carboylamino

— l-3-Oxazine-2,6-dione - l-3-Oxazine-2,6-dione

— 6-N-benzoyI-2-tyrosyl - 6-N-benzoyI-2-tyrosyl

— a-Benzyloxycarbonylamino - a-Benzyloxycarbonylamino

— 2,4-Pentanedione (Acetylacetone) - 2,4-Pentanedione (Acetylacetone)

45 — N-Carbobenzoxy 45 - N-Carbobenzoxy

— ß-Dicarbonyl (BzCH2Ac, AcCH2, AcCH2C02Et) - ß-Dicarbonyl (BzCH2Ac, AcCH2, AcCH2C02Et)

— N-(2-Hyd'roxyl-l-naphthylmethylene) anhydride - N- (2-Hyd'roxyl-l-naphthylmethylene) anhydride

— 6,2-Phenylcyclohex-3-enyl-carboxamid'o - 6.2-Phenylcyclohex-3-enyl-carboxamid'o

— Furfural, furylacrolein, crotonaldehyde, anisaldehyde and so salicylaldehyde - Furfural, furylacrolein, crotonaldehyde, anisaldehyde and so salicylaldehyde

— Ethoxyformic anhydride - Ethoxyformic anhydride

— Phenylsulfid'e (PhSH) - Phenylsulfid'e (PhSH)

— o-Acetoacetanisidine (-Cieslak, J. et al., Poi. 51 708; - o-Acetoacetanisidine (-Cieslak, J. et al., Then. 51 708;

55 — Album H. E. et al., Fr. 1 349 621; 55 - Album H. E. et al., Fr.1 349 621;

— Album H. E. et al., U.S. 3 206 455; - Album H. E. et al., U.S. 3 206 455;

— Catlin E. R. et al., Brit. 903 785; - Catlin E. R. et al., Brit. 903 785;

— Novak L. et al., Czech. 124 836; - Novak L. et al., Czech. 124 836;

— Bianchi G. et al., S. African 68 00 294; - Bianchi G. et al., S. African 68 00 294;

6o — Album H. E. et al., U.S. 3 520 876; 6o - Album H. E. et al., U.S. 3 520 876;

— American Home Products Corp., Brit. 1 082 427; - American Home Products Corp., Brit. 1,082 427;

— Austin K. W. B. et al., S. African 6 705 627; - Austin K. W. B. et al., S. African 6 705 627;

— König R., Hung. 155 099; - König R., Hung. 155 099;

— Mestre R., Span. 355 361; - Mestre R., Span. 355 361;

65 — Beecham Group Ltd., Neth. Appi. 6 603 044; 65 - Beecham Group Ltd., Neth. Appi. 6 603 044;

— Lepetit S. p. A., Belg. 622 901; - Lepetit S. p. A., Belg. 622 901;

— Novo Terapeutisk Laboratorium A/s., Brit. 985 655; - Novo Terapeutisk Laboratorium A / s., Brit. 985 655;

— Fosker G. R. et al., Brit. 991586; - Fosker G. R. et al., Brit. 991,586;

3 3

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— Novak L. et al., Belg. 626 175; - Novak L. et al., Belg. 626 175;

— Chas. Pfizer and' Co., Inc., Brit. 958 824; - Chas. Pfizer and 'Co., Inc., Brit. 958 824;

— Fosher G. R. et al., Brit. 980 777; - Fosher G. R. et al., Brit. 980 777;

— Smith, Kline and French Laboratories, U.S. 3 117 119; - Smith, Kline and French Laboratories, U.S. 3 117 119;

— Uglesic A. et al., Ger. Offen 1 940 571; - Uglesic A. et al., Ger. Offen 1 940 571;

— Luttiger J. R. et al., Belg. 612 599). - Luttiger J. R. et al., Belg. 612 599).

Dopo questo primo esempio possiamo elencare i brevetti che più si avvicinano ai metodi «Beecham» e che prevedono, come già detto, radiazione del 6-APA. Variano i gruppi protettivi sia del carbossile del 6-APA che del derivato acilico, variano le condizioni di reazione, varia il modo di attivare il gruppo acilico, ma fondamentalmente il processo si può così schematizzare: After this first example, we can list the patents that come closest to the «Beecham» methods and which, as already mentioned, provide for 6-APA radiation. The protective groups of both the 6-APA carboxyl and the acyl derivative vary, the reaction conditions vary, the way of activating the acyl group varies, but basically the process can be schematized as follows:

K-C0-\ + K-C0- \ +

0= 0 =

-N- -N-

! !

< <

L-coo'r' L-coo'r '

Tuco-HH Tuco-HH

COO-R' COO-R '

Per idrolisi, idrogenazione o sostituzione di gruppi funzionali si ottengono le desiderate penicilline semisintetiche. Molte ditte operanti in campo farmaceutico sono titolari di brevetti ricollegabili a questo metodo e qui di seguito ne riportiamo un elenco: By hydrolysis, hydrogenation or replacement of functional groups, the desired semi-synthetic penicillins are obtained. Many companies operating in the pharmaceutical field have patents related to this method and here is a list of them:

— SANKIO, Japan 7 122 037, Japan Kokai 7 220 190; - SANKIO, Japan 7 122 037, Japan Kokai 7 220 190;

— GEMA, Ger. Offen 2 105 166, Span. 386 962; - GEMA, Ger. Offen 2 105 166, Span. 386 962;

— MERK, Ger. Offen 2 010 010; - MERK, Ger. Offen 2 010 010;

— ALL-UNION, Ger. Offen 2 053 214, Austrian 320 850; - ALL-UNION, Ger. Offen 2 053 214, Austrian 320 850;

— ASTRA, Ger. Offen 2 144 457; - ASTRA, Ger. Offen 2 144 457;

— POLFA, Pol. 64 393, Pol. 76 438; - POLFA, Pol. 64 393, Pol. 76 438;

— IBI, Fr. Demande 2 100 730; - IBI, Br. Demande 2 100 730;

— CHEMIE GRÜNENTHAL, Ger. Offen 2 115 542, Ger. 1 770 855; - CHEMIE GRÜNENTHAL, Ger. Offen 2 115 542, Ger. 1 770 855;

— AMERICAN HOME PROD., Ger. Offen 2 253 864; - AMERICAN HOME PROD., Ger. Offen 2 253 864;

— LABORATOIRE PHARMEDICAL, Fr. Demande 5 2 148 405, Span. 398 825; - LABORATOIRE PHARMEDICAL, Fr. Demande 5 2 148 405, Span. 398 825;

