CN1154738C - 新的鉴定刺激stf-1在胰岛细胞内表达的化合物的方法 - Google Patents

新的鉴定刺激stf-1在胰岛细胞内表达的化合物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1154738C
CN1154738C CNB971917825A CN97191782A CN1154738C CN 1154738 C CN1154738 C CN 1154738C CN B971917825 A CNB971917825 A CN B971917825A CN 97191782 A CN97191782 A CN 97191782A CN 1154738 C CN1154738 C CN 1154738C
Authority
CN
China
Prior art keywords
stf
cell
islet cells
insulin
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB971917825A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1209843A (zh
Inventor
Mr
M·R·蒙特米尼
S·夏尔马
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RESEARCH DEVELOPMENT FOUDATION
Original Assignee
RESEARCH DEVELOPMENT FOUDATION
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by RESEARCH DEVELOPMENT FOUDATION filed Critical RESEARCH DEVELOPMENT FOUDATION
Publication of CN1209843A publication Critical patent/CN1209843A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1154738C publication Critical patent/CN1154738C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Abstract

本发明提供了两种实施方式。其一是检测能够诱导STF-1转录的化合物的方法。分离出表达STF-1/lacZ融合基因的胰岛细胞，通过将待测化合物加入表达STF-1/lacZ的细胞来测定各种化合物的作用。然后利用比色法定量测定对照细胞和经处理细胞内的lacZ活性。利用此方法可以筛选大量化合物并可以方便地鉴定出STF-1诱导性化合物。其二是在体内用STF-1启动子标记产生胰岛素的胰岛细胞的方法。其中，绿荧光蛋白(GFP)被用作指示物。用转基因方法将STF-1-绿荧光蛋白引入猪体内就能够高效迅速地从胰腺中回收产生胰岛素的细胞。

Description

新的鉴定刺激STF-1在胰岛细胞内表达的化合物的方法
技术领域
本发明主要涉及生物化学内分泌学、分子生物学和蛋白质化学。更具体地说，本发明涉及鉴定刺激胰岛细胞内STF-1表达的化合物的新方法。
技术背景
血液中葡萄糖平衡需要许多神经内分泌***的协同作用。胰岛被认为是哺乳动物体内主要的“葡萄糖传感器”。胰岛包含4种细胞群，经鉴定主要是产生胰岛素、胰高血糖素、抑生长素或胰腺多肽的细胞。其中以产生胰岛素的β细胞为主。血清葡萄糖的升高会刺激胰岛素的分泌和产生，由此指令特定组织吸收葡萄糖。因此，β细胞的功能紊乱或损伤会导致血清葡萄糖水平升高，最终发展成为糖尿病。
遗传连锁分析显示，遗传因素极大地影响着糖尿病的易患性。例如，至少有18个基因座在一定程度上与胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)连锁。被称为IDDM2的一种疾病易患基因座包含了人胰岛素基因，并被与胰岛素启动子的转录调控功能的改变相关联。因此，胰岛素基因表达的调控过程受到干扰在一定程度上造成了糖尿病的发生。与该假设一致的是，β细胞功能受损是糖尿病非常常见的特征之一。
