ES2236234T3

ES2236234T3 - Ciclipostinas, procedimiento para su preparacion y su uso.

Info

Publication number: ES2236234T3
Application number: ES01936275T
Authority: ES
Inventors: Laszlo Vertesy; Klaus Ehrlich; Michael Kurz; Joachim Wink
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2000-05-04
Filing date: 2001-04-25
Publication date: 2005-07-16
Anticipated expiration: 2021-04-25
Also published as: PL358328A1; RU2266911C2; JP2003531914A; EE05090B1; CA2407808A1; HK1055745A1; CN1216890C; HUP0300306A3; IL152612A; JP5038572B2; HRP20020864A2; ZA200208928B; SK15602002A3; CN1427845A; BR0110459A; YU81502A; AU6222901A; CZ20023547A3; NZ522352A; EP1280812A1

Abstract

5 Compuesto de fórmula general I **(Fórmula)** en la que R 1 es 1. una cadena de carbono que tiene 10 a 18 átomos de carbono, que puede ser lineal, ramificada, saturada o insaturada, carbocíclica o heterocíclica y en la que la cadena de carbono está opcionalmente monosustituida o disustituida con: 1.1 -OH, 1.2 =O, 1.3 -O-alquilo-C1-C6, en donde el alquilo es lineal o ramificado, 1.4 -O-alquenilo-C2-C6, en donde el alquenilo es lineal o ramificado, 1.5 -alquilo-C1-C6, en donde el alquilo es lineal o ramificado, 1.6 -arilo, 1.7 -alquil-C1-C6-benceno, 1.8 -difenilo, 1.9 -NH-alquilo-C1-C6, en donde el alquilo es lineal o ramificado, 1.10 -NH-alquenilo-C2-C6, en donde el alquenilo es lineal o ramificado, 1.11 -NH2, 1.12 =S, 1.13 -S-alquilo-C1-C6, en donde el alquilo es lineal o ramificado, o 1.14 -S-alquenilo-C2-C6, en donde el alquenilo es lineal o ramificado, 1.15 halógeno, en donde los sustituyentes 1.1 a 1.15 pueden estar adicionalmente sustituidos; R 2 es 1.0 alquilo-C1-C6, en donde el alquilo no está sustituido o está monosustituido o disustituido como se ha descrito en 1.1 a 1.15, 2.0 alquenilo-C2-C6, en donde el alquenilo no está sustituido o está monosustituido o disustituido tal y como se ha descrito en 1.1 a 1.15, 3.0 alquinilo-C2-C6, en donde el alquinilo no está sustituido o está monosustituido o disustituido tal y como se ha descrito en 1.1 a 1.15, E es un átomo de fósforo (P) y X1, X2 y X3 son -O- independientemente uno de otro.

Description

Ciclipostinas, procedimiento para su preparación y su uso.

La invención se refiere a nuevos compuestos, denominados ciclipostinas, obtenibles por cultivo de la especie HAG 004107 (DSM 13381) de Streptomyces y a sus sales fisiológicamente tolerables y sus equivalentes químicos. La invención se refiere adicionalmente a un procedimiento para la preparación de las ciclipostinas, al microorganismo HAG 004107 (DSM 13381), al uso de las ciclipostinas y sus sales fisiológicamente tolerables y sus equivalentes químicos como fármacos, en particular como inhibidores de lipasas, y a preparaciones farmacéuticas que contienen ciclipostina o una sal o un equivalente de la misma, fisiológicamente tolerable.

Una enfermedad que se puede tratar de forma particularmente ventajosa con los inhibidores de la lipasa es la enfermedad del azúcar, diabetes mellitus. La diabetes mellitus es una enfermedad que se caracteriza por concentraciones elevadas de azúcar en sangre debido a trastornos metabólicos crónicos. Los trastornos metabólicos se basan en una deficiencia en insulina o en un efecto reducido de la insulina. La falta de efecto de la insulina conduce a que las células corporales realicen un uso defectuoso de la glucosa absorbida en la sangre. Por ello y debido a la neogénesis de glucosa a partir de proteínas (gluconeogénesis), se llega a un aumento del nivel de glucosa en sangre. Además, en el caso de un efecto disminuido de la insulina en el tejido adiposo, las hormonas antagonistas de la insulina, tales como el glucagón, conducen a un incremento de la lipolisis y de este modo a concentraciones elevadas de ácidos grasos en sangre. Tiene lugar cetoacidosis, es decir, la formación incrementada de cuerpos cetónicos (ácido acético, ácido \beta-hidroxibutírico, acetona). Bajo condiciones agudas, el grado de la mala regulación bioquímica es una amenaza de muerte y conduce, sin tratamiento, al coma diabético y finalmente a una muerte rápida. La diabetes pertenece a las enfermedades metabólicas crónicas más frecuentes en los seres humanos, se estima que hasta más del 3% de la población tiene una disposición diabética o prediabética y está por ello fuertemente amenazada.

Por ello existe una gran necesidad de medios para el tratamiento o la curación de la diabetes mellitus.

La diabetes se trata mediante la administración de insulina y en la diabetes de adulto, la denominada no dependiente de insulina (NIDDM) o de tipo II, se administran en primer lugar sulfonilureas. El principio activo de las sulfonilureas es una proliferación de la secreción de insulina de las células \beta en el páncreas para compensar de este modo la falta de hormona o la resistencia a insulina. Sin embargo, al avanzar la enfermedad se tiene que emplear insulina. El efecto de la insulina se puede resumir del modo siguiente. Esta hormona peptídica reduce la concentración de glucosa en sangre y conduce a un incremento de los procesos anabólicos y simultáneamente a una inhibición de los procesos catabólicos:

\bullet: Incrementa el transporte de glucosa en las células corporales,

\bullet: Incrementa la formación de glucógeno en el hígado y en los músculos,

\bullet: Inhibe la lipolisis,

\bullet: Incrementa la absorción de ácidos grasos en el tejido graso e

\bullet: Incrementa la absorción de aminoácidos en las células corporales y la síntesis de proteínas.

Uno de los efectos más fuertes de la insulina es la inhibición de la lipolisis. En el caso de diabéticos de tipo II, esta regulación de la lipolisis ya no es eficaz y tiene lugar un incremento del nivel de ácidos grasos libres en la sangre. Los ácidos grasos libres en la sangre estimulan la gluconeogénesis en el hígado y disminuyen el uso de glucosa en los músculos esqueléticos. Se controla la lipolisis, es decir, la liberación de ácidos grasos por la denominada lipasa sensible a hormonas (HSL), que se encuentra en los adipocitos y se inhibe con insulina mediante una cascada de fosforilaciones. Por ello serían deseables inhibidores, es decir, inhibidores de la HSL, que estimulen la acción de la insulina y sean capaces de disminuir el nivel de lípidos en sangre. Tales agentes son adecuados para el tratamiento de diabéticos de tipo II para controlar el metabolismo lipídico, pero también serían posibles aplicaciones en otras enfermedades del tipo glucogenosis. Por estas razones, se necesitan urgentemente nuevos inhibidores de la HSL y de otras lipasas y por ello se buscan.

Se ha encontrado sorprendentemente que la cepa del microorganismo HAG 004107, DSM 13381 de la especie Streptomyces, es capaz de formar nuevos inhibidores de lipasas altamente activos que inhiben la lipasa sensible a hormonas incluso con concentraciones muy reducidas. Los nuevos compuestos naturales son organofosfatos que constan de un sistema de anillo doble (biciclo) y una cadena de carbonos sustituida e inhiben específicamente las lipasas. La estructura de anillo ha sido descrita por primera vez -sólo con un grupo metilo en lugar de la cadena de carbono- como un inhibidor de la esterasa de acetilcolina, CGA 134 736, por R. Neumann & H. H. Peter en Experientia, Volumen 43, páginas 1235-1237, 1987 y después el mismo compuesto, denominado ciclofostina, por T. Kurokawa y col. en J. Antibiotics, 46, 1315-1318, 1993. Este compuesto relacionado estructuralmente no tiene propiedades selectivas de inhibición de lipasas. Las sustancias conocidas previamente tienen desventajas que se manifiestan en un nivel de acción insatisfactorio, alta toxicidad y/o efectos colaterales indeseados.