— HOFFMANN-LA ROCHE, Ger. Offen 2 301 544 e 2 301 542; - HOFFMANN-LA ROCHE, Ger. Offen 2 301 544 and 2 301 542;

— SUMITOMO, S. African 7 205 865, Ger. Offen 2 416 449; - SUMITOMO, S. African 7 205 865, Ger. Offen 2 416 449;

io — CIPAN, Fr. 2 165 409, S. African 7 205 231, Austrian 327 377; i - CIPAN, Fr.2 165 409, S. African 7 205 231, Austrian 327 377;

— YAMANOUCHI, Japan 7 126 515; - YAMANOUCHI, Japan 7 126 515;

— BRISTOL-MYERS, Belg. 831 941; - BRISTOL-MYERS, Belg. 831 941;

— E.R.A.S.M.E., Fr. Demande 2 013 456; 15 — HEBRON, Span. 413 693; - E.R.A.S.M.E., Fr. Demande 2 013 456; 15 - HEBRON, Span. 413 693;

— LAPLEX, Belgi an 824 158; - LAPLEX, Belgi an 824 158;

— BAYER, Ger. Offen 2 353 584, U.S. 3 859 274; - BAYER, Ger. Offen 2 353 584, U.S. 3 859 274;

— GLAXO, Ger. Offen 2 520 647; - GLAXO, Ger. Offen 2 520 647;

— ROMANIA ANTIBIOTTC PLANT, Ger. Offen 20 2 101 003 - ROMANIA ANTIBIOTTC PLANT, Ger. Offen 20 2 101 003

ed inoltre and also

— PANINA M.A., U.S., 3 567 709; - PANINA M.A., U.S., 3 567 709;

— DUSEK J., Czech. 162 369; - DUSEK J., Czech. 162 369;

— MAGGI R., Fr. 1 592 564; - MAGGI R., Fr.1 592 564;

25 — ARIES R., Fr. 2 202 515, 2 203 383, 2 203 384, 2 220 531, 2 210 188, 2 198 489; 25 - ARIES R., Fr. 2 202 515, 2 203 383, 2 203 384, 2 220 531, 2 210 188, 2 198 489;

— PEREIRA DA LUZ, SpA 399 960. - PEREIRA DA LUZ, SpA 399 960.

Una variante può essere considerata quella della TOYA-30 MA (Japan 26 508) che prevede la reazione fra il 6-APA e derivati del glyoxylonitrile a dare derivati della oxacillina: A variant can be considered that of TOYA-30 MA (Japan 26 508) which provides for the reaction between 6-APA and glyoxylonitrile derivatives to give oxacillin derivatives:

35 35

r COCN r COCN

■f 6 - A"PA ■ f 6 - A "PA

Così pure è abbastanza differenziata la variante che prevede innanzitutto la trasformazione del gruppo amminico 40 del 6-APA in gruppo isocianico, quindi la trafila di reazioni qui riportate: Similarly, the variant that primarily involves the transformation of the amino group 40 of the 6-APA into an isocyanic group is quite different, therefore the series of reactions reported here:

_ C.OO He-3 f" _ C.OO He-3 f "

"RCEBCH "RCEBCH

rivi a Grignard get to Grignard

"R. C = C-Co-rtH "R. C = C-Co-rtH

D =4 D = 4

c oos/L Ht ^ + c oos / L Ht ^ +

■r'C f^O ■ r'C f ^ O

-7- -7-

"R-C C - to - MH "R-C C - to - MH

O OR

65 Questa sintesi è descritta dalla KONINKLI JKE NETH. (Fr. Demande 2 081 380, Ger. Offen 2 155 152, idem 2 228 894, idem 2 264 602) e dalla AMERICAN HOME PROD. (U.S. 3 736 318). 65 This summary is described by the KONINKLI JKE NETH. (Br. Demande 2 081 380, Ger. Offen 2 155 152, idem 2 228 894, idem 2 264 602) and from AMERICAN HOME PROD. (U.S. 3 736 318).

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4 4

I brevetti fino ad ora citati si ricollegano in modo più o meno stretto ai metodi descritti dalla Beecham, ed occorre una accurata verifica dei dettagli sperimentali per poterne giudicare le differenze, quando esistano e la validità. The patents mentioned so far relate more or less closely to the methods described by Beecham, and an accurate verification of the experimental details is necessary to be able to judge their differences, when they exist and their validity.

Numerosi altri brevetti differiscono però sostanzialmente dagli schemi fino ad ora ricordati e prevedono l'impiego di penicilline naturali, come sostanza di partenza, senza 6-APA quale intermedio. Numerous other patents, however, differ substantially from the schemes hitherto mentioned and provide for the use of natural penicillins, as the starting substance, without 6-APA as an intermediate.

Lo schema generale è il seguente: The general scheme is as follows:

"R- "R-

o=J-r/ o = J-r /

"Pfct. "Pfct.

COOR' COOR '

;jj- ; jj-

/\/ / \ /

e oor' and oor '

■Î- ■ I-

0'R i il 0'R i the

0=1 0 = 1

vicoce a oo'r' vicoce a oo'r '

-p- -p-

OR OR

"R—C.; "R-C .;

CCR1" I CCR1 "I

N - N -

cr o-J cr o-J

-ìi- -II-

,c , c

-COO R' -COO R '

~b ~ b

■R111 -CO-M H- ■ R111 -CO-M H-

0- 0-

Coo H Coo H

Alcuni degli intermedi riportati in questo schema sono descritti anche per la produzione del 6-APA per via chimica da penicilline naturali: fra i brevetti apparsi ricordiamo quelli della TOYO (U.S. 3 935 193, Japan 7 448 438), della GLAXO (Ger. Offen 2 211 763), della YAMANOUCHI (Japan 7 126 511) e di PEREIRA DA LUZ (Belg. 796 731, Austrian 322 101). Some of the intermediates shown in this scheme are also described for the chemical production of 6-APA from natural penicillins: among the patents that have appeared we mention those of TOYO (US 3 935 193, Japan 7 448 438), of GLAXO (Ger. Offen 2 211 763), YAMANOUCHI (Japan 7 126 511) and PEREIRA DA LUZ (Belg. 796 731, Austrian 322 101).

