CN1216890C - 环波菌素、它们的制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通式(I)化合物，其中R1、R2、E、X1、X2和X3的定义见本申请，通过培养链霉菌属菌株HAG 004107(DSM 13381)而得，还涉及所述化合物的生理学上可相容的盐和化学等价物。本发明还涉及用于制备环波菌素及其生理学上可相容的盐和化学等价物的方法，这些物质用作药物，特别是脂肪酶抑制剂，还涉及药物制剂，含有环波菌素或其生理学上可相容的盐或化学等价物。
Description
本发明涉及新颖的化合物，称为环波菌素(cyclipostin)，可通过培养链霉菌属菌株HAG 004107(DSM 13381)获得，及其生理学上可耐受的盐和化学等价物。本发明进而涉及环波菌素的制备方法、微生物HAG 004107(DSM 13381)、环波菌素及其生理学上可耐受的盐和化学等价物作为药物、特别是作为脂肪酶抑制剂的用途，和含有环波菌素或其生理学上可耐受的盐或等价物的药物制剂。
特别有利地用脂肪酶抑制剂治疗的疾病是糖尿病。糖尿病是这样一种病症，由于慢性代谢障碍，以血糖浓度增加为特征。代谢障碍基于胰岛素缺乏或胰岛素作用减少。缺少胰岛素作用引起机体细胞利用在血液中所吸收的葡萄糖不足。有鉴于此，并且由于蛋白质再生葡萄糖(糖异生)，血液葡萄糖水平上升。而且，在脂肪组织中胰岛素作用减少的情况下，胰岛素拮抗激素、例如胰高血糖素引起脂肪分解增加，从而升高血液中的脂肪酸浓度。发生酮酸中毒，也就是酮体(乙酸、β-羟基丁酸、丙酮)的生成增加。在急性条件下，生物化学调节异常的程度危及生命，若不经治疗，引起糖尿病性昏迷，最终迅速死亡。糖尿病属于最常见的人慢性代谢障碍，据估计高达3％以上的人口患有糖尿病或前驱糖尿病素因，从而是颇具威胁的。因此迫切需要治疗或治愈糖尿病的药物。
糖尿病是通过胰岛素给药进行治疗的，在成人发作的糖尿病中，即所谓的非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)或II型糖尿病，首先给药的是磺酰脲类。磺酰脲类的作用原理是胰腺β-细胞分泌胰岛素激增，目的从而是补偿激素缺乏或胰岛素抵抗。不过，随着条件的发展，也已经采用胰岛素。胰岛素的作用可以总结为下列方式。这种肽类激素降低血液中的葡萄糖浓度，引起合成代谢过程增加，同时抑制分解代谢：
·它增加机体细胞内的葡萄糖转运，
·它增加肝脏和肌肉内的糖原生成，
·它抑制脂肪分解，
·它增加脂肪组织对脂肪酸的吸收，
·它增加机体细胞对氨基酸的吸收和蛋白质合成。
胰岛素最强烈的效果之一是抑制脂肪分解。在II型糖尿病的情况下，这种脂肪分解的调节作用不再有效，血液中的游离脂肪酸水平增加。血液中的游离脂肪酸刺激肝脏内的糖异生，减少骨骼肌对葡萄糖的利用。脂肪分解也就是脂肪酸被所谓的激素敏感性脂肪酶(HSL)所释放，见于脂肪细胞内，通过磷酸化级联被胰岛素所抑制，因此是受控制的。抑制剂、也就是HSL抑制剂因此将是可取的，它刺激胰岛素的作用，能够降低血液脂质水平。这类药物适合于治疗II型糖尿病，控制脂质代谢，但是在其他储藏障碍中的应用也将是可能的。为此，迫切需要和寻找HSL和其他脂肪酶的新抑制剂。
已经惊人地发现，微生物链霉菌属菌株HAG 004107，DSM 13381能够生成高度活性的新颖的脂肪酶抑制剂，它们即使在非常低的浓度下也抑制激素敏感性脂肪酶。新颖的天然化合物是有机磷酸酯类，由双环***(二环)和取代的碳链组成，特异性地抑制脂肪酶。环结构——仅有甲基代替碳链——已经被第一次描述为乙酰胆碱酯酶抑制剂CGA 134736，见R.Neumann & H.H.Peter，Experientia(实验)，
43卷，1235-1237页，1987，后来，同一化合物被称为cyclophostin，见T.Kurokawa等，J.Antibiotics(抗生素杂志)，46，1315-1318，1993。这种结构上相关的化合物不具有选择性脂肪酶抑制性质。以前已知的物质表现出不令人满意的作用水平、高毒性和/或不可取的副作用等缺点。
本发明因此涉及式I化合物
其中
R1是
1.具有2至30个碳原子的碳链，它可以是直链、支链、饱和或不饱和、碳环或杂环的，其中该碳链可选地被下列基团单或二取代：
1.1-OH，
1.2＝O，
1.3-O-C1-C6-烷基，其中的烷基是直链或支链的，
1.4-O-C2-C6-烯基，其中的烯基是直链或支链的，
1.5-C1-C6-烷基，其中的烷基是直链或支链的，
1.6-芳基，
1.7-C1-C6-烷基苯，
1.8-联苯，
1.9-NH-C1-C6-烷基，其中的烷基是直链或支链的，
1.10-NH-C2-C6-烯基，其中的烯基是直链或支链的，
1.11-NH2，
1.12＝S，
1.13-S-C1-C6-烷基，其中的烷基是直链或支链的，或
1.14-S-C2-C6-烯基，其中的烯基是直链或支链的，
1.15卤素，
其中取代基1.1至1.15还可以是另外被取代的，
2.-[-芳基-(CH2)n]m，其中[-芳基-(CH2)n]m是未取代的或者被1.1至1.15所述取代基单或二取代，n和m彼此独立地是整数0、1、2或3；
R2是
1.C1-C6-烷基，其中的烷基是未取代的或者被1.1至1.15所述取代基单或二取代，
2.C2-C6-烯基，其中的烯基是未取代的或者被1.1至1.15所述取代基单或二取代，
3.C2-C6-炔基，其中的炔基是未取代的或者被1.1至1.15所述取代基单或二取代，
E是磷(P)或硫(S)原子，
X1、X2和X3彼此独立地是
1.-O-，
2.-NH-，
3.-N＝，
4.-S-，或
5.-CH2-和-CHR2，
以所有它们的立体化学形式和这些形式的任意比例混合物存在，和它们的生理学上可耐受的盐和化学等价物。
R1优选地具有6至24个碳原子的链长，非常优选为10至18个碳原子。该链可以是饱和的，例如-烷基，其中的烷基可以是直链或支链的，或者可以是不饱和的，例如-烯基或-炔基，其中的烯基或炔基是直链或支链的。R1可以是未取代的，或者被上述基团1.1至1.15相同或不同地单或二取代。碳原子8’至16’上的取代基是优选的，位置10’至14’是特别优选的。取代基1.1至1.15还可以另外被一个或多个基团取代，取代基选自：醇、醛、缩醛、缩酮、醚、羧基、酯、氨基、腈、硝基、肟、肟醚和卤素。
具有2至30个碳原子的碳环碳链是由2至30个碳原子组成的链，且具有一个或多个、优选为一个、两个或三个环系，该环系优选地各自由4、5、6或7个碳原子组成。该环可以是单环、二环或三环的，优选为单环，可以位于碳链的开始、中间和/或末尾。碳环可以是脂族的或芳族的。实例是：取代的联苯或烷基苯。
