CN1219509C - 迷迭香酸及其衍生物用于制备免疫抑制剂药物的用途 - Google Patents

迷迭香酸及其衍生物用于制备免疫抑制剂药物的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN1219509C
CN1219509C CNB998063061A CN99806306A CN1219509C CN 1219509 C CN1219509 C CN 1219509C CN B998063061 A CNB998063061 A CN B998063061A CN 99806306 A CN99806306 A CN 99806306A CN 1219509 C CN1219509 C CN 1219509C
Authority
CN
China
Prior art keywords
rosmarinic acid
cell
derivant
herba rosmarini
rosmarini officinalis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB998063061A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1315863A (zh
Inventor
许银美
崔永峰
朴昌远
李钟星
朴东洙
尹荣大
李键炯
吴宗恩
安洵撤
李炫宣
安宗石
郑守一
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mogam Biotechnology Research Institute
Original Assignee
Mogam Biotechnology Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1019980017741A external-priority patent/KR100279902B1/ko
Priority claimed from KR1019990015989A external-priority patent/KR20000072988A/ko
Application filed by Mogam Biotechnology Research Institute filed Critical Mogam Biotechnology Research Institute
Publication of CN1315863A publication Critical patent/CN1315863A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1219509C publication Critical patent/CN1219509C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Abstract

本发明涉及使用迷迭香酸和/或其衍生物作为免疫抑制试剂和/或作为SH2结构域功能的抑制剂。本发明公开的是迷迭香酸和其衍生物特异地抑制配体多肽与Lck SH2结构域的结合，干扰T细胞内的Lck介导的信号传导，也抑制细胞因子基因的表达和抑制移植组织内的免疫反应。迷迭香酸及其衍生物的这些活性支持了他们在移植排斥、GVHD、自身免疫病、炎性疾病等的治疗、预防和/或诊断中的应用性。

Description

迷迭香酸及其衍生物用于制备免疫抑制剂药物的用途
发明领域
本发明是关于迷迭香酸和/或其衍生物作为免疫抑制剂和/或LCK(淋巴细胞激酶)SH2结域构功能抑制剂的使用。
背景
器官移植现在对肾，心脏，肝或肺功能衰竭的病人已普遍使用。目前，肾，心脏，肺，肝，骨髓，胰脏(胰岛细胞)，角膜，小肠和皮肤已经普遍使用于异体移植。另外，现在猪心脏瓣膜用于进行异体移植。然而器官移植会引起宿主各种免疫应答，导致移植排斥和移植引起的宿主疾病(以下称“GVHD”)。
免疫应答主要由T细胞识别异体抗原而引起，移植排斥的主要目标是非自身等位形式的I型和II型主要组织相容性复合体(MHC)抗原。在急性排斥中，供体的抗原递呈细胞如树状细胞和单细胞，从异体移植转移到局部***，在这里它们被受体CD4+TH细胞识别为外源的，刺激TH细胞增殖。随着TH胞的增殖，效应细胞群(包括细胞毒CD8+T细胞和CD4+T细胞)产生，它们迁移进入到移植区域并且介导移植排斥(Noelle等，FASEB 5(13)：2770，1991)。
但是急性排斥是T细胞依赖的过程，移植破坏中许多效应机制参与。通过释放细胞因子和细胞与细胞的作用，不同类型的淋巴细胞，包括CD4+T细胞，CD8+T细胞毒T细胞，形成抗体的B细胞和其他前炎症淋巴细胞参与到抗异体移植反应中。抗原递呈移植细胞被细胞毒性CD8+T细胞直接破坏。活化CD4+T细胞产生的白细胞介素-2(以下称做“IL-2”)，它对活化CD8+T细胞和B细胞是必须的。另外，CD4+T细胞产生其他细胞因子如IFN-γ和IL-4，它们对异体移植的破坏也起一份作用。其次，干扰素-γ(以下简称“IFN-γ”)诱导移植组织MHC I类和MHC II类分子的表达的提高，从而更容易被异体反应效应细胞攻击。IFN-γ增强巨噬细胞的活性并影响许多炎症细胞导致延迟型过敏反应和炎症，引起对移植的非特异性损伤。这些反应是引起早期急性排斥的主要原因，发生在移植后的最初几周。如果不进行治疗，急性排斥是一种快的、严重的过程，导致在几天内移植物的毁坏。
在骨髓移植中，GVHD(；移植物相对于宿主的疾病)是另外一个影响移植病人存活的障碍。GVHD是一种其中被移植的髓细胞攻击受体细胞的疾病(Storb，“病理生理学和骨髓移植病理生理学和骨髓移植，免疫学进展：血细胞抗原和骨髓移植，McCullogh and Sandler，编著，Alan，Inc.，New York，p.337，1984”)。大部分患有GVHD的病人因此死亡(Weiden et al.，“Graft-versus-host disease in allogeneic marrowtransplantation”，IN Biology of Bone-Marrow Transplantation，Gale and Fox，编著，Academic Press，New York，p37，1980)。
为了使病人免于这种致命的伤害，使用了各种免疫抑制剂。目前，异体移植排斥用以下免疫抑制剂来控制：如环孢多肽A、硫唑嘌呤、皮质类固醇包括强的松，和甲基***龙，环磷酰胺。环孢多肽A是一种最强的利用最广的免疫抑制剂，它引起了器官移植的革命。其他免疫抑制剂如FK506、雷怕霉素，霉酚酸、15-脱氧***蛋白、mizoibine、米索前列醇、OKT3和抗IL-2受体的抗体，已被用于治疗和预防器官排斥反应(Brigges，Immunology letters，29(1-2)，89-94，1991；FASER 3：3411，1989)。虽然新的免疫抑制剂的发现使病人存活率显著提高，这些药物的副作用有较高发生率，比如肾中毒和/或肝中毒。
由于移植排斥的免疫应答主要依赖于T细胞，因此能抑制T细胞功能的药物应该是比较有效的。环孢多肽A(CsA)和FK506通过抑制细胞因子的转录来抑制T细胞的活化。它们的作用机理总结如下。
环孢多肽A和FK506与免疫蛋白例如环孢多肽免疫蛋白和FK506结合蛋白(FKBPs)结合。药物-免疫蛋白复合物结合并抑制钙和钙调蛋白依赖的丝氨酸/酪氨酸磷酸酶即钙神经蛋白的活性。此酶的失活阻断了细胞质的转录因子NF-AT(活化T细胞的核因子)的核移位，该过程需细胞因子包括IL-2的表达。
然而，当环孢多肽A即使治疗剂量使用时就会引起毒副作用。虽然FK506抑制体外诱导IL-2转录的激活和体内移植排斥的作用比环孢多肽A强10-100倍，它也会引起诸如神经中毒和肾中毒等副作用。
雷怕霉素是另一种强免疫抑制剂，能抑制IL-2依赖型淋巴细胞的增殖。雷怕霉素-FKBP复合物的细胞靶目标，mTOR有磷酸肌醇激酶的活性，mTOR信号传导与的细胞周期进程有关，对细胞因子作出应答。
以上所说的免疫抑制剂药物都是影响T细胞的功能。但环孢多肽A和FK506阻断T细胞活化步骤，雷帕霉素抑制T细胞的增殖。但是这些药物细胞靶目标表达普遍。在免疫细胞，特别是T细胞中特异性表达的选择性抑制靶分子的化合物无疑是一种理想的和更为有效的免疫抑制药物。因此目前需要提高免疫抑制剂对免疫细胞的特异性作用。
对T细胞活化和效应器功能的抑制是药物发展的一个有吸引力的目标以治疗T细胞介导的免疫疾病，如自身免疫病和移植排斥。抗原特异性T细胞的活化由T细胞受体(以下简称“TCR”)介导的信号传导引起，该过程需酪氨酸激酶或磷酸蛋白的参与。活化的T细胞进入细胞增殖后被IL-2和IL-2受体之间的相互作用所调控。