La presente invención se refiere por ello a compuestos de fórmula I

1

en la que

R^{1} es

1.: una cadena de carbono que tiene 10 a 18 átomos de carbono, que puede ser lineal, ramificada, saturada o insaturada, carbocíclica o heterocíclica y en la que la cadena de carbono está opcionalmente monosustituida o disustituida con:

1.1: -OH,

1.2: =O,

1.3: -O-alquilo-C_{1}-C_{6}, en donde el alquilo es lineal o ramificado,

1.4: -O-alquenilo-C_{2}-C_{6}, en donde el alquenilo es lineal o ramificado,

1.5: -alquilo-C_{1}-C_{6}, en donde el alquilo es lineal o ramificado,

1.6: -arilo,

1.7: -alquil-C_{1}-C_{6}-benceno,

1.8: -difenilo,

1.9: -NH-alquilo-C_{1}-C_{6}, en donde el alquilo es lineal o ramificado,

1.10: -NH-alquenilo-C_{2}-C_{6}, en donde el alquenilo es lineal o ramificado,

1.11: -NH_{2},

1.12: =S,

1.13: -S-alquilo-C_{1}-C_{6}, en donde el alquilo es lineal o ramificado, o

1.14: -S-alquenilo-C_{2}-C_{6}, en donde el alquenilo es lineal o ramificado,

1.15: halógeno, en donde los sustituyentes 1.1 a 1.15 pueden estar adicionalmente sustituidos;

R^{2} es

1: alquilo-C_{1}-C_{6}, en donde el alquilo no está sustituido o está monosustituido o disustituido como se ha descrito en 1.1 a 1.15,

2: alquenilo-C_{2}-C_{6}, en donde el alquenilo no está sustituido o está monosustituido o disustituido tal y como se ha descrito en 1.1 a 1.15, o

3: alquinilo-C_{2}-C_{6}, en donde el alquinilo no está sustituido o está monosustituido o disustituido tal y como se ha descrito en 1.1 a 1.15,

E es fósforo (P) y

X_{1}, X_{2} y X_{3} independientemente uno de otro, son

1: -O-,

en todas sus formas estereoquímicas y mezclas de estas formas en cualquier proporción y sus sales fisiológicamente tolerables.

R^{1} tiene una longitud de cadena de 10 a 18 átomos de C. La cadena puede estar saturada, p. ej., -alquilo, en donde el alquilo puede ser lineal o ramificado, o insaturada, p. ej., -alquenilo o -alquinilo, en donde el alquenilo o el alquinilo es lineal o ramificado. R_{1} puede estar no sustituido o estar de forma idéntica o diferente, monosustituido o disustituido con los grupos 1.1 a 1.15, tal y como se han descrito anteriormente. Se prefieren los sustituyentes en los átomos de carbono 8' a 16', y las posiciones 10' a 14' son especialmente preferidas. Los sustituyentes 1.1 a 1.15 también pueden estar adicionalmente sustituidos por uno o varios grupos seleccionados entre: alcohol, aldehído, acetal, cetal, éter, carboxilo, éster, amino, nitrilo, nitro, oxima, éter de oxima y halógeno.

Una cadena de carbonos carbocíclicos con 10 a 18 átomos de C es una cadena que consta de 10 a 18 átomos de C, con uno o con varios sistemas de anillos, preferentemente con uno, dos o tres sistemas de anillos que, en cada caso, constan preferentemente de 4, 5, 6 o 7 átomos de carbono. Los anillos pueden ser monocíclicos, dicíclicos o tricíclicos, preferentemente monocíclicos y estar situados en el comienzo, en el centro y/o al final de la cadena de carbono. Los carbociclos pueden ser de naturaleza alifática o aromática. Ejemplos son: difenilos o alquilbencenos sustituidos.

Una cadena de carbonos heterocíclica con 10 a 18 átomos de carbono es una cadena que consta de 10 a 18 átomos de carbono que tiene uno o varios, preferentemente uno a tres sistemas de anillos en los que al menos un átomo de carbono está sustituido por heteroátomos, tales como O, S o N. Los anillos pueden ser mono, di o tricíclicos, preferentemente monocíclicos y estar situados en el comienzo, en el centro y/o al final de la cadena de carbonos. Pueden ser preferentemente anillos de 4-, 5-, 6- o 7-miembros de naturaleza alifática o aromática. Ejemplos son: alquilpiperidinas que están sustituidas o no sustituidas.

Halógeno es cloruro, bromuro, fluoruro o seudohaluros, tales como cianuro (nitrilo).

Alquilo-C_{1}-C_{6} es un alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1, 2, 3, 4, 5 o 6 átomos de C, como por ejemplo, metilo, etilo, i-propilo, terc-butilo y hexilo.

Alquenilo-C_{2}-C_{6} es un alquenilo de cadena lineal o ramificada que tiene 2, 3, 4, 5 o 6 átomos de C, tales como por ejemplo, alilo, crotilo y pentenilo.

Alquinilo-C_{2}-C_{6} es un alquinilo de cadena lineal o ramificada que tiene 2, 3, 4, 5 o 6 átomos de C, como por ejemplo, propinilo, butinilo y pentinilo.

R^{1} es preferentemente

1: -(CH_{2})_{15}CH_{3},

2: -(CH_{2})_{13}CH(CH_{3})_{2},

3: -(CH_{2})_{11}CH(OH)(CH_{2})_{3}CH_{3},

4: -(CH_{2})_{11}CH(OH)CH_{2}CH(CH_{3})_{2},

5: -(CH_{2})_{12}CH(OH)(CH_{2})_{2}CH_{3},

6: -(CH_{2})_{13}CH(OH)CH_{2}CH_{3},

7: -(CH_{2})_{14}CH(OH)CH_{3},

8: -(CH_{2})_{15}CH_{2}(OH),

9: -(CH_{2})_{16}CH_{3}, o

10.0: -(CH_{2})_{13}C=OCH_{2}CH_{3}

11.0: -(CH_{2})_{12}C=OCH_{2}CH_{2}CH_{3}

12.0: -(CH_{2})_{11}C=OCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}

13.0: -(CH_{2})_{13}CH_{3}

14.0: -(CH_{2})_{11}CH(CH_{3})_{2}

15.0: -(CH_{2})_{14}CH_{3} o

16.0: -(CH_{2})_{12}CH(CH_{3})_{2}

R^{2} es preferentemente alquilo-C_{1}-C_{6}, en particular, metilo, etilo o propilo.

Compuestos preferidos de la invención se indican a continuación:

Ciclipostina A de fórmula II:

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

Ciclipostina A 2 de fórmula II A:

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

Ciclipostina B de fórmula III:

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

Ciclipostina C de fórmula IV:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

Ciclipostina D de fórmula V:

6

\newpage

Ciclipostina E de fórmula VI:

7

Ciclipostina F de fórmula VII:

8

Ciclipostina G de fórmula VIII:

9

Ciclipostina H de fórmula IX:

10

Ciclipostina N de fórmula X:

11

Ciclipostina P de fórmula XI:

12

Ciclipostina P 2 de fórmula XI A:

13

Ciclipostina Q de fórmula XII:

14

Ciclipostina R de fórmula XIII:

15

Ciclipostina R2 de fórmula XIIIA:

16

Ciclipostina S de fórmula XIV:

17

Ciclipostina T de fórmula XV:

18

Ciclipostina T2 de fórmula XV A:

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

en todas sus formas estereoquímicas y mezclas de estas formas en cualquier proporción, así como sus sales fisiológicamente tolerables.

La forma de contar los átomos de carbono para los espectros de RMN en las fórmulas mencionadas anteriormente es:

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

Sólo el sistema de anillo ya contiene dos átomos asimétricamente sustituidos, los átomos de carbono 3 y el átomo de fósforo. Ambos átomos pueden estar presentes en la configuración R o la S. Se ha encontrado sorprendentemente que la cepa HAG 004107, DSM 13381 de la especie Streptomyces es capaz en cada caso de formar una cantidad de estereoisómeros de los compuestos de fórmula general I, es decir, la cepa sintetiza compuestos en los que los átomos C3 y P pueden asumir, independientemente uno de otro, la configuración R o la S. Los isómeros que tienen la forma espacial sobre el carbono(3) en la configuración R y sobre el fósforo en la configuración S, aparecen en menor cantidad en cultivos de la especie HAG 004107, DSM 13381 de Streptomyces. Fórmula I A:

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

Además, sin embargo, las ciclipostinas que tienen otras configuraciones, tales como (R,R), (S,S) o (S,R) también se forman, lo que también tiene sorprendentemente unos efectos considerables de inhibición de lipasas.

El compuesto de fórmula I o una sal o un equivalente químico fisiológicamente tolerable del mismo, se puede preparar por fermentación del microorganismo HAG 004107, DSM 13381 de la especie Streptomyces o una de sus variantes o mutantes bajo condiciones adecuadas, en un medio de cultivo, hasta que uno o varios compuestos de fórmula general I se acumulan en el medio de cultivo y a continuación se pueden aislar del medio de cultivo y convertir opcionalmente en equivalentes químicos y sales fisiológicamente tolerables.

Las ciclipostinas de acuerdo con la invención se pueden producir a través de la especie Actinomycetales, preferentemente con la especie de Streptomyces HAG 004107, DSM 13381. HAG 004107, DSM 13381 de la especie Streptomyces tiene un micelio de color marfil (RAL 1014) y se caracteriza por los conidióforos característicos de los estreptomicetos.

Se depositó un aislado en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D 38124 Braunschweig, Alemania, según las normas del Tratado de Budapest, el 16 de marzo, 2000, con el siguiente número: especie Streptomyces HAG 004107, DSM 13381.

