CN1215432A - 调节外源性基因在哺乳动物***中表达的激素介导的方法及其相关产物 - Google Patents

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Abstract

根据本发明,提供了采用修饰的蜕皮激素受体调节外源基因在哺乳动物受体中表达的各种方法。而且还提供了修饰的蜕皮激素受体,以及含有该受体的同型二聚体和异型二聚体受体,编码本发明的修饰的蜕皮激素受体的核酸,修饰的蜕皮激素反应元件,基因转移载体,重组细胞,和含有编码本发明的修饰的蜕皮激素受体的核酸的转基因动物。

Description

调节外源性基因在哺乳动物***中表达的激素 介导的方法及其相关产物
发明领域
本发明涉及重组DNA技术领域的方法，及其相关产物，更具体地说，本发明涉及调节外源基因在哺乳动物***中表达的方法和产物。
发明背景
类固醇/甲状腺激素受体包含在介导细胞命运和功能的改变中起关键作用的配体依赖性转录因子的一个超家族(Evans,R.M，科学，240:889-895(1988))。该受体将细胞外激素信号转导到包含称为激素反应元件(HREs)的特异增强子序列的靶基因上，Evans,(1988)；Green和Chanbon.遗传学趋势，4:309-314(1988)；Yamamoto,K R.遗传学年鉴，19:209-252(1985))。每个受体识别它自己的HRE，可确信每个单独的反应由各个激素信号引发。相关的转录因子的集合及其相关反应元件一起提供了唯一的控制基因表达的可能性。
类固醇/甲状腺激素受体超家族中的每一个成员的DNA结合结构域具有66-68个氨基酸。其中包括9个半胱氨酸在内的20个氨基酸在整个家族中是保守的。这个受体超家族成员的模块结构容许在受体的同源结构域之间发生交换而产生功能性嵌合体。这个策略被用于证实DNA结合结构域在体内(Green和Chambon，自然325:75-78(1987)；Giguere等，自然330:624-629(1987)；Petkovich等，自然330:444-450(1987)；Kumar等，细胞，51:941-951(1987)；Umesono等，自然336:262-265(1988)；Thompson和Evans，美国科学院学报86:3494-3498(1989)和体外(Kumar和Chanbon，细胞55:145-156(1988))单独负责特异性识别。通过对建议的非洲爪蟾属转录因子ⅢA的结构的类推(Miller等，EMBO J.4:1609-1614(1985))，不变的半胱氨酸被认为形成两个介导DNA结合功能的“锌指”。(Hollenberg和Evans，细胞55:899-906(1988))。这些半胱氨酸涉及的Zn(Ⅱ)的共济作用可被广泛的X-射线吸收的精细结构所支持(Freeman等，自然334:543-546(1988))，而且DNA结合作用可被点诱变实验支持(Hollenberg和Evan,(1988)；Severne等，EMBO J.7:2503-2508(1988))。
事实上HREs在结构上是相关的，但在功能上是不同的。糖皮质激素受体反应元件(GRE)，***受体反应元件(ERE)，和甲状腺激素受体反应元件(TRE)已被详细鉴定。发现这些特定的反应元件有一回文对的六基数“半位点”(Evans,(1988)；Green和Chambon,(1988))。对于最优化的虚拟或共有反应元件，GRE和ERE之间的每个半位点只有两个核苷酸不同(Klock等，自然329:734-736(1987))。另一方面，EREs和TREs具有相同的半位点，但在两个半位点之间的核苷酸间隔序列数目不同(Glass等，细胞54:313-323(1988))。
与有回文序列基序的反应元件对比，以下激素受体一般识别的反应元件具有两个直接重复(DR)序列基序的半位点：RXR,RAR,COUP-TF,PPAR等，(见，例如，Mangelsdorf等，类视色素：生物学，化学，和医学，第二版，Raven出版有限公司，纽约，1994，第8章)。因而至少有三种不同的方法可获得HRE多样性：1)对特定半位点的结合位点特异性；2)在两个半位点之间的核苷酸间隔序列；3)半位点相对于另一个半位点的方向。
在昆虫***中，一个类固醇激素蜕皮激素的脉冲引发黄猩猩果蝇的***，在加激素的几分钟内，就表现出基因组效应，如染色体膨化。在昆虫中介导这个反应的是功能性蜕皮激素受体，蜕皮激素受体(ECR)的杂二聚体和超气门(ultraspiracle)基因(USP)的产物(Yao等，(1993)自然366,476-479；和Yao等。(1992)细胞71,63-72)。对昆虫蜕皮甾类的反应性能通过ECR,USP的共转化和用蜕皮激素或合成类似物盐酸甾酮A处理在培养的哺乳动物细胞中再产生，其中USP是一种蜕皮激素反应性报道基因。
在遗传工程领域中，精确控制基因表达在研究，操作和控制发育和其它生理过程中是无价的工具。例如：调控基因表达在哺乳动物***中的应用包括诱导的基因打靶，毒素和致畸形基因的过度表达，反义RNA的表达，以及基因治疗(Jaenisch,R.(1988)科学240,1468-1474)。对于培养的细胞来说，可用糖皮质激素和其它甾类来诱导所需基因的表达。
作为哺乳动物***中另一个控制基因表达的方式，已设计了一个诱导性四环素调控***并用于转基因小鼠中，从而是在缺乏抗生素时诱导基因的活性，而在其存在时抑制活性(见，例如，Gossen等(1992)美国科学院学报，89,5547-5551；Gossen等(1993),TIBS18,471-475；Furth等(1994)美国科学院学报91,9302-9306；和Shockett等(1995)美国科学院学报92,6522-6526)。然而，这个***的缺点包括：连续四环素处理以抑制表达和延缓骨中抗生素的清除，这会干扰快速和精确的诱导。尽管此***已通过最近鉴定的一个反式作用可作为诱导性激活子的突变的四环素抑制子而得到改进，四环素的药物动力学会阻碍在发育中必需精确和有效的“开闭”开关时的使用。(Gossen等(1995)科学268:1766～1769)。
因而，在本领域需要一个改进的方法以精确调节外源基因在哺乳动物受体中的表达。
发明简述
根据本发明，提供了各种调节外源基因在哺乳动物受体中的表达的方法。本发明方法在很多需要在外源基因的体内诱导性表达的应用中，如向病人的各种细胞中输送重组蛋白的体内治疗学方法有用。
与背景技术四环素为基础的策略不同，向哺乳动物细胞转移蜕皮激素反应性利用了自然存在的甾类可诱导***。使用蜕皮甾类的好处包括化合物的亲脂特性(它提供对包括大脑的所有组织的有效穿透)，半衰期短(容许精确和有效的诱导)，和防止储存和促进清除的适宜的药物动力学。
根据本发明的另一个实施方案，提供了修饰的蜕皮激素受体，它可以是包含伴随本发明的修饰的蜕皮激素受体的类固醇/甲状腺受体超家族的至少一个沉默配偶体的同型二聚体类或异型二聚体类的形式。本发明的修饰的蜕皮激素受体在例如调节外源基因在哺乳动物受体中的表达的方法中是有用的。
根据本发明的另外的实施方案，提供了编码本发明的修饰的蜕皮激素受体的核酸，修饰的蜕皮激素受体反应元件，基因转移载体，重组细胞，和包含编码本发明修饰的蜕皮激素受体的核苷酸的转基因动物。
附图的简述
图1A-1D表示采用各种USP或RXR与不同的修饰的EcRs组合的蜕
皮激素反应性的最优化。在图1A中，图两侧的数值的刻度相同，并为清楚起见利用重复的GEcR/RXR值。暗的和斜纹的方框分别表示没有激素或1μM盐酸甾酮A时，报告基因的活性。
图1B表示FXR和VpEcR对蜕皮激素反应元件(EcER)和杂合蜕皮激素/糖皮质激素反应元件(E/GRE)反应性报告基因上的活性。VpEcR,VgEcR和没有受体的对照转染用1μM盐酸甾酮处理。FXR转染用50μM的保幼激素Ⅲ(Sigma)处理。暗的和斜纹的方框分别表示没有激素或1μM盐酸甾酮A/50μM的保幼激素Ⅲ时，报告基因的活性。
图1C表示E/GRE和GRE是不重叠的反应元件。暗的和斜纹的方框分别表示没有激素或1μM盐酸甾酮A/1μM***时，报告基因的活性。
图1D表示修饰的蜕皮激素受体的示意图。GEcR是包含GR的N-末端反式激活结构域和EcR的DNA和配体结合结构域的嵌合受体。VpEcR是融合到Vp16的激活结构域上的EcR的N-末端截短片段。VgEcR除DNA结合结构域的P盒中的以下点突变外与VpEcR相同：E282G,G283S，和G286V。在该图中，DBD=DNA结合结构域，LBD=配体结合结构域。图2表示本发明蜕皮激素诱导性基因表达***的示意图。在表达RXR和一个修饰的EcR后，在激素存在时，这两个受体可异型二聚体化和反式激活于包含蜕皮激素反应元件的启动子。蜕皮激素反应元件放在能够启动任一外源cDNA表达的最小启动子(即无增强子的启动子)的上游。
图3A表示N13细胞的盐酸甾酮剂量依赖激活。N13细胞在不同浓度的盐酸甾酮中培养36小时，然后用标准ONPG测试法测试β-半乳糖苷酶活性(空心方框)或测试荧光素酶活性(实心环)。图3B表示用激素处理的N13细胞的荧光素酶活性与时间的关系。N13细胞在含1μM盐酸甾酮的分开的小孔中生长，在不同的时间收获，并按实施例3中所描述测定荧光素酶活性。
图4表示按实施例4所述的小鼠中盐酸甾酮活性。
发明详述
根据本发明，提供了调节外源基因在哺乳动物受体中表达的方法，该哺乳动物受试体含有：
(ⅰ)一种DNA构建体，包含所说的在一个蜕皮激素反应元件控制下的外源基因，和
(ⅱ)一种修饰的蜕皮激素受体，在其配体存在时，且任选在可作为其沉默配偶体的受体进一步存在时，与所说的蜕皮激素反应元件结合。
所说的方法包括给所说的受试体施用有效量的所说的修饰的蜕皮激素受体的配体，其中所说的的配体在正常情况下不存在所说的受试体细胞中；且其中所说的配体对所说的受试体是无毒的。
因此，根据本发明的昆虫蜕皮激素在作为哺乳动物***中基因表达的调控诱导剂是有利的，即，在不存在诱导所需的条件时表达的背景水平基本为零。已经发现含有与本发明的修饰的蜕皮激素受体(优选具有改变了的DNA结合特异性)结合的新修饰的蜕皮激素反应元件的最优化启动子提供非常有力和特异性的诱导性哺乳动物表达***。本发明的表达***的低基础活性有利于表达转录因子和毒素基因。本发明诱导性表达***的优良的剂量反应和诱导率特性容许精确控制目的基因诱导的程度和时期。
由于本发明的方法提供了以外源性非哺乳动物诱导子调控基因表达，它能有利地在各种体内和体外的哺乳动物表达***中使用。例如，根据本发明的方法在转基因哺乳动物中cre重组酶的诱导性表达，可使本领域的技术人员实现对成体或发育的胚胎的暂时特异性诱导性基因打靶(O’Gorman等(1991)科学251,1351-1355)。
本文所用的术语“调节”指相对于不存在配体时而言，给定的配体/受体复合物影响外源基因转录反式激活的能力。复合物形成对受体的反式激活活性的实际影响依赖于作为配体/受体复合物一部分的特异性受体种类和配体/受体复合物与其相互作用的反应元件而改变。
本文使用的短语“对所说的哺乳动物受体外源性的”或简单称为“外源性的”，当指基因时可指任何基因，其中该基因产物在需要表达的特定细胞中不是天然表达的。例如，外源基因可以是天然或者合成的野生型基因和治疗性基因，它可以以DNA或RNA形式导入受试体。目的基因可导入靶细胞(对于体外应用)，或直接导入受试体，或通过转化的细胞转移进受试体间接导入。
“野生型”基因是那些对特定类型的细胞为天然存在的基因。该基因可以不需过度表达，或可以不以生物学上明显的水平表达。因此，例如，尽管编码人胰岛素的合成的或天然的基因对酵母细胞是外源性的遗传物质(因为酵母细胞在天然状态下不包含胰岛素基因)，而***人表皮成纤维细胞的人胰岛素基因相对于该细胞为野生型基因，因为人表皮成纤维细胞包含编码人胰岛素的遗传物质，尽管人表皮成纤维细胞并不以生物学上明显的水平表达人胰岛素。
预期用于本发明的实践的野生型基因包括的基因编码的基因产物是：
其基本上不存在导致所说的受试体出现不正常状态：或
其基本上过剩会导致所说受试体出现不正常状态；等。
本文所用的短语“治疗基因”指赋予表达该基因的宿主细胞有利功能的基因。治疗基因是那些天然状态下在宿主细胞中不存在的基因。例如，编码野生型人胰岛素的合成的或天然的基因当***表皮成纤维细胞以便在人宿主中表达时是治疗基因性的，其中人宿主否则不能以生物学上明显的水平表达有功能活性的人胰岛素，根据本文所述的方法，治疗基因以提供相应治疗蛋白治疗上的有效量的水平表达。
预期用于本发明的实践中的治疗基因包括的基因编码的基因产物是：
对表达它的细胞有毒；或
赋予宿主受体有利的特性(如：疾病抗性，等)；
及类似的情况。
许多编码各种蛋白质的基因组和cDNA核苷酸序列是本领域熟知的的。在本发明的实践中有用的外源性遗传物质包括编码有生物学活性的目的蛋白的基因，如能够从所说的细胞中释放出的分泌蛋白；能够将来自毒性物质的底物代谢为非毒性物质或将无活性物质转变为有活性物质的酶；调节蛋白；细胞表面受体，等。有用的基因包括编码凝血因子，如人因子Ⅷ和Ⅸ的基因；编码诸如胰岛素，甲状旁腺激素，促黄体生成激素释放因子(LHRH),α和β***抑制素和人生长激素激素的基因，编码诸如其缺乏会导致出现异常状态的酶的基因；编码细胞因子或淋巴因子如干扰素，粒细胞巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF)，集落刺激因子-1(CSF-1)，肿瘤坏死因子(TNF)，和***(EPO)的基因；编码抑制剂物质如α1-抗胰蛋白酶的基因，编码用作药物的物质的基因，如，编码白喉和霍乱毒素的基因，等类似基因。
通常，一种所需蛋白的核酸序列信息可在一种众多的公共数据库中找到，如GENBANK,EMBL,Swiss-Prot，和PIR，或在众多的有关生物学杂志出版物中找到。因而，对于实际上是于众所周知的基因，本领域的技术人员可获得其的核酸序列。本领域的技术人员可直接从公共保藏单位或公开该序列研究所获得相应的核酸分子。任选的是一旦查清编码所需蛋白质的核酸序列，技术人员可采用常规方法，如聚合酶链式反应(PCR)扩增，从合适的核酸文库中分离所需的核酸分子。因此，用于本文所述的方法和产物的所有编码目的蛋白的已知核酸是可获得的。
本文所用的术语“哺乳动物”指人类，驯养的动物，如，大鼠，小鼠，兔，狗，猫等，农场动物，如，鸡，牛，猪和绵羊等，和动物学研究上感兴趣的动物，如猴和狒狒等。
预期用于本发明的实践中的修饰的蜕皮激素受体包括：
一种蜕皮激素配体结合结构域；
一种从DNA-结合蛋白获得的DNA结合结构域；和
一种转录因子的激活结构域，
其中至少一种所说的DNA结合结构域或所说的激活结构域不是从天然蜕皮激素受体获得的，
前提是，当所说的激活结构域来自糖皮质激素受体时，所说的DNA结合结构域不是来自糖皮质激素受体或一个大肠杆菌LexA蛋白质。根据本发明，修饰的蜕皮激素受体在优选哺乳动物的表达***中的功能是从有蜕皮激素反应元件的转录调控区域反式激活基因表达。
预期用于本发明的修饰的蜕皮激素受体制品中的蜕皮激素配体结合结构域典型地来自天然蜕皮激素受体的C-末端部分，并能与蜕皮甾类结合(Koelle等，细胞67:59-77,1991；和Christopherson等，PNAS,USA,89:6314-6318,1992)。蜕皮激素配体结合结构域在功能上可在本发明修饰的蜕皮激素受体内以任一方向和各个位置存在。例如：蜕皮激素配体结合结构域可位于修饰受体的氨基或羧基末端，或在其之间。在本发明的优选实施方案中，蜕皮激素配体结合结构域位于修饰受体的羧基末端(见图1D)。
预期用于本发明的修饰的蜕皮激素受体制品中的DNA-结合结构域典型地DNA结合蛋白(如，转录因子)获得。术语“DNA-结合结构域”在本领域理解为指能够结合DNA的氨基酸序列。本文使用的术语“DNA结合结构域”包括DNA-结合蛋白的最小肽序列，一直到DNA结合蛋白的全长，只要该DNA-结合结构域能发挥与特定的反应元件相联的功能。
已知该DNA结合结构域通过保持结合天然DNA识别序列的能力而与其它的功能蛋白结构域组合以异源方式发挥功能(见，如Brent和Ptashne,1985，细胞，43:729-736)。例如，已知激素受体具有在嵌合蛋白质中具有功能的可互换的DNA-结合结构域(见，如，美国专利4,981,784；和Evans,R.,1988，科学，240:889-895)。因而，与本发明的修饰的蜕皮激素受体的配体结合结构域类似，DNA-结合结构域可位于羧基末端或氨基末端，或者DNA结合结构域也可位于配体结合结构域和激活结构域之间。在本发明优选的实施方案中，DNA结合结构域也可位于配体结合结构域和激活结构域之间。
本文预期使用的“DNA结合蛋白”属于能直接结合DNA，并能帮助起始或抑制转录的一类熟知蛋白质。预期用于本文的举例性的DNA结合蛋白包括转录控制蛋白(如，转录因子等；Conaway和Conaway,1994，“转录机制和调控”，Raven分子和细胞生物学出版系列，Vol.3 Raven出版有限公司，纽约，NY)。
本文预期用作该DNA结合结构域来源的转录因子包括，如同源盒蛋白，锌指蛋白，激素受体，螺旋-转角-螺旋蛋白，螺旋-环-螺旋蛋白，碱性Zip蛋白(bZip),β-带状因子等。见，例如，Harrison,S.,“DNA结合结构域的结构分类学”，自然，353:715-719。适用于本文的同源盒NDA-结合蛋白包括，例如，HOX,STF-1(Leonard等，1993,Mol.Endo.7:1275-1283),Antp,Matα-2,INV等，也见：Scott等(1988)，生物化学和生物物理学报，989:25-48。已发现包含STF-1同源域的76个氨基酸的片段(相应Leonard等1993,Mol.Endo,7:1275-1283中描述的氨基酸140-215)结合DNA与野生型STF-1一样紧。本文使用的合适的的锌指DNA结合蛋白包括Zif268,GLI,XFin，等。也见，Klug和Rhodes(1987)，生物化学科学动态12:464,Jacobs和Michaels(1990)，新生物学，2:583；和Jacobs(1992),EMBOJ.,11:4507-4517。
优选的是，本文使用的DNA结合结构域从类固醇/甲状腺超家族受体的一个成员中获得。本文使用的短语“类固醇/甲状腺激素超家族受体成员”(也称为“核受体”或“细胞内受体”)指以配体依赖性转录因子操作的激素结合蛋白，包括特异性配体尚未鉴定的类固醇/甲状腺超家族受体已鉴定的成员(下文称作“孤独受体”)。
类固醇/甲状腺超家族受体的举例性成员(包括其各种同工型)包括甾类受体如：糖皮质激素受体(GR)，盐皮质激素受体(MR)，***受体(ER)，孕激素受体(PR)，雄激素受体(AR)，维生素D3受体(VDR)；等。还有类视色素受体，如视黄酸受体的各种同工型(如RARα,RARβ,RARγ)，各种类视色素受体X受体的同工型(如RXRα,RXRβ,RXRγ)，等，(例如见美国专利4,981,784；5,171,671；和5,071,773)；甲状腺受体(TR)，如TRα,TRβ等，昆虫衍生的受体如蜕皮激素受体等；以及以其结构和特性被认为是上文限定的超家族成员的其它基因产物，包括其各种同工型。本文预期用作DNA结合结构域来源的孤独受体的例子包括HNF4(例如见Sladek等基因与发育4:2353-2365(1990)),COUP受体家族〔例如见Miyajima等，核酸研究16:11057-11074(1988)，和Wang等，自然340:163-166(1989)〕,COUP类受体和COUP同源物，如Mlodzik等，细胞60:211-224(1990)和Ladias等，科学251:561-565(1991)所述的那些受体，过氧化物酶体增殖子激活的受体的各种同工型，(PPARs；见Issemann和Green，出处同上)，昆虫衍生的knirps和knirps相关受体，等。
受体的类固醇/甲状腺家族的所有成员的DNA结合结构域是相关的，由66-68个氨基酸残基组成，具有大约20个不变氨基酸残基，其中包括9个半胱氨酸残基。超家族的一个成员可鉴定为包含该20个不变氨基酸残基的蛋白质。超家族成员DNA结合结构域的高度保守氨基酸如下：
Cys-x-x-Cys-x-x-Asp*-x-
Ala*-x-Gly*-x-Tyr*-x-x-
x-x-Cys-x-x-Cys-Lys*-x-
Phe-Phe-x-Arg*-x-x-x-x-
x-x-x-x-x-(x-x-)Cys-x-
x-x-x-x-(x-x-x-)Cys-x-
x-x-Lys-x-x-Arg-x-x-
Cys-x-x-Cys-Arg*-x-x-
Lys*-Cys-x-x-x-Gly*-Met
(SEQ ID NO:1)
其中X表示DNA结合结构域内的不保守氨基酸，星号表示几乎广泛保守的氨基酸残基，但其中在一些鉴定的激素受体中已发现有变化；在括号中包括的残基是任选的残基(因而，DNA结合结构域在长度上最短为66个氨基酸，但可包含有几个额外的残基)。
本文还涉及修饰现存的DNA结合结构域以识别新的靶识别序列。例如，根据本发明，已发现修饰类固醇/甲状腺超家族受体DNA结合结构域的“P-盒”序列提供了在其它嵌合激素受体中不存在的独特优势。例如，修饰“P-盒”氨基酸序列比天然存在的P-盒氨基酸序列优先结合不同的激素反应元件半位点可降低不需要的基因表达背景水平。因此，本发明的受体和方法提供在特定受试体中提高对外源基因表达的选择性的优势。
本文所用的短语“P-盒氨基酸序列”指典型地存在于第一锌指和连接区的结合区的激素受体的DNA结合结构域的近端元件区，例如，在DNA结合结构域的约氨基酸19-23(即，SEQ ID NO:1的氨基酸19-23，例如见Umesono等。(1989)，细胞57:1139-1146，图2)。Umesono等(1989)，出处同上，在表1中描述了各种激素受体DNA结合结构域的各种天然存在的P-盒氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，激素受体DNA结合结构域的P-盒序列修饰成具有与天然存在的P-盒氨基酸序列不同的P-盒氨基酸序列。在本发明优选的实施方案中，修饰的P-盒氨基酸序列与天然存在的P-盒氨基酸序列有3个氨基酸不同。
优选的是，修饰P-盒氨基酸序列，使只有被DNA结合结构域识别的半位点核苷酸序列被改变，而不改变DNA结合结构域两个半位点识别的之间的间隔区。例如，当蜕皮激素受体的DNA结合结构域用于本发明修饰的蜕皮激素受体时，P-盒可从氨基酸序列EGCKG(SEQ ID NO:2；它识别半位点为-AGGTCA-)修饰为氨基酸序列GSCKV(SEQ ID NO:3；它识别半位点序列-AGAACA-)。在目前优选的实施方案中，当本发明的修饰的蜕皮激素受体的DNA结合结构域来自蜕皮激素受体时，P-盒氨基酸序列修饰为GSCKV(SEQ ID NO:3)。
已发现体处进化方法可用于修饰和改进现存的DNA结合结构域(例如见Devlin等，1990，科学249:404-406；和Scott和Smith,1990，科学249:386-390)。
预期用于本发明修饰的蜕皮激素受体制品的激活结构域一般来自转录因子，并包含当与合适的DNA结合结构域和合适的配体结合结构域相联系时起激活基因表达功能的相邻氨基酸序列。与配体和DNA结合结构域一样，用于本发明修饰的蜕皮激素受体制品的，激活结构域可位于羧基末端，氨基末端或和配体结合结构域与DNA结合结构域之间。在本发明优选的实施方案中，激活结构域位于修饰的蜕皮激素受体氨基末端。
合适的激活结构域可以从许多来源获得，例如，从类固醇/甲状腺超家族受体成员的N-末端，从转录因子的激活结构域，如：VP16或GAL4激活结构域等获得。预期用于本发明的实践中的目前最优选的激活结构域从VP16蛋白质的N-末端区域获得。
预期用于本文的目前最优选的修饰的蜕皮激素受体为VgEcR(SEQID NO5),VpEcR(SEQ ID NO:7)或GEcR(SEQ ID NO:9)，特别优选VgEcR(SEQ ID NO 5)。这些修饰的蜕皮激素受体的制品在下文的实施例1中列出。