具有2至30个碳原子的杂环碳链是由2至30个碳原子组成的链，且具有一个或多个、优选为一至三个环系，其中至少一个碳原子被杂原子代替，例如O、S或N。这些环可以是单环、二环或三环的，优选为单环，可以位于碳链的开始、中间和/或末尾。它们可以优选地是4-、5-、6-或7-元脂族或芳族环。实例是：取代或未取代的烷基哌啶。
芳基是具有6至14个、优选为6至10个碳原子的芳族环或环系，例如可选被取代的烷基苯酚或烷基萘酚。
卤素是氯、溴、氟或拟卤化物，例如氰化物(腈)。
-C1-C6-烷基是具有1、2、3、4、5或6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、异丙基、叔丁基和己基。
-C2-C6-烯基是具有2、3、4、5或6个碳原子的直链或支链烯基，例如烯丙基、巴豆基和戊烯基。
-C2-C6-炔基是具有2、3、4、5或6个碳原子的直链或支链炔基，例如丙炔基、丁炔基和戊炔基。
R1优选地是
1.-(CH2)15CH3，
2.-(CH2)13CH(CH3)2，
3.-(CH2)11CH(OH)(CH2)3CH3，
4.-(CH2)11CH(OH)CH2CH(CH3)2，
5.-(CH2)12CH(OH)(CH2)2CH3，
6.-(CH2)13CH(OH)CH2CH3，
7.-(CH2)14CH(OH)CH3，
8.-(CH2)15CH2(OH)，
9.-(CH2)16CH3，或
10.0-(CH2)13C＝OCH2CH3
11.0-(CH2)12C＝OCH2CH2CH3
12.0-(CH2)11C＝OCH2CH2CH2CH3
13.0-(CH2)13CH3
14.0-(CH2)11CH(CH3)2
15.0-(CH2)14CH3或
16.0-(CH2)12CH(CH3)2
R2优选地是C1-C6-烷基，特别是甲基、乙基或丙基。
优选的本发明化合物如下所示：
式II的环波菌素A：
式IIA的环波菌素A2：
式III的环波菌素B：
式IV的环波菌素C：
式V的环波菌素D：
式VI的环波菌素E：
式VII的环波菌素F：
式VIII的环波菌素G：
式IX的环波菌素H：
式X的环波菌素N：
式XI的环波菌素P：
式XIA的环波菌素P2：
式XII的环波菌素Q：
式XIII的环波菌素R：
式XIIIA的环波菌素R2：
所有它们的立体化学形式和这些形式的任意比例混合物、和它们的生理学上可耐受的盐和化学等价物。
上述结构式中关于NMR光谱的碳原子编号方式如下：
环系独自含有两个不对称取代的原子，即碳原子3和磷原子。这两个原子都可以存在R或S构型。已经惊人地发现，链霉菌属菌株HAG 004107，DSM 13381能够各自生成大量式I化合物的立体异构体，也就是说该菌株合成其中C3和P原子彼此独立地可以假定为R或S构型的化合物。空间形式为碳(3)R构型且磷S构型的异构体大量存在于链霉菌属菌株HAG 004107，DSM 13381中，即式IA：
不过，另外也生成具有其他构型的环波菌素，例如(R，R)、(S，S)或(S，R)，它们惊人地也具有相当的脂肪酶抑制作用。
式I化合物或其生理学上可耐受的盐或化学等价物可以这样制备，在适合的条件下，在培养基中发酵微生物链霉菌属菌株HAG004107，DSM 13381或其变体或突变体之一，直至一种或多种式I化合物蓄积在培养基中，然后从培养基中分离它们，再可选地转化为化学等价物和生理学上可耐受的盐。
根据本发明的环波菌素可以由放线菌目菌株(Actinomycetalesspecies)制备，优选为链霉菌属菌株(Streptomyces species)HAG 004107，DSM 13381链霉菌属菌株HAG 004107，DSM 13381具有象牙色菌丝体(RAL 1014)，以链霉菌特有的分生孢子为特征。
分离菌已经按照布达佩斯条约于2000年3月16日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1B，D 38124中，编号为链霉菌属菌株HAG004107，DSM 13381。
代替链霉菌属菌株HAG 004107，DSM 13381的是，也有可能采用它的突变体和变体来合成一种或多种根据本发明的环波菌素化合物。这类突变体可以以本身已知的方式通过物理手段制备，例如辐射，例如紫外或X-射线，或者化学诱变剂，例如甲磺酸乙酯(EMS)、2-羟基-4-甲氧基二苯酮(MOB)或N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)。
本发明因而涉及式I化合物或其生理学上可耐受的盐的制备方法，其特征在于它包含在适合的条件下，在培养基中发酵微生物链霉菌属菌株HAG 004107，DSM 13381或其变体或突变体之一，直至一种或多种式I化合物蓄积在培养基中，然后从培养基中分离它们，再可选地转化为化学等价物和生理学上可耐受的盐。
优选地，在含有碳与氮源和常用无机盐的营养溶液(也称培养基)中发酵链霉菌属菌株HAG 004107，DSM 13381、它的突变体和/或变体，直至新颖的环波菌素蓄积在培养基中，然后从培养基中分离这些环波菌素，再可选地分离为单独的活性组分。
发酵优选地在需氧条件下进行；它在18与35℃之间的温度下和6与8之间的pH下进行得特别充分。
根据本发明的方法可以用于在实验室规模(毫升至升范围)和工业规模(立方米规模)上发酵。如果没有相反规定，所有百分率都指的是重量。在液体情况下的混合比例指的是体积，除非给出其他细节。
适合于需氧发酵的优选碳源是可同化的碳水化合物和糖醇，例如葡萄糖、乳糖、蔗糖或D-甘露糖醇，和含有碳水化合物的天然产物，例如燕麦片、大豆粉和麦芽提取物。可能的含氮营养物是：氨基酸、肽和蛋白质，和它们的降解产物，例如蛋白胨或胰胨，进一步的小麦提取物、酵母提取物、研磨过的种子(例如玉米、小麦、豆、大豆或棉花植物)、酒精生产的蒸馏残余物、小麦粗粉或酵母提取物，以及铵盐和硝酸盐。营养溶液可以含有的无机盐例如碱金属或碱土金属、铁、锌、钴和锰的氯化物、碳酸盐、硫酸盐或磷酸盐。
根据本发明的式II至XVA环波菌素的生成在含有大约0.1至5％、优选为0.3至3％燕麦片和痕量元素的培养基中进行得特别好。百分率的细节各自基于全部培养基的重量。
优选的式VIII至XVA环波菌素的生成可以特别容易地在含有大约0.1至5％、优选为0.3至2％甘油和0.2至5％、优选为0.5至3％大豆粗粉和0.05至1.0g/l、优选为0.1至1.0g/l氯化钠的营养溶液中进行。
在培养基中，链霉菌属菌株HAG 004107，DSM 13381生成环波菌素的混合物。根据培养基的组成，一种或多种根据本发明的环波菌素的量可以各不相同。而且，有可能借助培养基的组成控制单独环波菌素的合成，以便完全没有制备其他一种或多种环波菌素或者所制备的量低于微生物的检测限。
培养物优选地含有可检测的环波菌素。环波菌素A或P或P2是优选生成的。