Il procedimento nella sua totalità è descritto in numerosi brevetti giapponesi, fra i quali quelli della YAMANOUCHI (Japan 7 440 720, Japan 7 224 036, Ger. Offen 2 215 039, Japan 7 226 512, Japan 7 226 513, Ger. Offen 2 029 195, Japan 7 520 077, Japan Kokai 75 129 589, Japan 7 440 720) e della TOYAMA (Japan Kokai 7 323 795). The whole process is described in numerous Japanese patents, including those of YAMANOUCHI (Japan 7 440 720, Japan 7 224 036, Ger. Offen 2 215 039, Japan 7 226 512, Japan 7 226 513, Ger. Offen 2 029 195, Japan 7 520 077, Japan Kokai 75 129 589, Japan 7 440 720) and TOYAMA (Japan Kokai 7 323 795).

Sempre su questo argomento esistono pure brevetti della BRISTOL-MYERS (Belg. 827 858) e della ARCHIFAR (Ger. Offen 2 454 841). Also on this subject there are also patents of BRISTOL-MYERS (Belg. 827 858) and ARCHIFAR (Ger. Offen 2 454 841).

Un procedimento abbastanza simile al precedente può essere considerato quello che prevede la diacilazione direttamente dell'imminocloruro con un adatto sale di derivato carbossilico: TOYO (Ger. Offen 2 109 404, U.S. 3 668 200, Japan 7 500 035), POLFA (Poi. 70 552), ARIES R. (Fr. Demande 2 217 341). A procedure quite similar to the previous one can be considered that which involves the diacylation directly of the iminochloride with a suitable carboxylic derivative salt: TOYO (Ger. Offen 2 109 404, US 3 668 200, Japan 7 500 035), POLFA (Then. 70 552), ARIES R. (Fr. Demande 2 217 341).

Questo esame della situazione brevettuale relativa ad alcune classi di penicilline semisintetiche, pur nella sua brevità e incompletezza, in quanto non sono stati esaminati i dettagli di ogni singolo brevetto, né si sono citati tutti i brevetti apparsi in questi ultimi anni, può dare tuttavia una idea di quanto è stato fatto in questo campo e di come sia difficile, per non dire impossibile, sostenere che una data penicillina semisintetica possa essere preparata unicamente con un solo metodo. Va aggiunto che non sono stati presi ia considerazione i numerosi lavori apparsi come pubblicazioni sulle maggiori riviste intemazionali. This examination of the patent situation relating to some classes of semisynthetic penicillins, despite its brevity and incompleteness, as the details of each individual patent have not been examined, nor have all the patents that have appeared in recent years been cited, can however give a idea of what has been done in this field and how difficult, if not impossible, to claim that a given semisynthetic penicillin can only be prepared with one method. It should be added that the numerous works that appeared as publications in the major international magazines have not been taken into consideration.

In particolare i ricercatori giapponesi hanno svolto una notevole mole di lavoro e a riprova ci sembra che non sia superfluo ricordare il recente accordo fra la TOYAMA e la CYANAMID per la produzione di penicilline semisinteti-40 che. In particular, Japanese researchers have carried out a considerable amount of work and as evidence it seems that it is not superfluous to remember the recent agreement between TOYAMA and CYANAMID for the production of semi-synthetic penicillins-40 that.

Questo metodo di modificazione per via enzimatica di penicilline e cefalosporine si basa sulla stabilizzazione degli enzimi che catalizza le reazioni di idrolisi e di acilazione, mediante reticolazione con legame chimico e insolubilizza-45 zione a matrici polimeriche. This method of enzymatic modification of penicillins and cephalosporins is based on the stabilization of the enzymes which catalyzes the hydrolysis and acylation reactions, by crosslinking with a chemical bond and insolubilization with polymer matrices.

Gli enzimi in questione sono catalizzatori proteici che sono già stati utilizzati in un gran numero di applicazioni, sia sotto il profilo industriale che per la ricerca e sono presenti in numerosi microorganismi tipo Aspergillus, Strepto-50 myces, Escherichia, Schizomycetes, Basidiomycetes Fusarium, ecc. The enzymes in question are protein catalysts that have already been used in a large number of applications, both from an industrial and research point of view and are present in numerous microorganisms such as Aspergillus, Strepto-50 myces, Escherichia, Schizomycetes, Basidiomycetes Fusarium, etc. .

In alternativa a metodi chimici per l'idrolisi e radiazione di antibiotici, le reazioni enzimatiche possono risultare vantaggiose su larga scala poiché esse non richiedono usual-55 mente un elevato dispendio energetico dato il carattere di «spontaneità della reazione», possono risultare sufficientemente specifiche, con1 l'utilizzo di enzimi dotati di elevato grado di purezza, e non necessitano usualmente di reattori particolarmente costruiti, incidendo quindi in senso positivo 60 sul costo di realizzazione. As an alternative to chemical methods for the hydrolysis and radiation of antibiotics, enzymatic reactions can be advantageous on a large scale since they do not usually require a high energy expenditure given the "spontaneity of the reaction" character, they can be sufficiently specific, with the use of enzymes endowed with a high degree of purity, and usually do not need particularly constructed reactors, thus affecting positively 60 on the cost of construction.

Per la preparazione dell'acido penicillanico si utilizza come enzima un'amideidrolasi secondo la reazione: For the preparation of penicillanic acid an amide hydrolase is used as enzyme according to the reaction:

5 5

640240 640240

R -CHz-Co-tiU- R -CHz-Co-tiU-

o- or-

V V

N N

Cooh Cooh

A hot o!s)S ) ■ > A hot o! S) S) ■>

■R-CH2COOH -h HiN—j—^ Y ■ R-CH2COOH -h HiN — j— ^ Y

o =—^ '—cooh mentre per la sintesi delle penicilline semisintetiche da esso derivanti si utilizza una penicillina-acilasi in presenza di un adeguato ester etilico, secondo la reazione: o = - ^ '—cooh while for the synthesis of the semi-synthetic penicillins deriving from it a penicillin-acylase is used in the presence of an adequate ethyl ester, according to the reaction:

HtN HtN

o- or-

Y Y

4-R1 - COQ Cl Hs y A e î la Si 4-R1 - COQ Cl Hs y A and î la Si

COOH COOH

v R-CO-NH-,—p'Y v R-CO-NH -, - p'Y

q J N «-COoH q J N «-COoH

Idrolisi enzimatiche sono trasferibili a sistemi applicativi quando è reperibile una elevata attività dell'enzima. Enzymatic hydrolysis are transferable to application systems when high enzyme activity is available.