本发明的修饰的蜕皮激素受体蛋白可按实施例1所述的经过在合适的宿主细胞中表达编码嵌合蛋白的核苷酸构建体来生产。将表达构建体导入合适的宿主细胞生产所需蛋白的重组方法是本领域熟知的。本发明的修饰的蜕皮激素受体能够通过蛋白质本身的直接导入，通过将编码受体的DNA构建体导入到受试体中，或导入从该受试体获得的细胞中(其中转化该细胞并随后返回受试体)而导入特定的受试体中。
在优选的实施方案中，本发明的修饰的蜕皮激素受体在组织特异性启动子的控制下表达。正如本领域的技术人员所容易理解的术语“组织特异性”指在组织中基本上专一性地起始转录，其中特定的启动子从该组织中启动一个给定的基因表达。
根据本发明的一个方面，本发明的修饰的蜕皮激素受体以包含一个本发明的修饰的蜕皮激素受体和至少一个类固醇/甲状腺超家族受体的沉默配偶体的异型二聚体形式存在。优选的是的沉默配偶体为哺乳动物产生的受体，特别优选的是RXR。
本文预期的沉默配偶体为类固醇/甲状腺超家族受体的成员，能够与本发明的修饰的蜕皮激素受体形成异型二聚体种类，其中沉默配偶体不直接参加结合配体(即，只有修饰的蜕皮激素受体伴随配偶体的异型二聚体结合配体)。沉默配偶体能对受试体的细胞而言可以是内源性的或可以经过将编码受体的DNA构建体导入受试体而提供给受试体。用于本文的优选的沉默配偶体为RXR。在本发明方法的一个具体实施方案中，给所说的哺乳动物受试体提供外源的RXR。
异型二聚体受体的形成可调节在所说受体的配体存在时类固醇/甲状腺超家族受体成员反式激活基因维持在表达控制下的转录的能力。例如，修饰的蜕皮激素受体与另一哺乳动物激素受体形成的异型二聚体可在蜕皮激素反应元件存在时提高修饰的蜕皮激素受体诱导反式激活活性的能力。
根据本发明的另一方面，本发明的修饰的蜕皮激素受体以包含多个(即至少2个)本发明修饰的蜕皮激素受体的同型二聚体类形式存在。
预期用于本发明的配体为化合物，它能在细胞内结合本发明的修饰的蜕皮激素受体，从而形成一个配体/受体复合物，后者又能与合适的反应元件结合。本文可互换使用的术语“蜕皮激素”和“蜕皮甾类”，在本文以一般意义使用(根据本领域中的常规用法)，指具有合适的结合和反式激活活性的配体家族(例如见，Cherbas等，在无脊椎动物激素的生物合成，代谢和作用模式，(J.Hoffmann和M.porchet编辑)，p305-322；Springer-Verlag Berlin)。因此，蜕皮激素是一种调节基因转录使基因保持在蜕皮激素反应元件的控制下的化合物。
20-羟基-蜕皮激素(也称β-蜕皮激素)是主要天然存在的蜕皮激素。未取代蜕皮激素(也称为α-蜕皮激素)在周围组织中转化为β-蜕皮激素。天然存在的蜕皮激素类似物也包括在本发明的范围内。该类似物的例子通常指蜕皮甾类，包括松甾酮A,26-碘化松甾酮A，盐酸甾酮A,inokosterone,26-mesylinokosterone等。由于以前报导上述蜕皮激素不是毒素，致畸胎剂，也已知不影响哺乳动物的生理，因此它们是在根据本发明方法中用作培养细胞和转基因哺乳动物的诱导剂的理想候选者。
预期用于本发明的实践中的配体的特征为在正常情况下不存在于受试者细胞中，即该配体对受试者是外源性的。例如，蜕皮甾类并不天然存在哺乳动物***中。因此，根据本发明的方法，除非且直到将蜕皮甾类施用给受试体，否则基本上不发生所需基因的表达。
预期用于本发明的实践中的配体的有效量是获得基因表达产物的所需水平时所需的配体(即，蜕皮甾类)的量。配体可通过本领域熟知的各种方法施用。例如，该配体可经局部，口服，静脉内，腹膜内，血管内注射等施用。
预期用于本发明的实践中的蜕皮激素反应元件(涉及调节外源基因在受试者中的表达)包括天然的和修饰的蜕皮激素反应元件。由于本发明的修饰的蜕皮激素受体可以作为同型二聚体或异型二聚体(常有其沉默配偶体)发挥功能，所以任何以同型二聚体或异型二聚体形式与本发明的修饰的蜕皮激素受体反应的反应元件预期可用于本文所述的本发明的方法中。在本发明优选的实施方案中，本发明的修饰的蜕皮激素反应元件改造成不再能结合Farnesoid激素受体(因为哺乳动物Farnesoid激素受体能够结合天然蜕皮激素受体反应元件)。本发明的修饰的蜕皮激素反应元件当用于哺乳动物***时提供较低的外源基因背景表达水平，提高了基因表达***的选择性。
预期用于本文的蜕皮激素反应元件为短的顺式作用序列(即约12-20bp)，它是与特定激素受体相关的诸如：蜕皮激素或盐酸甾酮A的合适的配体发生反应的转录激活所需的元件。这些反应元件与其它蜕皮激素非反应性调控序列的联合使该调控序列变成蜕皮激素反应性。蜕皮激素反应元件序列以位置和方向依赖性方式发挥功能。
天然的蜕皮激素反应元件以前面已有描述，见，例如，Yao，等，细胞，71:63-72,1992。根据本发明修饰的蜕皮激素反应元件包括被0-5核苷酸的间隔子分开的两个半位点(相互以直接重复或反向重复方向)。本文使用的术语“半位点”指被特定类固醇/甲状腺超家族受体成员结合的连续的6个核苷酸序列。每个半位点一般被0到大约5个核苷酸的间隔子分开。通常，两个具有相应应间隔子的半位点组成一个激素反应元件。激素反应元件可以以多拷贝***到各种转录调控区。
根据本发明优选的修饰的蜕皮激素反应元件包括，以任意顺序的被0-5个核苷酸的间隔子分开的第一半位点和第二半位点；
其中第一个和第二个半位点相互为反向；
其中所说的第一个半位点具有序列：
-RGBNNM-
(或其互补序列)其中：
每个R独立地选自A或G；
每个B独立地选自G,C或T；
每个N独立地选自A,T,C或G；
每个M独立地选自A或C；
其前提是每个-RGBNNM的核苷酸组中至少有4核苷酸与序列-AGGTCA-对应位置的核苷酸相同；且
所说的第二半位点从糖皮质激素受体亚族反应元件获得。
与上面提出的-RGBNNM-序列互补的是-YCVNNK-，
其中
每个Y独立地选自T或C；
每个V独立地选自C,G或A；
每个N独立地选自A,T,C或G；
每个K独立地选自T或G；
例如本发明使用的修饰的蜕皮激素反应元件的具有-RGBNNM-基序的举例性的第一个半位点包括，选自-AGGGCA-,-AGTTCA,-AGGTAA-,-AGGTCA-,-GGTTCA-,-GGGTTA-,-GGGTGA-,-AGGTGA-，或-GGGTCA-的半位点。特别优选的第一半位点为-AGTGCA-。
预期用于本发明的实践中的糖皮质激素受体亚族反应元件是具有与一般糖皮质激素，盐皮质激素，孕激素，或雄激素受体结合的半位点的反应元件。合适的糖皮质激素受体亚族反应元件的半位点可选自下面序列(以任一方向)：
-RGNNCA-
(或其互补序列如-YCNNGT-)，其中R,Y和N定义如上。用于本发明修饰的蜕皮激素反应元件中的具有-RGNNCA-基序的举例性半位点包括：-AGAACA-,-GGAACA-,-AGTTCA-,-AGGTCA-,-GGAACA-,-GGTTCA-,-GGGTCA-,-GGGTCA-,-AGGTGA-,-GGGTCA-等，及其互补序列。特别优选的具有-RGNNCA-基序的半位点，包括-AGAACA-和-GGAACA，尤其优选-AGAACA-。
当上述修饰的蜕皮激素反应元件用于结合本发明的异型二聚体受体时，第二半位点与第一半位点反向。例如，在以5’-3’方向描述本发明的修饰蜕皮激素反应元件的单链时，可采用下面的通用基序；
RGBNNM-(N)x-TGNNCY(SEQ ID NO:10)
其中X为0到大约5的整数，特别优选X=1。作为对上述元件基序(SEQ ID NO:10)的一种可供选择的取向，本发明的一个反应元件以5’-3’方向可描述为：
RGNNCA-(N)x-KNNVCY(SEQ ID NO:11)
其中X是0到大约5的整数，特别优选X=1。
在本发明的优选实施方案中，第一半位点从蜕皮激素反应元件获得，第二半位点从选自糖皮质激素反应元件，盐皮质激素反应元件，孕激素反应元件或雄激素反应元件的激素反应元件获得。在本发明特别优选的实施方案中，第一半位点从蜕皮激素反应元件获得，第二半位点从糖皮质激素反应元件获得。
在本发明修饰的蜕皮激素反应元件的一个特别优选的的实施方案中，第一半位点是AGTGCA，所说的第二半位点是TGTTCT。用于本发明方法的目前最优选的修饰的蜕皮激素反应元件是：
AGTGCA-N-TGTTCT(SEQ ID NO:12)
在本发明的人另一方面，当本发明的修饰的蜕皮激素受体以同型二聚体存在时，优选使用的反应元件具有如下的直接重复基序(代替上述的反向重复基序)：
RGBNNM-(N)x’-RGBNNM(SEQ ID NO:13)
其中R,B,N和M按前文定义，且X’为0到大约5的整数，特别优选的是X’=3。
本发明的修饰的蜕皮激素反应元件的特征为在于基本上不具有组成型活性，这是指本发明修饰的蜕皮激素反应元件在导入哺乳动物表达***时起始的基因表达的背景水平基本上没有。因为已发现哺乳动物farnesoid激素受体能结合并反式激活从天然蜕皮激素反应元件的基因表达，因此在本发明的某些实施方案中(如：当需要避免farnesoid-介导的背景表达时)，采用修饰的蜕皮激素反应元件。
目前优选的本发明修饰的蜕皮激素反应元件的另一特性在于farnesoid X受体(FXR)基本上无结合亲和力，即，本发明的反应元件不能结合FXR(从而会产生不必要的表达背景水平)。因此，目前优选的本发明修饰的蜕皮激素反应元件优选诱导基本上为零的基础表达水平。
用于本发明的实践的反应元件与合适的外源基因产物表达启动子有效连接的。本文使用的术语“启动子”指被RNA聚合酶识别的特异性核苷酸序列，该酶起动RNA的合成。这个序列是在合适条件下可在其上特异性起始转录的位点。当与合适的启动子有效连接的外源基因导入合适宿主的细胞中时，外源基因的表达由存在的蜕皮甾类化合物控制，而蜕皮甾类化合物正常情况下不存在宿主细胞中。
根据本发明的另一实施方案，提供了在哺乳动物受试体中诱导外源基因表达的方法，其中所说的受试体含有：
(ⅰ)一种DNA构建体，包括在蜕皮激素反应元件控制下的外源基因，
(ⅱ)在诱导性启动子控制下的编码修饰的蜕皮激素受体的DNA；其中所说的修饰的蜕皮激素受体在其配体存在下，且任选在能够用作其沉默配偶体的受体进一步存在下与所说的蜕皮激素反应元件结合，和
(ⅲ)所说的修饰的蜕皮激素受体的配体；
所说的方法包括使所说的受试体处于适合于诱导所说的修饰的蜕皮激素受体表达的条件下。
预期用于本发明的实践中的诱导性启动子为转录调节区，除非存在诱导条件，否则它们不能发挥转录mRNA的功能。合适的诱导性启动子的例子包括相应于与IPTG反应的大肠杆菌lac操纵子(见Nakamura等，细胞18:1109-117.1979)；对重金属(如Zn)诱导起反应的金属硫蛋白启动子的金属调控元件(见，Evans等美国专利No.4,879,009)，对IPTG反应的噬菌体T7lac启动子(见，Studier等，酶学方法，185：60-89,1990；和U.S.#4,952,496)，热休克启动子等的DNA序列。
根据本发明的另一个实施方案，提供了在包含DNA构建体的哺乳动物受试体中诱导外源基性因表达的方法，其中该DNA构建体包含所说的在蜕皮激素反应元件控制下的外源性基因，所说的方法包括导入所说的受试体：
一种修饰的蜕皮激素受体；和
所说的修饰的蜕皮激素受体的配体，
其中所说的受体，与其配体结合，并任选存在一个可用作沉默配偶体的受体，与所说的蜕皮激素反应元件结合，从而激活转录。
根据本发明的另一个实施方案，提供表达对宿主生物体有害的重组产物的方法，所说的方法包括：用下列物质转化合适的宿主细胞：
(ⅰ)一种DNA构建体，它编码在蜕皮激素反应元件控制下的所说重组产物，
(ⅱ)编码修饰的蜕皮激素受体的DNA；
在合适培养基中培养所说的宿主细胞；通过将所说的修饰的蜕皮激素受体的配体，及任选一个可用作为的所说的修饰的蜕皮激素受体沉默配偶体导入到所说的宿主细胞中诱导所说的重组产物的表达。
预期用于根据本发明的方法表达的对宿主生物体有害的重组产物包括具有提供对机体有毒影响之功能的任何基因产物。例如：诸如白喉毒素等毒素的诱导性表达容许诱导性组织的特异性脱离(Ross等(1993)基因与发育7,1318-1324)。因此，一种在表达该产物的细胞中诱导细胞程序性死亡的许多基因产物预期在本文中使用(例如见：程序性死亡，细胞死亡的分子基础，现代细胞和分子生物学通讯，冷泉港实验室出版，1991)。
预期用于本发明的实践中的合适的培养基包括任何基本没有配体的生长和/或维持培养基，其中该配体与本发明修饰的蜕皮激素受体结合到能够结合蜕皮激素反应元件上。
根据本发明的另一实施方案，提供了编码本发明修饰的蜕皮激素受体的核酸。本发明的核酸能够***到本领域的技术人员已知的各种表达载体中。优选的编码修饰的蜕皮激素受体的核酸在SEQ ID NOs:4,6和8中描述，特别优选SEQ ID NO:4。
根据本发明的另一实施方案，提供了将本发明的构建体导入合适的宿主细胞中有用的基因转移载体。该基因转移载体包括具有最小启动子(即，没有增强子的启动子区)的转录调控区和本发明修饰的蜕皮激素反应元件，其中所说的调控区与含有外源基因的DNA有效相联，且其中所说的修饰的蜕皮激素反应元件以多拷贝存在。反应元件的拷贝数可由本领域的技术人员很容易地改变。例如：转录调节区可包含1到大约50个拷贝的特定反应元件，优选2到大约25个拷贝，更优选3到大约10-15个拷贝，特别优选大约4-6个拷贝。
预期用于本文的基因转移载体(也称为“表达载体”)是重组核酸分子，它用于将外源核酸转运进细胞以进行其表达和/或复制。表达载体可以是环状或线型，可在其中***各种核酸构建体。典型的表达载体以质粒的形式存在，当它导入适当的宿主细胞时导致所***的DNA表达。
本文所用的短语“转录调节区”指基因或表达构建体控制mRNA转录起始的区域。预期用于本文的调节区典型地包含至少一个与蜕皮激素反应元件结合的最小启动子。最小启动子在与增强子区(例如，激素反应元件)结合时，功能为与配体/受体复合物反应而起始mRNA转录。然而，没有所需的诱导剂(配体)存在时不能发生转录。
本文所用的短语“可操作地相连”指DNA与诸如启动子，增强子，转录和翻译终止位点，及其它信号序列的调控和效应器的核苷酸序列的功能性关系。例如：DNA与启动子的可操作地连接指DNA与启动子之间的物理和功能关系使得由特异性识别RNA聚合酶结合和转录该DNA，从启动子起始该DNA的转录。
优选的转录调控区进一步包含一个普遍存在的转录因子的结合位点。这样的结合位点优选位于启动子和本发明经修饰的蜕皮激素反应元件之间。本文采用的合适的普遍转录因子在本领域是众所周知的，包括，例如，Sp1。
适合用于本发明实践的表达载体是本领域的技术人员所熟知的，包括那些可在真核和/或原核细胞中复制的载体，以及那些保持游离状态的和整合进宿主细胞基因组的。典型的表达载体进一步包含其它功能上重要的核酸序列。例如编码抗生素抗性蛋白的表达构建体，及类似物。
举例性的真核表达载体包括诸如pSV-2gpt***(Mulligan等，自然1979,277:108-114)的真核构建体；遗传研究所描述的表达克隆载体(科学，1985,228:810-815)pBlueSkript(Stratagene,LaJolla,CA)，及类似物。每一个这样的质粒载体都能够启动本发明感兴趣的嵌合蛋白的表达。
依赖于调控的特性，启动子可以是组成性或诱导性调控的，或可以是组织特异性的(例如：只在T-细胞，内皮细胞，平滑肌细胞，及类似物中表达)。预期在本发明的实践中应用的举例性启动子包括SV40早期启动子，细胞肥大病毒(CMV)启动子，小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)类固醇-诱导型启动子，鼠莫洛尼氏白血病毒(MMLV)启动子，延伸因子1α(EF1α)启动子，白蛋白启动子，APOA1启动子，环腺苷酸依赖型激酶Ⅱ(CaMKⅡ)启动子，角蛋白启动子，CD3启动子，免疫球蛋白轻链或重链启动子，神经丝启动子，神经元特异性烯醇化酶启动子，L7启动子，CD2启动子，肌球蛋白轻链激酶启动子，HOX基因启动子，胸腺嘧啶核苷激酶(TK)启动子，RNA PolⅡ启动子，MYOD启动子，MYF5启动子，磷酸甘油激酶(PGK)启动子，Stf1启动子，低密度脂蛋白(LDL)启动子，及类似物。
将包含本发明核酸构建体的表达载体导入(转导)到宿主细胞以产生转导的重组细胞(即包含重组异源核酸的细胞)的合适的方法是在本领域熟知的(见综述，Friedmann,1989，科学，244:1275-1281；Mulligan,1993，科学，260:926-932，分别以其全文引入以供参考。转导的举例性方法包括，例如，使用病毒载体感染(例如见，美国专利4,405,712和4,650,764)，磷酸钙转染(美国专利4,399,216和4,634,665)，硫酸葡聚糖转染，电穿孔，脂质体转染(见，例如美国专利4,394,448和4,619,794)，细胞转染(cytofection)，粒子轰击，及类似方法。异源核酸可任选包括容许其染色体外(即，游离型)保持的序列，或异源核酸可以是整合到宿主基因组中的供体核酸。
在具体的实施方案中，所说的基因转移载体是病毒载体，优选逆转录病毒载体。逆转录病毒载体是具有位于两个逆转录病毒LTRs之间编码外源基因的表达构建体的基因转移质粒。逆转录病毒载体典型地包括合适的包装信号，此信号可使逆转录病毒载体，或使用逆转录病毒载体为模板转录的RNA在合适的包装细胞系中包装进病毒粒子(见，例如，美国专利4,650,764)。
本文使用的合适的逆转录病毒载体在，例如，美国专利5,399,346和5,252,479；和WIPO公开WO92/07573,WO90/06997,WO89/05345,WO92/05266和WO92/14829中描述，本文引用作为参考，这些文献提供了对使利用逆转录病毒载体将核酸有效导入人细胞的方法的描述。其它逆转录病毒载体包括，例如，小鼠乳腺瘤病毒载体(例如Shackleford等，1988,PNAS,USA,85:9655-9659)，及类似载体。
提供辅助细胞的各种程序也是本领域是熟知的，此辅助细胞可产生基本没有复制病毒的逆转录病毒载体颗粒。例如见，美国专利4,650,764；Miller，人类基因治疗，1:5-14(1990)；Markowitz，等，病毒学杂志，61(4):1120-1124(1988)；Watanabe，等，分子和细胞生物学，3(12):2241-2249(1983)；Danos等，美国科学院学报，85:6460-6464(1988)；和Bosselman等，分子和细胞生物学，7(5):1797-1806(1987)，这些文献公开了生产病毒载体和能使产生包含复制病毒的病毒载体的机会最小化的辅助细胞的程序。
适于实施本发明的重组逆转录病毒采用熟知的用于生产逆转录病毒粒子的方法生产。例如见美国专利4,650,764；Miller，人类基因治疗，1:5-14(1990)；Markowitz等，病毒学杂志，61(4):1120-1124(1988)；Watanabe等，分子和细胞生物学3(12):2241-2249(1983)；Danos等，美国科学院学报85:6460-6464(1988)；和Bosselman等，分子和细胞生物学7(5):1797-1806(1987)。
根据本发明的另一实施方案，提供了包含编码本发明经修饰的蜕皮激素受体的核酸的重组细胞。用于导入本发明的病毒载体的举例性的真核细胞包括，例如CV-1细胞，P19细胞和NT2/D1细胞(来自人胚胎癌)，COS细胞，小鼠L细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，原代人成纤维细胞，人胚肾细胞，非洲绿猴细胞，HEK293(ATCC保藏号#CRL1573；美国专利号5,024,939),Ltk-细胞(ATCC保藏号#CCL1.3),COS-7细胞(ATCC保藏号#CRL1651),DG44细胞(dhfr-CHO细胞；例如见，Urlaub等，(1986)细胞分子遗传学12:555)，培养的原代组织，培养的肿瘤细胞，及其类似物。目前优选的细胞包括CV-1和293细胞。
根据本发明的另一实施方案，提供了包含编码本发明经修饰的蜕皮激素受体的核酸的转基因哺乳动物。本文使用的短语“转基因哺乳动物”指包含一个或多个可遗传的表达构建体的哺乳动物，其中可遗传的表达构建体包含一个重组的经修饰的蜕皮激素受体转移基因和/或一个在本发明的经修饰的蜕皮激素反应元件转录控制下的外源基因。优选的是，本发明的转基因动物也包含一个或多个可遗传的表达构建体，可遗传的表达构建体包含一个用作经修饰的蜕皮激素受体(如RXR)的沉默配偶体功能的类固醇/甲状腺素超家族的受体。
使用特定的核酸构建体制备转基因动物的方法在本领域中是众所周知的。在制备本发明的转基因动物时，优选繁殖两个转基因品系。第一个品系会表达，例如RXR和经修饰的EcR(例如，VpEcR)。组织特异性通过选择随后指导受体表达的组织特异性启动子(例如T细胞特异性)而提供。第二个品系包含控制异源cDNA表达的蜕皮激素反应性启动子。
在本发明优选的实施方案中，本发明的转基因哺乳动物包含一个或多个表达构建体，该表达构建体包含编码一个经修饰的蜕皮激素受体，异源RXR和一个在本发明的经修饰的蜕皮激素反应元件的转录控制下的外源基因的核酸。已发现在包含一个蜕皮激素诱导性启动子(即本发明的经修饰的蜕皮激素反应元件)并表达经修饰的蜕皮激素受体和RXR的转基因小鼠中，盐酸甾酮的处理能够激活基因表达。因此，通过修饰的蜕皮激素受体和RXR的组织特异性表达以及激素的定时处理，诱导性基因可获得空间，剂量，时间特异性的表达。
根据本发明的另一实施方案，提供了在转基因哺乳动物中诱导外源基因表达的方法，其中该转基因哺乳动物包含根据本发明的修饰的蜕皮激素受体，所说的方法包括：
在所说的哺乳动物中导入编码外源基因的DNA构建体，其中该外源基因在与所说的经修饰的蜕皮激素受体反应性的蜕皮激素反应元件转录控制下；和
给所说的哺乳动物施用一定量的，对诱导所说的外源基因表达有效的所说的经修饰的蜕皮激素受体的配体。
如上文所讨论的，经修饰的蜕皮激素受体在类固醇/甲状腺素超家族受体的沉默配偶体存在时形成同型二聚体，或任选的异型二聚体，并对含有与形成的特定同型二聚体或异型二聚体反应的反应元件的表达载体发挥激活转录功能。
根据本发明的另一实施方案，提供了在哺乳动物受体中诱导两种不同基因的方法，包括；使用本发明的蜕皮激素诱导性***激活第一外源基因；采用四环素诱导性***激活第二基因。本发明的诱导两个不同基因的方法特别有利，因为它容许以时间，空间，和剂量特异性控制两个外源基因。
四环素诱导性***在本领域是众所周知的(例如见，Gossen等，(1992)美国科学院学报，89,5547-5551；Gossen等(1993)TIBS 18,471-475；Furth等(1994)美国科学院学报91,9302-9306：和Shockett等，(1995)美国科学院学报92,6522-6526)。
本文提及的所有美国和外国专利出版物，教科书，和杂志出版物以其全文特意引入本文作为参考。现在参考以下非限制性的实施例对本发明作更详细的描述。
实施例1
制备经修饰的蜕皮激素受体
质粒的制备
质粒CMX-EcR,CMX-USP,CMX-FXR,CMX-hRXRa,EcREx5-ΔMTV-Luc,CMX-GEcR,MMTV-luc，和CMX-GR在以前已被描述(Yao等，自然366:476-479(1993)和Forman等，细胞81:687-693(1995))。
质粒CMX-VpEcR通过连接psk-EcR和CMX-Vp16的EcoRI片段来构建。
质粒CMX-VgEcR通过采用转化诱变试剂盒(Clontech)和诱变的寡聚核苷酸(SEQ ID NO:14):5’-TACAACGCCCTCACCTGTGGATCCTGCAAGGTGTTTCTTTCGACGCAGC-3’定点诱变CMX-VpEcR来产生。
VpEcR诱变成VgEcR的将蜕皮激素受体的DNA结合结构域的P-盒区改变成与GR的此区类似(Umesono和Evans，细胞57:1139-1146(1989))。在蜕皮激素受体的DNA结合结构域中的下列氨基酸已改变：E282G,G283S，和G286V(E=谷氨酰胺，G=甘氨酸，S=丝氨酸，V=缬氨酸)。