T细胞特异性蛋白酪氨酸激酶，淋巴细胞激酶(以下简称“Lck”)TCR介导的信号传导的重要分子，并且在T细胞的成熟和活化中起重要作用。Lck在T细胞功能中最基本的作用是通过与SH2和/或SH3结构域和其他信号传导效应分子以及激酶结构域的催化活性实现。
SH2结构域是一些调控蛋白的保守区，包括约100个氨基酸，在细胞内蛋白与蛋白间的交流起重要作用。许多含有SH2结构域的蛋白有细胞内信号传导的功能。蛋白的SH2结构域与其配体蛋白的结合特异性是由磷酰酪氨酸的序列和结构以及结合位点附近的氨基酸所决定(Pawson，Nature，373：573-580，1995)。
Lck的SH2结构域同SH3结构域一样是Lck的调控基序。当Lck处于钝化状态时，SH2结构域结合到分子内的磷酰酪氨酸(pY505)。当Lck活化，SH2结构域从自调控***释放，即SH2结构域结合位点暴露于特异性T细胞配体蛋白，使二者结合(Peri et al.，Oncogene Res.，8：2765-2722，1993)。
以前的报道证明了Lck SH2结构域在T细胞活化中的重要作用。这些杰出的研究之一是利用Lck突变体，其中，配体蛋白的磷酰酪氨酸不能结合到SH2结构域上。在这种Lck突变体中，T细胞的信号传导***紊乱，如T细胞活化诱导的钙信号传送以及对T细胞增殖必需的IL-2的生物合成和分泌的信号传送(Xu and Littman，Cell，74：633-643；Straus etal.，J.Bio.Chem.，271：9976-9981，1996；Lewis et al.，J.Immunol.，159：2297-2300，1997)。总之，Lck的SH2结构域对于T细胞内ζ链有效磷酸化，活化诱导胞内Ca2+的移动及IL-2基因的表达的作用是必不可缺的。
尽管SH2结构域在细胞信号中重要，但对于单独的SH2结构域的功能知之甚少。研究象Lck一类的酪氨酸激酶在T细胞受体功能中的作用，由于缺少特异的药物抑制剂而无法进行。虽然几种小分子酪氨酸激酶抑制剂如herbimycin和PP1/PP2已经发现，但这些药物抑制了酪氨酸激酶的激酶活性却缺少特异性。
我们注意到Lck在T淋巴细胞特异性地表达，Lck的SH2结构域对T细胞的活化，增殖和分化起重要作用。鉴于此，我们尝试开发特异性抑制Lck SH2结构域的功能和T细胞功能的新型免疫抑制剂。在本发明中，我们公开了迷迭香酸及其衍生物有效抑制由动物组织移植引起的免疫应答和特异性的抑制Lck的SH2结构域。
由于迷迭香酸是一种结构域特异性抑制剂，选择性抑制SH2结构域，它能用于由SH2结构域和它的天然配体相互作用引起的疾病或病理反应，它也能用于治疗或预防免疫***紊乱如移植排斥、移植引起的宿主疾病、自身免疫疾病和慢性炎症。
本发明概述
本发明提供了迷迭香酸及其衍生物作为免疫抑制剂的新用途。
除了用做免疫抑制剂，本发明提出了迷迭香酸及其衍生物可作为SH2结构域抑制剂。
本发明的所有方面中，迷迭香酸的衍生物包括迷迭香基异丙基酯，迷迭香基乙基酯，和(S)-迷迭香基双(叔丁基二甲基甲硅烷基)醚。
本发明也提供将夏枯草(Prunella vulgaris) 提取物用做免疫抑制剂。
本发明也涉及将夏枯草提取物用做SH2结构域抑制剂。
本发明的免疫抑制剂对的治疗、预防，或诊断被移植器官、组织的排斥、慢性排斥、移植引起的宿主疾病方面有作用。
另外，本发明用迷迭香酸、其衍生物或夏枯草提取物治疗、预防或诊断自身免疫病。
另外，本发明用迷迭香酸、其衍生物或夏枯草提取物治疗由IL-1β，IL-4或IL-6水平升高引起的症状。
另外，本发明提供了用迷迭香酸、其衍生物或夏枯草提取物和至少另一种已明确的免疫抑制剂一起使用。
本发明还涉及从夏枯草分离迷迭香酸的方法，步骤如下：
1)将夏枯草浸入甲淳中，从其抽提活性材料；
2)用乙酸乙酯抽提由步骤1)所得物质，得活性组分；
3)用柱层析纯化步骤2)所得的产物，其中非活性组分由含有氯仿和甲醇的溶剂洗涤，活性组分由含有氯仿，甲醇和水的溶剂洗脱；
4)层析法纯化步骤3)所得的产物，其中甲醇被用作展开剂；
5)层析法纯化步骤4)所得的产物，其中含有甲醇和磷酸的溶剂被用作展开剂；
6)高效液相色谱纯化步骤5)所得的产物，其中含有甲醇和磷酸的溶剂被用作展开剂。
本发明目的是提供迷迭香酸及其衍生物作为免疫抑制剂或SH2结构域抑制剂的新用途。
本发明的另一目的是提供一种对哺乳动物副作用小的免疫抑制剂。
本发明的另一目的是提供一种免疫抑制剂，它可特异性地抑制T细胞激活，增殖和/或分化。
本发明的在一个目的是提供一种SH2结构域抑制剂，它能抑制T细胞活化的细胞内信号转导。
本发明的另一目的是提供一种从夏枯草中生产迷迭香酸的有效方法。
附图简述
图1表示的是体外迷迭香酸对Lck的SH2结构域与特异的磷酸酪氨酰肽之间的结合的抑制作用。
图2表示的是迷迭香酸不同剂量对细胞内钙信号的抑制作用，钙信号由对Jurat T细胞抗CD3和抗CD4抗体的使用而活化。
图3表示的是迷迭香酸对受TCR刺激的T细胞的活化的抑制作用。
图4表示的是迷迭香酸的衍生物物或(S)-迷迭香酸对受TCR刺激的T细胞的活化的抑制作用。
图5表示的是迷迭香酸对混合淋巴细胞反应(MLR)中T细胞增殖的抑制作用。
图6表示的是迷迭香酸在小鼠中与DNFB的接触敏感反应的抑制作用，和
图7表示的是迷迭香酸对肾的异体移植的细胞因子产生的抑制作用。
优选实施方案详述
本发明提供了迷迭香酸及其衍生物作为免疫抑制剂或SH2结构域抑制剂的新用途。本发明的迷迭香酸包括(R)型，(S)型，及消旋型。
本发明提出了生产迷迭香酸的方法，其中通过溶剂抽提和层析法从夏枯草中分离迷迭香酸。
本发明也提供了迷迭香酸衍生物作为免疫抑制剂和/或Lck的SH2结构域特异抑制剂的使用。迷迭香酸的衍生物包括迷迭香基异丙基酯、迷迭香基乙基酯和(S)-迷迭香基-双(叔丁基-二甲基甲硅烷基)醚。
本发明还提供了药物组合物，包括迷迭香酸，其衍生物和/或夏枯草的提取物。该药物组合物用做免疫抑制剂和/或Lck的SH2结构域抑制剂，尤其在治疗、预防和/或诊断移植器官或组织的排斥、自身免疫疾病、炎症等方面。
以下是本发明的详细说明。
一方面，本发明提供了迷迭香酸，其衍生物和/或夏枯草的提取物用做免疫抑制剂和/或Lck的SH2结构域特异抑制剂。
本发明的迷迭香酸的应用不同于已建立的迷迭香酸的应用或生物活性，如下所述：抗病毒活性(WO 9213523)，抑制TNF产生的活性(JP721584)，5-脂氧合酶抑制活性(JP 1121217)，抗***试剂(DE3247610，DE 2952114，EP 34214，US 4329361，等)，抗氧化，抗菌活性等。
本发明的各方面，迷迭香酸和迷迭香酸的衍生物包括：S型，R型迷迭香酸，迷迭香基异丙基酯，迷迭香基乙基酯和(S)-迷迭香基-双(叔丁基-二甲基甲硅烷基)醚等。可以使用其它的衍生物而不脱离本发明的精神和范围。
在优选实施方案中，迷迭香酸可从包括夏枯草在内的各种草本植物的抽提物中分离得到。
筛选出的迷迭香酸是一种Lck SH2结构域与特异的配体分子之间相结合的抑制剂。
在优选实施方案中，从夏枯草中纯化迷迭香酸的方法包括以下步骤：
1)将夏枯草浸入甲淳，从其抽提活性材料；
2)用乙酸乙酯抽提由步骤1)所得物质，得活性组分；
3)用柱层析纯化步骤2)所得的产物，其中非活性组分由含有氯仿和甲醇的溶剂洗涤，并且其中活性组分由含有氯仿，甲醇和水的溶剂洗脱；
4)层析法纯化步骤3)所得的产物，其中甲醇作为展开剂；
5)层析法纯化步骤4)所得的产物，其中展开剂溶剂含有甲醇和磷酸；
6)高效液相色谱纯化步骤5)所得的产物，其中展开剂溶剂含有甲醇和磷酸。
在优选实施方案中也提供了迷迭香酸的衍生物，包括迷迭香基异丙基酯，迷迭香基乙基酯和(S)-迷迭香基-双(叔丁基-二甲基甲硅烷基)醚。这些衍生物可以从迷迭香酸或从酪氨酸和咖啡酸合成。本领域普通技术人员将会看到，根据现有技术和本发明可容易地制备出更多的衍生物。
在优选实施方案中，迷迭香酸及其衍生物在体外能抑制Lck的SH2结构域与特异配体肽的结合(见图1)。特别是迷迭香酸及其衍生物选择性抑制Lck的SH2结构域与谷光苷肽-S-转移酶(GST)的融合。由于迷迭香酸及其衍生物干扰由含有一个或多个SH2结构域和它们的天然配体形成的信号传导复合物的形成或稳定，它们可被用于治疗或防止由这种复合体介导的病理作用引起的疾病。
在另一优选实施方案中，迷迭香酸影响T细胞内免疫应答诱导的钙信号传导(见图2)。特别的，据报道，抗CD3和CD4抗体、T淋巴细胞表面抗原的治疗，刺激T细胞活化，随后细胞内钙离子水平升高，并且知道Lck参与了这些细胞事件。既然迷迭香酸能抑制由抗CD3和抗CD4抗体活化的细胞内钙信号传导，证实了它可抑制Lck的SH2结构域功能，也能用于抑制T细胞活化的过程。