除了环波菌素A至T2(式II至XVA化合物)以外，在链霉菌属菌株HAG 004107，DSM 13381的培养基中还生成其他相关的化合物，它们因经过修饰的基团R1和R2而不同于式II至XVA所示化合物。已经检测到更少量的R1被截短或进一步分支的环波菌素。这些次要组分的氧化(羟基化)产物在链霉菌属菌株HAG 004107，DSM 13381的培养物中也是可检测到的。
微生物的培养是需氧进行的，例如在摇瓶或发酵器内深层培养，同时摇动或搅拌，如果适当的话引入空气或氧。可以在大约18至35℃的温度范围内进行，优选为大约25至32℃，特别是26至30℃。pH范围应当在6与8之间，优选在6.5与7.8之间。微生物在这些条件下一般培养24至300小时，优选为30至90小时。
有利的是，培养分多个阶段进行，也就是说首先在液体培养基中制备一份或多份预培养物，然后接种在真正的制备培养基、即主培养基中，例如体积比为1∶10。预培养物例如是这样得到的，向营养溶液接种菌丝体，使其生长大约36至120小时，优选为48至96小时。菌丝体例如可以这样得到，在固体或液体营养培养基上，例如麦芽/酵母/琼脂或燕麦片/琼脂，使菌株生长大约3至40天，优选为4至10天。
发酵的过程可以借助培养物pH或菌丝体体积加以监测，并采用色谱方法，例如薄层色谱或高效液相色谱，或者测试生物活性。根据本发明的环波菌素存在于菌丝体中，在培养物滤液中也存在一小部分。下述分离过程用以纯化根据本发明的环波菌素，优选为环波菌素A和P。
根据本发明的环波菌素从培养基中分离和/或纯化是按照已知方法进行的，并考虑天然物质的化学、物理和生物性质。关于测定培养基中或单独分离阶段中的环波菌素浓度，可以使用薄层色谱，例如硅胶，使用二氯甲烷/乙酸乙酯或氯仿/甲醇混合物(例如定量比为98∶1)作为洗脱剂，或HPLC。在薄层色谱分离情况下的检测例如可以这样进行，借助显色剂，例如钼磷酸或I2蒸气，将预期生成的物质量与校准溶液比较。
关于根据本发明的环波菌素的分离，首先按照常用方法从培养基中分离出菌丝体，然后使用可选与水混溶的有机溶剂从细胞物中萃取环波菌素。有机溶剂相含有根据本发明的环波菌素；可选地在真空中浓缩它们，进一步如下所述纯化。
可选地将培养物滤液与菌丝体提取物浓缩物合并，用适合的水不混溶性有机溶剂萃取，例如正丁醇或乙酸乙酯。随后分离出有机相，可选地在真空中浓缩，溶于最初体积为1/30的水/甲醇。
一种或多种根据本发明的环波菌素的进一步纯化是通过在适合材料上的色谱法进行的，例如优选在分子筛、正相载体(例如硅胶、氧化铝)、离子交换或吸附树脂或反相(反转相，RP)上。环波菌素是借助这些色谱方法分离的。环波菌素的色谱法是利用有机溶剂或水溶液与有机溶液混合物进行的。
水溶液或有机溶液的混合物被理解为表示所有水可混溶性有机溶剂，优选为甲醇、丙醇和乙腈，溶剂浓度为10至100％，优选为60至90％，或者所有经过缓冲的水溶液，它们与有机溶剂是可混溶的。所用缓冲剂与上述相同。
环波菌素基于不同极性的分离是借助反相色谱进行的，例如MCI(来自日本三菱的吸附树脂)或Amberlite XAD(TOSOHAAS)，其他疏水性材料，例如RP-8或RP-18相。而且，分离可以借助正相色谱进行，例如硅胶、氧化铝等。
环波菌素的色谱法是利用经过缓冲或酸化的水溶液或水溶液与醇或其他水可混溶性有机溶剂的混合物进行的。所用有机溶剂优选地是丙醇和乙腈。
经过缓冲或酸化的水溶液被理解为例如表示水、磷酸盐缓冲液、乙酸铵、柠檬酸缓冲液，浓度为1mM至0.5M，和甲酸、乙酸、三氟乙酸或本领域技术人员已知的所有商业上可得到的酸，浓度优选为0.01至3％，特别是0.1％。
色谱法是利用梯度进行的，开始于100％含水缓冲剂，终止于100％溶剂；优选地采用50至100％2-丙醇或乙腈的线性梯度。
作为替代选择，还可以进行凝胶色谱或疏水相色谱。
凝胶色谱是在聚丙烯酰胺或混合的聚合物凝胶上进行的，例如Biogel-P 2(Biorad)、Fractogel TSK HW 40(Merck，Germany或Toso Haas，USA)或 Sephadex(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。
上述色谱的顺序是可逆的。
进而非常有效的环波菌素纯化步骤是结晶。环波菌素会从有机溶剂溶液和水与有机溶剂的混合物中结晶出来。结晶是以本身已知的方式进行的，例如浓缩或冷却饱和环波菌素溶液。
根据本发明的环波菌素在固体或液体状态下和在pH在4与8之间、特别是5与7之间的溶液中是稳定的，从而能够结合在常用的药物制剂中。
本发明进一步包含式I化合物的明显的化学等价物，它们具有轻微的化学差异，也就是说具有相同的活性或者能够在温和条件下转化为根据本发明的化合物。所述等价物例如包括根据本发明的化合物的酯与醚和氧化、还原与氢化产物。
酯与醚衍生物、氧化、氢化与还原产物可以按照文献所述方法制备，例如Advanced Organic Synthesis(高等有机合成)，第4版，J.March，John Wiley & Sons.，1992。
本发明包括式I至XVA化合物的所有立体异构型。式I至XVA化合物所含有的不对称中心都可以彼此独立地具有S构型或R构型。本发明包括所有可能的对映异构体和非对映异构体，以及任意比例的两种或多种立体异构型的混合物，例如对映异构体和/或非对映异构体的混合物。本发明因而涉及对映异构纯形式的对映异构体、旋转和右旋的对映体、R和S构型、外消旋物的形式和任意比例的两种对映异构体的混合物形式。在顺式/反式异构现象的存在下，本发明涉及顺式构型和反式构型以及任意比例的这些形式的混合物。
鉴于宝贵的药理性质，根据本发明的化合物适合在人和/或兽医中用作药物。它们抑制脂肪酶，具有有利于代谢障碍治疗的性质，代谢障碍导致脂质代谢紊乱。根据本发明的式I化合物对激素敏感性脂肪酶HSL具有惊人的抑制作用，HSL是脂肪细胞中的一种变构酶，受胰岛素的抑制，负责脂肪细胞中脂肪的分解，从而负责脂肪成分向血流的转移。这种酶的抑制从而相当于根据本发明的化合物的胰岛素样作用，最终引起血液中的游离脂肪酸和血糖减少。它们因此能够用于代谢机能障碍，例如非胰岛素依赖型糖尿病、糖尿病综合征和对胰腺的直接损伤。
本发明因此涉及药物制剂，该制剂含有一种或多种根据本发明的环波菌素和/或其化学等价物。与适合的赋形剂或载体材料混合使用是优选的。可以用于人的载体材料都是药理学上可耐受的载体材料和/或赋形剂。
本发明进一步涉及根据本发明的药物的制备方法，其特征在于包含利用药学上适合的与生理学上可耐受的载体和——如果适当的话——其它适合的活性化合物、添加剂或赋形剂将至少一种根据本发明的化合物制成适合的给药剂型。