报告基因构建体EcREx4-ΔHSP-β-gal通过两个包含HSP-EcRE的退火寡聚核苷酸的寡聚化而构建成(Yao等，自然366:476-479(1993))。
EcREx4-Splx3-ΔHSP-βgal通过将下列退火寡聚化核苷酸连接进EcREx4-ΔHSP-β-gal的Asp718位点而构建成，(SEQ ID NO:15):5’-GTACTCCCGGGGCGGGGCTATGCGGGGCGGGGCTAATCGCTAGGGGCGGGGCA-3’
和(SEQ ID NO:16):5’-GTACTGCCCCGCCCCTAGCGATTAGCCCCGCCCCGCATAGCCCCGCCCCGGGA-3’
ΔHSP是来自果蝇的其增强子被删除的热休克启动子的最小启动子。
为产生构建体E/GREx4-ΔMTV-Luc，将下列寡聚核苷酸(SEQ ID NO:17):
5’-AGCTCGATGGACAAGTGCATTGTTCTTTGCTGAA-3’；
和(SEQ ID NO:18)
5’-AGCTTTCAGCAAGAGAACAATGCACTTGTGCATCG-3’
进行退火，多聚体化，并连入ΔMTV-Luc的HindⅢ位点。得到的报告基因含4个拷贝的本发明经修饰的蜕皮激素反应元件E/GRE。
为生产质粒pRC-ESHβ，将包含EcREx4-Splx3-ΔHSP-β-gal的BglⅡ/(XhoⅠ)片段亚克隆到包含新霉素抗性基因的BglⅡ/(NotⅠ)消化的pRC-CMV(Invitrogen,San Diego,CA)中。
细胞培养和暂时性转染：
CV-1细胞在补充10％的胎牛血清的DMEM中维持。暂时性转染使用DOTAP转染试剂(Boehringer-Mannheim)进行。采用β-半乳糖苷酶作为报告基因的转染通过半乳糖光荧光测试法(Tropix,Bedford,MA)或标准液体ONPG测试法(Sigma,St.Louis,MO)测试。得到的值用CMX-荧光素酶的共转染标准化。使用荧光素酶作为报告基因的转染通过采用荧光素和ATP的标准技术测试。这些值用CMX-β-半乳糖苷酶的共转染标准化。除非另有说明，激素处理的细胞用乙醇，50μM保幼激素Ⅲ(Sigma),1μM盐酸甾酮A(Zambon,Bresso,IT)，或1μM***(Sigma)处理。
为最大化本发明的蜕皮激素诱导性***的敏感性，对蜕皮激素受体进行了修饰。蜕皮激素受体的N-末端反式激活结构域被糖皮质激素受体(GR)的相应结构域替换，产生经修饰的蜕皮激素受体GEcR(见附图1D)。CV-1细胞用编码上面讨论的经修饰的蜕皮激素受体的质粒CMX-GEcR转染。在转染后，细胞用乙醇或1μM盐酸甾酮A处理。这个杂合的经修饰的蜕皮激素受体在暂时转染测试(附图1A)中增强盐酸甾酮反应性3-11倍。蜕皮激素受体的天然异型二聚体配偶体，USP被其哺乳动物同源物，类视色素X受体(RXR)替换，产生一个更有效的配体依赖性异型二聚体，并提供34倍的诱导(附图1A)。
然而，一个更有效的异型二聚体通过结合RXR和VpEcR，一个粘附在VP16激活结构域的蜕皮激素受体N-末端截短片段而获得。并产生212倍的诱导(附图1A和1D)。与大多数表现高度组成型活性的核受体/VP16融合蛋白不同，VpEcR产生配体依赖性超级诱导而维持非常低的基础活性。(Underhill等，Mol.Encod.8:274-285(1994)和Perlmann等，基因和发育7:1411-1422(1993))。
另外，报告基因载体也通过在最小启动子和蜕皮激素反应元件之间***遍在转录因子Sp1的共同结合位点而进行修饰(Kamine等，美国科学院学报88:8510-8514(1991)和Strahle等，EMBO 7:3389-3395(1988))。向蜕皮激素反应性启动子中加入Sp1位点提高绝对活性5倍(附图1A)。
实施例2
构建新的蜕皮激素反应元件
尽管没有哺乳动物转录因子表现出有类似由两个具有被一个核苷酸间隔的AGGTCA序列的反向半位点组成的蜕皮激素反应元件的天然增强子元件，但很难排除这种可能性。最近克隆的farnesoid X受体(FXR)与极高浓度的farnesoids反应能够很微弱地激活某些包含蜕皮激素反应元件的合成启动子(Forman等，细胞81:687-693(1995))。
在包含FXR的细胞和转基因小鼠中，内源性受体对基因表达激活会产生不需要的报告蛋白背景水平。为克服这个潜在的问题，VpEcR的DNA结合特异性被改变为与GR的类似，GR作为同型二聚体结合被3个核苷酸间隔的反向重复的AGAACA序列。这个改变的结合特异性是通过诱变以前表现为DNA序列识别所必需的DNA结合结构域的P-盒中的3个氨基酸残基而获得(Umesono和Evans，细胞57:1139-1146(1989))。这个新的杂合的修饰的蜕皮激素受体本文称为VgEcR，并对一种本文称为E/GRE(SEQ ID NO:12)的新的杂合反应元件具反应性，该新的杂合反应元件包含两个不同的半位点基序，RGBNNM和RGNNCA，并被一个核苷酸间隔开(附图1B)。这个新的反应元件是糖皮质激素反应元件(GRE)和类似RXR,EcR，视黄酸受体(RAR)，甲状腺素受体(T3R)等Ⅱ型核受体的杂合体。尽管FXR能够激活包含野生型蜕皮激素反应元件的启动子，但它不能激活包含E/GRE的启动子(附图1B；注意对数刻度)。E/GRE报告基因不能被GR激活，VgEcR也不能激活***反应性启动子(附图1C)。
实施例3
在稳定细胞系中对蜕皮激素反应性的测试
产生的稳定细胞系包含经修饰的蜕皮激素受体VpEcR，一个异型二聚体配偶体(RXR)，和蜕皮激素诱导性报告基因(附图2)。293细胞采用下列线性化质粒转染，pRC-ESHβ,EcREx5-ΔMTV-Luc,CMX-VpEcR，和CMX-hRXRa。第二天，细胞按1∶10稀释，并容许在加入1mg/mlG418(GIBCO)选择前恢复一天。选择14天后，分离到14个单独的克隆，并在存在0.5mg/mlG418时分别生长。14个G418抗性克隆中，10个表现有不同程度的盐酸甾酮反应性。
这些细胞系中的一个，N13在存在或不存在1μM盐酸甾酮的条件下生长20小时。然后按实施例1所述测试细胞裂解物的β-半乳糖苷酶和荧光素酶活性。对稳定细胞系进行X-gal染色。细胞与10％的甲醛在PBS中简单混合，接着用X-Gal(分子探针，Eugene.OR)染色2～6小时。在用1μM的盐酸甾酮处理24小时后，在染色3小时后100％的细胞变成深蓝。因此，包含经修饰的蜕皮激素受体VpEcR，异型二聚体配偶体(RXR)，和被修饰的蜕皮激素反应元件调控的报告基因构建体的哺乳动物细胞，与诸如蜕皮激素的配体反应有效表达外源基因。
剂量反应测试通过将N13细胞在不同浓度的盐酸甾酮中生长36小时，然后测试β-半乳糖苷酶活性(使用熟知的ONPG测试法)，或测试细胞的荧光素酶活性来进行。N13细胞中稳定整合的β-半乳糖苷酶和荧光素酶报告基因的剂量反应曲线表明在最终浓度10μM的盐酸甾酮(附图3A)中可获得达到3个数量级的诱导性。在低至100nM浓度的盐酸甾酮中可获得100倍的诱导(附图3A)。
最后，测量了盐酸甾酮介导的诱导的动力学。N13细胞在含有1μM盐酸甾酮的分离小孔中生长，在不同的时间收获，并测定荧光素酶活性。观测到处理3小时后100倍，8小时后1000倍和20小时后20000倍的最大效应的诱导(附图3B)。在包含CMX-VgEcR和E/GRE报告基因的稳定细胞系中观测到类似结果。
实施例4
盐酸甾酮的生物利用率和活性
为了将盐酸甾酮在小鼠中作为潜在的激素使用，检查了它的毒性和生物利用率。对于毒性研究，向成年小鼠腹腔内注射悬浮在芝麻油中的20mg盐酸甾酮A。接着，对小鼠观测约2个月。对于致畸形的研究，向怀孕小鼠腹腔内注射悬浮在芝麻油中的20mg盐酸甾酮A，并对母鼠和幼鼠观测3个月。结果表明在注射到小鼠中时，盐酸甾酮保持其活性，而且无毒性和致畸形作用，也不被血清结合蛋白灭活。除了盐酸甾酮(一种蜕皮激素)的惰性外，VpEcR和RXR的过度表达不表现出毒性。
对于盐酸甾酮的生物利用率的研究，向成年小鼠的腹腔内注射有或无10mg盐酸甾酮的芝麻油，接着处死进行血清收集。在12小时后，从小鼠中抽出血液，经过对全血进行简单离心分离血清。为了进行盐酸甾酮活性检测的转染测试，芝麻油注射的小鼠的血清分成两半，并且一半补加盐酸甾酮至最终浓度为10μM。三批小鼠血清在DMED中以1∶10稀释并放在用CMX-GEcR,CMX-hRXRa，和EcREx5-DMTV-Luc转染的CV-1细胞上。
结果在附图4中表示，表明盐酸甾酮处理的小鼠的血清产生的荧光素酶活性比得上补加1μM盐酸甾酮的未处理小鼠血清看到的结果。结果表明单一位点注射的物质可能会广泛循环，并且很少或没有因为与血清蛋白联系的活性抑制。
实施例5
存转基因小鼠中的盐酸甾酮依赖性基因表达
为生产转基因小鼠，制备了以下的DNA构建体，接着注射到受精卵中：CD3-VpEcR,CD3-RXR,ESHβ(Lee等，实验医学杂志175:1013-1025(1992))。繁殖的两个分离的转基因小鼠系分别包含蜕皮激素诱导性报告基因，ESHβ或VpEcR和RXR的T-细胞特异性表达构建体。前者称为报告基因小鼠，后者称为受体小鼠，双重转基因小鼠称为受体/报告基因小鼠。将构建体CD3-VpEcR和CD3-RXR混合并共注射，而ESHβ被单独注射。用Southern印迹分析进行原代基因型测定，并用点印迹分析法监测转基因小鼠的传递。受体小鼠通过Northern印迹法分析从这些小鼠收集的RNA来分析VpEcR和RXR的表达。对于Northern印迹分析法，15μg来自胸腺和各种作为对照组织的总RNA跑变凝性胶并印迹到硝酸纤维素膜上。用放射标记的β-gal-特异性探针探测印迹并在胶片上曝光2天。通过视觉观测发现这些受体小鼠健康，可育，且表现正常。另外，转移基因按预期经孟德尔遗传学的被转移到后代。这些资料表明在T-细胞中VpEcR和RXR的过表达不具毒性。
受体表达小鼠与报告基因小鼠(包含ESHβ)繁殖产生双重转基因受体/报告基因小鼠。成年受体/报告基因转基因小鼠(基因型=CD3-VpEcR；CD3-RXR；和ESHβ)经腹腔内注射有或无10mg盐酸甾酮的芝麻油。然后，对双重转基因小鼠系采用从处理48小时后包括胸腺，脑和肝的各种组织中分离的RNA进行Northern印迹分析以检测蜕皮激素诱导性启动子的特异性诱导。所用的探针对蜕皮激素诱导性启动子的活性具有特异性。放射自显影曝光36小时。Northern分析的结果表明对包含T-细胞特异性表达构建体VpEcR和RXR，和蜕皮激素诱导性报告基因ESHβ的转基因小鼠的盐酸甾酮处理导致胸腺中蜕皮激素诱导性启动子的明显诱导，而其不存在时观察到较低的基础活性。
尽管本发明已经参考其某些优选的实施方案进行了详细描述，但应该理解修改与变化也在所描述和所要求的实质和范围内。
序列表
(1)一般信息：
  (ⅰ)申请人：索尔克生物学研究所，等
  (ⅱ)发明题目：调节外源基因在哺乳动物***中表达的激素介导的方法，及其相关产物。
  (ⅲ)序列数：18
  (ⅳ)联系地址：
    (A)联系人：Gray Cary Ware & Freidenrich
    (B)街道：4365 Excutive Drive,Suite1600
    (C)城市：圣地亚哥
    (D)州：加利福尼亚州
    (E)国家：美国
    (F)邮政编码：92121
  (ⅴ)计算机可读形式：
    (A)媒体类型：软盘
    (B)计算机：IBM PC兼容机
    (C)操作***：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.25
  (ⅵ)目前申请数据：
    (A)申请号：PCT/US 97/05330
    (B)申请日：27/03/1997
    (C)分类：
  (ⅷ)律师/代理人信息：
    (A)姓名：Reiter,Stephen E
    (B)登记号：31,192
    (C)参考/备案号：SALK1520WO
  (ⅸ)电迅信息：
    (A)电话：619-677-1409
    (B)电传：619-677-1465
    (2)SEQ ID NO:1的信息：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：71个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：两种
  (ⅱ)分子类型：蛋白质
  (ⅴ)片段类型：内部
(ⅹⅰ)SEQ ID NO:1的序列描述：
Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Asp Xaa Ala Xaa Gly Xaa Tyr Xaa XaaXaa
1               5                   10                   15
Xaa Cys Xaa Xaa Cys Lys Xaa Phe Phe Xaa Arg Xaa Xaa Xaa XaaXaa
            20              25                         30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa XaaCys
         35                  40                   45
Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Arg XaaXaa
     50                  55                   60
Lys Cys Xaa Xaa Xaa Gly Met
65                  70
(2)SEQ ID NO:2的信息：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：5个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
  (ⅱ)分子类型：肽
  (ⅴ)片段类型：内部
  (ⅹⅰ)SEQ ID NO:2的序列描述：
  Glu Gly Cys Lys Gly
  1               5
(2)SEQ ID NO:3的信息：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：5个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
  (ⅱ)分子类型：肽
  (ⅴ)片段类型：内部
  (ⅹⅰ)-SEQ ID NO:3的序列描述：
  Gly Ser Cys Lys Val
  1               5
(2)SEQ ID NO:4的信息：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：2241个碱基对
    (B)类型：核酸
    (c)链型：两种
    (D)拓扑学：两种
  (ⅱ)分子类型：cDNA
  (ⅸ)特征：
    (A)名字/关键词：CDS
    (B)位置：1..2241
    (D)其它信息：/产品=“VgEcR”
  (ⅹⅰ)SEQ ID NO:4的序列描述：ATG GCC CCC CCG ACC GAT GTC AGC CTG GGG GAC GAG CTC CAC TTA GAC
 48Met Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp1               5                 10                   15GGC GAG GAC GTG GCG ATG GCG CAT GCC GAC GCG CTA GAC GAT TTC GAT
 96Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp
         20                 25                   30CTG GAC ATG TTG GGG GAC GGG GAT TCC CCG GGT CCG GGA TTT ACC CCC
144Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro
    35                   40                   45CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ATG GCC GAC TTC GAG TTT
192His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe
50                   55                   60GAG CAG ATG TTT ACC GAT GCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT GGG AAG
240Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly Lys65                  70                  75                  80CTT CTA GGT ACC TCT AGA AGG ATA TCG AAT TCT ATA TCT TCA GGT CGC
288Leu Leu Gly Thr Ser Arg Arg Ile Ser Asn Ser Ile Ser Ser Gly Arg
             85                  90                  95GAT GAT CTC TCG CCT TCG AGC AGC TTG AAC GGA TAC TCG GCG AAC GAA
336Asp Asp Leu Ser Pro Ser Ser Ser Leu Asn Gly Tyr Ser Ala Asn Glu
        100                  105                 110AGC TGC GAT GCG AAG AAG AGC AAG AAG GGA CCT GCG CCA CGG GTG CAA
 384Ser Cys Asp Ala Lys Lys Ser Lys Lys Gly Pro Ala Pro Arg Val Gln
    115                 120                 125GAG GAG CTG TGC CTG GTT TGC GGC GAC AGG GCC TCC GGC TAC CAC TAC
432Glu Glu Leu Cys Leu Val Cys Gly Asp Arg Ala Ser Gly Tyr His Tyr
130                  135                 140AAC GCC CTC ACC TGT GGA TCC TGC AAG GTG TTC TTT CGA CGC AGC GTT480Asn Ala Leu Thr Cys Gly Ser Cys Lys Val Phe Phe Arg Arg Ser Val145                 150                 155                 160ACG AAG AGC GCC GTC TAC TGC TGC AAG TTC GGG CGC GCC TGC GAA ATG
528Thr Lys Ser Ala Val Tyr Cys Cys Lys Phe Gly Arg Ala Cys Glu Met
           165                 170                  175GAC ATG TAC ATG AGG CGA AAG TGT CAG GAG TGC CGC CTG AAA AAG TGC
576Asp Met Tyr Met Arg Arg Lys Cys Gln Glu Cys Arg Leu Lys Lys Cys
        180                  185                190CTG GCC GTG GGT ATG CGG CCG GAA TGC GTC GTC CCG GAG AAC CAA TGT
624Leu Ala Val Gly Met Arg Pro Glu Cys Val Val Pro Glu Asn Gln Cys
    195                 200                 205GCG ATG AAG CGG CGC GAA AAG AAG GCC CAG AAG GAG AAG GAC AAA ATG
672Ala Met Lys Arg Arg Glu Lys Lys Ala Gln Lys Glu Lys Asp Lys Met
 210                    215              220ACC ACT TCG CCG AGC TCT CAG CAT GGC GGC AAT GGC AGC TTG GCC TCT
720Thr Thr Ser Pro Ser Ser Gln His Gly Gly Asn Gly Ser Leu Ala Ser225                  230                235                 240GGT GGC GGC CAA GAC TTT GTT AAG AAG GAG ATT CTT GAC CTT ATG ACA
768Gly Gly Gly Gln Asp Phe Val Lys Lys Glu Ile Leu Asp Leu Met Thr
            245                 250                 255TGC GAG CCG CCC CAG CAT GCC ACT ATT CCG CTA CTA CCT GAT GAA ATA
816Cys Glu Pro Pro Gln His Ala Thr Ile Pro Leu Leu Pro Asp Glu Ile
    260                     265                 270TTG GCC AAG TGT CAA GCG CGC AAT ATA CCT TCC TTA ACG TAC AAT CAG864Leu Ala Lys Cys Gln Ala Arg Asn Ile Pro Ser Leu Thr Tyr Asn Gln
    275                 280                 285TTG GCC GTT ATA TAC AAG TTA ATT TGG TAC CAG GAT GGC TAT GAG CAG
 912Leu Ala Val Ile Tyr Lys Leu Ile Trp Tyr Gln Asp Gly Tyr Glu Gln
290                 295                 300CCA TCT GAA GAG GAT CTC AGG CGT ATA ATG AGT CAA CCC GAT GAG AAC