En lugar de la cepa HAG 004107, DSM 13381 de la especie Streptomyces, también se pueden emplear sus mutantes y variantes que sintetizan uno o varios compuestos de las ciclipostinas de acuerdo con la invención. Tales mutantes se pueden producir de forma conocida por sí misma mediante medios físicos, por ejemplo radiación, tal como ultravioleta o rayos X, o mutágenos químicos, tales como metanosulfonato de etilo (EMS), 2-hidroxi-4-metoxi-benzofenona (MOB) o N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG).

La invención se refiere, por tanto, a un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula I o una sal fisiológicamente tolerable del mismo, caracterizado porque comprende fermentar el microorganismo HAG 004107, DSM 13381 de la especie Streptomyces o una de sus variantes o mutantes bajo condiciones adecuadas en un medio de cultivo, hasta que se acumulen uno o varios compuestos de fórmula general I en el medio de cultivo y a continuación aislarlos del medio de cultivo y convertirlos opcionalmente en equivalentes químicos y sales fisiológicamente tolerables.

Preferentemente, la cepa HAG 004107, DSM 13381 de la especie Streptomyces, sus mutantes y/o variantes se fermentan en una solución nutritiva (también denominada medio de cultivo) con una fuente de carbono y de nitrógeno y las sales inorgánicas acostumbradas, hasta que las nuevas ciclipostinas se acumulan en el medio de cultivo, a continuación se aislan las ciclipostinas del medio de cultivo y opcionalmente se separan en los componentes activos individuales.

La fermentación tiene lugar preferentemente bajo condiciones aerobias, se desarrolla particularmente bien a una temperatura entre 18 y 35ºC y a un pH entre 6 y 8.

El procedimiento de acuerdo con la invención se puede emplear para la fermentación a escala de laboratorio (intervalo de mililitros hasta litros) y para la escala industrial (escala de metros cúbicos). Todos los porcentajes se refieren, si no se indica de otro modo, al peso. Las proporciones de mezcla en el caso de líquidos se refieren al volumen, si no se proporcionan otros datos.

Se prefieren como fuentes de carbono adecuadas para la fermentación aerobia, los carbohidratos asimilables y los polioles, tales como glucosa, lactosa, sacarosa o D-manitol, y los productos naturales que contienen carbohidratos, tales como copos de avena, harina de soja y extracto de malta. Como posibles nutrientes que contienen nitrógeno se consideran: los aminoácidos, los péptidos y las proteínas, y sus productos de degradación, tales como peptonas o triptonas, además, extractos de carne, extractos de levadura, semillas molidas, por ejemplo de maíz, trigo, judías, soja o la planta del algodón, residuos de la destilación de la producción de alcohol, harinas de carne o extractos de levadura, pero también sales de amonio y nitratos. Las sales inorgánicas que puede contener la solución nutritiva son, por ejemplo, cloruros, carbonatos, sulfatos o fosfatos de metales alcalinos o alcalinotérreos, hierro, zinc, cobalto y manganeso.

La formación de las ciclipostinas de fórmula II a XV A de acuerdo con la invención, tiene lugar particularmente bien en un medio de cultivo que contiene aproximadamente 0,1 a 5%, preferentemente 0,3 a 3% de copos de avena y elementos traza. Los datos en tantos por ciento se refieren en cada caso al peso de todo el medio de cultivo.

La formación preferida de ciclipostinas de fórmula VIII a XV A se puede realizar particularmente bien en soluciones nutritivas que contienen aproximadamente 0,1 a 5%, preferentemente 0,3 a 2% de glicerol y 0,2 a 5%, preferentemente 0,5 a 3% de harina de soja y 0,05 a 1,0 g/l, preferentemente 0,1 a 1,0 g/l de cloruro sódico.

En el medio de cultivo, la especie de Streptomyces HAG 004107, DSM 13381 forma una mezcla de ciclipostinas. Dependiendo de la composición del medio de cultivo, puede variar la proporción cuantitativa de una o de varias de las ciclipostinas de acuerdo con la invención. Además, es posible mediante la composición de los medios, controlar la síntesis de las ciclipostinas individuales de modo que una o también varias ciclipostinas no se preparen en absoluto o se preparen en una cantidad inferior al límite de detección del microorganismo.

Preferentemente, el cultivo contiene una ciclipostina detectable. Se forman preferentemente las ciclipostinas A o P o P 2.

Además de las ciclipostinas A hasta T2 (compuestos de fórmula II a XV A) se forman otros compuestos relacionados en el medio de cultivo de la especie de Streptomyces HAG 004107, DSM 13381 que difieren de los compuestos mostrados en las fórmulas II a XV A en los restos modificados R^{1} y R^{2}. Se han encontrado en cantidades menores ciclipostinas que tienen restos R^{1} truncados y ramificados adicionalmente. También son detectables productos de oxidación (hidroxilación) de estos componentes secundarios, en cultivos de Streptomyces HAG 004107, DSM 13381.

El cultivo del microorganismo se realiza de forma aerobia, es decir, por ejemplo, sumergido con sacudidas o en frascos de agitación o fermentadores, si es adecuado, con introducción de aire o de oxígeno. Se puede realizar en un intervalo de temperatura desde aproximadamente 18 hasta 35ºC, preferentemente a aproximadamente 25 a 32ºC, especialmente de 26 hasta 30ºC. El intervalo de pH debe estar entre 6 y 8, preferentemente entre 6,5 y 7,8. Los microorganismos se cultivan con estas condiciones en general durante un periodo de 24 a 300 horas, preferentemente 30 a 90 horas.

De forma ventajosa el cultivo se realiza en una variedad de etapas, es decir, primero se preparan uno o varios precultivos en un medio de cultivo líquido, que a continuación se inoculan en el medio de producción real, el cultivo principal, por ejemplo, en una proporción en volumen de 1:10. El precultivo se obtiene, por ejemplo, inoculando un micelio en una solución nutritiva y permitiéndole crecer durante aproximadamente 36 a 120 horas, preferentemente 48 a 96 horas. El micelio se puede obtener por ejemplo, dejando crecer la cepa durante aproximadamente 3 a 40 días, preferentemente 4 a 10 días, sobre un medio nutritivo sólido o líquido, por ejemplo, maíz-levadura-agar o copos de avena-agar.

El curso de la fermentación se puede vigilar mediante el valor del pH de los cultivos o el volumen de micelio y por métodos cromatográficos, tales como cromatografía en capa fina o cromatografía de líquidos a alta presión o sometiendo a ensayo la actividad biológica. Las ciclipostinas de acuerdo con la invención están presentes en el micelio y en una parte menor también en el material filtrado del cultivo. El procedimiento de aislamiento descrito a continuación sirve para la purificación de las ciclipostinas de acuerdo con la invención, preferentemente para la purificación de las ciclipostinas A y P.

El aislamiento y/o la purificación de las ciclipostinas de acuerdo con la invención, a partir del medio de cultivo se realiza según métodos conocidos, teniendo en cuenta las propiedades químicas, físicas y biológicas de las sustancias naturales. Para someter a ensayo la concentración de ciclipostina en el medio de cultivo o en las etapas individuales del aislamiento, se puede utilizar la cromatografía en capa fina, por ejemplo, sobre gel de sílice empleando cloruro de metileno/acetato de etilo o cloroformo/mezclas de metanol (p. ej., en la proporción relativa 98:1) como eluyente o HPLC. La detección en el caso de la separación por cromatografía en capa fina se puede realizar, por ejemplo, mediante reactivos de color, tales como molibdato de ácido fosfórico o vapor de I_{2}, comparándose la cantidad de sustancia formada convenientemente con una solución de calibración.

Para aislar las ciclipostinas de acuerdo con la invención, se separa en primer lugar el micelio del medio de cultivo, de acuerdo con los procedimientos convencionales y a continuación se extraen las ciclipostinas de la masa celular empleando un disolvente orgánico que es opcionalmente miscible en agua. La fase del disolvente orgánico contiene las ciclipostinas de acuerdo con la invención, opcionalmente se concentran a vacío y se purifican adicionalmente tal y como se describe a continuación.

El material filtrado del cultivo se combina opcionalmente con el material concentrado del extracto de micelio y con un disolvente orgánico adecuado, no miscible en agua, por ejemplo, con n-butanol o acetato de etilo. La fase orgánica separada a continuación se concentra opcionalmente a vacío y se disuelve en 1/30 del volumen original de agua/metanol.

La purificación adicional de una o de varias de las ciclipostinas de acuerdo con la invención, se realiza por cromatografía sobre materiales adecuados, preferentemente, por ejemplo, sobre tamices moleculares, soportes de fase normal, tales como gel de sílice, alúmina, sobre intercambiadores iónicos o sobre resinas de adsorción o sobre fases inversas (fase inversa, RP). Con ayuda de estos procedimientos cromatográficos se separan las ciclipostinas. La cromatografía de las ciclipostinas tiene lugar empleando disolventes orgánicos o empleando mezclas de soluciones acuosas y orgánicas.