在另一优选实施方案中，迷迭香酸及其衍生物抑制IL-2基因在T细胞的表达。本发明应用IL-2/荧光素酶报告***分析IL-2基因的表达水平。由于IL-2的生物合成和分泌引起T细胞增殖，迷迭香酸及其衍生物抑制IL-2的合成，因此可用于抑制T细胞增殖。
综上所述，迷迭香酸及其衍生物不仅可被用于抑制与Lck的SH2结构域的结合及IL-2的生物合成，而且抑制与SH2结构域和IL-2功能相关的免疫应答和疾病。
根据优选实施方案，迷迭香酸及其衍生物在体外(见图5)和体内(见图6)抑制免疫应答。在本发明中，进行了混合淋巴细胞反应(MLR)和对DNFB的接触超敏反应，以证实迷迭香酸及其衍生物的免疫抑制作用。
根据另一优选实施方案，迷迭香酸及其衍生物抑制动物异体移植排斥(见表1)。在本发明中，这种抑制效应由体内药学实验过程所证实，该实验测定被移植皮肤的存活时间。
根据另一优选实施法案方案，迷迭香酸抑制移植诱导的各种细胞因子基因的表达。已发现细胞因子基因在异体移植组织高表达，迷迭香酸抑制细胞因子的产生的作用通过反转录-聚合酶链式反应的方法检测。结果显示迷迭香酸及其衍生物可用于移植排斥的免疫抑制和由细胞因子水平升高引起的其他疾病的治疗。
根据上述结果，迷迭香酸及其衍生物在治疗以下疾病有作用：诸如心脏、肾、肝、骨髓、皮肤的移植；自生免疫疾病如狼疮，类风湿性关节炎，糖尿病，重症肌无力，多重硬化和牛皮癣，炎症如皮炎，湿疹，皮脂溢和肠炎；真菌感染。
本发明也提供药物组合物，含有迷迭香酸，其衍生物和/或夏枯草的提取物。
该药物组合物用于免疫抑制的治疗，尤其在治疗移植排斥、自身免疫疾病、炎症等方面。
在优选实施方案中，该药物组合物可用于以下方面的治疗，预防和/或诊断：移植排斥，自身免疫疾病，炎症，更特别的有狼疮，类风湿性关节炎，糖尿病，重症肌无力，多重硬化和牛皮癣，炎症如皮炎，湿疹，皮脂溢和肠炎，克罗恩氏病，初期胆汁性硬化。
在另一优选实施方案中，该药物组合物可被用于抑制Lck的SH2结构域或SH2介导的细胞功能。该药物组合物包括治疗有效量的迷迭香酸及其衍生物和/或夏枯草的提取物，有/无药学上可接受的药物赋形剂。另外，该药物组合物可以包括其它免疫抑制剂，如环胞多肽A及其衍生物，FK506及其衍生物，霉酚酸及其2-N-吗啉代-乙基酯，霉酚酸莫非替克，硫唑嘌呤，皮质类固醇，reflunomide，环磷酰胺，雷帕霉素，OKT-3，ATG，15-脱氧***蛋白，咪唑立宾，米索前列醇，甲氨蝶呤，抗白细胞介素2受体抗体和抗淋巴细胞/胸腺细胞抗血清。含有其它免疫抑制剂的药物组合物具有协同作用，即比单独使用等量的迷迭香酸或其它免疫抑制剂有提高免疫抑制的作用，这样可以获得高的免疫抑制作用而副作用降低。
在另一优选实施方案中，该药物组合物用于治疗移植排斥。在这方面，药物组合物可用来治疗异体移植，GVHD引起的并发症。在另一优选实施方案中，用于治疗免疫排斥的药物组合物包括迷迭香酸和环胞多肽A。
迷迭香酸及其衍生物可以和非固醇类抗炎症药物一起服用，用于治疗和/或预防哺乳动物器官移植排斥、GVHD、自身免疫病和慢性炎症。这些药物包括阿司匹林、布洛芬、萘普索、吲哚美辛、环氟拉嗪、舒林酸、吡罗昔康、依托度酸、酮洛芬、甲氯芬那酸、舒洛芬和托美丁。
迷迭香酸，其衍生物和/或夏枯草提取物可以和药物赋形剂或稀释剂一起使用，配制成口服、静脉、皮下、鼻内、支气管内或直肠给药形式。该药物组合物根据所需给药方式用经典的方法配制，如固体或液体赋形剂、稀释剂和添加剂。口服，药物可用片剂、胶囊、颗粒、粉末等形式给药。本发明的化合物也能和月桂硫酸酯或药物性去污剂一起使用以增加该化合物的口服生物利用度。
迷迭香酸及其衍生物给药剂量在大约0.01-1000mg/kg，比较适合是0.1-500mg/kg，每天给药0.5-3次。
                          实施例
本发明的可行和优选实施方案在下列实施例中阐明。
然而，本领域的普通技术人员在本发明公开的基础上可以进行修改而不脱离本发明的精神和范围。
实施例1：结合Lck的SH2结构域的抑制剂的筛选
本发明发展了一个新的筛选***，用于筛选抑制Lck的SH2结构域和其配体相结合的物质。在结合检测中，Lck的SH2结构域同谷光苷肽-S-转移酶(GST)融合表达并提纯，通过酰胺键与96微孔板共价结合。固定化的蛋白随后与生物素化的含有磷酰酪氨酸(pY)的合成多肽(生物素-SGSGEEPQpYEEIPI)相结合，该物质是Lck的SH2结构域的高亲和配体。
为了结合到96微孔板上，提纯的1μm融合蛋白(GST-Lck SH2)室温下反应2小时。加入1μm的生物素化的多肽(Lck SH2的配体)和候选抑制剂。候选物是成千上万的天然物质包括链霉菌、真菌和草本植物的提取物。结合反应在室温下发应2个小时，GST-Lck SH2和多肽发生竞争性抑制作用。然后，偶联过氧化物酶的抗生蛋白链菌素加入到反应物中与生物素化的多肽结合。未结合的偶联物被洗掉，用颜色反应测定固定化过氧化物酶的活力，或者在加入候选抑制剂的情况下多肽与SH2的结合活力。特别的，颜色反应是加入3，3，5，5-四甲基联苯胺(底物)到反应混合物中起始的。30分钟后，用0.8M的硫酸终止反应，并立即用分光光度计测定450nm下的吸收值。
利用这种筛选程序结果从多生草本植物夏枯草中发现一种抑制物质。
实施例2：从夏枯草提取物中分离纯化迷迭香酸
从当地草药人处买得干夏枯草(600g)，室温浸泡于甲醇中(10-20L)。3-5天后，真空浓缩甲醇得提取物，悬浮于蒸溜水中，用乙酸乙酯抽提。根据对Lck的SH2结合的抑制活性将乙酸乙酯抽提物进行分级。
将具有最高活性的组分进行真空浓缩并溶于少量氯仿∶甲醇(20∶1)中，上样到硅胶柱层析。氯仿∶甲醇(20∶1)洗掉无抑制活性的组分后，活性组分用氯仿∶甲醇∶水(20∶10∶1-10∶5∶1)洗脱。
真空浓缩活性组分，溶于少量体积的甲醇中，然后上样到SephadexLH-20(Sigma)，用甲醇作为展开剂。
所得到的活性组分用反向低压层析分离(Lobar，Merck)，用20％的甲醇和1％的磷酸作为展开剂。被Diaion HP-20吸附的活性组分用100％甲醇洗脱。
洗脱得到的组分上样到高效液相色谱(HPLC)，其中45％的甲醇和5％的磷酸溶液被用做展开剂，通过YMC-Pack C18柱(2cm内径×15cm外径)，流速4ml/min，254nm UV波长。22min洗脱时间所得到的活性组分对抑制结合SH2结构域的抑制能力具有峰值。该组分用Diaion HP-20吸附并且用100％甲醇洗脱，得到有抑制Lck SH2结构域能力的物质(50mg)。
提纯的物质的物理化学性质如下：
1)外观：具淡绿色的液体
2)UV，λmax(nm)：210，220，230(s)，250(s)，285，340(中性和酸性甲醇)，208，225，250-260，300-310，370(碱性甲醇)
3)IR，vmax(cm-1，KBr)：3300(羟基)，1700(羰基)，1600，1500，1450(芳香基)
4)质谱：m/z 361[M+H]
5)1H-NMR(300MHz，DMSO)，δ(ppm)：7.5(1H，d，j＝15.8Hz，H-8)，7.03(1H，d，j＝2.3Hz，H-2)，6.92(1H，dd，j＝2.3，8.3Hz，H-6)，6.76(1H，d，j＝8.3Hz，H-5)，6.77(1H，d，j＝2.3Hz，H-2’)，6.67(1H，d，j＝8.3Hz，H-5’)，6.62(1H，dd，j＝2.3，8.3Hz，H-6’)，6.25(1H，d，j＝15.8Hz，H-7)，6.62(1H，dd，j＝3，9.8Hz，H-8’)，3.10(1H，d，j＝3，14.3Hz，H-7α)，2.93(1H，dd，j＝9.8，14.3Hz，H-7β)
6)13C-NMP(75MHz，DMSO)，δ(ppm)：127.9(C-1)，115.6(C-2)，149.4(C-3)，146.7(C-4)，116.5(C-5)，122.9(C-6)，146.7(C-7)，115.6(C-8)，169.1(C-9)，131.1(C-1’)，117.5(C-2’)，145.9(C-3’)，144.8(C-4’)，116.2(C-5’)，121.8(C-6’)，38.79(C-7’)，77.6(C-8’)，177.9(C-9’)。
分子式1
结果表明纯化的分子就是迷迭香酸。
实施例3：迷迭香基异丙基酯
向溶于DMF(4ml)中的迷迭香酸(75mg，0.21mmol)中加入异丙醇(33mg，0.26mmol)和邻-苯并***基-N，N，N`，N`-4-甲基uronium四氟硼酸盐(TBTU，75mg，0.23mmol)。溶液在N2环境下室温搅拌后，加入甲苯胺(34mg，0.28mmol)。室温下搅拌24小时后反应溶液用乙酸乙酯50ml稀释，并用NaHCO3溶液(3×20ml)和10％的HCl冲洗。有机相用MgSO4干燥，并真空浓缩。通过闪烁色谱(洗脱体系正己烷∶乙酸乙酯，85∶15到6∶4)得到黄色固体(79mg，82％)。