960Pro Ser Glu Glu Asp Leu Arg Arg Ile Met Ser Gln Pro Asp Glu Asn305                 310                 315                 320GAG AGC CAA ACG GAC GTC AGC TTT CGG CAT ATA ACC GAG ATA ACC ATA1008Glu Ser Gln Thr Asp Val Ser Phe Arg His Ile Thr Glu Ile Thr Ile
            325                 330                 335CTC ACG GTC CAG TTG ATT GTT GAG TTT GCT AAA GGT CTA CCA GCG TTT
1056Leu Thr Val Gln Leu Ile Val Glu Phe Ala Lys Gly Leu Pro Ala Phe
        340                 345                 350ACA AAG ATA CCC CAG GAG GAC CAG ATC ACG TTA CTA AAG GCC TGC TCG
1104Thr Lys Ile Pro Gln Glu Asp Gln Ile Thr Leu Leu Lys Ala Cys Ser
    355                 360                 365TCG GAG GTG ATG ATG CTG CGT ATG GCA CGA CGC TAT GAC CAC AGC TCG1152Ser Glu Val Met Met Leu Arg Met Ala Arg Arg Tyr Asp His Ser Ser370                  375                  380GAC TCA ATA TTC TTC GCG AAT AAT AGA TCA TAT ACG CGG GAT TCT TAC
1200Asp Ser Ile Phe Phe Ala Asn Asn Arg Ser Tyr Thr Arg Asp Ser Tyr385                 390                 395                 400AAA ATG GCC GGA ATG GCT GAT AAC ATT GAA GAC CTG CTG CAT TTC TGC1248Lys Met Ala Gly Met Ala Asp Asn Ile Glu Asp Leu Leu His Phe Cys
            405                 410                 415CGC CAA ATG TTC TCG ATG AAG GTG GAC AAC GTC GAA TAC GCG CTT CTC1296Arg Gln Met Phe Ser Met Lys Val Asp Asn Val Glu Tyr Ala Leu Leu
        420                425                  430ACT GCC ATT GTG ATC TTC TCG GAC CGG CCG GGC CTG GAG AAG GCC CAA
1344Thr Ala Ile Val Ile Phe Ser Asp Arg Pro Gly Leu Glu Lys Ala Gln
    435                 440                 445CTA GTC GAA GCG ATC CAG AGC TAC TAC ATC GAC ACG CTA CGC ATT TAT1392Leu Val Glu Ala Ile Gln Ser Tyr Tyr Ile Asp Thr Leu Arg Ile Tyr
450                 455                 460ATA CTC AAC CGC CAC TGC GGC GAC TCA ATG AGC CTC GTC TTC TAC GCA
1440Ile Leu Asn Arg His Cys Gly Asp Ser Met Ser Leu Val Phe Tyr Ala465                 470                 475                 480AAG CTG CTC TCG ATC CTC ACC GAG CTG CGT ACG CTG GGC AAC CAG AAC1488Lys Leu Leu Ser Ile Leu Thr Glu Leu Arg Thr Leu Gly Asn Gln Asn
            485                 490                 495GCC GAG ATG TGT TTC TCA CTA AAG CTC AAA AAC CGC AAA CTG CCC AAG
1536Ala Glu Met Cys Phe Ser Leu Lys Leu Lys Asn Arg Lys Leu Pro Lys
        500                 505                 510TTC CTC GAG GAG ATC TGG GAC GTT CAT GCC ATC CCG CCA TCG GTC CAG1584Phe Leu Glu Glu Ile Trp Asp Val His Ala Ile Pro Pro Ser Val Gln
    515                 520                 525TCG CAC CTT CAG ATT ACC CAG GAG GAG AAC GAG CGT CTC GAG CGG GCT
1632Ser His Leu Gln Ile Thr Gln Glu Glu Asn Glu Arg Leu Glu Arg Ala
530                 535                540GAG CGT ATG CGG GCA TCG GTT GGG GGC GCC ATT ACC GCC GGC ATT GAT
1680Glu Arg Met Arg Ala Ser Val Gly Gly Ala Ile Thr Ala Gly Ile Asp545                 550                 555                 560TGC GAC TCT GCC TCC ACT TCG GCG GCG GCA GCC GCG GCC CAG CAT CAG1728Cys Asp Ser Ala Ser Thr Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln His Gln
            565                 570                 575CCT CAG CCT CAG CCC CAG CCC CAA CCC TCC TCC CTG ACC CAG AAC GAT1776Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Ser Ser Leu Thr Gln Asn Asp
        580                 585                 590TCC CAG CAC CAG ACA CAG CCG CAG CTA CAA CCT CAG CTA CCA CCT CAG
1824Ser Gln His Gln Thr Gln Pro Gln Leu Gln Pro Gln Leu Pro Pro Gln
    595                 600                 605CTG CAA GGT CAA CTG CAA CCC CAG CTC CAA CCA CAG CTT CAG ACG CAA1872Leu Gln Gly Gln Leu Gln Pro Gln Leu Gln Pro Gln Leu Gln Thr Gln
610                 615                 620CTC CAG CCA CAG ATT CAA CCA CAG CCA CAG CTC CTT CCC GTC TCC GCT1920Leu Gln Pro Gln Ile Gln Pro Gln Pro Gln Leu Leu Pro Val Ser Ala625                  630                635                 640CCC GTG CCC GCC TCC GTA ACC GCA CCT GGT TCC TTG TCC GCG GTC AGT1968Pro Val Pro Ala Ser Val Thr Ala Pro Gly Ser Leu Ser Ala Val Ser
            645                 650                 655ACG AGC AGC GAA TAC ATG GGC GGA AGT GCG GCC ATA GGA CCC ATC ACG
2016Thr Ser Ser Glu Tyr Met Gly Gly Ser Ala Ala Ile Gly Pro Ile Thr
        660                 665                 670CCG GCA ACC ACC AGC AGT ATC ACG GCT GCC GTT ACC GCT AGC TCC ACC2064Pro Ala Thr Thr Ser Ser Ile Thr Ala Ala Val Thr Ala Ser Ser Thr
    675                 680                 685ACA TCA GCG GTA CCG ATG GGC AAC GGA GTT GGA GTC GGT GTT GGG GTG2112Thr Ser Ala Val Pro Met Gly Asn Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val
690                 695                 700GGC GGC AAC GTC AGC ATG TAT GCG AAC GCC CAG ACG GCG ATG GCC TTG2160Gly Gly Asn Val Ser Met Tyr Ala Asn Ala Gln Thr Ala Met Ala Leu705                 710                 715                 720ATG GGT GTA GCC CTG CAT TCG CAC CAA GAG CAG CTT ATC GGG GGA GTG2208Met Gly Val Ala Leu His Ser His Gln Glu Gln Leu Ile Gly Gly Val
           725                  730                 735GCG GTT AAG TCG GAG CAC TCG ACG ACT GCA TAG2241Ala Val Lys Ser Glu His Ser Thr Thr Ala
        740                 745(2)SEQ ID NO:5的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：746个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅹⅰ)SEQ ID NO:5的序列描述：Met Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp1                5                  10                   15Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp
         20                  25                    30Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro
     35                   40                   45His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe
 50                  55                   60Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly Lys65                  70                  75                  80Leu Leu Gly Thr Ser Arg Arg Ile Ser Asn Ser Ile Ser Ser Gly Arg
             85                   90                   95Asp Asp Leu Ser Pro Ser Ser Ser Leu Asn Gly Tyr Ser Ala Asn Glu
        100                     105               110Ser Cys Asp Ala Lys Lys Ser Lys Lys Gly Pro Ala Pro Arg Val Gln
    115                 120                  125Glu Glu Leu Cys Leu Val Cys Gly Asp Arg Ala Ser Gly Tyr His Tyr
130                 135                  140Asn Ala Leu Thr Cys Gly Ser Cys Lys Val Phe Phe Arg Arg Ser Val145                 150                 155                 160Thr Lys Ser Ala Val Tyr Cys Cys Lys Phe Gly Arg Ala Cys Glu Met
            165                 170                   175Asp Met Tyr Met Arg Arg Lys Cys Gln Glu Cys Arg Leu Lys Lys Cys
        180                   185                 190Leu Ala Val Gly Met Arg Pro Glu Cys Val Val Pro Glu Asn Gln Cys
    195                  200                   205Ala Met Lys Arg Arg Glu Lys Lys Ala Gln Lys Glu Lys Asp Lys Met
210                 215                   220Thr Thr Ser Pro Ser Ser Gln His Gly Gly Asn Gly Ser Leu Ala Ser225                 230                  235                240Gly Gly Gly Gln Asp Phe Val Lys Lys Glu Ile Leu Asp Leu Met Thr
            245                   250                  255Cys Glu Pro Pro Gln His Ala Thr Ile Pro Leu Leu Pro Asp Glu Ile
        260                  265                  270Leu Ala Lys Cys Gln Ala Arg Asn Ile Pro Ser Leu Thr Tyr Asn Gln
    275                 280                   285Leu Ala Val Ile Tyr Lys Leu Ile Trp Tyr Gln Asp Gly Tyr Glu Gln
290                  295                  300Pro Ser Glu Glu Asp Leu Arg Arg Ile Met Ser Gln Pro Asp Glu Asn305                 310                 315                 320Glu Ser Gln Thr Asp Val Ser Phe Arg His Ile Thr Glu Ile Thr Ile
            325                 330                   335Leu Thr Val Gln Leu Ile Val Glu Phe Ala Lys Gly Leu Pro Ala Phe
        340                  345                  350Thr Lys Ile Pro Gln Glu Asp Gln Ile Thr Leu Leu Lys Ala Cys Ser
    355                 360                  365Ser Glu Val Met Met Leu Arg Met Ala Arg Arg Tyr Asp His Ser Ser
370                  375                380Asp Ser Ile Phe Phe Ala Asn Asn Arg Ser Tyr Thr Arg Asp Ser Tyr385                 390                 395                 400Lys Met Ala Gly Met Ala Asp Asn Ile Glu Asp Leu Leu His Phe Cys
            405                 410                   415Arg Gln Met Phe Ser Met Lys Val Asp Asn Val Glu Tyr Ala Leu Leu
        420                  425                  430Thr Ala Ile Val Ile Phe Ser Asp Arg Pro Gly Leu Glu Lys Ala Gln
    435                440                    445Leu Val Glu Ala Ile Gln Ser Tyr Tyr Ile Asp Thr Leu Arg Ile Tyr
450                 455                   460Ile Leu Asn Arg His Cys Gly Asp Ser Met Ser Leu Val Phe Tyr Ala465                 470                 475                 480Lys Leu Leu Ser Ile Leu Thr Glu Leu Arg Thr Leu Gly Asn Gln Asn
            485                 490                   495Ala Glu Met Cys Phe Ser Leu Lys Leu Lys Asn Arg Lys Leu Pro Lys
        500                  505                  510Phe Leu Glu Glu Ile Trp Asp Val His Ala Ile Pro Pro Ser Val Gln
    515                  520                  525Ser His Leu Gln Ile Thr Gln Glu Glu Asn Glu Arg Leu Glu Arg Ala
530                 535                  540Glu Arg Met Arg Ala Ser Val Gly Gly Ala Ile Thr Ala Gly Ile Asp545                 550                 555                 560Cys Asp Ser Ala Ser Thr Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln His Gln
            565                  570                  575Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Ser Ser Leu Thr Gln Asn Asp
        580                  585                 590Ser Gln His Gln Thr Gln Pro Gln Leu Gln Pro Gln Leu Pro Pro Gln
    595                 600                  605Leu Gln Gly Gln Leu Gln Pro Gln Leu Gln Pro Gln Leu Gln Thr Gln
610                  615                 620Leu Gln Pro Gln Ile Gln Pro Gln Pro Gln Leu Leu Pro Val Ser Ala625                 630                 635                 640Pro Val Pro Ala Ser Val Thr Ala Pro Gly Ser Leu Ser Ala Val Ser
            645                  650                  655Thr Ser Ser Glu Tyr Met Gly Gly Ser Ala Ala Ile Gly Pro Ile Thr
        660                 665                   670Pro Ala Thr Thr Ser Ser Ile Thr Ala Ala Val Thr Ala Ser Ser Thr
     675                680                   685Thr Ser Ala Val Pro Met Gly Asn Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val