根据本发明的药物一般是口服、局部或肠胃外给药的，但是直肠给药在原则上也是可能的。适合的固体或液体药物剂型例如颗粒剂、粉剂、片剂、包衣片、(微)胶囊剂、栓剂、糖浆剂、乳剂、悬液、气雾剂、滴剂或安瓿形式的可注射溶液，和延长活性化合物释放的制剂，在这样的制剂中，习惯上使用载体和添加剂和/或赋形剂，例如崩解剂、包衣剂、溶胀剂、滑动剂或润滑剂、矫味剂、甜味剂或稳定剂。经常使用的载体或赋形剂例如可以提到碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露糖醇与其他糖类、滑石、乳蛋白、明胶、淀粉、维生素、纤维素及其衍生物、动物或植物油、聚乙二醇和溶剂，例如无菌水、醇、甘油和多元醇。
如果适当的话，可以将剂量单元微囊包封，用于口服给药，目的是延迟或延长释放经过更长的时间，例如将颗粒形式的活性化合物包衣或包埋在适合的聚合物、蜡等中。
优选地，药物制剂是以剂量单元形式制备和给药的，每个单元含有作为活性成分的特定剂量的一种或多种根据本发明的环波菌素化合物和/或其化学衍生物。在固体剂量单元的情况下，例如片剂、胶囊剂和栓剂，这种剂量可以高达大约200mg，但是优选大约0.1至100mg，在安瓿形式的注射溶液的情况下，至多大约200mg，但是优选大约0.1至100mg，均为每日剂量。
所要给药的每日剂量取决于哺乳动物的体重、年龄、性别和状况。不过在某些环境下，更高或更低的每日剂量也可以是适当的。每日剂量的给药可以这样进行，以单独剂量单元或多数更小剂量单元的形式单次给药，或者按特定间隔分剂量反复给药。
本发明还涉及药物制剂，它含有一种或多种根据本发明的环波菌素和/或其化学等价物。与适合的赋形剂或载体材料混合使用是优选的。在人的情况下，所用载体材料可以都是药理学上可耐受的载体材料和/或赋形剂。
测试了根据本发明的式I化合物对下列酶试验***的作用：
酶的制备：
部分纯化的HSL的制备：
按照已公开的方法(例如S.Nilsson等，Anal.Biochem.(生物化学纪事)158，1986，399-407；G.Fredrikson等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)256，1981，6311-6320；H.Tornquist等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)251，1976，813-819)，通过胶原酶处理，从未经治疗的雄性大鼠(Wistar，220-250g)附睾脂肪组织得到离体大鼠脂肪细胞。通过浮集法，将来自10只大鼠的脂肪细胞各自用50ml匀化缓冲液(25ml Tris/HCl，pH7.4，0.25M蔗糖，1mMEDTA，1mM DTT，10μg/ml亮肽素，10μg/ml抗蛋白酶，20μg/ml胃酶抑制剂)洗涤三次，最后溶于10ml匀化缓冲液。在含特氟隆玻璃匀化器(Braun-Melsungen)内匀化脂肪细胞，条件是10冲程、1500rpm和15℃。将匀化产物离心(Sorvall SM24试管，5000rpm，10min，4℃)。除去上面的脂肪层与粒状沉淀之间的下层，反复离心。再次离心由此所得下层(Sorvall SM24试管，20000rpm，45min，4℃)。除去下层，用1g肝素-琼脂糖处理(Pharmacia-Biotech，CL-6B，用25mM Tris/HCl，pH7.4，150mM NaCl洗涤5x)。在4℃下培育60min后(每隔15min摇动)，成批离心(Sorvall SM24试管，3000rpm，10min，4℃)。向上清液加入乙酸至pH5.2，在4℃下培育30min。离心收集沉淀(Sorvall SS34，12000rpm，10min，4℃)，悬浮在2.5ml 20mM Tris/HCl，pH7.0，1mM EDTA，65mM NaCl，13％蔗糖，1mM DTT，10μg/ml亮肽素/胃酶抑制剂/抗蛋白酶)中。在4℃下将悬液对25mM Tris/HCl，pH7.4，50％甘油，1mM DTT，10μg/ml亮肽素、胃酶抑制剂、抗蛋白酶透析过夜，然后上羟基磷灰石(hydroxyappetite)柱(0.1g每1ml悬液，用10mM磷酸钾，pH7.0，30％甘油，1mM DTT平衡)。将柱子用四体积平衡缓冲液洗涤，流速为20至30ml/h。用一体积含有0.5M磷酸钾的平衡缓冲液洗脱HSL，然后透析(见上)，通过在4℃下超滤(Amicon Diaflo PM 10 Filter)浓缩5至10倍。经过部分纯化的HSL可以在-70℃下贮存4至6周。
测定法：
关于底物的制备，将25-50μCi[3H]三油酰基甘油(甲苯溶液)、6.8μMol未标记的三油酰基甘油和0.6mg磷脂(磷脂酰胆碱/磷脂酰肌醇3∶1 w/v)混合，借助N2干燥，然后通过超声处理(Branson250，microtips，1-2档，2×1min，间隔1min)溶于2ml 0.1M KPi(pH7.0)。加入1ml KPi和新的超声处理(冰上4×30sec，间隔30sec)后，加入1ml 20％BSA(牛血清白蛋白)(KPi)(三油酰基甘油的最终浓度为1.7mM)。关于反应，将100μl底物溶液吸移到100μl HSL溶液(如上制备的HSL，稀释在20mM KPi，pH7.0，1mMEDTA，1mM DTT，0.02％BSA，20μg/ml胃酶抑制剂，10μg/ml亮肽素中)中，在37℃下培育30min。加入3.25ml甲醇/氯仿/庚烷(10∶9∶7)和1.05ml 0.1M K2CO3、0.1M硼酸(pH10.5)后，将该批次充分混合，最后离心(800xg，20min)。相分离后，除去一当量上层相(1ml)，通过液体闪烁测量法测定放射性。
评价：
习惯上分独立的四批测试物质。通过与未抑制的对照反应比较，测定供试物质对HSL酶活性的抑制作用。IC50值的计算是借助抑制曲线进行的，采用至少10种浓度的供试物质。关于数据的分析，使用Elsevier-BIOSOFT的GRAPHIT软件包。
本试验中，化合物显示下列作用：
环波菌素A、P、P2和R抑制大鼠脂肪细胞的脂肪分解，IC50＝~0.2μM，它们还抑制人激素敏感性脂肪酶(HSL)，以三油酰基甘油为底物：IC50＝~0.07至0.5μM。以NBD(4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)为底物，在4nM至10nM的浓度下抑制来自大鼠的HSL。
环波菌素在亚微摩尔浓度下抑制激素敏感性脂肪酶(HSL)和大鼠提取物的单酰基甘油脂肪酶。
下列实施例进一步阐述本发明。百分率指的是重量。混合比在液体的情况下指的是体积，除非已经给出其他的细节。
实施例
实施例1
链霉菌属菌株HAG 004107，DSM 13381甘油培养物的制备
在无菌的300ml埃伦迈厄烧瓶内向100ml营养溶液(麦芽提取物2.0％，酵母提取物0.2％，葡萄糖1.0％，(NH4)2HPO4 0.05％，pH6.0)接种链霉菌属菌株HAG 004107，DSM 13381，在28℃和180rpm下在旋转摇动器上培育7天。然后将1.5ml该培养物用1.5ml 99％甘油稀释，贮存在-20℃下。