Celle di microorganismi sono state utilizzate per la reazione direttamente, però risultati più validi si possono ricavare mediante impiego dell'enzima estratto dalle celle. Cells of microorganisms have been used for the reaction directly, however more valid results can be obtained by using the enzyme extracted from the cells.

Un inconveniente importante per l'impiego dell'enzima consiste nel fatto che esso viene usato comunemente come dispersione acquosa. In queste condizioni possiede generalmente una debole durata ed in particolare in condizioni di diluizione è anche più facilmente instabile. An important drawback for the use of the enzyme consists in the fact that it is commonly used as an aqueous dispersion. In these conditions it generally has a weak duration and in particular in dilution conditions it is also more easily unstable.

Come è noto tale difficoltà può essere, come per molti altri mezzi, superata mediante processi che ne permettano la immobilizzazione su matrici solide come, per esempio, fibre di cellulosa rigenerata, allineate ed impaccate in un reattore a flusso come illustrato nella fig. 1 o su film di cellulosa rigenerata avvolto a spirale in modo da poter costituire un reattore a riciclo, come illustrato nella fig. 2. As is known, this difficulty can be, as for many other means, overcome by processes which allow it to be immobilized on solid matrices such as, for example, regenerated cellulose fibers, aligned and packed in a flow reactor as illustrated in fig. 1 or on a spiral-wound regenerated cellulose film so as to constitute a recycling reactor, as illustrated in fig. 2.

In addizione l'impiego di enzima supportato permette di ottenere una facile separazione tra reagenti (e prodotti) della reazione chimica e il catalizzatore in fase solida, con un notevole vantaggio dal punto di vista preparativo. In addition, the use of supported enzyme allows to obtain an easy separation between reagents (and products) of the chemical reaction and the catalyst in the solid phase, with a significant advantage from the preparation point of view.

L'enzima può essere immobilizzato con differenti metodologie: adsorbimento su matrici solide (polimeriche reticolate) o legato covalentemente a polimeri non solubili in H20. The enzyme can be immobilized with different methods: adsorption on solid matrices (cross-linked polymers) or covalently bound to polymers insoluble in H20.

Nei primi due casi si verifica usualmente una continua perdita di enzima, durante il processo dovuto al fatto che fenomeni di desassorbimento o di permeazione sono possibili. In the first two cases there is usually a continuous loss of enzyme, during the process due to the fact that phenomena of desorption or permeation are possible.

L'attacco di un enzima per formazione di un legame chimico con la matrice solida fornisce invece una maggiore ritenzione di attività delle preparazioni di enzima immobilizzato e può risultare in una maggiore stabilizzazione dell'enzima data la possibilità di irrigidirne la struttura. The attack of an enzyme for the formation of a chemical bond with the solid matrix instead provides a greater retention of activity of the immobilized enzyme preparations and can result in a greater stabilization of the enzyme given the possibility of stiffening its structure.

La scelta del supporto è poi funzione delle condizioni di impiego dell'enzima immobilizzato. The choice of support is then a function of the conditions of use of the immobilized enzyme.

Numerosi sono stati i supporti utilizzati, ma principalmente, hanno fornito risultati soddisfacenti, ai fini della immobilizzazione quelli a base di polidestrani insolubilizzati. Numerous substrates were used, but mainly, they provided satisfactory results, for the purposes of immobilization those based on insolubilized polydestranes.

L'elevato costo di questi materiali di partenza e la non possibilità di riutilizzo ne rendono tuttavia poco valida l'applicazione pratica. However, the high cost of these starting materials and the fact that they cannot be reused make their practical application of little value.

Uno dei metodi appropriati per ottenere le caratteristiche sopraccitate consiste nell'utilizzo di cellulosa, polvere, 3o fibre, filato, film come matrice solida per supportare enzimi che siano ad essa chimicamente legati. One of the appropriate methods to obtain the aforementioned characteristics consists in the use of cellulose, powder, 3rd fiber, yarn, film as a solid matrix to support enzymes which are chemically linked to it.

La cellulosa risulta essere un materiale poco costoso e facilmente reperibile in commercio, appropriato quindi per l'impiego come materiale di supporto tenendo conto della 35 disponibilità di funzione alcoliche per la formazione, previa opportuna attivazione, di legami covalenti con gruppi am-minici delle proteine. Cellulose is an inexpensive and easily available material on the market, therefore suitable for use as a support material taking into account the availability of alcohol functions for the formation, after appropriate activation, of covalent bonds with amino groups of proteins .

In considerazione della sua struttura, costituita da una parte altamente impaccata e quindi inaccessibile, necessita 40 di una modificazione fisica per ottenere una maggiore possibilità di attacco della molecola della proteina. In view of its structure, consisting of a highly packed and therefore inaccessible part, it requires 40 physical modification to obtain a greater possibility of attack by the protein molecule.

Dopo opportuno metodo di rigonfiamento la cellulosa può essere attivata mediante reazione con CNBr per fornire prodotti reattivi. After a suitable swelling method, the cellulose can be activated by reaction with CNBr to provide reactive products.

45 II materiale cellulosico attivato può ora essere trattato con proteine (penicillin-amidasi o penicillin-acilasi) fornendo quindi enzima immobilizzato che viene poi impiegato in reattore per idrolisi o radiazione di penicilline e cefalosporine. 45 The activated cellulosic material can now be treated with proteins (penicillin-amidase or penicillin-acylase) thus providing immobilized enzyme which is then used in the reactor by hydrolysis or radiation of penicillins and cephalosporins.

Va inoltre ricordato che l'applicazione di acilasi grezze so presenti in biomasse per la diretta sintesi enzimatica di derivati di penicilline e cefalosporine può condurre a derivati che portano abbastanza frequentemente a fenomeni allergici. Ciò risulta essere conseguenza del fatto che la sintesi enzimatica viene fatta mediante enzimi che ancora contengono 55 una forte quantità di proteine estranee e che possono di conseguenza originare i fenomeni sopraccitati. It should also be remembered that the application of crude acylases present in biomass for the direct enzymatic synthesis of penicillin and cephalosporin derivatives can lead to derivatives that lead quite frequently to allergic phenomena. This is a consequence of the fact that the enzymatic synthesis is carried out by enzymes which still contain a strong quantity of foreign proteins and which can consequently originate the above mentioned phenomena.

Al tempo stesso l'utilizzo in genere di enzimi sensibilmente purificati per un singolo ciclo di reazione può risultare scarsamente vantaggioso sotto il profilo applicativo da-60 to il costo generalmente sensibile che presenta un enzima purificato. At the same time the use in general of sensitively purified enzymes for a single reaction cycle can be of little advantageous from the application point of view from the generally sensitive cost that a purified enzyme has.