690                 695                   700Gly Gly Asn Val Ser Met Tyr Ala Asn Ala Gln Thr Ala Met Ala Leu705                 710                 715                 720Met Gly Val Ala Leu His Ser His Gln Glu Gln Leu Ile Gly Gly Val
            725                  730                  735Ala Val Lys Ser Glu His Ser Thr Thr Ala
        740                 745(2)SEQ ID NO:6的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：2241个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：两种
  (D)拓扑学：两种
(ⅱ)分子类型：cDNA
(ⅸ)特征：
  (A)名字/关键词：CDS
  (B)位置：1..2241
  (D)其它信息：/产品=“VpEcR”
(ⅹⅰ)SEQ ID NO:6的序列描述：ATG GCC CCC CCG ACC GAT GTC AGC CTG GGG GAC GAG CTC CAC TTA GAC
   48Met Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp1                 5                10                  15GGC GAG GAC GTG GCG ATG GCG CAT GCC GAC GCG CTA GAC GAT TTC GAT
 96Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp
         20                   25                  30CTG GAC ATG TTG GGG GAC GGG GAT TCC CCG GGT CCG GGA TTT ACC CCC
144Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro
     35                  40                   45CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ATG GCC GAC TTC GAG TTT
192His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe
 50                  55                  60GAG CAG ATG TTT ACC GAT GCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT GGG AAG
240Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly Lys65                 70                  75                   80CTT CTA GGT ACC TCT AGA AGG ATA TCG AAT TCT ATA TCT TCA GGT CGC
288Leu Leu Gly Thr Ser Arg Arg Ile Ser Asn Ser Ile Ser Ser Gly Arg
             85                  90                   95GAT GAT CTC TCG CCT TCG AGC AGC TTG AAC GGA TAC TCG GCG AAC GAA
336Asp Asp Leu Ser Pro Ser Ser Ser Leu Asn Gly Tyr Ser Ala Asn Glu
        100                  105                 110AGC TGC GAT GCG AAG AAG AGC AAG AAG GGA CCT GCG CCA CGG GTG CAA
384Ser Cys Asp Ala Lys Lys Ser Lys Lys Gly Pro Ala Pro Arg Val Gln
    115                 120                 125GAG GAG CTG TGC CTG GTT TGC GGC GAC AGG GCC TCC GGC TAC CAC TAC
432Glu Glu Leu Cys Leu Val Cys Gly Asp Arg Ala Ser Gly Tyr His Tyr
130                 135                 140AAC GCC CTC ACC TGT GAG GGC TGC AAG GGG TTC TTT CGA CGC AGC GTT
 480Asn Ala Leu Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Val145                 150                 155                 160ACG AAG AGC GCC GTC TAC TGC TGC AAG TTC GGG CGC GCC TGC GAA ATG
528Thr Lys Ser Ala Val Tyr Cys Cys Lys Phe Gly Arg Ala Cys Glu Met
            165                 170                 175GAC ATG TAC ATG AGG CGA AAG TGT CAG GAG TGC CGC CTG AAA AAG TGC
576Asp Met Tyr Met Arg Arg Lys Cys Gln Glu Cys Arg Leu Lys Lys Cys
        180                 185                  190CTG GCC GTG GGT ATG CGG CCG GAA TGC GTC GTC CCG GAG AAC CAA TGT
624Leu Ala Val Gly Met Arg Pro Glu Cys Val Val Pro Glu Asn Gln Cys
    195                 200                 205GCG ATG AAG CGG CGC GAA AAG AAG GCC CAG AAG GAG AAG GAC AAA ATG
672Ala Met Lys Arg Arg Glu Lys Lys Ala Gln Lys Glu Lys Asp Lys Met
210                 215                 220ACC ACT TCG CCG AGC TCT CAG CAT GGC GGC AAT GGC AGC TTG GCC TCT
720Thr Thr Ser Pro Ser Ser Gln His Gly Gly Asn Gly Ser Leu Ala Ser225                 230                 235                 240GGT GGC GGC CAA GAC TTT GTT AAG AAG GAG ATT CTT GAC CTT ATG ACA
768Gly Gly Gly Gln Asp Phe Val Lys Lys Glu Ile Leu Asp Leu Met Thr
            245                  250                  255TGC GAG CCG CCC CAG CAT GCC ACT ATT CCG CTA CTA CCT GAT GAA ATA
816Cys Glu Pro Pro Gln His Ala Thr Ile Pro Leu Leu Pro Asp Glu Ile
        260                 265                 270TTG GCC AAG TGT CAA GCG CGC AAT ATA CCT TCC TTA ACG TAC AAT CAG
864Leu Ala Lys Cys Gln Ala Arg Asn Ile Pro Ser Leu Thr Tyr Asn Gln
    275                 280                 285TTG GCC GTT ATA TAC AAG TTA ATT TGG TAC CAG GAT GGC TAT GAG CAG
912Leu Ala Val Ile Tyr Lys Leu Ile Trp Tyr Gln Asp Gly Tyr Glu Gln
290                 295                  300CCA TCT GAA GAG GAT CTC AGG CGT ATA ATG AGT CAA CCC GAT GAG AAC
960Pro Ser Glu Glu Asp Leu Arg Arg Ile Met Ser Gln Pro Asp Glu Asn305                 310                 315                 320GAG AGC CAA ACG GAC GTC AGC TTT CGG CAT ATA ACC GAG ATA ACC ATA1008Glu Ser Gln Thr Asp Val Ser Phe Arg His Ile Thr Glu Ile Thr Ile
            325                 330                  335CTC ACG GTC CAG TTG ATT GTT GAG TTT GCT AAA GGT CTA CCA GCG TTT1056Leu Thr Val Gln Leu Ile Val Glu Phe Ala Lys Gly Leu Pro Ala Phe
        340                 345                  350ACA AAG ATA CCC CAG GAG GAC CAG ATC ACG TTA CTA AAG GCC TGC TCG1104Thr Lys Ile Pro Gln Glu Asp Gln Ile Thr Leu Leu Lys Ala Cys Ser
    355                  360                 365TCG GAG GTG ATG ATG CTG CGT ATG GCA CGA CGC TAT GAC CAC AGC TCG1152Ser Glu Val Met Met Leu Arg Met Ala Arg Arg Tyr Asp His Ser Ser
370                 375                  380GAC TCA ATA TTC TTC GCG AAT AAT AGA TCA TAT ACG CGG GAT TCT TAC
1200Asp Ser Ile Phe Phe Ala Asn Asn Arg Ser Tyr Thr Arg Asp Ser Tyr385                 390                  395                400AAA ATG GCC GGA ATG GCT GAT AAC ATT GAA GAC CTG CTG CAT TTC TGC
1248Lys Met Ala Gly Met Ala Asp Asn Ile Glu Asp Leu Leu His Phe Cys
            405                  410                 415CGC CAA ATG TTC TCG ATG AAG GTG GAC AAC GTC GAA TAC GCG CTT CTC1296Arg Gln Met Phe Ser Met Lys Val Asp Asn Val Glu Tyr Ala Leu Leu
        420                 425                 430ACT GCC ATT GTG ATC TTC TCG GAC CGG CCG GGC CTG GAG AAG GCC CAA1344Thr Ala Ile Val Ile Phe Ser Asp Arg Pro Gly Leu Glu Lys Ala Gln
    435                 440                 445CTA GTC GAA GCG ATC CAG AGC TAC TAC ATC GAC ACG CTA CGC ATT TAT1392Leu Val Glu Ala Ile Gln Ser Tyr Tyr Ile Asp Thr Leu Arg Ile Tyr
450                 455                 460ATA CTC AAC CGC CAC TGC GGC GAC TCA ATG AGC CTC GTC TTC TAC GCA1440Ile Leu Asn Arg His Cys Gly Asp Ser Met Ser Leu Val Phe Tyr Ala465                 470                 475                 480AAG CTG CTC TCG ATC CTC ACC GAG CTG CGT ACG CTG GGC AAC CAG AAC1488Lys Leu Leu Ser Ile Leu Thr Glu Leu Arg Thr Leu Gly Asn Gln Asn
            485                 490                 495GCC GAG ATG TGT TTC TCA CTA AAG CTC AAA AAC CGC AAA CTG CCC AAG1536Ala Glu Met Cys Phe Ser Leu Lys Leu Lys Asn Arg Lys Leu Pro Lys
        500                 505                 510TTC CTC GAG GAG ATC TGG GAC GTT CAT GCC ATC CCG CCA TCG GTC CAG1584Phe Leu Glu Glu Ile Trp Asp Val His Ala Ile Pro Pro Ser Val Gln
    515                 520                 525TCG CAC CTT CAG ATT ACC CAG GAG GAG AAC GAG CGT CTC GAG CGG GCT
1632Ser His Leu Gln Ile Thr Gln Glu Glu Asn Glu Arg Leu Glu Arg Ala
530                 535                 540GAG CGT ATG CGG GCA TCG GTT GGG GGC GCC ATT ACC GCC GGC ATT GAT1680Glu Arg Met Arg Ala Ser Val Gly Gly Ala Ile Thr Ala Gly Ile Asp545                 550                 555                 560TGC GAC TCT GCC TCC ACT TCG GCG GCG GCA GCC GCG GCC CAG CAT CAG1728Cys Asp Ser Ala Ser Thr Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln His Gln
            565                 570                  575CCT CAG CCT CAG CCC CAG CCC CAA CCC TCC TCC CTG ACC CAG AAC GAT1776Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Ser Ser Leu Thr Gln Asn Asp
        580                 585                 590TCC CAG CAC CAG ACA CAG CCG CAG CTA CAA CCT CAG CTA CCA CCT CAG1824Ser Gln His Gln Thr Gln Pro Gln Leu Gln Pro Gln Leu Pro Pro Gln
    595                 600                 605CTG CAA GGT CAA CTG CAA CCC CAG CTC CAA CCA CAG CTT CAG ACG CAA1872Leu Gln Gly Gln Leu Gln Pro Gln Leu Gln Pro Gln Leu Gln Thr Gln
610                615                  620CTC CAG CCA CAG ATT CAA CCA CAG CCA CAG CTC CTT CCC GTC TCC GCT1920Leu Gln Pro Gln Ile Gln Pro Gln Pro Gln Leu Leu Pro Val Ser Ala625                 630                 635                 640CCC GTG CCC GCC TCC GTA ACC GCA CCT GGT TCC TTG TCC GCG GTC AGT1968Pro Val Pro Ala Ser Val Thr Ala Pro Gly Ser Leu Ser Ala Val Ser
            645                 650                 655ACG AGC AGC GAA TAC ATG GGC GGA AGT GCG GCC ATA GGA CCC ATC ACG
2016Thr Ser Ser Glu Tyr Met Gly Gly Ser Ala Ala Ile Gly Pro Ile Thr
        660                 665                 670CCG GCA ACC ACC AGC AGT ATC ACG GCT GCC GTT ACC GCT AGC TCC ACC
2064Pro Ala Thr Thr Ser Ser Ile Thr Ala Ala Val Thr Ala Ser Ser Thr
    675                 680                 685ACA TCA GCG GTA CCG ATG GGC AAC GGA GTT GGA GTC GGT GTT GGG GTG
2112Thr Ser Ala Val Pro Met Gly Asn Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val
690                695                  700GGC GGC AAC GTC AGC ATG TAT GCG AAC GCC CAG ACG GCG ATG GCC TTG2160Gly Gly Asn Val Ser Met Tyr Ala Asn Ala Gln Thr Ala Met Ala Leu705                 710                 715                 720ATG GGT GTA GCC CTG CAT TCG CAC CAA GAG CAG CTT ATC GGG GGA GTG2208Met Gly Val Ala Leu His Ser His Gln Glu Gln Leu Ile Gly Gly Val
            725                 730               735GCG GTT AAG TCG GAG CAC TCG ACG ACT GCA TAG2241Als Val Lys Ser Glu His Ser Thr Thr Ala
        740                 745(2)SEQ ID NO:7的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：746个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅹⅰ)SEQ ID NO:7的序列描述：Met Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp1               5                   10                  15Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp
         20                   25                   30Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro
     35                  40                   45His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe
50                        55              60Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly Lys65                  70                  75                  80Leu Leu Gly Thr Ser Arg Arg Ile Ser Asn Ser Ile Ser Ser Gly Arg
             85                   90                   95Asp Asp Leu Ser Pro Ser Ser Ser Leu Asn Gly Tyr Ser Ala Asn Glu
        100                 105                   110Ser Cys Asp Ala Lys Lys Ser Lys Lys Gly Pro Ala Pro Arg Val Gln
    115                  120                 125Glu Glu Leu Cys Leu Val Cys Gly Asp Arg Ala Ser Gly Tyr His Tyr