式2
实施例4：迷迭香基乙酸酯
迷迭香酸(75mg，0.21mmol)溶于乙醇(10ml)回流24小时。溶液用乙酸乙酯50ml稀释，并用饱和的NaHCO3溶液(3×20ml)和10％的HCl冲洗。有机相用MgSO4干燥，并真空浓缩。通过闪烁色谱(洗脱体系正己烷∶乙酸乙酯，85∶15到6∶4)得到白色固体(79mg，82％)。
式3
实施例5：(S)-迷迭香基-双(叔-丁基二甲基甲硅烷基)醚
(步骤1)羟基苯丙氨酸盐酸盐(1)的乙酰化
(S)-酪氨酸(1.45g，80mmol)溶于蒸馏好的硝基苯中，然后向其中缓慢加入AlCl3(4.24g，31.8mmol)。将得到的溶液搅拌，加入乙酰氯(0.78ml，11mmol)后，溶液回流6小时。将反应溶液倒入含冰的浓HCl中，然后加入80ml乙酸乙酯。分离有机相并真空干燥。所得固体物质在5M HCl溶液中重结晶。
1H NMR(D2O)：δ2.67(s，3H)，3.22(dd，1H)，3.32(dd，1H)，4.27(dd，1H)，7.00(d，1H)，7.49(dd，1H)，7.82(d，1H)；
质谱m/z：223([M]-HCl)+
反应式1
(步骤2)乙酰羟基苯基乳酸(2)的合成
化合物(1)(1g，3.5mmol)溶解在水(20ml)中并在冰水浴里冷却。将这种溶液滴加到溶解在12ml的水里的NaNO2(0.4g，5.8mmol)的溶液并慢慢搅动。在溶液于室温搅动20小时后，加入硫酸铵(204mg，1.54mmol)，再搅动1小时。用乙酸乙酯提取粗制品，分离的有机相在MgSO4上干燥。多余的溶剂通过旋转挥发仪除去。闪烁色谱法(洗脱***，正己烷∶乙酸乙酯，85∶15-6∶4)得到作为主要产物的黄色油(0.7mg，81％)。
1H NMR(CDCl3)：δ2.62(s，3H)，2.97(dd，1H)，3.16(dd，1H)，4.50(dd，1H)，6.92(d，1H)，7.37(dd，1H)，7.63(d，1H)，12.16(s，1H)；
质谱m/z 224(M+)
反应式2
(步骤3)3-(3，4-二羟基苯基)-(S)-乳酸(3)的合成
化合物(2)(1mg，4.5mmol)加入含NaOH(0.64g，16mmol)的30％H2O2溶液里，并搅动12小时。得到的溶液用浓HCl(1ml)进行酸化，用乙酸乙酯提取粗制品。分离的有机相在MgSO4上干燥和通过旋转挥发仪进行浓缩。通过闪烁色谱法(0.55mg，61％)得到黄色固体。
1H NMR(丙酮-d6)δ2.78(dd，1H)，2.97(dd，1H)，4.32(dd，1H)，6.60(dd，1H)，6.71(d，1H)，6.78(d，1H)；
质谱m/z 198(M+)
反应式3
Figure C9980630600162
(步骤4)3-(3’，4’-二羟基苯基)-(S)-乳酸的二丙烯基醚丙烯基酯(4)的合成
将化合物(3)(940mg，4.7mmol)溶解在丙酮(14ml)中，随后加入烯丙基溴化物(7ml，80mmol)和碳酸钾(1.97g，14.3mmol)。溶液在硅油浴中回流22小时。过滤除去不溶的盐，滤过物溶解在CH2Cl2中，用H2O(10ml)洗涤，有机相在MgSO4上干燥和浓缩。通过闪烁色谱法(640mg，42％)得到无色的固体。
1H NMR(CDCl3)δ2.91(dd，1H)，3.06(dd，1H)，4.44(dd，1H)，4.58(d，4H)，4.65(dt，2H)，5.23-5.44(m，2H)，5.84-5.97(ddt，1H)，6.01-6.14(m，1H)，6.73(dd，1H)，6.78(d，1H)，6.82(d，1H)；
质谱m/z 318(M+)
反应式4
(步骤5)咖啡酸的双(叔-丁基二甲基甲硅烷基)醚(5)的合成
将咖啡酸(4g，22.2mmol)溶解在CH2Cl2中，并加入叔-丁基二甲基甲硅烷基triflate和三乙胺，溶液搅动17小时。用10％HCl溶液(2×20ml)和水(2×20ml)洗涤反应液。有机相在MgSO4上干燥和浓缩。通过闪烁色谱法纯化无色的固体并溶解在50％的甲醇(200ml)。在加入碳酸钾(1.8g，11mmol)之后，反应溶液在室温搅动6小时。通过过滤除去固体，随后用小量的盐酸酸化滤过物。在用乙酸乙酯提取酸化产品和用水(3×20ml)洗涤后，将合并的有机相在MgSO4上干燥和浓缩。通过闪烁色谱法得到无色的固体。
反应式5
(步骤6)咖啡酸的双(叔-丁基二甲基甲硅烷基)醚和3-(3’，4’-二羟基苯基)-(S)-乳酸(6)的反应
将纯化的咖啡酸的双(叔-丁基二甲基甲硅烷基)醚(5)(4.31g，10.5mmol)与CCl4里的SOCl2(2.4m；，33mmol)反应，并除去多余的溶剂。加入CH2Cl2中的合成的化合物(4)(2.13g，6.0mmol)和三乙胺(5.9ml，42mmol)，在氮气中搅动4小时。用10％HCl溶液洗涤合成溶液，并用浓盐水处理。分离的有机相在MgSO4上干燥和浓缩。通过使用闪烁色谱法(己烷中的20％乙酸乙酯)，得到亮黄色固体(4.6g，90％)。
反应式6
Figure C9980630600181
(步骤7)(S)-迷迭香基双(叔-丁基二甲基甲硅烷基)醚(7)
将纯化的固体(6)(600mg，1.2mmol)溶解在30ml的乙醇、苯、水(7∶3∶1，v/v)中，溶液在有三(三苯基膦)氯化铑(I)(700mg，0.757mmol)的存在下进行回流。多余的溶剂被除去，剩余物质溶解在乙酸乙酯(40ml)。用40ml饱和NaHCO3溶液(3×20ml)和10％HCl洗涤有机相。有机相在MgSO4上干燥和浓缩。闪烁色谱法(洗脱***，正己烷∶乙酸乙酯，85∶15-6∶4)得到无色的固体(120mg，29％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.22(s，6H)，0.23(s，6H，0.99(s，9H)，1.00(s，9H)，3.03(dd，1H)，3.13(dd，1H)，5.22(dd，1H)，6.29(d，1H)，6.67(dd，1H)，6.75(d，1H)，6.86(m，2H)，7.05(d，1H)，7.16(d，1H)，7.56(d，1H)；
质谱m/z 592([M]+H)+
反应式7
Figure C9980630600191
(步骤6)(S)-迷迭香酸的合成
将实施例5(4.23g，5.97mmol)中得到的纯化固体溶解在氮气中的THF和加入三-n-丁基胺氟化物(在THF含1.0M，12ml，12mmol)。在搅拌15分钟后，用水洗涤这种溶液，用乙酸乙酯提取。分离的有机相在MgSO4上干燥和浓缩。闪烁色谱法得到作为主要产物的黄色油(1.47g，51％)。
1H NMR(丙酮-d6)δ3.03(dd，1H)，3.13(dd，1H)，5.22(dd，1H)，6.29(d，1H)，6.67(dd，1H)，6.75(d，1H)，6.86(m，2H)，7.05(dd，1H)，7.16(d，1H)，7.56(d，1H)；
质谱m/z 361([M+H]+)
反应式8
下面的实施例说明迷迭香酸及其衍生物作为Lck SH2结构域的抑制剂或免疫抑制剂的功效。
然而，应当理解本领域的那些技术熟练人员在考虑本发明公开的内容时，可以在本发明的精神和范围内进行修饰和改进。
实施例7：Lck SH2结构域和特异的磷酸酪氨酰肽体外结合的抑制
迷迭香酸及其衍生物结合到Lck SH2结构域的活性在本发明中通过使用实施例1中的体外结合分析***进行了研究。
从夏枯草或其衍生物中分离出来的多种浓度的(0.03-300μg/ml)迷迭香酸溶液，加入蛋白包被的微孔，并与磷酸化肽溶液混合。生物素化pY肽的结合通过链霉亲和素连接的辣根过氧化物酶(HRP)进行检测。
迷迭香酸选择地结合到GST融合的Lck SH2结构域，与浓度成正比(见图1)。估计的最大半数抑制浓度(IC50)是3μg/ml。
除了迷迭香酸的处理，迷迭香酸的衍生物的处理如迷迭香基异丙基酯，及其衍生物迷迭香基乙基酯和(S)-迷迭香基双(叔-丁基二甲基甲硅烷基)醚和(S)-迷迭香酸导致对SH2结构域结合的竞争性抑制。在这些例子中，IC50分别是1，4，13和10μg/ml。
迷迭香酸及其衍生物作为分子生物学研究的试剂是非常有用的，例如它们能解开或阻断特定的信号传导途径。迷迭香酸及其衍生物，干预含有一个或多个SH2结构域蛋白和它们的天然配体的信号复合物的形成或稳定，能够用于治疗或预防这种复合物介导的疾病。
实施例8：对T细胞增殖信号传导的抑制作用
虽然从夏枯草分离的迷迭香酸及其衍生物抑制配体与Lck SH2结构域的结合，可以推测这些抑制作用将干扰T细胞增殖的信号传导***，改变细胞内钙离子移动的模式。