Pertanto l'immobilizzazione di enzimi a sufficiente stadio di purificazione su matrici solide risulta essere un processo vantaggioso nel caso di preparazione di derivati delle 65 penicilline e cefalosporine, poiché da un lato può ridurre o evitare la formazione di prodotti che diano luogo a fenomeni di allergia, dall'altro lato permette di riutilizzare in cicli ripetuti Io stesso enzima per la preparazione. Therefore the immobilization of enzymes with a sufficient purification stage on solid matrices turns out to be an advantageous process in the case of the preparation of derivatives of 65 penicillins and cephalosporins, since on the one hand it can reduce or avoid the formation of products that give rise to allergy phenomena , on the other hand, allows the same enzyme to be reused in repeated cycles for the preparation.

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6 6

Realizzazione realization

Si può utilizzare materiale celluioso in forma di polvere, fibra e in forma di film rigenerato. Cellular material in the form of powder, fiber and in the form of regenerated film can be used.

La scelta opportuna della matrice solida risulta funzione del tipo di utilizzo del reattore necessario. The appropriate choice of the solid matrix is a function of the type of use of the necessary reactor.

La cellulosa è costituita da catene policarboidrate con legame 1,4 ß-glucosidico che risultano particolarmente impaccate in forma di microfibrille costituendo una zona altamente cristallina e quindi inaccessibile ai reagenti (senza distruzione del cristallo) ed una parte amorfa che può essere più facilmente attivata e quindi accessibile. Cellulose consists of polycarbohydrate chains with 1,4 ß-glucosidic bond which are particularly packed in the form of microfibrils constituting a highly crystalline area and therefore inaccessible to the reagents (without destruction of the crystal) and an amorphous part that can be more easily activated and therefore accessible.

La reattività della funzione ossidrile è fortemente attivata in seguito alla formazione di alcali-cellulosa, originando contemporaneamente un aumento di accessibilità della fibra che favorisce la successiva reazione dell'enzima. The reactivity of the hydroxyl function is strongly activated following the formation of alkali-cellulose, simultaneously giving rise to an increase in the accessibility of the fiber which favors the subsequent reaction of the enzyme.

L'eventuale presenza di un tensioattivo ha come solo effetto quello di favorire la penetrazione dell'alcali nel materiale cellulosico. The possible presence of a surfactant has the only effect of promoting the penetration of alkali into the cellulosic material.

La immobilizzazione ha effetto in termini di stabilizzazione dell'enzima. Immobilization has an effect in terms of stabilizing the enzyme.

Esempio n. 1 Example n. 1

Immobilizzazione di penicillin amidasi su polvere di cellulosa Immobilization of penicillin amidase on cellulose powder

5 g di polvere di cellulosa vengono mercerizzati con-NaOH 17,5% w/v contenente 2%0 di tensioattivo non ionico con un rapporto di bagno: cellulosa/NaOH, 1:12. Si lascia a 10°C per 30' e poi si agita vigorosamente la sospensione per 15'. Si filtra e si lava su opportuno filtro-pressa sino o. un peso di 12 g. 5 g of cellulose powder are mercerized with 17.5% w / v-NaOH containing 2% 0 of non-ionic surfactant with a bath: cellulose / NaOH ratio, 1:12. The suspension is left at 10 ° C for 30 'and then the suspension is vigorously stirred for 15'. It is filtered and washed on a suitable filter press until or. a weight of 12 g.

Questi vengono sospesi in soluzione alcalina 0.1 M a temperatura di 10° correggendo il pH a 11.2. Si addiziona lentamente una soluzione di CNBr sotto agitazione mantenendo costante il pH a 11.2. Terminata l'addizione del reattivo si filtra a freddo e si lava con una soluzione di opportuno tampone (carbonato, fosfato, borato) a pH compreso tra 6 e 9. These are suspended in 0.1 M alkaline solution at a temperature of 10 ° correcting the pH to 11.2. A solution of CNBr is slowly added under stirring keeping the pH constant at 11.2. Once the addition of the reagent is complete, it is filtered cold and washed with a solution of suitable buffer (carbonate, phosphate, borate) at a pH between 6 and 9.

Si ottiene una sospensione a cui viene aggiunta una soluzione di penicillin amidase (E.C. 3.5.1.11) 1-50 mg in opportuno tampone (carbonato, fosfato, borato) a pH compreso tra 6 e 9. A suspension is obtained to which a solution of penicillin amidase (E.C. 3.5.1.11) 1-50 mg is added in a suitable buffer (carbonate, phosphate, borate) at a pH between 6 and 9.

Si lascia agitare a temperature comprese tra 4 e 30°C per 180' e si lascia a temperatura inferiore a 7° per altre 15 ore. The mixture is left to stir at temperatures between 4 and 30 ° C for 180 minutes and is left at a temperature below 7 ° for another 15 hours.

Si lava con un gradiente di Na^Oj-NaCl sino a neutralità. It is washed with a Na ^ Oj-NaCl gradient until neutral.

La penicillin amidase è pronta per essere utilizzata in reattore a colonna. Penicillin amidase is ready for use in a column reactor.

Esempio n. 2 Example n. 2

Immobilizzazione di penicillin amidasi su fibre di cellulosa Immobilization of penicillin amidase on cellulose fibers

5 g di fibre di cellulosa ad alto grado' di purezza ed esenti da grassi, e residui di lignina sono trattati allo sfibrilla-tore per 30', in acqua demineralizzata, con un rapporto 1:8 solido liquido. 5 g of high purity and fat-free cellulose fibers and lignin residues are treated with the defibrillator for 30 ', in demineralized water, with a 1: 8 liquid solid ratio.

Le fibre vengono poi filtrate e sospese in NaOH 17.5% per 2 ore a t.a. Si filtra e si lava sotto pressa sino a un recupero del 250%. Si sospende in HaO (4°) correggendo il pH a 11.2 opportunamente con un rapporto di bagno 1:20. The fibers are then filtered and suspended in 17.5% NaOH for 2 hours at t.a. It is filtered and washed under press until a recovery of 250%. It is suspended in HaO (4 °), correcting the pH to 11.2 appropriately with a 1:20 bath ratio.

Si addiziona una soluzione di CNBr e si mantiene il pH costante a 11.2 per addizione di NaOH. A solution of CNBr is added and the pH is kept constant at 11.2 by addition of NaOH.