130                 135                  140Asn Ala Leu Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Val145                 150                 155                 160Thr Lys Ser Ala Val Tyr Cys Cys Lys Phe Gly Arg Ala Cys Glu Met
            165                  170                 175Asp Met Tyr Met Arg Arg Lys Cys Gln Glu Cys Arg Leu Lys Lys Cys
        180                 185                  190Leu Ala Val Gly Met Arg Pro Glu Cys Val Val Pro Glu Asn Gln Cys
    195                 200                  205Ala Met Lys Arg Arg Glu Lys Lys Ala Gln Lys Glu Lys Asp Lys Met
210                 215                  220Thr Thr Ser Pro Ser Ser Gln His Gly Gly Asn Gly Ser Leu Ala Ser225                 230                 235                 240Gly Gly Gly Gln Asp Phe Val Lys Lys Glu Ile Leu Asp Leu Met Thr
            245                  250                 255Cys Glu Pro Pro Gln His Ala Thr Ile Pro Leu Leu Pro Asp Glu Ile
        260                 265                   270Leu Ala Lys Cys Gln Ala Arg Asn Ile Pro Ser Leu Thr Tyr Asn Gln
    275                 280                  285Leu Ala Val Ile Tyr Lys Leu Ile Trp Tyr Gln Asp Gly Tyr Glu Gln
290                 295                  300Pro Ser Glu Glu Asp Leu Arg Arg Ile Met Ser Gln Pro Asp Glu Asn305             310                      315                320Glu Ser Gln Thr Asp Val Ser Phe Arg His Ile Thr Glu Ile Thr Ile
            325                  330                 335Leu Thr Val Gln Leu Ile Val Glu Phe Ala Lys Gly Leu Pro Ala Phe
        340                  345                  350Thr Lys Ile Pro Gln Glu Asp Gln Ile Thr Leu Leu Lys Ala Cys Ser
    355                360                   365Ser Glu Val Met Met Leu Arg Met Ala Arg Arg Tyr Asp His Ser Ser
370                  375                 380Asp Ser Ile Phe Phe Ala Asn Asn Arg Ser Tyr Thr Arg Asp Ser Tyr385                 390                 395                 400Lys Met Ala Gly Met Ala Asp Asn Ile Glu Asp Leu Leu His Phe Cys
            405                  410                 415Arg Gln Met Phe Ser Met Lys Val Asp Asn Val Glu Tyr Ala Leu Leu
        420                 425                   430Thr Ala Ile Val Ile Phe Ser Asp Arg Pro Gly Leu Glu Lys Ala Gln
    435                 440                  445Leu Val Glu Ala Ile Gln Ser Tyr Tyr Ile Asp Thr Leu Arg Ile Tyr
450                 455                  460Ile Leu Asn Arg His Cys Gly Asp Ser Met Ser Leu Val Phe Tyr Ala465                 470                 475                 480Lys Leu Leu Ser Ile Leu Thr Glu Leu Arg Thr Leu Gly Asn Gln Asn
            485                 490                   495Ala Glu Met Cys Phe Ser Leu Lys Leu Lys Asn Arg Lys Leu Pro Lys
         500                505                    510Phe Leu Glu Glu Ile Trp Asp Val His Ala Ile Pro Pro Ser Val Gln
    515                 520                   525Ser His Leu Gln Ile Thr Gln Glu Glu Asn Glu Arg Leu Glu Arg Ala
530                 535                   540Glu Arg Met Arg Ala Ser Val Gly Gly Ala Ile Thr Ala Gly Ile Asp545                 550                555                  560Cys Asp Ser Ala Ser Thr Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln His Gln
            565             570                        575Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Ser Ser Leu Thr Gln Asn Asp
        580                  585                  590Ser Gln His Gln Thr Gln Pro Gln Leu Gln Pro Gln Leu Pro Pro Gln
    595                 600                  605Leu Gln Gly Gln Leu Gln Pro Gln Leu Gln Pro Gln Leu Gln Thr Gln
610                  615                 620Leu Gln Pro Gln Ile Gln Pro Gln Pro Gln Leu Leu Pro Val Ser Ala625                 630                 635                 640Pro Val Pro Ala Ser Val Thr Ala Pro Gly Ser Leu Ser Ala Val Ser
            645                  650                 655Thr Ser Ser Glu Tyr Met Gly Gly Ser Ala Ala Ile Gly Pro Ile Thr
        660                  665                 670Pro Ala Thr Thr Ser Ser Ile Thr Ala Ala Val Thr Ala Ser Ser Thr
    675                 680                 685Thr Ser Ala Val Pro Met Gly Asn Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val
690                 695                  700Gly Gly Asn Val Ser Met Tyr Ala Asn Ala Gln Thr Ala Met Ala Leu705                 710                715                  720Met Gly Val Ala Leu His Ser His Gln Glu Gln Leu Ile Gly Gly Val
            725                 730                   735Ala Val Lys Ser Glu His Ser Thr Thr Ala
        740                 745(2)SEQ ID NO:8的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：3126个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：两种
  (D)拓扑学：两种
(ⅱ)分子类型：cDNA
(ⅸ)特征：
  (A)名字/关键词：CDS
  (B)位置：1..3126
  (D)其它信息：/产品=“GEcR”
(ⅹⅰ)SEQ ID NO:8的序列描述：ATG GAC TCC AAA GAA TCA TTA ACT CCT GGT AGA GAA GAA AAC CCC AGC
 48Met Asp Ser Lys Glu Ser Leu Thr Pro Gly Arg Glu Glu Asn Pro Ser1                5                  10                  15AGT GTG CTT GCT CAG GAG AGG GGA GAT GTG ATG GAC TTC TAT AAA ACC
 96Ser Val Leu Ala Gln Glu Arg Gly Asp Val Met Asp Phe Tyr Lys Thr
         20                  25                   30CTA AGA GGA GGA GCT ACT GTG AAG GTT TCT GCG TCT TCA CCC TCA CTG
 144Leu Arg Gly Gly Ala Thr Val Lys Val Ser Ala Ser Ser Pro Ser Leu
    35                   40                   45GCT GTC GCT TCT CAA TCA GAC TCC AAG CAG CGA AGA CTT TTG GTT GAT
192Ala Val Ala Ser Gln Ser Asp Ser Lys Gln Arg Arg Leu Leu Val Asp
 50                  55                  60TTT CCA AAA GGC TCA GTA AGC AAT GCG CAG CAG CCA GAT CTG TCC AAA
240Phe Pro Lys Gly Ser Val Ser Asn Ala Gln Gln Pro Asp Leu Ser Lys65                  70                  75                  80GCA GTT TCA CTC TCA ATG GGA CTG TAT ATG GGA GAG ACA GAA ACA AAA
288Ala Val Ser Leu Ser Met Gly Leu Tyr Met Gly Glu Thr Glu Thr Lys
             85                  90                   95GTG ATG GGA AAT GAC CTG GGA TTC CCA CAG CAG GGC CAA ATC AGC CTT
336Val Met Gly Asn Asp Leu Gly Phe Pro Gln Gln Gly Gln Ile Ser Leu
        100                 105                110TCC TCG GGG GAA ACA GAC TTA AAG CTT TTG GAA GAA AGC ATT GCA AAC
 384Ser Ser Gly Glu Thr Asp Leu Lys Leu Leu Glu Glu Ser Ile Ala Asn
    115                 120                 125CTC AAT AGG TCG ACC AGT GTT CCA GAG AAC CCC AAG AGT TCA GCA TCC
 432Leu Asn Arg Ser Thr Ser Val Pro Glu Asn Pro Lys Ser Ser Ala Ser
130                 135                 140ACT GCT GTG TCT GCT GCC CCC ACA GAG AAG GAG TTT CCA AAA ACT CAC
480Thr Ala Val Ser Ala Ala Pro Thr Glu Lys Glu Phe Pro Lys Thr His145                 150                 155                 160TCT GAT GTA TCT TCA GAA CAG CAA CAT TTG AAG GGC CAG ACT GGC ACC528Ser Asp Val Ser Ser Glu Gln Gln His Leu Lys Gly Gln Thr Gly Thr
            165                170                   175AAC GGT GGC AAT GTG AAA TTG TAT ACC ACA GAC CAA AGC ACC TTT GAC576Asn Gly Gly Asn Val Lys Leu Tyr Thr Thr Asp Gln Ser Thr Phe Asp
        180                 185                 190ATT TTG CAG GAT TTG GAG TTT TCT TCT GGG TCC CCA GGT AAA GAG ACG624Ile Leu Gln Asp Leu Glu Phe Ser Ser Gly Ser Pro Gly Lys Glu Thr
    195                 200                 205AAT GAG AGT CCT TGG AGA TCA GAC CTG TTG ATA GAT GAA AAC TGT TTG
672Asn Glu Ser Pro Trp Arg Ser Asp Leu Leu Ile Asp Glu Asn Cys Leu
210                 215                 220CTT TCT CCT CTG GCG GGA GAA GAC GAT TCA TTC CTT TTG GAA GGA AAC
720Leu Ser Pro Leu Ala Gly Glu Asp Asp Ser Phe Leu Leu Glu Gly Asn225                 230                 235                 240TCG AAT GAG GAC TGC AAG CCT CTC ATT TTA CCG GAC ACT AAA CCC AAA
768Ser Asn Glu Asp Cys Lys Pro Leu Ile Leu Pro Asp Thr Lys Pro Lys
            245                 250                  255ATT AAG GAT AAT GGA GAT CTG GTT TTG TCA AGC CCC AGT AAT GTA ACA
816Ile Lys Asp Asn Gly Asp Leu Val Leu Ser Ser Pro Ser Asn Val Thr
        260                 265                 270CTG CCC CAA GTG AAA ACA GAA AAA GAA GAT TTC ATC GAA CTC TGC ACC
864Leu Pro Gln Val Lys Thr Glu Lys Glu Asp Phe Ile Glu Leu Cys Thr
    275                 280                 285CCT GGG GTA ATT AAG CAA GAG AAA CTG GGC ACA GTT TAC TGT CAG GCA
912Pro Gly Val Ile Lys Gln Glu Lys Leu Gly Thr Val Tyr Cys Gln Ala
290                 295                  300AGC TTT CCT GGA GCA AAT ATA ATT GGT AAT AAA ATG TCT GCC ATT TCT
960Ser Phe Pro Gly Ala Asn Ile Ile Gly Asn Lys Met Ser Ala Ile Ser305                 310                 315                 320GTT CAT GGT GTG AGT ACC TCT GGA GGA CAG ATG TAC CAC TAT GAC ATG1008Val His Gly Val Ser Thr Ser Gly Gly Gln Met Tyr His Tyr Asp Met
            325                  330                 335AAT ACA GCA TCC CTT TCT CAA CAG CAG GAT CAG AAG CCT ATT TTT AAT1056Asn Thr Ala Ser Leu Ser Gln Gln Gln Asp Gln Lys Pro Ile Phe Asn
        340                 345                 350GTC ATT CCA CCA ATT CCC GTT GGT TCC GAA AAT TGG AAT AGG TGC CAA1104Val Ile Pro Pro Ile Pro Val Gly Ser Glu Asn Trp Asn Arg Cys Gln
    355                 360                 365GGA TCT GGA GAT GAC AAC TTG ACT TCT CTG GGG ACT CTG AAC TTC CCT1152Gly Ser Gly Asp Asp Asn Leu Thr Ser Leu Gly Thr Leu Asn Phe Pro
370                 375                 380GGT CGA ACA GTT TTT TCT AAT GGC TAT TCA AGC CCC AGC ATG AGA CCA1200Gly Arg Thr Val Phe Ser Asn Gly Tyr Ser Ser Pro Ser Met Arg Pro385                 390                 395                 400GAT GTA AGC TCT CCT CCA TCC AGC TCC TCA ACA GCA ACA ACA GGA CCA1248Asp Val Ser Ser Pro Pro Ser Ser Ser Ser Thr Ala Thr Thr Gly Pro
            405                 410                  415CCT CCC AGC GGC CGC GTG CAA GAG GAG CTG TGC CTG GTT TGC GGC GAC
1296Pro Pro Ser Gly Arg Val Gln Glu Glu Leu Cys Leu Val Cys Gly Asp
        420                 425                 430AGG GCC TCC GGC TAC CAC TAC AAC GCC CTC ACC TGT GGA TCC TGC AAG
1344Arg Ala Ser Gly Tyr His Tyr Asn Ala Leu Thr Cys Gly Ser Cys Lys
    435                 440                 445GTG TTC TTT CGA CGC AGC GTT ACG AAG AGC GCC GTC TAC TGC TGC AAG
1392Val Phe Phe Arg Arg Ser Val Thr Lys Ser Ala Val Tyr Cys Cys Lys
450                 455                  460TTC GGG CGC GCC TGC GAA ATG GAC ATG TAC ATG AGG CGA AAG TGT CAG1440Phe Gly Arg Ala Cys Glu Met Asp Met Tyr Met Arg Arg Lys Cys Gln465                 470                 475                 480GAG TGC CGC CTG AAA AAG TGC CTG GCC GTG GGT ATG CGG CCG GAA TGC1488Glu Cys Arg Leu Lys Lys Cys Leu Ala Val Gly Met Arg Pro Glu Cys