抗原特异的T细胞激活是通过TCR介导信号传导而起始的，其中涉及多种酪氨酸激酶或磷酸化蛋白。激活的T细胞进入细胞增殖的过程，通过IL-2和IL-2受体之间的相互作用来调控。尤其是，已经有报道，针对CD3和CD4抗体的治疗，T淋巴细胞表面抗原，刺激T细胞激活和随后提高细胞内钙离子水平，也知道了Lck的作用涉及这些细胞事件。因此，在本发明中对迷迭香酸行研究，它是否能抑制细胞内钙离子水平的升高，这是T淋巴细胞激活所诱导的。
一种细胞内钙离子的荧光指示剂，Fura-2/AM(Calbiochem，SanDiego，CA，USA)，加入Jurkat细胞，并用多种量(0.5μg，1μg，10μg，50μg)从夏枯草分离的迷迭香酸处理细胞10分钟。将细胞用抗-CD3和抗-CD4的抗体处理，随后通过细胞发出的荧光的量记录细胞内钙离子水平的波动。
图2显示迷迭香酸对钙离子水平的剂量依赖性抑制作用。这样，公开本发明中从夏枯草分离的迷迭香酸对细胞内钙离子动员有抑制活性。
实施例9：对TCR刺激-诱导IL-2基因表达的抑制
既然迷迭香酸及其衍生物选择地抑制Lck功能，我们测定这些化合物是否能抑制IL-2激活诱导的IL-2产生，它负责T细胞增殖的进程。迷迭香酸及其衍生物对IL-2基因表达水平的作用通过IL-2荧光素酶报告***进行了测定，其中培养细胞转染了报告质粒。这个质粒通过将IL-2启动子与荧光素酶结构基因融合而构建。
通过使用SuperfectTM(Qiagen Inc.)，用IL-2荧光素酶报告质粒转染了106 Jurkat T细胞。在温育24小时后，细胞在T细胞增殖之前用多种药物(8μM迷迭香酸及其衍生物，8μM环孢多肽A，8μM FK506，8μM LY294002)处理30分钟。细胞通过在5μg/ml抗-CD3抗体(UCHT1，Pharmingen)和/或抗CD4抗体(RPA-T4，Pharmingen)包被的35mm平皿里孵育14小时而激活，随后收获细胞。至于PMA加Ionomycin刺激，将5ng/ml PMA和500ng/ml Ionomycin加入培养液，孵育14小时。荧光素酶活性用Berthold luminometer LB953对每个实验的两个重复样品测定3次而确定。
迷迭香酸比其它免疫抑制剂更有效地抑制TCR诱导的IL-2基因的表达(见图3)。而且，使用迷迭香酸衍生物如迷迭香基异丙基酯，迷迭香基乙基酯和(S)-迷迭香基双(叔-丁基二甲基甲硅烷基)醚和(S)-迷迭香酸实验的荧光素酶活性同使用迷迭香酸一样受到抑制(见图4)。
既然迷迭香酸及其衍生物选择地抑制T细胞的活化，它们能用来治疗和/或预防涉及T细胞介导的免疫反应的疾病如自身免疫病，慢性炎症疾病以及移植排斥和GVHD。
实施例10：对T细胞增殖的抑制
因为Lck是一种T细胞特异的酪氨酸激酶，对T细胞激活和增殖行使它的功能，在本发明中，迷迭香酸对T细胞增殖的抑制作用受到测定。下面叙述的混合淋巴细胞反应(MLR)实验用来证明本发明的化合物有抑制免疫细胞反应的能力。MLR用来确定供体(移植物)和受体之间的移植相容性(Park and Good，p71，组织类型和器官移植，1973，AcademicPress Inc.，NY)。MLR，其中免疫反应通过从不同的物种或个体分离的两种淋巴细胞而诱导出来，通过细胞生长速度表示免疫反应活性。
混合从Balb/c和C57BL/6鼠的脾细胞(1×105/孔)，在有湿度37℃的培养箱中培养。在第5天，[甲基-3H]-胸腺嘧啶(0.5μCi/孔)加入培养物，随后细胞培养物的掺入量在次日进行检测。在所有过程中，环孢多肽A，迷迭香酸，它的衍生物和(S)-迷迭香酸都按指定的浓度进行处理。
本发明使用的迷迭香酸以剂量依赖的方式抑制T细胞增殖，范围从10-1到1000nM(图5)，而迷迭香基异丙基酯，迷迭香基乙基酯和(S)-迷迭香基双(叔-丁基二甲基甲硅烷基)醚和(S)-迷迭香酸的范围是从1nM到1000nM。
MLR是一种体外免疫反应。MLR免疫反应的抑制是免疫学领域使用的一种标准的测定方法，它被认为可以指示体内的免疫抑制活性。特别是，MLR的活性表示迷迭香酸及其衍生物在防止器官移植排斥和GVHD中应当是有效的。这样，考虑到本申请中给出的结果，迷迭香酸及其衍生物能有效地治疗这些疾病。
实施例11：体内免疫反应的抑制
评价免疫抑制活性的体内实验过程是用对DNFB(2，4-二硝基氟苯)接触超敏反应来进行。DNFB接触敏感性已经被广泛地进行了研究，并在鼠中进行了表征，以确定参与细胞介导免疫反应的调控机制(Claman等，Immunol.Rev.50：105，1980；Young and Young，用药物学的方法控制炎症的评价局部和***药物的皮肤炎症模型(Chang and Lewis，Eds.)，Alan R.Liss，Inc.，New York，pp215-231，1989)。这是一种抗原特异的T细胞介导的炎症反应，代表人类和其它动物都有的迟发型超敏反应(DTH)。接触敏感性动物模型在许多实验室用来常规筛选抗炎药物和治疗自身免疫病的药物。
接触敏感实验的致敏和引发按Scheynius等叙述的方法进行(Scheynius，1804，JI)。实验步骤概括如下。使用8周龄的Balb/c雌性小鼠。20μl溶解在4∶1稀释的丙酮∶橄榄油(Sigma Chemical Co.)里的0.5％DNFB(Sigma Chemical Co.)连续两天涂布在刮过毛的老鼠腹部皮肤上。4天后，小鼠用10μl同样载体里的0.2％DNFB攻击每侧的耳朵。环孢多肽A和迷迭香酸通过肌肉内从0至5天按指定的剂量处理。耳朵厚度的测量用工程微测计在攻击后24小时进行(Mitutoyo Co.Mfg，Ltd.，Tokyo)。
在诱导期间连续六天使用迷迭香酸(5-50mg/kg/day)或环孢多肽A处理以剂量依赖的方式抑制DNFB引起的接触超敏反应(图6)。迷迭香基异丙基酯，迷迭香基乙基酯和(S)-迷迭香基双(叔-丁基二甲基甲硅烷基)醚和(S)-迷迭香酸也显示剂量依赖性抑制。本结果表明迷迭香酸及其衍生物能抑制体内辅助性T细胞功能和记忆性T细胞的形成。
在这些标准药物实验方法的基础上，这些化合物可用于治疗移植排斥如心脏、肾、肝、骨髓和皮肤移植；自身免疫病如狼疮、类风湿性关节炎、糖尿病、重症肌无力、多发性硬化和牛皮癣；发炎疾病如皮炎、湿疹、皮脂溢和炎性肠道疾病；和真菌感染。
实施例12：对移植排斥的抑制
迷迭香酸及其衍生物诱导免疫抑制的能力在体内用标准药物实验方法进行了确定。通过体内方法评价皮肤移植物的存活时间。
实验的同种移植物排斥通过移植同种C57BL/6(H-2b)小鼠尾部皮肤到BALB/c(H-2b)受体小鼠来进行的。从移植那一天直到发生排斥都肌肉注射迷迭香酸及其衍生物。环孢多肽A用作实验对照，未处理的受体作为排斥对照。全厚的供体(C57BL/6)尾部皮肤移植物(正方形块2.0×2.0cm)移植到受体小鼠(Balb/c)的侧胸部，用灭菌的纱布盖住。整个胸部用塑料绷带包裹。迷迭香酸及其衍生物(15mg/kg/天)或环胞菌素A(50mg/kg/天)的脂质体制剂按上面提到的剂量每天给移植的小鼠注射，直到发生排斥。在第六天除去绷带后，每天监测皮肤移植物。排斥定义为多于90％的移植上皮坏死。
如表1显示，空载体处理对照组的同种移植排斥在第7天发生。对照组的50％同种移植物在第9天排斥。剂量为15mg/kg/天的迷迭香酸及其衍生物表现明显对皮肤移植物存活的延长作用。皮肤移植物的平均存活时间(MST)在对照组是9.6天和在用15mg/kg/天的迷迭香酸及其衍生物处理的小鼠是14天(p＜0.01)。在这个***中，环孢多肽A在剂量为50mg/kg/天(MST＝13.4天)时有上面相似的作用。
这个体内标准药物实验的这些结果显示迷迭香酸及其衍生物处理引起免疫抑制，因此能防止皮肤移植排斥。
此外，本发明使用的迷迭香酸或其衍生物可以协同环孢多肽A在体内抑制皮肤移植排斥。它们的低剂量协同环孢多肽A，意思是在治疗免疫抑制中，它们能避免副作用。
                                     表1
      药物    0至12天的剂量(mg/kg/天)      移植物的存活时间(天)       MST±SD(天)
空载体     -     7，9，10，10，11     9.4±1.5
环孢多肽A     50(p.o.)     13，14，14，14，14     13.8±0.5
环孢多肽A     50(i.m.)     13，13，13，14，14，     13.4±0.5
迷迭香酸     25(i.m.)     16，17，18，18，25     18.8±3.6
迷迭香酸     15(i.m.)     13，13，14，15，15     14.0±1.0
迷迭香基异丙基酯     15(i.m.)     13，13，13，15，17     14.2±1.8