Mezclas de soluciones acuosas u orgánicas significan todos los disolventes orgánicos miscibles en agua, preferentemente metanol, propanol y acetonitrilo, en una concentración de 10 a 100% de disolvente, preferentemente 60 a 90% de disolvente o, alternativamente, todas las soluciones acuosas tamponadas que son miscibles con disolventes orgánicos. Los tampones que se pueden utilizar son los mismos que se han indicado anteriormente.

La separación de las ciclipostinas basándose en su diferente polaridad se realiza con ayuda de la cromatografía en fase inversa, por ejemplo sobre una MCI® (resina adsorbente de Mitsubishi, Japón) o Amberlite XAD® (TOSOHAAS), sobre otros materiales hidrófobos, tales como fases de RP-8- o RP-18. Además, la separación puede realizarse con ayuda de cromatografía en fase normal, por ejemplo, sobre gel de sílice, alúmina y similares.

La cromatografía de las ciclipostinas tiene lugar empleando soluciones acuosas tamponadas o acidificadas o mezclas de soluciones acuosas con alcoholes u otros disolventes orgánicos miscibles con agua. El disolvente orgánico empleado es preferentemente propanol y acetonitrilo.

Soluciones acuosas tamponadas o acidificadas significan, por ejemplo, agua, tampón fosfato, acetato de amonio, tampón citrato en una concentración de 1 mM a 0,5 M y ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético o todos los ácidos disponibles comercialmente conocidos por la persona experta en la técnica, preferentemente en una concentración de 0,01 a 3%, en particular 0,1%.

La cromatografía se realiza empleando un gradiente que comienza con 100% de tampón acuoso y termina con 100% de disolvente, preferentemente se usa un gradiente lineal de 50 a 100% de 2-propanol o acetonitrilo.

Alternativamente, se puede utilizar también cromatografía en gel o cromatografía sobre fases hidrófobas.

La cromatografía en gel se realiza sobre geles de poliacrilamida o de polímeros mezclados, tales como p. ej., Biogel-P 2® (de Biorad), Fractogel TSK HW 40® (de Merck, Alemania o Toso Haas, EE.UU.) o sobre Sephadex® (de Pharmacia, Uppsala, Suecia).

La secuencia de las cromatografías mencionadas anteriormente es reversible.

Otra etapa de purificación muy eficaz para las ciclipostinas es la cristalización. Las ciclipostinas cristalizan en soluciones de disolventes orgánicos y en mezclas de agua con disolventes orgánicos. La cristalización tiene lugar de una forma conocida por sí misma, por ejemplo por concentración o enfriamiento de soluciones de ciclipostinas saturadas.

Las ciclipostinas de acuerdo con la invención son estables en estado sólido o líquido y en soluciones con un intervalo de pH entre 4 y 8, en particular 5 y 7 y se pueden incorporar de este modo en preparaciones farmacéuticas ordinarias.

Los ésteres, los derivados de ésteres, los productos de la oxidación, la hidrogenación y la reducción se pueden preparar de acuerdo con los procedimientos descritos en la bibliografía, p. ej., en Advanced Organic Synthesis, 4ª Edición, J. March, John Wiley & Sons., 1992.

La presente invención incluye todas las formas estereoisómeras de los compuestos de fórmula I a XV A. Los centros asimétricos contenidos en los compuestos de fórmula I a XV A pueden tener todos, independientemente unos de otros, la configuración S o la configuración R. La invención incluye todos los enantiómeros y diastereómeros posibles, así como las mezclas de dos o más formas estereoisómeras, por ejemplo, mezclas de enantiómeros y/o diastereómeros, en todas las proporciones. La invención se refiere, además, a enantiómeros en forma enantioméricamente pura, tanto las antípodas levogiratorias como dextrogiratorias, las configuraciones R y S, en forma de racematos y en forma de mezclas de los dos enantiómeros en todas las proporciones que son objeto de la invención. En presencia de isomerismo cis/trans, la invención se refiere a la forma cis y a la forma trans y a mezclas de estas formas en todas las proporciones.

Basándose en sus valiosas propiedades farmacológicas, los compuestos de acuerdo con la invención son adecuados para uso como fármacos en la medicina humana y veterinaria. Inhiben lipasas y tienen propiedades favorables para el tratamiento de alteraciones metabólicas que tienen su causa en la alteración del metabolismo lipídico. Los compuestos de fórmula general I de acuerdo con la invención tienen una acción inhibidora sorprendente sobre la lipasa sensible a hormonas, HSL, una enzima alostérica en adipocitos que se inhibe con insulina y que es responsable de la destrucción de grasas en los adipocitos y, por tanto, de la transferencia de constituyentes grasos a la corriente sanguínea. Una inhibición de esta enzima se corresponde, por tanto, con una acción similar a la insulina de los compuestos de acuerdo con la invención, que conduce finalmente a una disminución de los ácidos grasos libres en la sangre y del azúcar en la sangre. Por ello, se pueden emplear también en disfunciones del metabolismo, tales como diabetes mellitus no dependiente de insulina, el síndrome diabético y en lesiones directas del páncreas.

La invención se refiere, por tanto, a preparaciones farmacéuticas que contienen una o varias ciclipostinas de acuerdo con la invención y/o sus equivalentes químicos. Se prefiere el uso de una mezcla con excipientes o material de soporte adecuados. Los materiales de soporte que se pueden emplear en los seres humanos son todos los materiales de soporte y/o excipientes farmacológicamente tolerables.

La invención se refiere adicionalmente a un procedimiento para la preparación de un fármaco de acuerdo con la invención, que se caracteriza porque comprende proporcionar al menos uno de los compuestos de acuerdo con la invención con una forma de administración adecuada, empleando un vehículo farmacéuticamente adecuado y fisiológicamente tolerable, si es adecuado, otros compuestos activos, aditivos o excipientes adecuados.

Los fármacos de acuerdo con la invención se administran generalmente por vía oral, local o parenteral, pero también es posible en principio una administración por vía rectal. Las formas de preparación farmacéutica sólidas o líquidas son, por ejemplo, gránulos, polvos, comprimidos, grageas, (micro-)cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, aerosoles, gotas o soluciones inyectables en forma de ampolla, así como preparaciones que tiene liberación retardada del compuesto activo, en cuya preparación se emplean normalmente vehículos y aditivos y/o excipientes tales como agentes disgregantes, agentes aglutinantes, agentes de revestimiento, agentes de hinchamiento, agentes lubricantes, agentes saboreantes, edulcorantes o solubilizantes. Los vehículos o excipientes empleados frecuentemente que se pueden mencionar son, por ejemplo, carbonato de magnesio, dióxido de titanio, lactosa, manitol y otros azúcares, talco, lactoproteína, gelatina, almidón, vitaminas, celulosa y sus derivados, aceites animales o vegetales, polietilenglicoles y disolventes, tales como agua esterilizada, alcoholes, glicerol y alcoholes polihídricos.

Si es adecuado, las unidades de dosificación se pueden microencapsular para la administración oral, para retardar la liberación o para extenderla durante un periodo de tiempo más largo, tal como revistiendo o embebiendo el compuesto activo en forma de partículas en polímeros adecuados, ceras o similares.

Preferentemente, las preparaciones farmacéuticas se preparan y se administran en dosis unitarias, conteniendo cada unidad una dosis específica de uno o varios compuestos de las ciclipostinas de acuerdo con la invención y/o derivados químicos de las mismas. En el caso de unidades de dosificación sólidas, tales como comprimidos, cápsulas y supositorios, esta dosis puede ser de hasta aproximadamente 200 mg, pero con preferencia aproximadamente 0,1 a 100 mg, y en el caso de soluciones inyectables en forma de ampolla hasta aproximadamente 200 mg, pero con preferencia aproximadamente hasta 0,1 a 100 mg, al día.

La dosis diaria que se va a administrar depende del peso corporal, de la edad, del sexo y del estado del mamífero. En ciertas circunstancias, sin embargo, pueden ser adecuadas dosis diarias mayores o menores. La administración de la dosis diaria se puede realizar mediante una administración aislada en forma de una unidad de dosificación individual o en forma de diversas unidades de dosificación menores o por la administración repetida de dosis subdivididas a intervalos específicos. La invención se refiere también a preparaciones farmacéuticas que contienen una o varias de las ciclipostinas de acuerdo con la invención y/o sus derivados químicos. Se prefiere el uso de una mezcla con excipientes o material de soporte adecuados. Como material de soporte en humanos se puede utilizar todos los materiales de soporte o excipientes farmacológicamente aceptables.