            485                 490                 495GTC GTC CCG GAG AAC CAA TGT GCG ATG AAG CGG CGC GAA AAG AAG GCC1536Val Val Pro Glu Asn Gln Cys Ala Met Lys Arg Arg Glu Lys Lys Ala
        500                 505                 510CAG AAG GAG AAG GAC AAA ATG ACC ACT TCG CCG AGC TCT CAG CAT GGC1584Gln Lys Glu Lys Asp Lys Met Thr Thr Ser Pro Ser Ser Gln His Gly
    515                     520             525GGC AAT GGC AGC TTG GCC TCT GGT GGC GGC CAA GAC TTT GTT AAG AAG1632Gly Asn Gly Ser Leu Ala Ser Gly Gly Gly Gln Asp Phe Val Lys Lys
530                 535                 540GAG ATT CTT GAC CTT ATG ACA TGC GAG CCG CCC CAG CAT GCC ACT ATT1680Glu Ile Leu Asp Leu Met Thr Cys Glu Pro Pro Gln His Ala Thr Ile545                 550                 555                 560CCG CTA CTA CCT GAT GAA ATA TTG GCC AAG TGT CAA GCG CGC AAT ATA1728Pro Leu Leu Pro Asp Glu Ile Leu Ala Lys Cys Gln Ala Arg Asn Ile
            565                 570                 575CCT TCC TTA ACG TAC AAT CAG TTG GCC GTT ATA TAC AAG TTA ATT TGG1776Pro Ser Leu Thr Tyr Asn Gln Leu Ala Val Ile Tyr Lys Leu Ile Trp
        580                 585                  590TAC CAG GAT GGC TAT GAG CAG CCA TCT GAA GAG GAT CTC AGG CGT ATA1824Tyr Gln Asp Gly Tyr Glu Gln Pro Ser Glu Glu Asp Leu Arg Arg Ile
    595                 600                 605ATG AGT CAA CCC GAT GAG AAC GAG AGC CAA ACG GAC GTC AGC TTT CGG1872Met Ser Gln Pro Asp Glu Asn Glu Ser Gln Thr Asp Val Ser Phe Arg
610                 615                 620CAT ATA ACC GAG ATA ACC ATA CTC ACG GTC CAG TTG ATT GTT GAG TTT1920His Ile Thr Glu Ile Thr Ile Leu Thr Val Gln Leu Ile Val Glu Phe625                 630                 635                 640GCT AAA GGT CTA CCA GCG TTT ACA AAG ATA CCC CAG GAG GAC CAG ATC1968Ala Lys Gly Leu Pro Ala Phe Thr Lys Ile Pro Gln Glu Asp Gln Ile
            645                 650                  655ACG TTA CTA AAG GCC TGC TCG TCG GAG GTG ATG ATG CTG CGT ATG GCA
2016Thr Leu Leu Lys Ala Cys Ser Ser Glu Val Met Met Leu Arg Met Ala
       660                  665                 670CGA CGC TAT GAC CAC AGC TCG GAC TCA ATA TTC TTC GCG AAT AAT AGA2064Arg Arg Tyr Asp His Ser Ser Asp Ser Ile Phe Phe Ala Asn Asn Arg
    675                 680                 685TCA TAT ACG CGG GAT TCT TAC AAA ATG GCC GGA ATG GCT GAT AAC ATT2112Ser Tyr Thr Arg Asp Ser Tyr Lys Met Ala Gly Met Ala Asp Asn Ile
690                 695                 700GAA GAC CTG CTG CAT TTC TGC CGC CAA ATG TTC TCG ATG AAG GTG GAC2160Glu Asp Leu Leu His Phe Cys Arg Gln Met Phe Ser Met Lys Val Asp705                 710                 715                 720AAC GTC GAA TAC GCG CTT CTC ACT GCC ATT GTG ATC TTC TCG GAC CGG2208Asn Val Glu Tyr Ala Leu Leu Thr Ala Ile Val Ile Phe Ser Asp Arg
            725                 730                 735CCG GGC CTG GAG AAG GCC CAA CTA GTC GAA GCG ATC CAG AGC TAC TAC2256Pro Gly Leu Glu Lys Ala Gln Leu Val Glu Ala Ile Gln Ser Tyr Tyr
        740                 745                 750ATC GAC ACG CTA CGC ATT TAT ATA CTC AAC CGC CAC TGC GGC GAC TCA2304Ile Asp Thr Leu Arg Ile Tyr Ile Leu Asn Arg His Cys Gly Asp Ser
    755                 760                 765ATG AGC CTC GTC TTC TAC GCA AAG CTG CTC TCG ATC CTC ACC GAG CTG2352Met Ser Leu Val Phe Tyr Ala Lys Leu Leu Ser Ile Leu Thr Glu Leu
770                 775                 780CGT ACG CTG GGC AAC CAG AAC GCC GAG ATG TGT TTC TCA CTA AAG CTC2400Arg Thr Leu Gly Asn Gln Asn Ala Glu Met Cys Phe Ser Leu Lys Leu785                 790                795                  800AAA AAC CGC AAA CTG CCC AAG TTC CTC GAG GAG ATC TGG GAC GTT CAT2448Lys Asn Arg Lys Leu Pro Lys Phe Leu Glu Glu Ile Trp Asp Val His
            805                 810                 815GCC ATC CCG CCA TCG GTC CAG TCG CAC CTT CAG ATT ACC CAG GAG GAG2496Ala Ile Pro Pro Ser Val Gln Ser His Leu Gln Ile Thr Gln Glu Glu
        820                 825                 830AAC GAG CGT CTC GAG CGG GCT GAG CGT ATG CGG GCA TCG GTT GGG GGC2544Asn Glu Arg Leu Glu Arg Ala Glu Arg Met Arg Ala Ser Val Gly Gly
    835                 840                 845GCC ATT ACC GCC GGC ATT GAT TGC GAC TCT GCC TCC ACT TCG GCG GCG2592Ala Ile Thr Ala Gly Ile Asp Cys Asp Ser Ala Ser Thr Ser Ala Ala
850                 855                 860GCA GCC GCG GCC CAG CAT CAG CCT CAG CCT CAG CCC CAG CCC CAA CCC2640Ala Ala Ala Ala Gln His Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro865                 870                 875                 880TCC TCC CTG ACC CAG AAC GAT TCC CAG CAC CAG ACA CAG CCG CAG CTA2688Ser Ser Leu Thr Gln Asn Asp Ser Gln His Gln Thr Gln Pro Gln Leu
            885                 890                   895CAA CCT CAG CTA CCA CCT CAG CTG CAA GGT CAA CTG CAA CCC CAG CTC2736Gln Pro Gln Leu Pro Pro Gln Leu Gln Gly Gln Leu Gln Pro Gln Leu
        900                 905                  910CAA CCA CAG CTT CAG ACG CAA CTC CAG CCA CAG ATT CAA CCA CAG CCA2784Gln Pro Gln Leu Gln Thr Gln Leu Gln Pro Gln Ile Gln Pro Gln Pro
    915                 920                 925CAG CTC CTT CCC GTC TCC GCT CCC GTG CCC GCC TCC GTA ACC GCA CCT2832Gln Leu Leu Pro Val Ser Ala Pro Val Pro Ala Ser Val Thr Ala Pro
930                 935                 940GGT TCC TTG TCC GCG GTC AGT ACG AGC AGC GAA TAC ATG GGC GGA AGT
2880Gly Ser Leu Ser Ala Val Ser Thr Ser Ser Glu Tyr Met Gly Gly Ser945                 950                 955                 960GCG GCC ATA GGA CCC ATC ACG CCG GCA ACC ACC AGC AGT ATC ACG GCT
2928Ala Ala Ile Gly Pro Ile Thr Pro Ala Thr Thr Ser Ser Ile Thr Ala
            965                 970                  975GCC GTT ACC GCT AGC TCC ACC ACA TCA GCG GTA CCG ATG GGC AAC GGA2976Ala Val Thr Ala Ser Ser Thr Thr Ser Ala Val Pro Met Gly Asn Gly
        980                 985                 990GTT GGA GTC GGT GTT GGG GTG GGC GGC AAC GTC AGC ATG TAT GCG AAC3024Val Gly Val Gly Val Gly Val Gly Gly Asn Val Ser Met Tyr Ala Asn
     995               1000                  1005GCC CAG ACG GCG ATG GCC TTG ATG GGT GTA GCC CTG CAT TCG CAC CAA3072Ala Gln Thr Ala Met Ala Leu Met Gly Val Ala Leu His Ser His Gln1010                1015                 1020GAG CAG CTT ATC GGG GGA GTG GCG GTT AAG TCG GAG CAC TCG ACG ACT3120Glu Gln Leu Ile Gly Gly Val Ala Val Lys Ser Glu His Ser Thr Thr1025               1030                1035                1040GCA TAG
3126Ala(2)SEQ ID NO:9的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：1041个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅹⅰ)SEQ ID NO:9的序列描述：Met Asp Ser Lys Glu Ser Lau Thr Pro Gly Arg Glu Glu Asn Pro Ser1               5                  10                   15Ser Val Leu Ala Gln Glu Arg Gly Asp Val Met Asp Phe Tyr Lys Thr
         20                  25                   30Leu Arg Gly Gly Ala Thr Val Lys Val Ser Ala Ser Ser Pro Ser Leu
     35                   40                  45Ala Val Ala Ser Gln Ser Asp Ser Lys Gln Arg Arg Leu Leu Val Asp
 50                   55                   60Phe Pro Lys Gly Ser Val Ser Asn Ala Gln Gln Pro Asp Leu Ser Lys65                  70                  75                  80Ala Val Ser Leu Ser Met Gly Leu Tyr Met Gly Glu Thr Glu Thr Lys
             85                   90                  95Val Met Gly Asn Asp Leu Gly Phe Pro Gln Gln Gly Gln Ile Ser Leu
        100                  105                 110Ser Ser Gly Glu Thr Asp Leu Lys Leu Leu Glu Glu Ser Ile Ala Asn
   115                   120                  125Leu Asn Arg Ser Thr Ser Val Pro Glu Asn Pro Lys Ser Ser Ala Ser
130                  135                  140Thr Ala Val Ser Ala Ala Pro Thr Glu Lys Glu Phe Pro Lys Thr His145                 150                155                  160Ser Asp Val Ser Ser Glu Gln Gln His Leu Lys Gly Gln Thr Gly Thr
            165                  170                  175Asn Gly Gly Asn Val Lys Leu Tyr Thr Thr Asp Gln Ser Thr Phe Asp
        180                  185                  190Ile Leu Gln Asp Leu Glu Phe Ser Ser Gly Ser Pro Gly Lys Glu Thr
    195                  200                 205Asn Glu Ser Pro Trp Arg Ser Asp Leu Leu Ile Asp Glu Asn Cys Leu
210                  215                 220Leu Ser Pro Leu Ala Gly Glu Asp Asp Ser Phe Leu Leu Glu Gly Asn225                 230                 235                 240Ser Asn Glu Asp Cys Lys Pro Leu Ile Leu Pro Asp Thr Lys Pro Lys
            245                   250                255Ile Lys Asp Asn Gly Asp Leu Val Leu Ser Ser Pro Ser Asn Val Thr
        260                  265                 270Leu Pro Gln Val Lys Thr Glu Lys Glu Asp Phe Ile Glu Leu Cys Thr
    275                  280                 285Pro Gly Val Ile Lys Gln Glu Lys Leu Gly Thr Val Tyr Cys Gln Ala
290                 295                   300Ser Phe Pro Gly Ala Asn Ile Ile Gly Asn Lys Met Ser Ala Ile Ser305                 310                315                  320Val His Gly Val Ser Thr Ser Gly Gly Gln Met Tyr His Tyr Asp Met
           325                  330                   335Asn Thr Ala Ser Leu Ser Gln Gln Gln Asp Gln Lys Pro Ile Phe Asn
        340                   345                 350Val Ile Pro Pro Ile Pro Val Gly Ser Glu Asn Trp Asn Arg Cys Gln
    355                  360                 365Gly Ser Gly Asp Asp Asn Leu Thr Ser Leu Gly Thr Leu Asn Phe Pro
370                  375                 380Gly Arg Thr Val Phe Ser Asn Gly Tyr Ser Ser Pro Ser Met Arg Pro385                 390                 395                 400Asp Val Ser Ser Pro Pro Ser Ser Ser Ser Thr Ala Thr Thr Gly Pro
            405                 410                   415Pro Pro Ser Gly Arg Val Gln Glu Glu Leu Cys Leu Val Cys Gly Asp
        420                 425                   430Arg Ala Ser Gly Tyr His Tyr Asn Ala Leu Thr Cys Gly Ser Cys Lys
    435                 440                  445Val Phe Phe Arg Arg Ser Val Thr Lys Ser Ala Val Tyr Cys Cys Lys
450                  455                  460Phe Gly Arg Ala Cys Glu Met Asp Met Tyr Met Arg Arg Lys Cys Gln465                 470                 475                 480Glu Cys Arg Leu Lys Lys Cys Leu Ala Val Gly Met Arg Pro Glu Cys
            485                  490                  495Val Val Pro Glu Asn Gln Cys Ala Met Lys Arg Arg Glu Lys Lys Ala
        500                 505                   510Gln Lys Glu Lys Asp Lys Met Thr Thr Ser Pro Ser Ser Gln His Gly