实施例2
链霉菌属菌株HAG 004107，DSM 13381在埃伦迈厄烧瓶内的预培养物的制备
在无菌的300ml埃伦迈厄烧瓶内含有100ml下列营养溶液：15g/l葡萄糖、15g/l大豆粉、5g/l玉米浆、2g/l CaCO3和5g/lNaCl，接种生长在斜面试管上的培养物(相同的营养溶液，但是含有2％琼脂)或1ml甘油培养物(见实施例1)，在180rpm和28℃下在摇动器上培育。相同营养溶液的48至96小时深层培养(接种量约为10％)可满足10和200l发酵器的接种需求。
实施例3
链霉菌属菌株HAG 004107，DSM 13381在埃伦迈厄烧瓶内的培养物的制备
在无菌的300ml埃伦迈厄烧瓶内含有100ml下列营养溶液：20g/l狗用燕麦片和2.5ml痕量元素溶液，接种10％接种量的预培养物(实施例2)，在180rpm和28℃下在摇动器上培育。培养物可以在两天后用于得到环波菌素或者接种发酵器。痕量元素溶液具有下列组成：3g/l CaCl2x2H2O，1g/l柠檬酸Fe(III)，0.2g/l MnSO4xH2O，0.1g/l ZnCl2，0.025g/l CuSO4x5H2O，0.02g/l四硼酸Na，0.004g/l CoCl2x6H2O，0.01g/l钼酸Na。
实施例4
式II至IX环波菌素的制备
将200l发酵器在下列条件下用90升营养溶液操作：
营养培养基：20g/l燕麦片/水，2.5ml/l痕量元素，pH7.8(灭菌前)。
将营养溶液加热灭菌30分钟，冷却后，接种5％体积的按照实施例3所得接种材料。
痕量元素溶液：3g/l CaCl2x2H2O，1g/l柠檬酸Fe(III)，0.2g/l MnSO4xH2O，0.1g/l ZnCl2，0.025g/l CuSO4x5H2O，0.02g/l四硼酸Na，0.004g/l CoCl2x6H2O，0.01g/l钼酸Na。
进行时间： 72小时
培育温度： 28℃
搅拌速度： 90rpm
换气： 6m3空气每小时
无需加入止泡剂即可进行发酵。产量在约40至76小时后达到最大。
实施例5
环波菌素X至XV A的制备
在下列条件下操作200l发酵器，填充100l：
营养培养基：5g/l葡萄糖，20g/l甘油，20g/l大豆粉，5g/l酵母提取物，3g/l NaCl，2.5ml/l痕量元素溶液，pH7.0(灭菌前)。
进行时间： 72小时
培育温度： 27℃
搅拌速度： 65rpm
换气： 6m3空气每小时
无需加入抑制泡沫生成的试剂即可进行发酵。产量在约48小时后达到最大。
实施例6
环波菌素混合物从链霉菌属菌株HAG 004107，DSM 13381培养溶液中的分离
链霉菌属菌株HAG 004107，DSM 13381发酵完成后，向发酵器加入约2％过滤助剂(例如Celite)过滤按照实施例4所得100升培养肉汤，用40升甲醇萃取细胞物(10升)。过滤除去含有活性化合物的甲醇溶液中菌丝体，在真空中浓缩。将浓缩物加载上已准备好的7升MCI GEL，CHP20P柱。使用水至丙-2-醇的梯度进行洗脱。收集柱子流出物(每小时20升)，每10升一级分，将含有环波菌素19至21的级分各自在真空中浓缩。借助HPLC检查各级分(见实施例7)。第19级分包含环波菌素A至E和它们的异构体，第20级分包含环波菌素F及其异构体，第21级分包含抑制剂环波菌素N、P、P2、Q、R、S、T和它们的异构体。
实施例7
环波菌素的HPLC分析
环波菌素的高效液相色谱(HPLC)分析是在HP 1100单元中进行的，柱子为YMC Pack Pro C18柱(AS-303，250×4.6mm，S-5μm，120A°)。流速为1ml/分钟，柱温为40℃。使用0.05％三氟乙酸至乙腈的梯度。11分钟后洗脱剂变为100％乙腈，然后将柱子用这种溶剂进一步恒定(等度)洗脱。测量210nm下的紫外吸收，进行检测。利用这种操作，环波菌素具有下列保留时间：
环波菌素A 12.7分钟
环波菌素A2 12.6分钟
环波菌素F 13.2分钟
环波菌素N 15.9分钟
环波菌素P 17.7分钟
环波菌素P2 17.3分钟
环波菌素Q 18.3分钟
环波菌素R 16.7分钟
环波菌素R2 16.4分钟
环波菌素S 18.5分钟
环波菌素T 19.1分钟
环波菌素T2 18.7分钟
实施例8
纯环波菌素A和A2的制备
将按照实施例6所得第19级分在真空中浓缩，将1g浓缩物溶于水/甲醇(1∶1)，加载Nucleoprep 100-5 C18 AB柱(21×250mm)上。利用含50％乙腈的0.01％三氟乙酸至100％乙腈的梯度进行洗脱。流速为50ml/分钟。测量210nm下的吸光度，测试脂肪酶抑制性质，检查柱子流出级分。每60ml为一级分。在第34和35级分中发现环波菌素A，在第41至44级分中发现环波菌素A2。将这些级分分别合并，在真空中浓缩，连续在SP 250/10 Nucleosil 100-5 C18HD柱上分离。所选择的梯度是含50％至66％乙腈/0.01％三氟乙酸，用一滴氢氧化铵溶液调节溶液的pH至4.0。将含有纯化合物的级分分别合并，冷冻干燥。得到5.4mg纯的环波菌素A，为蜡状物质，和3mg环波菌素A2，为油状物。
实施例9
环波菌素A的特征鉴别
外观：中性、无色、蜡状物质，可溶于含氧有机溶剂，但是仅微溶于水和石油醚。
UV最大：在甲醇中为228nm。
IR谱带：1752和1671cm-1。
利用硝基苯甲醇/LiCl基质进行高分辨率FAB质谱分析，发现分子量为467.2757amu，与环波菌素A-Li的经验式C23H41O7PLi相对应。由此，从环波菌素A的经验式C23H41O7P得到分子量为460。以正电离模式进行电喷雾质谱(ESI，正)，发现峰值在461amu，与(M+H)+相对应；而且，特征峰在221amu，与C7H10O6P相对应。在ESI负模式中，发现459amu(M-H)-、337amu(C16H34O5P)和219amu(C7H8O6P)。关于醇基位置的测定，用N-甲基-N-三甲代甲硅烷基三氟乙酰胺进行衍生化，利用电子电离质谱检查样品。三甲代甲硅烷基衍生物得到：
质量数为554amu。甲硅烷基化羟基的位置由强化离子所示，在497amu(α-裂解)和159amu(α-裂解)。
NMR信号：见表1。
表1：在300K下，环波菌素A在甲醇-d4中的1H与13C化学位移
| 1H | 13C | |
| 1 | - | 171.08(1.4Hz)b) |
| 2 | - | 114.61(3.4Hz)b) |
| 3 | 3.87 | 40.75 |
| 4 | 4.46/3.86 | 66.04 |
| 5 | 4.31/4.25 | 69.39(6.0Hz)b) |