非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)的发生被认为是外部影响和复杂的遗传影响的共同结果。重要的是，人们已经将胰岛素基因座本身的等位变异体与糖尿病相关联。这些变异体似乎包含有正常的胰岛素基因，但是表现出转录调控方面的特性被改变。
据估计，约有20,000,000之多的美国人患有非胰岛素依赖型(II型)糖尿病。疾病的发展似乎需要环境因素和某些目前还没有完全确定的糖尿病易患性基因的共同作用，它们可能造成II型糖尿病外周抗胰岛素性，此时，组织不能应答胰岛素信号来合理使用葡萄糖。或者，遗传因素可能造成这些患者体内产生胰岛素的胰腺β细胞对葡萄糖敏感性降低。以上两种生理状态的最终结果都是严重的高血糖症，这是糖尿病的主要特征。
对胰岛素基因的转录调控是利用与细胞特异性葡萄糖敏感信号传导分子相作用的一小段侧翼DNA获得的。对该调控机构的确切性质还知之甚少，但一般认为，碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)和含同源域的因子是指导胰岛素的β细胞特异性表达的转录机制中的关键。胰岛特异性碱性螺旋-环-螺旋复合物与近端的E框(E-box)相互作用，后者又称Nir，IEB1或ICE；该元件在大鼠胰岛素I基因中有两份，但在大鼠胰岛素II基因和人胰岛素基因中只有一份。
产胰岛素细胞系内进行的瞬时试验表明，  E框结合因子与结合附近被称为FLAT的AT丰富序列的β细胞特异性蛋白具有协同作用，所述的序列具有特征性的同源域识别序列。数个已鉴定出的同源域蛋白已经被证明与FLAT元件结合，其中包括Isl-1、Imx-1、cdx-3和STF-1。此外，后者与在被称为P元件的进化保守AT丰富序列处的主结合活性有关。Isl-1与FLAT元件弱结合而且似乎不存在于用产胰岛素细胞提取物检测到的FLAT结合复合体中。目前的证据证明Isl-1更重要的作用在于神经发育方面。同源域因子Imx-1和cdx-3在异源细胞内具有重要的与胰岛素启动子功能有关的交叉活化特性，但是对于它们的细胞分布以及在β细胞内的FLAT结合能力仍然不清楚。而且，直接涉及这些因子在β细胞系内的功能的信息很少。
在具有结合胰岛素启动子活性的因子中，STF-1可能是真正的胰岛素启动子功能调控者的最有希望的候选因子。在小鼠中，STF-1最早是在胚胎期第8.5天在形成胰腺的原细胞的细胞核中检测到的，随后立即在该区域内最早检测到了胰岛素的表达。在随后的胰内分泌腺的整个发育过程中，STF-1和胰岛素大量地被共表达的。此外，在来自产胰岛素细胞系的提取物中，STF-1似乎是胰岛素启动子内FLAT和P元件处内源性DNA结合活性的一部分。和根据FLAT结合因子所在的预计一样，STF-1也与E框结合因子Pan-1具有强协同作用。但是，DNA结合分析显示，β细胞提取物中的其它未知因子对于测得的FLAT结合活性也有很大的贡献。人们至今仍然不清楚由FLAT介导的胰岛素启动活性需要全部这些被测得的因子还是只需要其中一部分。
虽然STF-1最早是同时在发育中的胰腺的外分泌细胞和内分泌细胞中表达的，但是STF-1的产生逐渐地局限于产生胰岛素和抑生长素的胰岛细胞。在这些细胞中，STF-1的作用似乎对于保持抑生长素和胰岛素基因的高水平表达至关重要。
STF-1识别胰岛素启动子上两个已经完全确定了的胰岛特异性元件，即FLAT和P。当STF-1与这些位置结合时，它与E47一起刺激胰岛素的转录，后者是识别被称为Far和Nir的两个E框的螺旋-环-螺旋蛋白。同样，STF-1通过被称为TSEI和TSEII的两个胰岛特异性元件调控胰岛细胞内抑生长素的表达。
已发现同源域蛋白如STF-1，通过确立细胞或细胞成份身份而在发育中起着重要作用。与它们在体内的特异性和区别性作用相反，大多数同源域蛋白在体外表现出很低的并且重迭的DNA结合特异性。但是，最近的研究暗示特定的蛋白质辅因子决定了体内同源域DNA结合的特异性。例如在果蝇中，人们发现外小齿(extradenticle)(exd)减弱同源异型蛋白的活性却不改变它们的表达方式。更确切的说，外小齿似乎通过加强特定同源域蛋白的DNA结合特异性来促进靶基因的选择。实际上，在脊椎动物中，外小齿是高度保守的，与人原癌基因Pbx1具有广泛的序列相似形(71％)。