Si lascia reagire per 25' quindi si filtra e si lava con soluzione di opportuno tampone 0.1 molare pH compreso tra 6 e 10. Si filtra a temperatura inferiore a 12° e si recupera il pannello che viene posto in apposito reattore a riciclo. The mixture is left to react for 25 minutes, then it is filtered and washed with a solution of a suitable 0.1 molar buffer pH between 6 and 10. It is filtered at a temperature below 12 ° and the panel is recovered and placed in a special recycling reactor.

Il pannello viene continuamente percolato con una soluzione a 18° di penicillin amidase (E.C. 3.5.1.11) in apposito reattore, a pH compreso tra 6 e 9.5 contenente 10-100 mg di enzima per tempi compresi tra 1 e 12 ore. 5 A reazione terminata le fibre cellulosiche sono lavate con soluzione tampone contenente 0.7 % di NaCl e 0.3 % di glicina. The panel is continuously percolated with an 18 ° solution of penicillin amidase (E.C. 3.5.1.11) in a special reactor, at a pH between 6 and 9.5 containing 10-100 mg of enzyme for times between 1 and 12 hours. 5 At the end of the reaction, the cellulosic fibers are washed with a buffer solution containing 0.7% of NaCl and 0.3% of glycine.

L'enzima immobilizzato può ora essere utilizzato in apposito reattore a riciclo. The immobilized enzyme can now be used in a special recycling reactor.

io I

Esempio n. 3 Example n. 3

Immobilizzazione di penicillin acilasi su fibre di cellulosa Immobilization of penicillin acylase on cellulose fibers

15 Fibre di cellulosa rigenerate sono allineate ed impaccate in un reattore a flusso come illustrato nella fig. 1. 15 Regenerated cellulose fibers are aligned and packed in a flow reactor as illustrated in fig. 1.

Figura 1 Figure 1

Il reattore opportunamente costruito viene percolato con 20 una soluzione 0.5 % di NaOH e successivamente con 0.3 M KHC03 a temperatura inferiore a 10° per 5-60'. Successivamente si fa passare attraverso il reattore una soluzione di CNBr mantenuta opportunamente a pH costante a valori tra 10.2 e 11.4 e temperature comprese tra 5 e 15°C. 25 Terminata l'attivazione (15-30 minuti) le fibre vengono opportunamente lavate con soluzioni acquose a pH compresi tra 6 e 8 ed a temperatura inferiore a quella ambiente. The suitably constructed reactor is percolated with 20 a 0.5% NaOH solution and subsequently with 0.3 M KHC03 at a temperature below 10 ° for 5-60 '. Subsequently, a solution of CNBr is passed through the reactor suitably maintained at a constant pH at values between 10.2 and 11.4 and temperatures between 5 and 15 ° C. 25 After activation (15-30 minutes), the fibers are suitably washed with aqueous solutions at a pH between 6 and 8 and at a lower temperature than the ambient temperature.

Il reattore viene successivamente percolato con una soluzione di penicillin acilasi (6.5 mg/ml) in tampone fosfato 30 ed a pH compreso tra 6 e 9 per 30 minuti a temperatura compresa tra 10 e 15°C e successivamente per 20 ore a bassa temperatura. The reactor is subsequently percolated with a solution of penicillin acylase (6.5 mg / ml) in phosphate buffer 30 and at a pH of between 6 and 9 for 30 minutes at a temperature of between 10 and 15 ° C and subsequently for 20 hours at low temperature.

Dopo la reazione le fibre sono opportunamente lavate con soluzioni tampone allo scopo di eliminare il materiale 35 proteico adsorbito e dopo di che il reattore risulta pronto per essere utilizzato. After the reaction, the fibers are suitably washed with buffer solutions in order to eliminate the adsorbed protein material 35 and after which the reactor is ready for use.

Esempio n. 4 Example n. 4

40 Immobilizzazione di penicillin amidasi su film di cellulosa 40 Immobilization of penicillin amidase on cellulose film

Film di cellulosa rigenerata (5 g) viene immerso per 2 ore in soluzione 0.5 % di NaOH e successivamente lavato 45 con soluzione di KHCOs a pH 10.9, 0.3 M. Si addizionano 100-800 mg di CNBr e si ricicla attraverso il film (avvolto a spirale) la soluzione sino a completa dissoluzione del CNBr (25-30 min) mantenendo fredda la soluzione (5-7°). Regenerated cellulose film (5 g) is immersed for 2 hours in 0.5% NaOH solution and then washed 45 with KHCOs solution at pH 10.9, 0.3 M. 100-800 mg of CNBr are added and is recycled through the film (wrapped spiral) the solution until complete dissolution of the CNBr (25-30 min) keeping the solution cold (5-7 °).

Si lava accuratamente l'eccesso di CNBr non reagito e 50 si ricicla attraverso il film una soluzione di penicillin amidase in tampone 0.2 M a concentrazione compresa tra 100-1000 mg per 500 mi. La reazione viene continuata per 1-10 ore con variazione di temperatura tra 20 e 4 gradi in presenza di (0-5 %) acido fenilacetico. The excess of unreacted CNBr is carefully washed and 50 is recycled through the film to a solution of penicillin amidase in 0.2 M buffer at a concentration of between 100-1000 mg per 500 ml. The reaction is continued for 1-10 hours with a temperature variation between 20 and 4 degrees in the presence of (0-5%) phenylacetic acid.

55 A reazione terminata si recupera l'enzima non reagito e il reattore è pronto per essere utilizzato. 55 At the end of the reaction, the unreacted enzyme is recovered and the reactor is ready for use.

Esempio n. 5 Example n. 5

Immobilizzazione di penicillin acilasi 60 su film di cellulosa Immobilization of penicillin acylase 60 on cellulose film

Film di cellulosa rigenerata viene avvolto a spirale in modo da poter costituire un reattore a riciclo (v. fig. 2). Regenerated cellulose film is wound in a spiral so as to form a recycling reactor (see fig. 2).

65 Figura 2 65 Figure 2

In cui l'alimentazione dei reagenti avvenga nella parte interna della spirale e il recupero della soluzione fuoriuscente avvenga alla parte superficiale esterna della spirale. La In which the feeding of the reactants takes place in the internal part of the spiral and the recovery of the leaking solution takes place in the external superficial part of the spiral. There

7 7

640240 640240

separazione tra le due superfici spiralate è ottenuta mediante l'interposizione di apposito materiale inerte. separation between the two spiral surfaces is obtained by interposing a specific inert material.