| 6 | - | 161.47(8.0Hz)b) |
| 7 | 2.40 | 17.89(4.6Hz)b) |
| 1‘ | 4.25 | 71.61(6.6Hz)b) |
| 2‘ | 1.73 | 31.16(6.6Hz)b) |
| 3‘ | 1.41 | 26.39 |
| n‘ | 3.49 | 72.45 |
| n±1 | 1.46-1.33 | 38.44，38.15 |
| 4‘-14‘(a) | 1.37-1.26 | 30.85-30.58 |
| 15‘ | 1.34 | 23.84 |
| 16‘ | 0.91 | 14.43 |
a)除了n和n±1以外
b)13C/31P偶合常数如括号内所示。
实施例10
环波菌素B的特征鉴别
如实施例8关于环波菌素A所述分离环波菌素B，多次重复色谱步骤，如实施例9进行特征鉴别。
外观：中性、无色、蜡状物质，可溶于含氧有机溶剂，但是仅微溶于水和石油醚。
UV最大：在甲醇中为228nm。
以正电离模式进行电喷雾质谱(ESI，正)，发现峰值在461amu，与(M+H)+相对应；而且，特征峰在221amu，与C7H10O6P相对应。在ESI负模式中，发现459amu(M-H)-、337amu(C16H34O5P)和219amu(C7H8O6P)。关于醇基位置的测定，用N-甲基-N-三甲代甲硅烷基三氟乙酰胺进行衍生化，利用电子电离质谱检查样品。三甲代甲硅烷基衍生物得到：
质量数为554amu。甲硅烷基化羟基的位置由强化离子所示，在511amu(α-裂解)和145amu(α-裂解)。
环波菌素B的经验式：C23H41O7P，分子量：460。
实施例11
环波菌素C的特征鉴别
如实施例8关于环波菌素A所述分离环波菌素C，多次重复色谱步骤，如实施例9进行特征鉴别。
外观：中性、无色、蜡状物质，可溶于含氧有机溶剂，但是仅微溶于水和石油醚。
UV最大：在甲醇中为228nm。
以正电离模式进行电喷雾质谱(ESI，正)，发现峰值在461amu，与(M+H)+相对应；而且，特征峰在221amu，与C7H10O6P相对应。在ESI负模式中，发现459amu(M-H)-、337amu(C16H34O5P)和219amu(C7H8O6P)。关于醇基位置的测定，用N-甲基-N-三甲代甲硅烷基三氟乙酰胺进行衍生化，利用电子电离质谱检查样品。三甲代甲硅烷基衍生物得到：
质量数为554amu。甲硅烷基化羟基的位置由强化离子所示，在525amu(α-裂解)和131amu(α-裂解)。
环波菌素C的经验式：C23H41O7P，分子量：460。
实施例12
环波菌素F的特征鉴别
如实施例8所述分离按照实施例6所得第20级分，多次重复色谱步骤分离环波菌素F，如实施例9进行特征鉴别。
保留时间：13.2分钟。
外观：中性、无色、蜡状物质，可溶于含氧有机溶剂，但是仅微溶于水和石油醚。
UV最大：在甲醇中为228nm。
以正电离模式进行电喷雾质谱(ESI，正)，发现峰值在459amu，与(M+H)+相对应；而且，特征峰在221amu，与C7H10O6P相对应。在ESI负模式中，发现457.6amu(M-H)-、336amu(C16H32O5P)和219amu(C7H8O6P)。
环波菌素F的经验式：C23H39O7P，分子量：458。
实施例13
环波菌素P的特征鉴别
如实施例8所述分离按照实施例5和6所得第21级分，多次重复色谱步骤分离环波菌素P(210mg)，如实施例9进行特征鉴别。
将210mg环波菌素P溶于3ml丙-2-醇和13ml乙腈，加入8ml水，进行结晶。滤出并用冷乙腈洗涤后，得到最终重量为135mg的环波菌素。m.p.58-59℃。
保留时间：17.7分钟。
外观：中性、无色、蜡状物质，可溶于含氧有机溶剂，但是仅微溶于水和石油醚。
UV最大：在甲醇中为228nm。
IR谱带：2917，2852，1753，1671，1471，1214，996和832cm-1。
利用硝基苯甲醇基质进行高分辨率FAB质谱分析，发现分子量为445.2717amu，与环波菌素P C23H42O6P的(M+H)+相对应。由此，从环波菌素P的经验式C23H41O6P得到分子量为444。以正电离模式进行电喷雾质谱(ESI，正)，发现峰值在445amu，与(M+H)+相对应；而且，特征峰在221amu，与C7H10O6P相对应。在ESI负模式中，发现443amu(M-H)-、321amu(C16H34O4P)和219amu(C7H8O6P)。
NMR数据如表2所示。
表2：在300K下，环波菌素P在MeOD中的化学位移
| 1H | 13C | |
| 1 | - | 171.08 |
| 2 | - | 114.60(3.0Hz)a) |
| 3 | 3.87 | 40.74 |
| 4 | 4.47/3.85 | 66.05 |
| 5 | 4.30/4.25 | 69.40(6.0Hz)a) |
| 6 | - | 161.47(8.0Hz)a) |
| 7 | 2.40 | 17.90(4.6Hz)a) |
| 1‘ | 4.24 | 71.62(6.9Hz)a) |
| 2‘ | 1.73 | 31.16(6.3Hz)a) |
| 3‘ | 1.41 | 26.38 |
| 4‘-13‘ | 1.34-1.29 | 30.76-30.11 |
| 14‘ | 1.34-1.29 | 33.07 |
| 15‘ | 1.31 | 23.72 |
| 16‘ | 0.89 | 14.42 |
a)13C/31P偶合常数如括号内所示。
实施例14
环波菌素P2的特征鉴别
如实施例8所述分离按照实施例5和6所得第21级分，多次重复色谱步骤分离环波菌素P2(130mg)，如实施例9进行特征鉴别。
保留时间：17.1分钟。
外观：中性、无色、油性物质，可溶于含氧有机溶剂，但是仅微溶于水和石油醚。
UV最大：在甲醇中为228nm。
利用硝基苯甲醇基质进行高分辨率FAB质谱分析，发现分子量为445.2721amu，与环波菌素P C23H42O6P的(M+H)+相对应。由此，从环波菌素P2的经验式C23H41O6P得到分子量为444。以正电离模式进行电喷雾质谱(ESI，正)，发现峰值在445amu，与(M+H)+相对应；而且，特征峰在221amu，与C7H10O6P相对应。在ESI负模式中，发现443amu(M-H)-、321amu(C16H34O4P)和219amu(C7H8O6P)。
环波菌素P2的NMR数据如表3所示。
表3：在300K下，环波菌素P2在CD3OD中的化学位移
| 1H | 13C | |
| 1 | - | 171.05 |
| 2 | - | 114.60(3.2Hz)a) |
| 3 | 3.87 | 40.74 |
| 4 | 4.46/3.85 | 66.02 |
| 5 | 4.30/4.25 | 69.38(6.0Hz)a) |