迷迭香基乙基酯     15(i.m.)     12，14，14，15，17     14.4±1.8
(S)-迷迭香基双(叔-丁基二甲基甲硅烷基)醚     15(i.m.)     12，12，13，13，16     13.2±1.6
(S)-迷迭香酸     15(i.m.)     13，14，15，15，17     14.8±1.5
环孢多肽A+迷迭香酸     17+10(i.m.)     14，14，15，15，17     15.0±1.4
实施例13：对移植组织里的细胞因子基因表达的抑制
根据本发明的一个重要方面，已经发现迷迭香酸有高水平地抑制同种移植组织的细胞因子基因表达的能力。这个发现的意义，对用在免疫抑制治疗和用在本实施例讨论的这些细胞因子的上升引起的其他疾病的治疗。
迷迭香酸抑制细胞因子产生的能力，用RT-PCR方法进行了检验。从C57BL/6供体移植了的Balb/c受体在被膜下肾脏移植后的第7天处死。收获肾脏同种移植物，提取细胞总RNA，分析各种细胞因子mRNA的表达。使用半定量PCR，我们同时分析了IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ的mRNA。
我们通过肌肉注射7天来确定迷迭香酸(日用量，25mg/kg/天)以及环孢多肽A(日用量，50mg/kg/天)的效果。RT-PCR试验用于检测细胞因子信息，结果表明迷迭香酸显著地抑制同种移植物中的IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-6和IL-1βmRNA的转录，而环孢多肽A抑制IL-2、IFN-γ、6和IL-1β。PCR的细胞因子水平通过用β-肌动蛋白mRNA作为对照进行标准化。
迷迭香酸能显著降低IL-4和IL-6而环孢多肽A不能，暗示迷迭香酸能抑制Th1和Th2细胞因子的表达而环孢多肽A主要抑制Th1细胞因子。对IL-2和IL-1β的抑制，迷迭香酸发挥比环孢多肽A更强大的作用。这些观察结果有力地说明迷迭香酸是一种有潜力的免疫抑制剂，它能影响涉及移植排斥或T-细胞介导的免疫病的许多免疫反应，甚至更广泛。
1)鼠被膜下肾脏移植
用被膜下肾脏移植技术将肾脏部分(C53BL/6)移植给同种异体的老鼠(Balb/c)。移植后，迷迭香酸(25mg/kg/天)或环孢多肽A(50mg/kg/天)与椰子油乳化，给移植鼠肌肉注射，每天一次，连续7天。
2)用半定量RT-PCR测量细胞因子mRNA
从连续7天用迷迭香酸(25mg/kg/天)处理的移植受体鼠除去移植物，立即在液氮里冷冻。用TRIZOLp LS试剂(Life Technologies)分离移植物的总RNA，加入氯仿后室温温育15分钟，用酚/氯仿抽提，异丙醇沉淀。然后，分离的总RNA用分光光度计进行定量。移植物总RNA(1μg)用TitanTM One Tube RT-PCR***(BM)按照制造商的使用说明进行。PCR在50μl体积含有Mg2+的1×RT-PCR缓冲液，0.2mM的每种dNTP(dATP，dCTP，dGTP和dTTP)，10U的Rnase抑制剂，酶混合物(AMV和ExpandTM高保真PCR***)，5mM DTT溶液和0.4μM适当的引物对。IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-6，IL-1β和β-肌动蛋白的引物序列从以前的报道中获得。IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-6，IL-1β和β-肌动蛋白的PCR产物分别是226，336，222，229，320和568。扩增循环数为25。部分(15μl)PCR产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，用EB染色扩增DNA片段。
3)引物
PCR引物描述为SEO ID NO：1-12。引物根据相应基因来命名：m指老鼠；这是通过基因名字确定的；F代表向前的方向和R代表反向。例如，mIL-2F代表在IL-2 PCR中使用的上游引物。所有引物的退火温度是52℃，而β-肌动蛋白的56℃除外。
实施例14：鼠的非肠道给药实验的急性毒性
我们做下列实验来发现迷迭香酸和其衍生物的急性毒性。
急性毒性用6周龄的SPF SD鼠进行测定。作为脂质体形式，1g/kg的迷迭香酸，迷迭香基异丙基酯，迷迭香基乙基酯和(S)-迷迭香基双(叔-丁基二甲基甲硅烷基)醚和(S)-迷迭香酸每个实验组肌肉注射两只。注射后，老鼠要观察临床症状和老鼠体重的变，进行血液实验和解解刨以便调查胃和胸部器官。因此，所有实验动物都存活，没有明显的临床症状，体重的改变或其他毒性作用。所有测定的化合物都没有毒性反应，当在1g/kg的范围内注射给小鼠，这提供了非肠道给药的安全化合物。
工业实用性
经优选实施方案公开的，迷迭香酸及其衍生物抑制与Lck SH2结构域的结合和功能。这种迷迭香酸及其衍生物的抑制作用引起T细胞内钙离子信号转导***的改变；抑制T细胞内IL-2基因的表达；抑制体内和体外的免疫反应；抑制移植排斥；和抑制移植物内细胞因子基因的表达。因此，迷迭香酸及其衍生物对抑制与Lck SH2结构域结合，抑制细胞因子介导的免疫反应，和抑制移植排斥，自身免疫疾病和炎性疾病，是有用的。既然迷迭香酸及其衍生物选择地抑制Lck SH2结构域，一种T细胞特异蛋白，它们对病人引起比建立的免疫抑制更少的副作用。
那些本领域的技术人员应当认识到以前叙述的公开的概念和特定实施方案可以容易地作为为实现本发明的同样目的基础来修改和设计其它实施方案。那些本领域的技术人员也应当认识到同样的实施方案不脱离本发明的实质和范围，作为附加权利要求提出。
                          序列表
<110>财团法人牧岩生命工学研究所
<120>迷迭香酸及其衍生物用作免疫抑制剂或SH2介导过程的抑制剂
<130>9fpo-04-05
<150>KR 98-17741
<151>1998-05-16
<150>KR 99-15989
<151>1999-05-04
<160>12
<170>KOPATIN 1.0
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mIL-2F，小鼠IL-2基因的PCR中的正向引物
<400>1
gcaggatgga gaattacagg a                                          21
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mIL-2R，小鼠IL-2基因的PCR中的反向引物
<400>2
tcagagccct ttagttttac                                            20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mIL4F，小鼠IL-4基因的PCR中的正向引物
<400>3
acaggagaag ggacgccatg                                            20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mIL-4R，小鼠IL-4基因的PCR中的反向引物
<400>4
gcagcttatc gatgaatcca                                            20
<210>5
<211>23
<212>DNA
<2113>人工序列
<220>
<223>mIL-6F，小鼠IL-6基因的PCR中的正向引物
<400>5
gacaaagcca gagtccttca gag                                        23
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mIL-6R，小鼠IL-6基因的PCR中的反向引物
<400>6
ctagctttgc cgagtagatctc                                          22
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mIFN-gammaF，小鼠IFN-gamma基因的PCR中的正向引物
<400>7
ggaggaactg gcaaaaggat ggt                                        23
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mIFN-gammaR，小鼠IFN-gamma基因的PCR中的反向引物