El efecto de los compuestos de fórmula I de acuerdo con la invención se sometió a ensayo con el siguiente sistema de ensayo enzimático:

Preparación de las enzimas Preparación de HSL parcialmente purificada

Lipocitos aislados de rata se obtienen a partir de tejido graso del epidídimo de ratas macho no tratadas (Wistar, 220-250 g) mediante tratamiento con colagenasa, según los procedimientos publicados (p. ej., S. Nilsson y col., Anal. Biochem. 158, 1986, 399 - 407; G. Fredrikson y col., J. Biol. Chem. 256, 1981, 6311 - 6320; H. Tomquist y col., J. Biol. Chem. 251, 1976, 813 - 819). Los lipocitos de 10 ratas se lavan tres veces por flotación con 50 ml de tampón de homogeneización en cada lavado (25 ml de Tris/HCI, pH 7,4, sacarosa 0,25 M, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, 10 \mug/ml de leupeptina, 10 \mug/ml de antipaína, 20 \mug/ml de pepstatina) y finalmente se toman en 10 ml de tampón de homogeneización. Los lipocitos se homogeneizan en un homogeneizador de Teflón-en-vidrio (Braun-Melsungen) mediante 10 recorridos a 1500 rpm y 15ºC. El material homogeneizado se centrifuga (Sorvall tubos SM24, 5000 rpm, 10 min, 4ºC). La capa inferior entre la capa grasa superior y el sedimento se retira y se repite la centrifugación. La capa inferior resultante de esto, se centrifuga de nuevo (Sorvall tubos SM24, 20000 rpm, 45 min, 4ºC). La capa inferior se retira y se trata con 1 g de heparina-Sepharosa (Pharmacia-Bíotech, CL-6B, se lava 5 x con Tris/HCl 25 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM). Después de incubar durante 60 min a 4ºC (sacudir a intervalos de 15 min), se centrifuga la carga (Sorvall tubos SM24, 3000 rpm, 10 min, 4ºC). El material sobrenadante se lleva a pH 5,2 añadiendo ácido acético y se incuba a 4ºC durante 30 min. El material precipitado se recoge por centrifugación (Sorvall SS34, 12000 rpm, 10 min, 4ºC) y se suspende en 2,5 ml de Tris/HCl 20 mM, pH 7,0, EDTA 1 mM, NaCl 65 mM, 13% de sacarosa, DTT 1 mM, 10 \mug/ml de leupeptina/pepstatina/antipaína. La suspensión se dializa durante una noche a 4ºC contra Tris/HCl 25 mM, pH 7,4, 50% de glicerol, DTT 1 mM, 10 \mug/ml de leupeptina, pepstatina, antipaína y a continuación se aplica a una columna de hidroxiapatito (0,1 g por 1 ml de suspensión, equilibrada con fosfato potásico 10 mM, pH 7,0, 30% de glicerol, DTT 1 mM). La columna se lava con cuatro volúmenes de tampón de equilibrio con un caudal de 20 a 30 ml/h. La HSL se eluye con un volumen de tampón de equilibrio que contiene fosfato potásico 0,5 M, a continuación se dializa (véase arriba) y se concentra 5 a 10 veces por ultrafiltración (Amicon Diaflo filtro PM 10) a 4ºC. La HSL parcialmente purificada se puede almacenar a -70ºC durante 4 a 6 semanas.

Ensayo

Para la preparación del sustrato, se mezclaron 25-50 \muCi de [^{3}H]trioleoilglicerol (en tolueno), 6,8 \muMol de trioleoilglicerol sin marcar y 0,6 mg de fosfolípidos (fosfatidilcolina/fosfatidilinositol 3:1 p/v), se secó sobre N_{2} y después se aplicó a 2 ml de KP_{i} 0,1 M; (pH 7,0) mediante tratamiento con ultrasonidos (Branson 250, micropuntas, ajustada a 1-2, 2 x 1 min en intervalos de 1 minuto). Después de añadir 1 ml de KP_{i} y un nuevo tratamiento con ultrasonidos (4 x 30 s sobre hielo en intervalos de 30 s), se añade 1 ml de 20% de BSA (seroalbúmina de ternera) (en KP_{i}) (concentración final de trioleoilglicerol 1,7 mM). Para la reacción se pipetean 100 \mul de solución del sustrato a 100 \mul de solución de HSL (HSL preparada como arriba, diluida en KP_{i} 20 mM, pH 7,0, EDTA 0, 1 mM, DTT 1 mM, 0,02% de BSA, 20 \mug/ml de pepstatina, 10 \mug/ml de leupeptina) y se incuba durante 30 min a 37ºC. Después de añadir 3,25 ml de metanol/cloroformo/heptano (10:9:7) y de 1,05 ml de K_{2}CO_{3} 0,1 M, ácido bórico 0,1 M (pH 10.5), se mezcla a fondo la carga y finalmente se centrifuga (800 x g, 20 min). Después de la separación de fases, se retira un equivalente de la fase superior (1 ml) y se determina la radiactividad por medición del centelleo líqui-
do.

Evaluación

Las sustancias se someten a ensayo normalmente en cuatro cargas independientes. La inhibición de la actividad enzimática de la HSL con una sustancia del ensayo se determina por comparación con una reacción testigo no inhibida. El cálculo del valor de la IC_{50} tiene lugar mediante una curva de inhibición, empleando al menos 10 concentraciones de la sustancia del ensayo. Para el análisis de los datos se emplea el paquete de programas GRAPHIT, Elsevier-BIOSOFT. En este ensayo, los compuestos mostraban el siguiente efecto: Las ciclipostinas A, P, P2 y R inhiben la lipolisis en adipocitos de ratas con IC_{50} = \sim 0,2 \muM, inhiben la lipasa humana sensible a hormonas (HSL) con trioleilglicerol como sustrato: IC_{50} = \sim 0,07 hasta 0,5 \muM. Con NBD (4-cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol) como sustrato, se inhibe la HSL de ratas en concentraciones de 4 nM a 10 nM.

Las ciclipostinas inhiben tanto la lipasa sensible a hormonas (HSL) como la monoacilglicerol-lipasa del extracto de ratas en concentraciones submicromolares.

La invención se ilustra adicionalmente en los siguientes ejemplos. Los porcentajes se refieren al peso. Las proporciones de las mezclas en el caso de líquidos se refieren al volumen, si no se indican otros datos.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de un cultivo de glicerol de la especie de Streptomyces HAG 004107, DSM 13381

100 ml de solución nutritiva (2% de extracto de malta, 0,2% de extracto de levadura, 1,0% de glucosa, 0,05% de (NH_{4})_{2}HPO_{4}, pH 6,0) en un matraz Erlenmeyer estéril de 300 ml se inoculan con la cepa de la especie de Streptomyces HAG 004107, DSM 13381 y se incuba en un agitador giratorio a 28ºC y 180 rpm durante 7 días. A continuación se diluyen 1,5 ml de este cultivo con 1,5 ml de glicerol al 99% y se almacena a -20ºC.

Ejemplo 2 Preparación de un precultivo en un matraz Erlenmeyer de la especie de Streptomyces HAG 004107, DSM 13381

Un matraz Erlenmeyer estéril de 300 ml que contiene 100 ml de la siguiente solución nutritiva: 15 g/l de glucosa, 15 g/l de harina de soja, 5 g/l de líquido de maceración de maíz, 2 g/l de CaCO_{3} y 5 g/l de NaCl se inocula con un cultivo que ha crecido en un tubo inclinado (misma solución nutritiva, pero con 2% de agar) o con 1 ml de un cultivo de glicerol (véase Ejemplo 1) y se incuba a 180 rpm y 28ºC en un agitador. Un cultivo sumergido de 48 a 96 horas (cantidad de inoculación aproximadamente 10%) de la misma solución nutritiva es suficiente para inocular fermentadores de 10 y 200 l.

Ejemplo 3 Preparación de un cultivo en matraces Erlenmeyer de la especie de Streptomyces HAG 004107, DSM 13381

Matraces Erlenmeyer estériles de 300 ml que contienen la siguiente solución nutritiva:

	20 g/l de copos de avena para perros
	2,5 ml de solución de elementos traza

se inoculan con una cantidad de 10% de inoculación del precultivo (Ejemplo 2) y se incuban a 180 rpm y 28ºC en un agitador. El cultivo se puede utilizar después de dos días para obtener las ciclipostinas o para inocular fermentadores. La solución de elementos traza tiene la siguiente composición:

3 g/l de CaCl_{2} x 2H_{2}O
	1 g/l de citrato de Fe(III);
	0,2 g/l de MnSO_{4} x H_{2}O;
	0,1 g/l de ZnCl_{2};
	0,025 g/l de CuSO_{4} x 5H_{2}O,
	0,02 g/l de tetraborato sódico
	0,004 g/l de CoCl_{2} x 6H_{2}O
	0,01 g/l de molibdato sódico.

Ejemplo 4 Preparación de las ciclipostinas de las fórmulas II a IX

Un fermentador de 200 l funciona con 90 litros de solución nutritiva bajo las siguientes condiciones:

Medio nutritivo:	20 g/l de copos de avena en agua;
	2,5 ml/l de elementos traza.
	pH 7,8 (antes de la esterilización)

La solución nutritiva se esteriliza con calor durante 30 minutos y, después de enfriar, se inocula 5% del volumen con material de inoculación obtenido según el Ejemplo 3.