    515                  520                 525Gly Asn Gly Ser Leu Ala Ser Gly Gly Gly Gln Asp Phe Val Lys Lys
530                 535                   540Glu Ile Leu Asp Leu Met Thr Cys Glu Pro Pro Gln His Ala Thr Ile545                 550                 555                 560Pro Leu Leu Pro Asp Glu Ile Leu Ala Lys Cys Gln Ala Arg Asn Ile
            565                  570                 575Pro Ser Leu Thr Tyr Asn Gln Leu Ala Val Ile Tyr Lys Leu Ile Trp
         580                 585                 590Tyr Gln Asp Gly Tyr Glu Gln Pro Ser Glu Glu Asp Leu Arg Arg Ile
    595                 600                   605Met Ser Gln Pro Asp Glu Asn Glu Ser Gln Thr Asp Val Ser Phe Arg
610                 615                  620His Ile Thr Glu Ile Thr Ile Leu Thr Val Gln Leu Ile Val Glu Phe625                 630                635                  640Ala Lys Gly Leu Pro Ala Phe Thr Lys Ile Pro Gln Glu Asp Gln Ile
            645                  650                  655Thr Leu Leu Lys Ala Cys Ser Ser Glu Val Met Met Leu Arg Met Ala
        660                  665                  670Arg Arg Tyr Asp His Ser Ser Asp Ser Ile Phe Phe Ala Asn Asn Arg
    675                 680                  685Ser Tyr Thr Arg Asp Ser Tyr Lys Met Ala Gly Met Ala Asp Asn Ile
690                 695                  700Glu Asp Leu Leu His Phe Cys Arg Gln Met Phe Ser Met Lys Val Asp705                 710                715                  720Asn Val Glu Tyr Ala Leu Leu Thr Ala Ile Val Ile Phe Ser Asp Arg
            725                  730                  735Pro Gly Leu Glu Lys Ala Gln Leu Val Glu Ala Ile Gln Ser Tyr Tyr
        740                  745                  750Ile Asp Thr Leu Arg Ile Tyr Ile Leu Asn Arg His Cys Gly Asp Ser
    755                  760                 765Met Ser Leu Val Phe Tyr Ala Lys Leu Leu Ser Ile Leu Thr Glu Leu
770                  775                 780Arg Thr Leu Gly Asn Gln Asn Ala Glu Met Cys Phe Ser Leu Lys Leu785                 790                795                  800Lys Asn Arg Lys Leu Pro Lys Phe Leu Glu Glu Ile Trp Asp Val His
            805                  810                  815Ala Ile Pro Pro Ser Val Gln Ser His Leu Gln Ile Thr Gln Glu Glu
         820                 825                  830Asn Glu Arg Leu Glu Arg Ala Glu Arg Met Arg Ala Ser Val Gly Gly
    835                  840                 845Ala Ile Thr Ala Gly Ile Asp Cys Asp Ser Ala Ser Thr Ser Ala Ala
850                         855                  860Ala Ala Ala Ala Gln His Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro865                 870                 875                 880Ser Ser Leu Thr Gln Asn Asp Ser Gln His Gln Thr Gln Pro Gln Leu
            885                   890                 895Gln Pro Gln Leu Pro Pro Gln Leu Gln Gly Gln Leu Gln Pro Gln Leu
        900                 905                   910Gln Pro Gln Leu Gln Thr Gln Leu Gln Pro Gln Ile Gln Pro Gln Pro
    915                 920                   925Gln Leu Leu Pro Val Ser Ala Pro Val Pro Ala Ser Val Thr Ala Pro
930                   935                 940Gly Ser Leu Ser Ala Val Ser Thr Ser Ser Glu Tyr Met Gly Gly Ser945                 950                 955                 960Ala Ala Ile Gly Pro Ile Thr Pro Ala Thr Thr Ser Ser Ile Thr Ala
             965                 970                 975Ala Val Thr Ala Ser Ser Thr Thr Ser Ala Val Pro Met Gly Asn Gly
        980                  985                  990Val Gly Val Gly Val Gly Val Gly Gly Asn Val Ser Met Tyr Ala Asn
     995                 1000                 1005Ala Gln Thr Ala Met Ala Leu Met Gly Val Ala Leu His Ser His Gln
1010                 1015                1020Glu Gln Leu Ile Gly Gly Val Ala Val Lys Ser Glu His Ser Thr Thr1025                1030               1035                1040Ala(2)SEQ ID NO:10的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：13个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：两种
  (D)拓扑学：两种
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅸ)特征：
  (A)名字/关键词：misc_特征
  (B)位置：7
  (D)其它信息：/产品=“修饰的蜕皮激素反应元件”
      /注=“在位点7的N是0～5个核苷酸，其中有一个特别优选的核苷酸。”
(ⅹⅰ)SEQ ID NO:10的序列描述：
RGBNNMNTGN NCY
      13
(2)SEQ ID NO:11的信息：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：13个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：两种
    (D)拓扑学：两种
  (ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
  (ⅸ)特征：
    (A)名字/关键词：misc_特征
    (B)位置：7
    (D)其它信息：/产品=“修饰的蜕皮激素反应元件”
        /注=“在位点7的N可以是0～5个核苷酸，其中有一个
        特别优选的核苷酸。”
  (ⅹⅰ)SEQ ID NO:11的序列描述：
  RGNNCANKNN VCY
          13
(2)SEQ ID NO:12的信息：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：13个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：两种
    (D)拓扑学：两种
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)SEQ ID NO:12的序列描述：
AGTGCANTGT TCT
        13(2)SEQ ID NO:13的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：13个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：两种
  (D)拓扑学：两种
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅸ)特征：
  (A)名字/关键词：misc_特征
  (B)位置：7
  (D)其它信息：/产品=“蜕皮激素反应元件”
      /注=“在位点7的N是0～5个核苷酸，其中有3个特别
      优选的核苷酸。”
(ⅹⅰ)SEQ ID NO:13的序列描述：
RGBNNMNRGB NNM
        13(2)SEQ ID NO:14的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：49个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：两种
  (D)拓扑学：两种
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)SEQ ID NO:14的序列描述：
TACAACGCCC TCACCTGTGG ATCCTGCAAG GTGTTTCTTT CGACGCAGC
       49(2)SEQ ID NO:15的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：53个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：两种
  (D)拓扑学：两种
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)SEQ ID NO:15的序列描述：
GTACTCCCGG GGCGGGGCTA TGCGGGGCGG GGCTAATCGC TAGGGGCGGG GCA
      53(2)SEQ ID NO:16的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：53个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：两种
  (D)拓扑学：两种
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)SEQ ID NO:16的序列描述：
GTACTGCCCC GCCCCTAGCG ATTAGCCCCG CCCCGCATAG CCCCGCCCCG GGA
     53(2)SEQ ID NO:17的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：34个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：两种
  (D)拓扑学：两种
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)SEQ ID NO:17的序列描述：AGCTCGATGG ACAAGTGCAT TGTTCTTTGC TGAA
   34(2)SEQ ID NO:18的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：35个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：两种
  (D)拓扑学：两种
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)SEQ ID NO:18的序列描述：
AGCTTTCAGC AAGAGAACAA TGCACTTGTC CATCG
       35

Claims (42)

1．一种调节外源基因在哺乳动物受试体中表达的方法，所说的受试体含有：
(ⅰ)一种DNA构建体，包含在一种蜕皮激素反应元件控制下的所说的外源基因；和
(ⅱ)一种经修饰的蜕皮激素受体，在其配体存在，及任选在可用作其沉默配偶体的受体进一步存在时，能结合所说的经修饰的蜕皮激素反应元件；
所说的方法包括给所说的受试体施用有效量的所说的经修饰的蜕皮激素受体的配体；其中所说的配体在正常情况下不存在于所说的受试体细胞中；其中所说的配体对所说的受试体没有毒性。
2．根据权利要求1的方法，其中所说的蜕皮激素反应元件是经修饰的反应元件，它包含以任意顺序的一个第一半位点和一个被0-5个核苷酸间隔序列分开的第二半位点；
其中所说的第一半位点具有序列：
-RGBNNM-
其中：
各个R独立地选自A或G；
各个B独立地选自G,C或T；
各个N独立地选自A,T,C或G；且
各个M独立地选自A或C；
其前提条件为各个-RGBNNM-核苷酸组至少有4个核苷酸与序列-AGGTCA-可比较位置的核苷酸相同；和
所说的第二半位点从糖皮质激素受体亚族反应元件获得。
3．根据权利要求2的方法，其中所说的第一半位点从一个蜕皮激素反应元件获得，而所说的第二半位点从选自糖皮质激素反应元件，盐皮质激素反应元件，孕激素反应元件或雄激素反应元件的激素反应元件中获得。
4．根据权利要求2的方法，其中所说的反应元件对farnesoidX受体(FXR)基本上没有结合亲和性。
5．根据权利要求2的方法，其中所说的第一半位点从一个蜕皮激素反应元件获得，所说的第二半位点从糖皮质激素反应元件获得。
6．根据权利要求5的方法，其中所说的第一半位点是AGTGCA，而所说的第二半位点为TGTTCT。
7．根据权利要求6的方法，其中所说的反应元件具有序列AGTGCA-N-TGTTCT。
8．根据权利要求2的方法，其中所说的经修饰的蜕皮激素受体包括：
一种蜕皮激素配体结合结构域；
一种从DNA结合蛋白获得的DNA结合结构域；和
一种转录因子的激活结构域，
其中至少一种所说的DNA结合结构域或所说的激活结构域不是从天然蜕皮激素受体获得的，
其前提条件是当所说的激活结构域来自糖皮质激素受体时，所说的DNA结合结构域不是来自糖皮质激素受体或大肠杆菌LexA蛋白质。
9．根据权利要求8的方法，其中所说的修饰的蜕皮激素受体其特征进一步在于在哺乳动物细胞中基本上没有组成型活性。
10．根据权利要求9的方法，其中所说的经修饰的蜕皮激素受体的DNA结合结构域来自类固醇/甲状腺激素受体超家族的一个成员。
11．根据权利要求10的方法，其中所说的类固醇/甲状腺激素受体超家族的成员选自：EcR，维生素D3受体，
RARα,RARβ,RARγ,RXRα,RXRβ,RXRγ,TRα,TRβ或ER。
12．根据权利要求11的方法，其中修饰的蜕皮激素受体的DNA结合结构域其特征在于具有与天然存在的DNA结合结构域的P-盒氨基酸序列不相同的P-盒氨基酸序列。
13．根据权利要求12的方法，其中所说的经修饰的P-盒氨基酸序列比所说的天然存在的P-盒氨基酸序列优先结合不同的激素反应元件半位点。
14．根据权利要求13的方法，其中所说的经修饰的蜕皮激素受体DNA结合结构域来自EcR，而P-盒氨基酸序列为GSCKV(SEQ IDNO:3)。
15．根据权利要求8的方法，其中所说的激活结构域从类固醇/甲状腺激素受体超家族的一个成员获得。
16．根据权利要求8的方法，其中所说的激活结构域选自糖皮质激素受体的激活结构域，VP16激活结构域，或GAL4激活结构域。
17．根据权利要求1的方法，其中所说的经修饰的蜕皮激素受体选自VpEcR,VgEcR或GEcR。
18．根据权利要求17的方法，其中所说的经修饰的蜕皮激素受体是具有SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列的VgEcR。
19．根据权利要求1的方法，其中所说的能够用作沉默配偶体的受体是RXR。
20．根据权利要求19的方法，其中所说的RXR对所说的哺乳动物受试体是外源性的。
21．根据权利要求1的方法，其中所说的外源基因是野生型基因和/或治疗性基因。
22．根据权利要求21的方法，其中所说的野生型基因选自编码下列产物的基因：
其基本上不存在会导致在所说的受试体中出现的不正常状态；或
其基本上过剩会导致在所说的受试体中出现不正常状态。
23．根据权利要求21的方法，其中所说的治疗基因是选自那些编码下列产物的基因：
其对表达它们的细胞有毒性；或
赋予所说的受试体有利的特性。
24．一种诱导外源基因在哺乳动物受试体中表达的方法，所说的受试体含有：
(ⅰ)一种DNA构建体，包含在蜕皮激素反应元件控制下的外源基因，
(ⅱ)在诱导性启动子控制下的编码经修饰的蜕皮激素受体的DNA，其中所说的经修饰的蜕皮激素受体，在其配体存在，及任选在可用作其沉默配偶体的受体进一步存在时，能结合所说的经修饰的蜕皮激素反应元件，和
(ⅲ)一种所说的经修饰的蜕皮激素受体的配体；
所说的方法包括使所说的受试体处于合适于诱导所说的经修饰的蜕皮激素受体表达的条件下。
25．一种诱导外源基因在哺乳动物受试体中表达的方法，所说的受试体包含含有在蜕皮激素反应元件控制下的所说的外源基因的一种DNA构建体，所说的方法包括在所说的受体中导入：
一种经修饰的蜕皮激素受体；和
所说的经修饰的蜕皮激素受体的配体，
其中所说的受体，与其配体结合，在任选的可用作其沉默配偶体的受体进一步存在时，能接合所说的蜕皮激素反应元件，激活从其进行的转录。
26．一种表达对宿主生物体有害的重组产物的方法，所说的方法包括：
用下列物质转化合适的宿主细胞：
(ⅰ)一种编码在蜕皮激素反应元件控制下的所说的重组产物的DNA构建体，和
(ⅱ)编码修饰的蜕皮激素受体的DNA。
在合适的培养基上生长所说的宿主细胞；并通过将所说的修饰的蜕皮激素受体的配体和任选能用作所说的修饰的蜕皮激素受体的沉默配偶体的受体导入所说的宿主细胞来诱导所说的重组产物的表达。
27．一种修饰的蜕皮激素受体，它包含：
一种蜕皮激素配体结合结构域；
一种从DNA结合蛋白获得的DNA结合结构域；和
一种转录因子的激活结构域，
其中至少一种所说的DNA结合结构域或所说的激活结构域不是从天然蜕皮激素受体获得的，
其前提条件是当所说的激活结构域来自糖皮质激素受体时，所说的DNA结合结构域不是来自糖皮质激素受体或一个大肠杆菌LexA蛋白质。
28．一种编码根据权利要求27的经修饰的蜕皮激素受体的核酸。
29．包含多个根据权利要求27的经修饰的蜕皮激素受体的同型二聚体受体。
30．包含一个根据权利要求27的经修饰的蜕皮激素受体和至少一个类固醇/甲状腺超家族受体的沉默配偶体的异型二聚体受体。
31．根据权利要求30的异型二聚体受体，其中所说的沉默配偶体是哺乳动物产生的受体。
32．根据权利要求31的异型二聚体受体，其中所说的哺乳动物产生的受体是RXR。
33．一种经修饰的蜕皮激素受体反应元件，它包含以任意顺序的一个第一半位点和一个被1-5个核苷酸间隔序列分开的第二半位点；其中所说的第一半位点具有序列：
-RGBNNM-
其中
各个R独立地选自A或G；
各个B独立地选自G,C或T；
各个N独立地选自A,T,C或G；且
各个M独立地选自A或C；
其前提条件是各个-RGBNNM-核苷酸组至少有4个核苷酸与序列-AGGTCA-可比较位置的核苷酸相同；和
所说的第二半位点从糖皮质激素受体亚族反应元件获得。
34．一个基因转移载体，包含具有最小启动子，和根据权利要求33的经修饰的蜕皮激素反应元件的转录调控区，其中所说的调控区与包含外源基因的DNA有效相联，而其中所说的修饰的蜕皮激素反应元件以1到大约6个拷贝存在。
35．根据权利要求34的载体，其中所说的调控区进一步包括遍在转录因子的结合位点。
36．根据权利要求35的载体，其中所说的结合位点位于所说的启动子和所说的合成蜕皮激素反应元件之间。
37．根据权利要求36的载体，其中所说的遍在转录因子是Sp1。
38．根据权利要求34的载体，其中所说的启动子是组织特异性的。
39．一种重组细胞，包含编码根据权利要求28的经修饰的蜕皮激素受体的核酸。
40．一种转基因哺乳动物，包含编码根据权利要求28的经修饰的蜕皮激素受体的核酸。
41．一种诱导外源基因在根据权利要求40的转基因哺乳动物中表达的方法，所说的方法包括：
在所说的哺乳动物细胞中导入一个编码在与所说的经修饰的蜕皮激素受体反应的蜕皮激素反应元件转录控制下的外源基因的DNA构建体；和
给所说的哺乳动物施用一定量的对诱导所说的外源基因表达有效的所说的经修饰的蜕皮激素受体的配体。
42．根据权利要求41的方法，其中所说的修饰的蜕皮激素受体与类固醇/甲状腺激素超家族受体的沉默配偶体形成异型二聚体。
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