<400>8
ttgggacaat ctcttcccca c                                          21
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mIL-1betaF，小鼠IL-1beta基因的PCR中的正向引物
<400>9
ttgaagaaga gcccatcctc tg                                         22
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>mIL-1betaR，小时IL-1beta基因的PCR中的反向引物
<400>10
gatccacact ctccagctgc                                            20
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>beta-actinF，小鼠beta-肌动蛋白基因的PCR中的正向引物
<400>11
cgacgaggcc cagagcaaga gagg                                       24
<210>12
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>beta-actinR，小鼠beta-肌动蛋白基因的PCR中的反向引物
<400>12
cgtcaggcag ctcatagctc ttctccaggg                                 30

Claims (5)

1.迷迭香酸或其选自迷迭香基异丙基酯，迷迭香基乙基酯和(S)-迷迭香基双(叔-丁基二甲基甲硅烷基)醚的衍生物用于制备治疗、预防和诊断移植器官或组织的排斥、慢性排斥或移植物对宿主疾病、或治疗、预防或诊断自身免疫病的药物的用途。
2.权利要求1中的用途，其中迷迭香酸以对映体或(R)，(S)迷迭香酸的形式使用。
3.权利要求1的用途，其中的移植器官或组织包括肾脏、心脏、肝脏、肺、骨髓、胰脏及其胰岛细胞、角膜、小肠、皮肤和心脏瓣膜。
4.权利要求1的用途，其中，迷迭香酸、它的选自迷迭香基异丙基酯，迷迭香基乙基酯和(S)-迷迭香基双(叔-丁基二甲基甲硅烷基)醚的衍生物与环孢多肽A组合使用。
5.从夏枯草分离迷迭香酸的方法，包括如下步骤；
1)通过用甲醇浸泡从夏枯草中提取活性材料；
2)用乙酸乙酯从步骤1)的产物里提取活性组分；
3)通过硅胶柱层析纯化步骤2)的产物，其中用含有20∶1的氯仿和甲醇的溶剂洗涤非活性组分，和其中的活性组分用含有20∶10∶1-10∶5∶1的氯仿、甲醇和水的溶剂洗脱；
4)通过Sephadex LH-20层析纯化步骤3)的产物，其中甲醇被用作展开溶剂；
5)通过Lobar RP-18层析纯化步骤4)的产物，其中含有20％甲醇和1％磷酸的溶剂被用作展开溶剂；和
6)通过2cm内径x15cm外径，保留时间为22min的YMC-PackC18高效液相色谱(HPLC)纯化步骤5)的产物，其中含有45％甲醇和5％磷酸的溶剂被用作展开溶剂，流速为4ml/min，和UV波长为254nm。
CNB998063061A 1998-05-16 1999-05-12 迷迭香酸及其衍生物用于制备免疫抑制剂药物的用途 Expired - Fee Related CN1219509C (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019980017741A KR100279902B1 (ko) 1998-05-16 1998-05-16 하고초로부터 분리된 림프구 세포 카이나아제의 에스에이치2 영역에 대한 결합 저해활성을 갖는 로즈마린산 및 그 분리정제방법
KR17741/1998 1998-05-16
KR15989/1999 1999-05-04
KR1019990015989A KR20000072988A (ko) 1999-05-04 1999-05-04 로즈마린산 및 그 유도체의 면역억제제 또는 ｓｈ２ 억제제로서의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1315863A CN1315863A (zh) 2001-10-03
CN1219509C true CN1219509C (zh) 2005-09-21

Family

ID=36274112

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB998063061A Expired - Fee Related CN1219509C (zh) 1998-05-16 1999-05-12 迷迭香酸及其衍生物用于制备免疫抑制剂药物的用途

Country Status (7)

Country Link
US (1) US6140363A (zh)
EP (1) EP1077715B1 (zh)
JP (1) JP3827948B2 (zh)
CN (1) CN1219509C (zh)
AU (1) AU3734999A (zh)
DE (1) DE69930619T2 (zh)
WO (1) WO1999059606A1 (zh)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002062365A1 (fr) * 2001-02-01 2002-08-15 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Procede de production d'un extrait vegetal de lamiacee contenant des phenols, et utilisation de ce dernier
US20030099725A1 (en) * 2001-02-26 2003-05-29 Global Cancer Strategies Ltd. Herbal compositions useful as chemopreventive and therapeutic agents and methods of manufacturing same
KR100483707B1 (ko) * 2001-05-18 2005-04-18 에스케이케미칼주식회사 관절 보호용 생약조성물
AU2002312610A1 (en) * 2001-06-27 2003-03-03 Surromed, Inc. Directed enzymatic modification of analytes for affinity capture and analysis
KR100517056B1 (ko) * 2002-04-15 2005-09-27 재단법인 목암생명공학연구소 하이드록실 페닐 유도체, 그의 제조방법 및 그를 포함하는약학적 조성물
WO2004100868A2 (en) * 2003-04-23 2004-11-25 Abbott Laboratories Method of treating transplant rejection
EP1648429A4 (en) * 2003-07-07 2009-09-02 Fox Chase Cancer Ct HEXAMORE PORPHOBILINOGENE SYNTHASE AS TARGET FOR THE DEVELOPMENT OF ANTIBIOTICS AND HERBICIDES
US8153410B2 (en) * 2003-07-07 2012-04-10 Fox Chase Cancer Center Alternate morpheein forms of allosteric proteins as a target for the development of bioactive molecules
US20060162014A1 (en) * 2003-07-07 2006-07-20 Jaffe Eileen K Alternate morpheeins of allosteric proteins as a target for the development of bioactive molecules
KR20050078743A (ko) * 2004-02-02 2005-08-08 재단법인 목암생명공학연구소 로즈마린산의 하이드록실페닐 유도체를 유효성분으로 하는항암용 약학 조성물