\newpage

Solución de elementos traza:	3 g/l de CaCl_{2} x 2H_{2}O
	1 g/l de citrato de Fe(III);
	0,2 g/l de MnSO_{4} x H_{2}O;
	0,1 g/l de ZnCl_{2};
	0,025 g/l de CuSO_{4} X 5H_{2}O,
	0,02 g/l de tetraborato sódico
	0,004 g/l de CoCl_{2} x 6H_{2}O
	0,01 g/l de molibdato sódico.
Duración del proceso:	72 horas
Temperatura de incubación:	28ºC
Velocidad de agitación:	90 rpm
Aireación:	6 m^{3} de aire por hora.

La fermentación se realiza sin añadir antiespumante. La producción máxima se alcanza después de aproximadamente 40 a 76 horas.

Ejemplo 5 Preparación de las ciclipostinas X a XV A

Un fermentador de 200 l funciona con las siguientes condiciones con un llenado de 100 l:

Medio nutritivo:	5 g/l de glucosa;
	20 g/l de glicerol;
	20 g/l de harina de soja;
	5 g/l de extracto de levadura;
	3 g/l de NaCl;
	2,5 ml/l de solución de elementos traza
	pH 7,0 (antes de la esterilización)
Duración del proceso:	72 horas,
Temperatura de incubación:	27ºC,
Velocidad de agitación:	65 rpm,
Aireación:	6 m^{3} de aire por hora,

La fermentación se realiza sin añadir agentes que eviten la formación de espuma. La producción máxima se alcanza después de aproximadamente 48 horas.

Ejemplo 6 Aislamiento de la mezcla de ciclipostinas a partir de la solución del cultivo de la especie de Streptomyces HAG 004107, DSM 13381

Después de completar la fermentación de la especie de Streptomyces HAG 004107, DSM 13381, se filtran 100 litros de caldo de cultivo del fermentador, obtenido según el Ejemplo 4, con adición de aproximadamente 2% de materias filtrantes (p. ej. Celite®) y la masa celular (10 litros) se extrae con 40 litros de metanol. La solución que contiene el compuesto activo, solución metanólica, se libera del micelio por filtración y concentración a vacío. El material concentrado se aplica a una columna preparada ®MCI GEL, CHP20P de 7 litros. La elución se realiza empleando un gradiente de agua a propanol-2. El caudal de la columna (20 litros por hora) se recoge en fracciones (10 litros cada una) y las fracciones que contienen ciclipostinas (19 a 21) se concentran en cada caso a vacío. Las fracciones se analizan mediante HPLC (véase el Ejemplo 7). La fracción 19 comprende las ciclipostinas A hasta E y sus isómeros, la fracción 20 la ciclipostina F y sus isómeros, la fracción 21 los inhibidores ciclipostina N, P, P 2, Q, R, S y T así como sus isómeros.

Ejemplo 7 Análisis con HPLC de las ciclipostinas

El análisis por cromatografía líquida de alta densidad (HPLC) de las ciclipostinas se realiza en una unidad HP 1100® con columnas YMC-Pack Pro C18® [AS-303, 250 x 4,6 mm, S-5 \mum, 120 Aº]. El caudal es 1 ml/minuto, la temperatura de la columna es 40ºC. Se emplea un gradiente de 0,05% de ácido trifluoroacético a acetonitrilo. Se consigue 100% de acetonitrilo como eluyente después de 11 minutos y a continuación se continúa eluyendo (isocráticamente) con este disolvente. La detección tiene lugar por medición de la absorción ultravioleta a 210 nm. Con este procedimiento, las ciclipostinas tienen los siguientes tiempos de retención:

\newpage

Ciclipostina A	12,7 minutos,
Ciclipostina A 2	12,6 minutos,
Ciclipostina F	13,2 minutos,
Ciclipostina N	15,9 minutos,
Ciclipostina P	17,7 minutos,
Ciclipostina P 2	17,3 minutos,
Ciclipostina Q	18,3 minutos,
Ciclipostina R	16,7 minutos,
Ciclipostina R2	16,4 minutos,
Ciclipostina S	18,5 minutos,
Ciclipostina T	19,1 minutos y
Ciclipostina T2	18,7 minutos.

Ejemplo 8 Preparación de ciclipostinas puras A y A 2

La fracción 19, obtenida según el Ejemplo 6, se concentra a vacío y 1 g del material concentrado, disuelto en agua/metanol (1:1), se aplica a una columna Nucleoprep 100-5 C_{18} AB® (21 x 250 mm). La elución tiene lugar con un gradiente de 50% de acetonitrilo en 0,01% de ácido trifluoroacético hasta 100% de acetonitrilo. El caudal es de 50 ml/minuto. El caudal de la columna se comprueba por medición de la absorción de luz a 210 nm y sometiendo a ensayo las propiedades de inhibición de lipasas. Se toman fracciones de 60 ml cada una. En las fracciones 34 y 35 se encuentra la ciclipostina A, en las fracciones 41 a 44 la ciclipostina A 2. Estas fracciones se combinan en cada caso, se concentran a vacío y se separan sucesivamente sobre una columna SP 250/10 Nucleosil 100-5 C18 HD®. El gradiente escogido era 50% a 66% de acetonitrilo en 0,01% ácido trilfluoroacético y el valor del pH de las soluciones se ajustó a 4,0 con una gota de solución de hidróxido de amonio. Las fracciones que contenían compuestos puros se combinaban en cada caso y se liofilizaron. Aportaron 5,4 mg de ciclipostina A pura como una sustancia cérea y 3 mg de ciclipostina A 2 como un aceite.

Ejemplo 9 Caracterización de la ciclipostina A

Apariencia: sustancia neutra, incolora, cérea, soluble en disolventes orgánicos que contienen oxígeno, pero sólo ligeramente soluble en agua y éter de petróleo.

Máximo de UV: 228 nm en metanol.

Bandas IR: 1752 y 1671 cm^{-1}.

Con espectrometría de masas FAB de alta resolución empleando una matriz de alcohol bencílico/LiCl, se encuentra el siguiente peso molecular: 467,2757 amu, que se corresponde con la fórmula empírica de la ciclipostinina A-Li de C_{23}H_{41}O_{7}PLi. A partir de esto, se encuentra una fórmula empírica para la ciclipostina A de C_{23}H_{41}O_{7}P, peso molecular: 460. Mediante espectrometría de masas por electropulverización, en el modo de ionización positivo (ESI, positivo), se encuentra un pico en 461 amu, que se corresponde con (M + H)^{+}; además, el pico característico en 221 amu, se corresponde con C_{7}H_{10}O_{6}P. En el modo negativo ESI, se encuentra 459 amu (M - H)^{-}, 337 amu (C_{16}H_{34}O_{5}P) y 219 amu (C_{7}H_{8}O_{6}P). Para determinar la posición del grupo alcohol, se realiza una derivatización con N-metil-N-trimetilsililfluoroacetamida y la muestra se analiza empleando espectrometría de masas con electroionización. Se obtiene el derivado de trimetilsililo:

22

de la masa 554 amu. La posición del grupo hidroxilo sililado se indica por los iones intensos en 497 amu (corte \alpha) y 159 amu (corte \alpha).

Señales RMN: véase la Tabla 1.

TABLA 1 Desplazamientos químicos ^{1}H- y ^{13}C de la ciclipostina A en metanol-d_{4} a 300K

23

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a) excepto para n y n \pm 1.\cr  b) las constantes de acoplamiento
 ^{13} C/ ^{31} P se indican entre
paréntesis.\cr}

Ejemplo 10 Caracterización de la ciclipostina B

La ciclipostina B se aisla tal y como se ha descrito en el Ejemplo 8 para la ciclipostina A, mediante repetición múltiple de las etapas cromatográficas y se caracteriza como en el Ejemplo 9.

Máximo de UV: 228 nm en metanol.

Mediante espectrometría de masas por electropulverización, en el modo de ionización positivo (ESI, positivo), se encuentra un pico en 461 amu, que se corresponde con (M + H)^{+}; además, el pico característico en 221 amu, se corresponde con C_{7}H_{10}O_{6}P. En el modo negativo ESI, se encuentra 459 amu (M - H)^{-}, 337 amu (C_{16}H_{34}O_{5}P) y 219 amu (C_{7}H_{8}O_{6}P). Para determinar la posición del grupo alcohol, se realiza una derivatización con N-metil-N-trimetilsililfluoroacetamida y la muestra se analiza empleando espectrometría de masas con electroionización. Resulta el derivado de trimetilsililo de masa 554 amu:

\vskip1.000000\baselineskip

25

La posición del grupo hidroxi sililado se indica por los iones intensos en 511 amu (corte \alpha) y 145 amu (corte \alpha).

Fórmula empírica de la ciclipostina B: C_{23}H_{41}O_{7}P, peso molecular: 460.

Ejemplo 11 Caracterización de la ciclipostina C

La ciclipostina C se aisla tal y como se ha descrito en el Ejemplo 8 para la ciclipostina A mediante repetición múltiple de las etapas cromatográficas y se caracteriza como en el Ejemplo 9.

Máximo de UV: 228 nm en metanol.