Il reattore viene fatto fluire con una soluzione alcalina (es. 0.5% NaOH) fredda e successivamente con una soluzione di KHCOj 0.3 M. The reactor is made to flow with a cold alkaline solution (e.g. 0.5% NaOH) and subsequently with a 0.3 M solution of KHCOj.

Mantenendo la temperatura intorno a 10°C si fa reagire il film cellulosico con aslogenuro di cianogeno per ottenere sul film funzioni reattive con r gruppi amminici delle proteine. By keeping the temperature around 10 ° C, the cellulosic film is reacted with cyanogen aslogenide to obtain reactive functions on the film with amine groups of proteins.

Dopo opportuno lavaggio con soluzioni acquose a pH compreso tra 6 e 9 il reattore è fatto continuamente fluire con una soluzione tampone (usualmente fosfato) a pH compreso tra 6 e 9 contenente penicillin acilasi (6.5 mg/ml). La temperatura di reazione viene gradualmente diminuita da 15 a 4°C e la reazione protratta per 2-24 ore. After appropriate washing with aqueous solutions at a pH between 6 and 9, the reactor is continuously made to flow with a buffer solution (usually phosphate) at a pH between 6 and 9 containing penicillin acylase (6.5 mg / ml). The reaction temperature is gradually decreased from 15 to 4 ° C and the reaction continued for 2-24 hours.

Terminato l'attacco della proteina al film cellulosico attivato, questo viene lavato a fondo con soluzioni tampone e il reattore può quindi essere utilizzato nella sintesi enzimatica di derivati delle cefalosporine e delle penicilline. Once the attachment of the protein to the activated cellulosic film is over, it is thoroughly washed with buffer solutions and the reactor can then be used in the enzymatic synthesis of cephalosporin and penicillin derivatives.

Esempio n. 6 Idrolisi di benzilpenicillina Example n. 6 Hydrolysis of benzylpenicillin

10 g di polvere di cellulosa preparata come al punto 1 contenente penicillin amidase viene impaccata in una colonna di 1.2 cm X 14 cm h termostata con bagno ad acqua tra 27 e 50°C. 10 g of cellulose powder prepared as in point 1 containing penicillin amidase is packed in a column of 1.2 cm X 14 cm h thermostated with a water bath between 27 and 50 ° C.

La colonna viene percolata con una soluzione da 0.1-5% di benzilpenicillina con un flusso regolato da 0.1 a 10 mi ora. Il pH della soluzione è compreso tra 6.5 e 7.2, in presenza di 0.2% toluene. The column is percolated with a 0.1-5% benzylpenicillin solution with a flow regulated from 0.1 to 10 ml per hour. The pH of the solution is between 6.5 and 7.2, in the presence of 0.2% toluene.

Dall'eluato si ottiene acido penicillanico con una resa superiore ad 80%. Penicillanic acid is obtained from the eluate with a yield higher than 80%.

L'acido 6-APA viene, dopo reazione enzimatica recuperato dal mezzo di reazione per concentrazione sotto vuoto e cristallizzazione. The 6-APA acid is, after enzymatic reaction, recovered from the reaction medium by concentration under vacuum and crystallization.

Esempio n. 7 Idrolisi di penicilline Example n. 7 Hydrolysis of penicillins

11 reattore a riciclo utilizzato per l'immobilizzazione di cellulose prerigonfiate viene utilizzato per idrolizzare benzilpenicillina (o altre penicilline) mediante fibre aventi attività amidasica. The recycling reactor used for the immobilization of pre-deflated cellulose is used to hydrolyze benzylpenicillin (or other penicillins) by means of fibers having amidase activity.

Quantità di fibre impaccate in pannello filtrante e contenenti penicillin amidasi ad esse immobilizzate, sono trattate a flusso continuo con una soluzione 0.1-5% di benzil penicillina (o altre penicilline) mantenendo il pH costante (6-8 pH) e la temperatura costante in apposita apparecchiatura dotata di pompa di riciclo. Quantity of fibers packed in a filter panel and containing penicillin amidase immobilized to them, are treated with a continuous flow with a 0.1-5% solution of benzyl penicillin (or other penicillins) maintaining the constant pH (6-8 pH) and the constant temperature in special equipment equipped with a recycling pump.

Durante la reazione di idrolisi il pH è mantenuto costante al valore fissato per correzione con alcali. During the hydrolysis reaction the pH is kept constant at the value set by correction with alkalis.

L'acido 6-APA formatosi viene poi separato per adsorbimento su resina a scambio ionico e il reattivo non trasformato riciclato. The 6-APA acid formed is then separated by adsorption on ion exchange resin and the recycled unprocessed reactive.

Esempio n. 8 Idrolisi di penicillina G. Example n. 8 Penicillin G hydrolysis.

Il reattore a flusso continuo viene preparato da film di cellulosa penicillinamidasi opportunamente avvolto attorno all'asse d'alimentazione e distanziati da opportuno separatore. The continuous flow reactor is prepared from penicillinamidase cellulose film suitably wrapped around the feed axis and spaced by a suitable separator.

Figura 2 Figure 2

Il reattore viene fatto lavorare a pH compresi tra 5 e 8 con una soluzione 10% di penicillina G. The reactor is made to work at a pH between 5 and 8 with a 10% solution of penicillin G.

Il reattore viene percorso dalla soluzione e si forma 6-APA che viene raccolto dalla parte esterna. The reactor is run through the solution and 6-APA is formed which is collected from the outside.

Si lavora in processo in continuo e la stabilità dell'enzima immobilizzato risulta superiore a 10 giorni di lavoro in continuo, con conversione dell'ordine di 85 % di penicillina. The process is carried out continuously and the stability of the immobilized enzyme is greater than 10 days of continuous work, with conversion of the order of 85% of penicillin.

Esempio n. 9 Preparazione dell'amoxicillina Example n. 9 Preparation of amoxicillin

Il reattore descritto nell'esempio 3, inserito in apposita apparecchiatura dotata di pompa di riciclo, viene percolato con una soluzione tampone 0.1 Molare di fosfato potassico a pH 7 contenente 0.3 % di acido 6-amminopenicillanico e 1% di estere etilico di d(—)-p-idrossifenilglicina; la temperatura è mantenuta costante a 25°C. The reactor described in Example 3, inserted in a special apparatus equipped with a recycling pump, is percolated with a 0.1 Mole buffer solution of potassium phosphate at pH 7 containing 0.3% of 6-aminopenicillanic acid and 1% of ethyl ester of d (- ) -p-hydroxyphenylglycine; the temperature is kept constant at 25 ° C.