ITMI20041871A1 (it) * 2004-10-01 2005-01-01 Indena Spa Uso di santoreggia satureja montana o dei suoi estratti per la preparazione di medicamenti per il trattamento dell'eiaculazione precoce
US7513627B2 (en) * 2005-12-30 2009-04-07 Honeywell International Inc. Image projection system with vibration compensation
CN100414293C (zh) * 2006-01-16 2008-08-27 复旦大学附属华山医院 一种测定咪唑立宾血药浓度的方法
CN101919837B (zh) * 2006-06-29 2011-08-03 山东绿叶天然药物研究开发有限公司 迷迭香酸在制备治疗或预防肾纤维化的药物中的应用
CN101095668B (zh) * 2006-06-29 2010-09-08 山东绿叶天然药物研究开发有限公司 迷迭香酸在制备治疗或预防肝纤维化和肾纤维化的药物中的应用
JP5372358B2 (ja) * 2007-01-20 2013-12-18 美智士 谷 生体活性治療物質
BRPI0802688C1 (pt) * 2008-06-25 2021-05-25 Acef S/A processo de obtenção de extrato rico em ácido rosmarínico (ar) obtido da espécie vegetal origanum vulgare e uso do extrato obtido
FR2948567B1 (fr) * 2009-07-31 2017-11-03 Inst De Rech Pour Le Dev Utilisation de l'acide rosmarinique et de ses derives pour traiter la ciguatera
CN102079705B (zh) * 2010-12-23 2013-03-13 济南九州富得香料有限责任公司 一种合成纯化脂溶性迷迭香酸酯的方法
CN102731296B (zh) * 2012-06-06 2015-06-10 中国人民解放军第二军医大学 迷迭香酸衍生物及其制备方法与在制备抗结核药物中的应用
US20140044813A1 (en) * 2012-08-09 2014-02-13 Kemin Industries, Inc. Plant Extracts for Improving Cognitive Health and Function
CN104744242B (zh) * 2013-12-25 2019-01-04 河北以岭医药研究院有限公司 一种（-）-丹参素钠的不对称合成方法及其应用
CN105997974A (zh) * 2016-07-19 2016-10-12 广西大学 迷迭香酸在制备治疗哮喘药物中的应用
CN110693873B (zh) * 2019-10-28 2022-07-12 杭州市西溪医院 冬凌草活性成分组合物的制备及应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2952115C2 (de) * 1979-12-22 1982-05-06 A. Nattermann & Cie GmbH, 5000 Köln Rosmarinsäure-Phospholipid-Komplex
DE2952114C2 (de) * 1979-12-22 1984-01-05 A. Nattermann & Cie GmbH, 5000 Köln Verwendung von Rosmarinsäure bei der Bekämpfung von Entzündungen und hierbei eingesetzte Arzneimittel
DE3010040C2 (de) * 1980-03-15 1985-05-02 A. Nattermann & Cie GmbH, 5000 Köln Verfahren zur Gewinnung von Rosmarinsäure aus Melisse
JPH04243822A (ja) * 1991-01-24 1992-08-31 Tsumura & Co カルシウム拮抗剤
DE4121388A1 (de) * 1991-02-07 1992-08-13 Nattermann A & Cie Pharmazeutisches produkt zur behandlung von viruserkrankungen
CA2185983C (en) * 1996-09-19 2004-04-13 Wie-Jong Kwak Process of extracting and purifying biologically effective ingredients from combined medicinal plants and their extract composition

Also Published As

Publication number Publication date
DE69930619D1 (de) 2006-05-18
CN1315863A (zh) 2001-10-03
EP1077715B1 (en) 2006-03-29
JP2002526384A (ja) 2002-08-20
US6140363A (en) 2000-10-31
WO1999059606A1 (en) 1999-11-25
DE69930619T2 (de) 2006-12-28
EP1077715A1 (en) 2001-02-28
JP3827948B2 (ja) 2006-09-27
AU3734999A (en) 1999-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1219509C (zh) 迷迭香酸及其衍生物用于制备免疫抑制剂药物的用途
CN1304416C (zh) 作为c型肝炎抑制剂的杂环三肽
CN1037574C (zh) 含水溶性喜树碱类似物的药物组合物的制备方法
CN1154488C (zh) 免疫抑制剂
CN1155571C (zh) 含有γ-谷氨酰基和β-天冬氨酰基的免疫调制剂化合物及其制备方法
CN1187769A (zh) 乳胱氨酸类似物
CN1223595C (zh) 雷公藤内酯醇衍生物及其应用
CN1152937A (zh) Tnf/ngf超家族受体和可溶性寡聚tnf/ngf超家族受体的调节剂
CN1261803A (zh) 抗氧化剂增强对细胞过度增生性疾病的治疗
CN1159830A (zh) 免疫调节剂
CN1090204A (zh) 白细胞介素-4/或白细胞介素-10的新用途及其抗体
CN1317970A (zh) 用aP2抑制剂和组合剂治疗动脉粥样硬化的方法
CN1496257A (zh) 调控免疫球蛋白e及抑制细胞增殖的苯并咪唑化合物
CN1017153B (zh) 嘌呤取代的氧杂环丁烷类化合物的制备方法
CN1131939A (zh) 氧化的类胡萝卜素、视黄酸类和相关共轭多烯，及衍生的用作细胞分化诱导剂、细胞抑制剂和抗肿瘤试剂的馏分和化合物
CN1250211C (zh) 包含环戊烯酮化合物作为活性组分的治疗剂或预防剂
CN1171792A (zh) 具有ii型磷脂酶a2抑制作用的新型单克隆抗体及含其一部分的蛋白质
CN1151165A (zh) 三萜衍生物及其药用组合物
CN1171874C (zh) 蛋白质法尼基转移酶与HMG CoA还原酶抑制剂的组合及其治疗癌症的用途
CN1210285C (zh) 带取代基的3,6－脱水半乳糖及组合物、食品
CN1498111A (zh) 包括含二硫键的肽和含氮碱基的化合物及其医学应用
CN101048170A (zh) 源自响尾蛇crotalus durissus terrificus蛇毒的止痛肽的类似化合物、它们的用途、组合物、制备和纯化方法
CN1733279A (zh) 一种治疗慢性肾衰的药物复合物
CN1656212A (zh) 提取自螺旋藻的新的抗逆转录病毒的硫脂、其制备方法,含有其的组合物及其作为hiv病毒逆转录酶抑制物的用途
CN1627939A (zh) 二环cb2***碱受体配体

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20050921