Mediante espectrometría de masas por electropulverización, en el modo de ionización positivo (ESI, positivo), se encuentra un pico en 461 amu, que se corresponde con (M + H)^{+}; además, el pico característico en 221 amu, se corresponde con C_{7}H_{10}O_{6}P. En el modo negativo ESI, se encuentra 459 amu (M - H)^{-}, 337 amu (C_{16}H_{34}O_{5}P) y 219 amu (C_{7}H_{6}O_{6}P). Para determinar la posición del grupo alcohol, se realiza una derivatización con N-metil-N-trimetilsililfluoroacetamida y la muestra se analiza empleando espectrometría de masas con electroionización. Resulta el derivado de trimetilsililo de masa 554 amu:

26

La posición del grupo hidroxi sililado se indica por los iones intensos en 525 amu (corte \alpha) y 131 amu (corte \alpha).

Fórmula empírica de la ciclipostina C: C_{23}H_{41}O_{7}P, peso molecular: 460.

Ejemplo 12 Caracterización de la ciclipostina F

La fracción 20, obtenida según el Ejemplo 6, se separa tal y como se describe en el Ejemplo 8 y la ciclipostina F se aisla por repetición múltiple de las etapas cromatográficas y se caracteriza como en el Ejemplo 9.

Tiempo de retención: 13,2 minutos.

Máximo de UV: 228 nm en metanol.

Mediante espectrometría de masas por electropulverización, en el modo de ionización positivo (ESI, positivo), se encuentra un pico en 459 amu, que se corresponde con (M + H)^{+}; además, el pico característico en 221 amu, se corresponde con C_{7}H_{10}O_{6}P. En el modo negativo ESI, se encuentra 457,6 amu (M - H)^{-}, 336 amu (C_{16}H_{32}O_{5}P_{)} y 219 amu (C_{7}H_{8}O_{6}P).

Fórmula empírica de la ciclipostina F: C_{23}H_{39}O_{7}P, Peso molecular: 458.

Ejemplo 13 Caracterización de la ciclipostina P

La fracción 21, obtenida según los Ejemplos 5 y 6, se separa tal y como se describe en el Ejemplo 8 y la ciclipostina P se aisla (210 mg) por repetición múltiple de las etapas cromatográficas y se caracteriza como en el Ejemplo 9. La ciclipostina P cristaliza disolviendo los 210 mg en 3 ml de propanol-2 y 13 ml de acetonitrilo y la adición de 8 ml de agua. Después de separar por filtración y lavar con acetonitrilo frío, se obtuvo un peso final de 135 mg de ciclipostina. P.f. 58-59ºC.

Tiempo de retención: 17,7 minutos.

Máximo de UV: 228 nm en metanol.

Bandas IR: 2917, 2852, 1753, 1671, 1471, 1214, 996 y 832 cm^{-1}.

Con espectrometría de masas FAB de alta resolución empleando una matriz de alcohol nitrobencílico, se encuentra el siguiente peso molecular: 445,2717 amu, que se corresponden con (M + H)^{+} para la ciclipostina P de C_{23}H_{42}O_{6}P. A partir de esto, se encuentra una fórmula empírica para la ciclipostina P de C_{23}H_{41}O_{6}P, peso molecular: 444. Mediante espectrometría de masas por electropulverización, en el modo de ionización positivo (ESI, positivo), se encuentra un pico en 445 amu, que se corresponde con (M + H)^{+}; además, el pico característico en 221 amu, se corresponde con C_{7}H_{10}O_{6}P. En el modo negativo ESI, se encuentra 443 amu (M - H)^{-}, 321 amu (C_{16}H_{34}O_{4}P) y 219 amu (C_{7}H_{8}O_{6}P).

27

Los datos de la RMN se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2 Desplazamientos químicos de la ciclipostatina P en MeOD a 300 K

28

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a) las constantes de acoplamiento  ^{13} C/ ^{31} P se indican
entre
paréntesis.\cr}

Ejemplo 14 Caracterización de la ciclipostina P 2

La fracción 21, obtenida según los Ejemplos 5 y 6, se separa tal y como se describe en el Ejemplo 8 y la ciclipostina P 2 se aisla (130 mg) por repetición múltiple de las etapas cromatográficas y se caracteriza como en el Ejemplo 9.

Tiempo de retención: 17,1 minutos.

Apariencia: sustancia neutra, incolora, aceitosa, soluble en disolventes orgánicos que contienen oxígeno, pero sólo ligeramente soluble en agua y éter de petróleo.

Máximo de UV: 228 nm en metanol.

Con espectrometría de masas FAB de alta resolución empleando una matriz de alcohol nitrobencílico, se encuentra el siguiente peso molecular: 445,2721 amu, se corresponden con (M + H)^{+} para la ciclipostina P de C_{23}H_{42}O_{6}P. A partir de esto, se encuentra una fórmula empírica para la ciclipostina P 2 de C_{23}H_{41}O_{6}P, peso molecular: 444. Mediante espectrometría de masas por electropulverización, en el modo de ionización positivo (ESI, positivo), se encuentra un pico en 445 amu, que se corresponde con (M + H)^{+}; además, el pico característico en 221 amu, se corresponde con C_{7}H_{10}O_{6}P. En el modo negativo ESI, se encuentra 443 amu (M - H)^{-}, 321 amu (C_{16}H_{34}O_{4}P) y 219 amu (C_{7}H_{8}O_{6}P).

29

Los datos de la RMN de la ciclipostina P 2 se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3 Desplazamientos químicos de la ciclipostina P 2 en CD_{3}OD con 300 K

30

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a) las constantes de acoplamiento  ^{13} C/ ^{31} P se indican
entre
paréntesis.\cr}

Ejemplo 15 Obtención y caracterización de la ciclipostina N

La fracción 21, obtenida según los Ejemplos 5 y 6, se separa tal y como se describe en el Ejemplo 8 y la ciclipostina N se aisla (2 mg) por repetición múltiple de las etapas cromatográficas y se caracteriza como en el Ejemplo 9.

Tiempo de retención: 15,9 minutos.

Apariencia: Sustancia neutra, incolora, aceitosa soluble en disolventes orgánicos que contienen oxígeno, pero sólo ligeramente soluble en agua y éter de petróleo.

Máximo de UV: 228 nm en metanol.

Con condiciones FAB de la espectrometría de masas de alta resolución, se observó un ión casi-molecular (M + H) en 417,2405 que se corresponde con la fórmula empírica de C_{21}H_{38}O_{6}P (teoría: 417,2406). Fragmento característico en el modo ESI^{+}: 221 amu.

TABLA 4 Desplazamientos químicos de la ciclipostina N en MeOD a 300 K

\vskip1.000000\baselineskip

32

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a) las constantes de acoplamiento  ^{13} C/ ^{31} P se indican
entre
paréntesis.\cr}

Ejemplo 16 Obtención y caracterización de la ciclipostina R

La fracción 21, obtenida según los Ejemplos 5 y 6, se separa tal y como se describe en el Ejemplo 8 y la ciclipostina R se aisla (8 mg) por repetición múltiple de las etapas cromatográficas y se caracteriza como en el Ejemplo 9.

Tiempo de retención: 16,7 minutos.

Apariencia: sustancia neutra, incolora, cristalina, soluble en disolventes orgánicos que contienen oxígeno, pero sólo ligeramente soluble en agua y éter de petróleo. Máximo de UV: 228 nm en metanol.

Con condiciones FAB de la espectrometría de masas de alta resolución, se observó un ión casi-molecular (M + H) en 431,2561 que se corresponde con la fórmula empírica de C_{22}H_{40}O_{6}P (teoría: 431,2562). Fragmento característico en el modo ESI^{+}: 221 amu.

TABLA 5 Desplazamientos químicos de la ciclipostina R en MeOD a 300 K

34

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a) las constantes de acoplamiento  ^{13} C/ ^{31} P se indican
entre
paréntesis.\cr}

Ejemplo 17 Obtención y caracterización de la ciclipostina R2

La fracción 21, obtenida según los Ejemplos 5 y 6, se separa tal y como se describe en el Ejemplo 8 y la ciclipostina R2 se aisla (8 mg) por repetición múltiple de las etapas cromatográficas y se caracteriza como en el Ejemplo 9.

Tiempo de retención: 16,4 minutos.

Apariencia: sustancia neutra, incolora y aceitosa, soluble en disolventes orgánicos que contienen oxígeno pero sólo ligeramente soluble en agua y éter de petróleo.

Máximo de UV: 228 nm en metanol.

Con condiciones FAB de espectrometría de masas de alta resolución, se observó un ión casi-molecular (M + H) en 431,2564 que se corresponde con la fórmula empírica de C_{22}H_{40}O_{6}P (teoría: 431,2562). Fragmento característico en el modo ESI^{+}: 221 amu.