| 6 | - | 161.46(8.0Hz)a) |
| 7 | 2.40 | 17.90(4.6Hz)a) |
| 1‘ | 4.24 | 71.60(6.9Hz)a) |
| 2‘ | 1.73 | 31.16(6.3Hz)a) |
| 3‘ | 1.41 | 26.39 |
| 4‘-11‘ | 1.34-1.29 | 31.04-30.11 |
| 12‘ | 1.29 | 28.53 |
| 13‘ | 1.17 | 40.25 |
| 14‘ | 1.52 | 29.15 |
| 15‘，16‘ | 0.87 | 23.04 |
a)13C/31P偶合常数如括号内所示。
实施例15
环波菌素N的获得和特征鉴别
如实施例8所述分离按照实施例5和6所得第21级分，多次重复色谱步骤分离环波菌素N(2mg)，如实施例9进行特征鉴别。
保留时间：15.9分钟。
外观：中性、无色、油性物质，可溶于含氧有机溶剂，但是仅微溶于水和石油醚。
UV最大：在甲醇中为228nm。
利用高分辨率质谱FAB条件，观察到准分子离子(M+H)在417.2405amu，与经验式C21H38O6P相对应(理论值：417.2406)。ESI+模式的特征片断：221amu。
表4：在300K下，环波菌素N在MeOD中的化学位移
| 1H | 13C | |
| 1 | - | 171.07 |
| 2 | - | 114.60(3.1Hz)a) |
| 3 | 3.87 | 40.74 |
| 4 | 4.45/3.84 | 66.03 |
| 5 | 4.30/4.25 | 69.39(5.9Hz)a) |
| 6 | - | 161.47(8.0Hz)a) |
| 7 | 2.40 | 17.90(4.9Hz)a) |
| 1‘ | 4.24 | 71.60(6.6Hz)a) |
| 2‘ | 1.73 | 31.16(6.2Hz)a) |
| 3‘ | 1.41 | 26.38 |
| 4‘-11‘ | 1.35-1.26 | 30.76-30.11 |
| 12‘ | 1.35-1.26 | 33.06 |
| 13‘ | 1.31 | 23.72 |
| 14‘ | 0.89 | 14.41 |
a)13C/31P偶合常数如括号内所示。
实施例16
环波菌素R的获得和特征鉴别
如实施例8所述分离按照实施例5和6所得第21级分，多次重复色谱步骤分离环波菌素R(8mg)，如实施例9进行特征鉴别。
保留时间：16.7分钟。
外观：中性、无色、结晶物质，可溶于含氧有机溶剂，但是仅微溶于水和石油醚。
UV最大：在甲醇中为228nm。
利用高分辨率质谱FAB条件，观察到准分子离子(M+H)在431.2561amu，与经验式C22H40O6P相对应(理论值：431.2562)。ESI+模式的特征片断：221amu。
表5：在300K下，环波菌素R在MeOD中的化学位移
| 1H | 13C | |
| 1 | - | 171.06 |
| 2 | - | 114.58(3.2Hz)a) |
| 3 | 3.87 | 40.75 |
| 4 | 4.45/3.85 | 66.04 |
| 5 | 4.30/4.25 | 69.40(6.0Hz)a) |
| 6 | - | 161.48(8.0Hz)a) |
| 7 | 2.40 | 17.90(5.0Hz)a) |
| 1‘ | 4.24 | 71.61(7.0Hz)a) |
| 2‘ | 1.73 | 31.16(6.2Hz)a) |
| 3‘ | 1.41 | 26.38 |
| 4‘-12‘ | 1.37-1.25 | 30.74-30.10 |
| 13‘ | 1.17 | 33.06 |
| 14‘ | 1.30 | 23.71 |
| 15‘ | 0.89 | 14.40 |
a)13C/31P偶合常数如括号内所示。
实施例17
环波菌素R2的获得和特征鉴别
如实施例8所述分离按照实施例5和6所得第21级分，多次重复色谱步骤分离环波菌素R2(8mg)，如实施例9进行特征鉴别。
保留时间：16.4分钟。
外观：中性、无色、油性物质，可溶于含氧有机溶剂，但是仅微溶于水和石油醚。
UV最大：在甲醇中为228nm。
利用高分辨率质谱FAB条件，观察到准分子离子(M+H)在431.2564amu，与经验式C22H40O6P相对应(理论值：431.2562)。ESI+模式的特征片断：221amu。
表6：在300K下，环波菌素R2在MeOD中的化学位移
| 1H | 13C | |
| 1 | - | 171.06(1.7Hz)a) |
| 2 | - | 114.58(3.1Hz)a) |
| 3 | 3.87 | 40.75 |
| 4 | 4.46/3.85 | 66.03 |
| 5 | 4.30/4.25 | 69.39(6.0Hz)a) |
| 6 | - | 161.47(8.0Hz)a) |
| 7 | 2.40 | 17.90(4.9Hz)a) |
| 1‘ | 4.24 | 71.60(6.9Hz)a) |
| 2‘ | 1.73 | 31.16(6.6Hz)a) |
| 3‘ | 1.41 | 26.38 |
| 4‘-10‘ | 1.37-1.25 | 31.02-30.10 |
| 11‘ | 1.29 | 28.51 |
| 12‘ | 1.16 | 40.24 |
| 13‘ | 1.51 | 29.15 |
| 14‘，15‘ | 0.87 | 23.02 |
a)13C/31P偶合常数如括号内所示。
实施例18
环波菌素S的获得和特征鉴别
如实施例8所述分离按照实施例5和6所得第21级分，多次重复色谱步骤分离环波菌素S(0.7mg)，如实施例9进行特征鉴别。
保留时间：18.5分钟。
外观：中性、无色、固体物质，可溶于含氧有机溶剂，但是仅微溶于水和石油醚。
UV最大：在甲醇中为228nm。
利用高分辨率质谱FAB条件，观察到准分子离子(M+H)在459.2883amu，与经验式C24H44O6P相对应(理论值：459.2575)。ESI+模式的特征片断：235amu。
表7：在300K下，环波菌素S在MeOD中的化学位移
| 1H | 13C | |
| 1 | - | 170.87(1.4Hz)a) |
| 2 | - | 113.66(3.1Hz)a) |
| 3 | 3.85 | 40.77 |
| 4 | 4.45/3.85 | 66.04 |
| 5 | 4.29/4.24 | 69.17(6.0Hz)a) |
| 6 | - | 165.80(8.3Hz)a) |
| 7 | 2.98/2.82 | 25.05(4.6Hz)a) |
| 8 | 1.16 | 10.86 |
| 1‘ | 4.25 | 71.57(6.9Hz)a) |