La conversione del 6-APA in amoxicillina è controllata con le usuali tecniche analitiche. The conversion of 6-APA into amoxicillin is controlled with the usual analytical techniques.

Esempio n. 10 Preparazione della cefalexina Example n. 10 Preparation of cefalexin

Operando come nell'esempio 9, ma sostituendo all'acido 6-amminopenicillanico (6-APA) l'acido 7-amminodeace-tossicefalosporanico (7 ADCA) si ottiene la cefalexina. By operating as in example 9, but by substituting 7-aminodeace-tossicefalosporanic acid (7 ADCA), 6-aminopenicillanic acid (6-APA) is obtained, cefalexin is obtained.

Esempio n. 11 Example n. 11

Per esigenze di assemblaggio o di reperimento dei materiali, è possibile sostituire al reattore a fibre descritto nell'esempio 3, il reattore a film descritto nell'esempio 5 ed impiegarlo con le medesime modalità descritte negli esempi 9 e 10. For assembly or material retrieval needs, it is possible to replace the fiber reactor described in Example 3 with the fiber reactor described in Example 5 and use it in the same way as described in Examples 9 and 10.

Gli esempi sopra riportati non sono limitativi della presente invenzione, ma sarà semplice per l'esperto della materia estenderli alla preparazione di altre penicilline o cefalosporine semisintetiche. The above examples are not limitative of the present invention, but it will be simple for the person skilled in the art to extend them to the preparation of other semi-synthetic penicillins or cephalosporins.

Esame delle differenze brevettuali Examination of patent differences

Penicilline e cefalosporine semisintetiche vengono preparate modificando per vie chimica penicilline e cefalosporine naturali. Semi-synthetic penicillins and cephalosporins are prepared by chemically modifying natural penicillins and cephalosporins.

I numerosi brevetti apparsi su questo argomento possono ricondursi a due schemi fondamentali: The numerous patents that have appeared on this topic can be traced back to two fundamental schemes:

a) idrolisi di prodotti naturali a 6-APA e successiva acilazione b) diacilazione dell'immino cloruro di prodotti naturali. a) hydrolysis of natural products to 6-APA and subsequent acylation b) diacylation of the imino chloride of natural products.

Tutti questi metodi sono nettamente diversi da quello descritto nel presente brevetto. All these methods are distinctly different from that described in the present patent.

In alternativa ai metodi chimici, esistono alcuni metodi microbiologici. Questi possono prevedere una fermentazione in presenza di adatti precursori (Lilly, U.S. 2 479 295, 2 479 296, 2 479 297, 2 562 408, 2 562 410, 2 562 411) in modo da avere una biosintesi per così dire pilotata, oppure radiazione del 6-APA preformato (Takeda, Neth. 7 17 613). As an alternative to chemical methods, there are some microbiological methods. These can involve fermentation in the presence of suitable precursors (Lilly, US 2 479 295, 2 479 296, 2 479 297, 2 562 408, 2 562 410, 2 562 411) so as to have a biosynthesis, so to speak piloted, or radiation of the preformed 6-APA (Takeda, Neth. 7 17 613).

Un ulteriore avvicinamento al nostro metodo può essere considerato l'impiego di sistemi enzimatici isolati. Le limitazioni derivano dalla scarsa stabilità degli enzimi in soluzione, da inibizioni dovute ai prodotti di reazione, dal possibile inquinamento con proteine estranee, causa di fenomeni allergici (SNAM, Ger. Offen 2 460 607). A further approach to our method can be considered the use of isolated enzyme systems. The limitations derive from the poor stability of the enzymes in solution, from inhibitions due to the reaction products, from possible pollution with foreign proteins, the cause of allergic phenomena (SNAM, Ger. Offen 2 460 607).

Le limitazioni del caso precedente possono essere superate con l'impiego di enzimi immobilizzati. The limitations of the previous case can be overcome with the use of immobilized enzymes.

In tal modo l'enzima è più stabile, può essere impiegato in reattori a flusso continuo evitando inibizioni ed escludendo proteine estranee. In this way the enzyme is more stable, it can be used in continuous flow reactors avoiding inhibitions and excluding foreign proteins.

L'immobilizzazione può essere effettuata per inglobamento fisico in fibre: cellulosa modificata, sciolta in solvente organico, emulsionata con la soluzione acquosa dell'adatto Immobilization can be carried out by physical incorporation into fibers: modified cellulose, dissolved in organic solvent, emulsified with the appropriate aqueous solution

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enzima, viene filata in presenza di un opportuno coagulante: l'enzima resta inglobato in vacuoli (SNAM, Brev. lt. 987 038. Ger. Offen 1 932 426, 2 460 649). enzyme, is spun in the presence of a suitable coagulant: the enzyme remains incorporated in vacuoles (SNAM, Brev. lt. 987 038. Ger. Offen 1 932 426, 2 460 649).

Un altro metodo di immobilizzazione prevede l'attacco covalente dell'enzima su vari polimeri come destrani e se-pharose mediante reattivi bifunzionali quali dialdeidi o di-ammine (Beecham, Ger. Offen 253 591). Another method of immobilization involves the covalent attack of the enzyme on various polymers such as dextrans and sepharose by means of bifunctional reagents such as dialdehydes or di-amines (Beecham, Ger. Offen 253 591).

Questi due metodi che prevedono l'impiego dell'enzima immobilizzato, più si avvicinano al metodo descritto del presente brevetto. Le differenze sostanziali si possono così riassumere: nel primo caso si verifica usualmente una continua perdita di enzima per fenomeni di permeazione; nel secondo caso i supporti impiegati sono molto costosi, la for-5 mazione dlel legame chimico è abbastanza complessa. These two methods which provide for the use of the immobilized enzyme, come closest to the method described in the present patent. The substantial differences can be summarized as follows: in the first case there is usually a continuous loss of enzyme due to permeation phenomena; in the second case the supports used are very expensive, the formation of the chemical bond is quite complex.

Con il metodo descritto nel presente brevetto si evitano perdite di enzima, in quanto è legato chimicamente al supporto, il supporto stesso è poco costoso, facilmente reperibile ed) il metodo di immobilizzazione è piuttosto semplice. With the method described in the present patent, enzyme losses are avoided, since it is chemically linked to the support, the support itself is inexpensive, easily available and) the immobilization method is rather simple.

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2 fogli disegni 2 drawings sheets