TABLA 6 Desplazamientos químicos de la ciclipostina R2 en MeOD a 300 K

35

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a) las constantes de acoplamiento  ^{13} C/ ^{31} P se indican
entre
paréntesis.\cr}

Ejemplo 18 Obtención y caracterización de la ciclipostina S

La fracción 21, obtenida según los Ejemplos 5 y 6, se separa tal y como se describe en el Ejemplo 8 y la ciclipostina S se aisla (0,7 mg) por repetición múltiple de las etapas cromatográficas y se caracteriza como en el Ejemplo 9.

Tiempo de retención: 18,5 minutos.

Apariencia: sustancia neutra, incolora, sólida, soluble en disolventes orgánicos que contienen oxígeno, pero sólo ligeramente soluble en agua y éter de petróleo.

Máximo de UV: 228 nm en metanol.

Con condiciones FAB de la espectrometría de masas de alta resolución, se observó un ión casi-molecular (M + H) en 459,2883 que se corresponde con la fórmula empírica de C_{24}H_{44}O_{6}P (teoría: 459,2575). Fragmento característico en el modo ESI^{+}: 235 amu.

\newpage

TABLA 7 Desplazamientos químicos de la ciclipostina S en MeOD a 300 K

36

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a) las constantes de acoplamiento  ^{13} C/ ^{31} P se indican
entre
paréntesis.\cr}

Ejemplo 19 Obtención y caracterización de la ciclipostina T

La fracción 21, obtenida según los Ejemplos 5 y 6, se separa tal y como se describe en el Ejemplo 8 y la ciclipostina T se aisla (5 mg) por repetición múltiple de las etapas cromatográficas y se caracteriza como en el Ejemplo 9.

Tiempo de retención: 19,1 minutos.

Máximo de UV: 228 nm en metanol.

Con condiciones FAB de la espectrometría de masas de alta resolución, se observó un ión casi-molecular (M + H) en 473,3030 que se corresponde con la fórmula empírica de C_{25}H_{46}O_{6}P (teoría: 473,3032). Fragmento característico en el modo ESI^{+}: 249 amu.

TABLA 8 Desplazamientos químicos de la ciclipostina T en MeOD a 300 K

37

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a) las constantes de acoplamiento  ^{13} C/ ^{31} P se indican
entre
paréntesis.\cr}

Ejemplo 20 Obtención y caracterización de la ciclipostina T2

La fracción 21, obtenida según los Ejemplos 5 y 6, se separa tal y como se describe en el Ejemplo 8 y la ciclipostina T2 se aisla (4 mg) por repetición múltiple de las etapas cromatográficas y se caracteriza como en el Ejemplo 9.

Tiempo de retención: 18,7 minutos.

Máximo de UV: 228 nm en metanol.

Con condiciones FAB de la espectrometría de masas de alta resolución, se observó unión casi-molecular (M + H) en 473,3035 que se corresponde con la fórmula empírica de C_{25}H_{46}O_{6}P (teoría: 473,3032). Fragmento característico en el modo ESI^{+}: 249 amu.

TABLA 9 Desplazamientos químicos de la ciclipostina T2 en MeOD a 300 K

39

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a) las constantes de acoplamiento  ^{13} C/ ^{31} P se indican
entre
paréntesis.\cr}

Ejemplo 21 Inhibición de la lipasa sensible a hormonas (HSL)

La lipasa sensible a hormonas de ratas se inhibe con las siguientes concentraciones (IC_{50}) empleando trioleilglicerol como sustrato:

Ciclipostina A:	20 nM,
Ciclipostina N:	450 nM,
Ciclipostina P:	30 nM,
Ciclipostina P2:	40 nM,
Ciclipostina R:	10 nM,
Ciclipostina R2:	220 nM,
Ciclipostina S:	20 nM,
Ciclipostina T:	200 nM,
Ciclipostina T2:	60 nM.

Claims

1. Compuesto de fórmula general I

41

en la que

R^{1} es

1.1: -OH,

1.2: =O,

1.3: -O-alquilo-C_{1}-C_{6}, en donde el alquilo es lineal o ramificado,

1.5: -alquilo-C_{1}-C_{6}, en donde el alquilo es lineal o ramificado,

1.6: -arilo,

1.7: -alquil-C_{1}-C_{6}-benceno,

1.8: -difenilo,

1.9: -NH-alquilo-C_{1}-C_{6}, en donde el alquilo es lineal o ramificado,

1.11: -NH_{2},

1.12: =S,

1.13: -S-alquilo-C_{1}-C_{6}, en donde el alquilo es lineal o ramificado, o

1.15: halógeno,

en donde los sustituyentes 1.1 a 1.15 pueden estar adicionalmente sustituidos;

R^{2} es

1.0: alquilo-C_{1}-C_{6}, en donde el alquilo no está sustituido o está monosustituido o disustituido como se ha descrito en 1.1 a 1.15,

2.0: alquenilo-C_{2}-C_{6}, en donde el alquenilo no está sustituido o está monosustituido o disustituido tal y como se ha descrito en 1.1 a 1.15,

3.0: alquinilo-C_{2}-C_{6}, en donde el alquinilo no está sustituido o está monosustituido o disustituido tal y como se ha descrito en 1.1 a 1.15,

E es un átomo de fósforo (P) y

X_{1}, X_{2} y X_{3} son -O- independientemente uno de otro,

2. Compuesto de fórmula I o una sal del mismo fisiológicamente tolerable según la reivindicación 1, caracterizado porque

R^{1} es

1.0: -(CH_{2})_{15}CH_{3},

2.0: -(CH_{2})_{13}CH(CH_{3})_{2},

3.0: -(CH_{2})_{11}CH(OH)(CH_{2})_{3}CH_{3},

4.0: -(CH_{2})_{11}CH(OH)CH_{2}CH(CH_{3})_{2},

5.0: -(CH_{2})_{12}CH(OH)(CH_{2})_{2}CH_{3},

6.0: -(CH_{2})_{13}CH(OH)CH_{2}CH_{3},

7.0: -(CH_{2})_{14}CH(OH)CH_{3},

8.0: -(CH_{2})_{15}CH_{2}(OH),

9.0: -(CH_{2})_{16}CH_{3}

10.0: -(CH_{2})_{13}C=OCH_{2}CH_{3}

11.0: -(CH_{2})_{12}C=OCH_{2}CH_{2}CH_{3}

12.0: -(CH_{2})_{11}C=OCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{3}

13.0: -(CH_{2})_{13}CH_{3}

14.0: -(CH_{2})_{11}CH(CH_{3})_{2}

15.0: -(CH_{2})_{14}CH_{3} o

16.0: -(CH_{2})_{12}CH(CH_{3})_{2}.

3. Compuesto de fórmula I o una sal fisiológicamente tolerable del mismo según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque R^{2} es alquilo-C_{1}-C_{6}.

4. Compuesto de fórmula I o una sal fisiológicamente tolerable del mismo según la reivindicación 3, caracterizado porque R^{2} es -CH_{3}, -CH_{2}CH_{3} o -CH_{2}CH_{2}CH_{3}.

5. Compuesto de fórmula I o una sal fisiológicamente tolerable del mismo según una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, preparable por fermentación de la especie de microorganismo HAG 004107, DSM 13381 de Streptomyces o una de sus variantes o mutantes bajo condiciones adecuadas, en un medio de cultivo, hasta que uno o varios compuestos de fórmula I se acumulan en el medio de cultivo y a continuación se pueden aislar del medio de cultivo y convertir opcionalmente en equivalentes químicos o sales fisiológicamente tolerables.

6. Procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula I o una sal fisiológicamente tolerable del mismo según una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se fermenta el microorganismo HAG 004107, DSM 13381 de la especie Streptomyces o una de sus variantes o mutantes bajo condiciones adecuadas, en un medio de cultivo, hasta que uno o varios compuestos de fórmula general I se acumulan en el medio de cultivo y a continuación se aislan del medio de cultivo y se convierten opcionalmente en equivalentes químicos o sales fisiológicamente
tolerables.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque la fermentación bajo condiciones aerobias se realiza a una temperatura entre 18 y 35ºC y a un pH entre 6 y 8.

8. Compuesto de fórmula I o una sal fisiológicamente tolerable del mismo según una o varias de las reivindicaciones 1-5, para uso como fármaco.

9. Compuesto de fórmula I o una sal fisiológicamente tolerable del mismo según una o varias de las reivindicaciones 1-5, para uso como fármaco para la inhibición de lipasas.

10. Compuesto de fórmula I o una sal fisiológicamente tolerable del mismo según una o varias de las reivindicaciones 1-5, para uso como antidiabético.

11. Preparación farmacéutica con un contenido en al menos un compuesto de fórmula I o una sal fisiológicamente tolerable del mismo, según una o varias de las reivindicaciones 1-5.

12. Procedimiento para la preparación de preparaciones farmacéuticas según la reivindicación 11, caracterizado porque al menos un compuesto de fórmula I o una sal tolerable del mismo según una o varias de las reivindicaciones 1-5, se produce en una forma de administración adecuada empleando excipientes y/o vehículos adecuados.

13. Especie de Streptomyces HAG 004107, DSM 13381.