| 2‘ | 1.74 | 31.19(6.3Hz)a) |
| 3‘ | 1.42 | 26.41 |
| 4‘-13‘ | 1.34-1.29 | 30.76-30.11 |
| 14‘ | 1.34-1.29 | 33.07 |
| 15‘ | 1.31 | 23.73 |
| 16‘ | 0.89 | 14.43 |
a)13C/31P偶合常数如括号内所示。
实施例19
环波菌素T的获得和特征鉴别
如实施例8所述分离按照实施例5和6所得第21级分，多次重复色谱步骤分离环波菌素T(5mg)，如实施例9进行特征鉴别。
保留时间：19.1分钟。
外观：中性、无色、固体物质，可溶于含氧有机溶剂，但是仅微溶于水和石油醚。
UV最大：在甲醇中为228nm。
利用高分辨率质谱FAB条件，观察到准分子离子(M+H)在473.3030amu，与经验式C25H46O6P相对应(理论值：473.3032)。ESI+模式的特征片断：249amu。
表8：在300K下，环波菌素T在MeOD中的化学位移
| 1H | 13C | |
| 1 | - | 170.98(1.7Hz)a) |
| 2 | - | 114.39(3.1Hz)a) |
| 3 | 3.87 | 40.78 |
| 4 | 4.46/3.85 | 66.02 |
| 5 | 4.29/4.26 | 69.23(5.9Hz)a) |
| 6 | - | 164.69(8.7Hz)a) |
| 7 | 2.89/2.83 | 33.35(4.5Hz)a) |
| 8 | 1.65 | 20.63 |
| 9 | 0.98 | 13.84 |
| 1‘ | 4.25 | 71.57(6.6Hz)a) |
| 2‘ | 1.74 | 31.18(6.2Hz)a) |
| 3‘ | 1.42 | 26.42 |
| 4‘-13‘ | 1.34-1.29 | 30.78-30.11 |
| 14‘ | 1.34-1.29 | 33.06 |
| 15‘ | 1.31 | 23.72 |
| 16‘ | 0.89 | 14.42 |
a)13C/31P偶合常数如括号内所示。
实施例20
环波菌素T2的获得和特征鉴别
如实施例8所述分离按照实施例5和6所得第21级分，多次重复色谱步骤分离环波菌素T2(4mg)，如实施例9进行特征鉴别。
保留时间：18.7分钟。
外观：中性、无色、固体物质，可溶于含氧有机溶剂，但是仅微溶于水和石油醚。
UV最大：在甲醇中为228nm。
利用高分辨率质谱FAB条件，观察到准分子离子(M+H)在473.3035amu，与经验式C25H46O6P相对应(理论值：473.3032)。ESI+模式的特征片断：249amu。
表9：在300K下，环波菌素T2在MeOD中的化学位移
| 1H | 13C | |
| 1 | - | 170.98(1.7Hz)a) |
| 2 | - | 114.40(3.1Hz)a) |
| 3 | 3.87 | 40.78 |
| 4 | 4.46/3.85 | 66.02 |
| 5 | 4.29/4.25 | 69.23(5.9Hz)a) |
| 6 | - | 164.69(8.7Hz)a) |
| 7 | 2.90/2.83 | 33.35(4.5Hz)a) |
| 8 | 1.65 | 20.63 |
| 9 | 0.98 | 13.84 |
| 1‘ | 4.24 | 71.57(6.9Hz)a) |
| 2‘ | 1.74 | 31.18(6.2Hz)a) |
| 3‘ | 1.42 | 26.42 |
| 4‘-11‘ | 1.37-1.25 | 31.03-30.11 |
| 12‘ | 1.29 | 28.52 |
| 13‘ | 1.17 | 40.25 |
| 14‘ | 1.52 | 29.15 |
| 15‘，16‘ | 0.87 | 23.03 |
a)13C/31P偶合常数如括号内所示。
实施例21
激素敏感性脂肪酶(HSL)的抑制作用
来自大鼠的激素敏感性脂肪酶受到下列浓度的抑制(IC50)，使用三油酰基甘油作为底物：
环波菌素A： 20nM
环波菌素N： 450nM
环波菌素P： 30nM
环波菌素P2： 40nM
环波菌素R： 10nM
环波菌素R2： 220nM
环波菌素S： 20nM
环波菌素T： 200nM
环波菌素T2： 60nM
Claims (9)
1、式I化合物
其中
R1是
1.0 -(CH2)15CH3，
2.0 -(CH2)13CH(CH3)2，
3.0 -(CH2)11CH(OH)(CH2)3CH3，
4.0 -(CH2)11CH(OH)CH2CH(CH3)2，
5.0 -(CH2)12CH(OH)(CH2)2CH3，
6.0 -(CH2)13CH(OH)CH2CH3，
7.0 -(CH2)14CH(OH)CH3，
8.0 -(CH2)15CH2(OH)，
9.0 -(CH2)16CH3，
10.0 -(CH2)13C＝OCH2CH3
11.0 -(CH2)12C＝OCH2CH2CH3
12.0 -(CH2)11C＝OCH2CH2CH2CH3
13.0 -(CH2)13CH3
14.0 -(CH2)11CH(CH3)2
15.0 -(CH2)14CH3 oder
16.0 -(CH2)12CH(CH3)2
R2是C1-C6-烷基，
E是磷(P)或硫(S)原子，
X1、X2和X3彼此独立地是-O-。
2、如权利要求1所要求保护的式I化合物或其生理学上可耐受的盐，其特征在于R2是-CH3、-CH2CH3或-CH2CH2CH3。
3、如权利要求1或2所要求保护的式I化合物或其生理学上可耐受的盐的制备方法，其特征在于它包含在适合的条件下，在培养基中发酵微生物链霉菌属菌株HAG 004107，DSM 13381或其变体或突变体之一，直至一种或多种式I化合物蓄积在培养基中，然后从培养基中分离它们，再可选地转化为化学等价物和生理学上可耐受的盐。
4、如权利要求3所述的方法，其特征在于发酵是在需氧条件下进行的，温度在18与35℃之间，pH在6与8之间。
5、权利要求1或2所要求保护的式I化合物或其生理学上可耐受的盐在制备用于抑制脂肪酶的药物中的应用。
6、权利要求1或2所要求保护的式I化合物或其生理学上可耐受的盐在制备用于治疗糖尿病的药物中的应用。
7、药物制剂，它含有至少一种权利要求1或2所要求保护的式I化合物或其生理学上可耐受的盐。
8、权利要求7所要求保护的药物制剂的制备方法，其特征在于它包含利用适合的赋形剂和/或载体将至少一种权利要求1或2所要求保护的式I化合物或其生理学上可耐受的盐制成适合的给药剂型。
9、链霉菌属菌株HAG 004107，DSM 13381。
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