发育过程中细胞的谱系特异性的定型主要是由许多同源域(HOX)选择蛋白的相对性表达决定的，所述的蛋白介导不同基因程序的活化作用。但是各HOX基因如何自身定向以便在不同的细胞类型中得以表达的机制还远没有被揭示过。
脊椎动物的胰腺由内分泌腺和外分泌腺构成，两者都来自十二指肠原基内共同的祖细胞(1)。在胰腺的内分泌部分，最早表达多种胰岛激素的多能前体细胞逐步受到限制直至形成构成郎氏成熟胰岛的4个细胞亚群：产生胰岛素、抑生长素、胰高血糖素和胰多肽的细胞(2，3)。这些发育路径的活化机制还不清楚，但是目前的证据暗示同源异型框因子STF-1(IPF-1/IDX-1)是该过程中的一个主要决定因素。实际上，发育过程需要STF-1得到了同源重组研究的支持，在该研究中，针对性地干扰STF-1/IPF-1基因造成胰腺的先天性缺失(4)。
STF-1(又称Pdx1)的表达最早可以在胚胎期第8.5天的胰腺原基和多能前体细胞中检测到。STF-1同时在发育中的胰腺的内分泌和外分泌部分瞬时表达后逐渐被限制在产生胰岛素和抑生长素的胰岛细胞内表达(5，6)。在这些细胞内，STF-1通过与胰岛素和抑生长素基因各自启动子内的功能元件结合调控它们的表达(5，7-16)。
现有技术缺乏调控同源域蛋白STF-1在胰腺细胞内表达的有效手段。本发明满足了本领域长期以来的这一需求。
                            发明概述
虽然STF-1是胰腺基因的一种主要调节物，但是STF-1的表达如何自身定向于胰腺细胞的机制还不清楚。本发明证明，STF-1启动子的一段6.5kb片段足以指导β-半乳糖苷酶报道基因在转基因小鼠和培养十二指肠细胞内的胰岛特异性表达。在该6.5kb的片段内，位于相对于主转录起始位点的-104位的一个E框对STF-1启动子活性尤其重要。该元件被STF-1胰岛特异性表达所必需的上游激活剂识别。实际上，该STF-1启动子使在胰岛细胞内STF-1定向表达的活性增加20至100倍。缺失位于-104位的近端的E框使得STF-1在HIT细胞内完全不表达。而且，抗-USF(上游因子)抗血清抑制C1、C2和C3的形成，这表明这些蛋白质是由USF蛋白质形成的。
而且，还在转录起始位置上游600bp的一段530bp区域内发现了一个STF-1增强子元件。包含该530bp片段的启动子结构物受***处理的完全抑制，但是包含遍在USF-1识别位置的基本STF-1启动子结构物却不受抑制。该530bp区域在HIT-T15细胞内的活性比在COS-7细胞内的高5至10倍，这表明该片段具有胰岛细胞特异性活性。所以，在本发明中STF-1-lacZ融合基因被用于筛选能够增强胰岛细胞内STF-1表达的化合物。刺激STF-1产生的化合物可加强胰岛B细胞的功能，即胰岛素的产生。所以，利用本发明描述的方法鉴定出的化合物对于因边缘胰岛细胞功能造成不耐糖的II型糖尿病患者尤其有用。
本发明提供了一种测定被测化合物刺激胰岛细胞诱导STF-1转录的能力的方法，它包括以下步骤：
提供包含操作性相连的STF-1增强子，STF-1启动子和报道基因的载体，所述STF-1增强子是SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.2或它们的具有STF增强子活性的片段，所述STF-1启动子包含选自S1，S2或S3的转录起始位点，所述S1，S2或S3分别位于翻译起始位置上游第91、107和120/125位核苷酸，所述报道基因的表达使胰岛宿主细胞具有可测信号；
在体外将所述载体转移到所述宿主细胞内；
在被测化合物存在下培养所述的宿主细胞；
分析所述被测化合物刺激所述宿主细胞产生所述可检测信号的能力，其中有所述信号的存在表示所述被测化合物刺激胰岛细胞诱导了STF-1的转录，而没有所述信号则表示所述的被测化合物没有刺激胰岛细胞诱导STF-1的转录。
本发明还提供了一种体外标记产胰岛素的胰岛细胞的方法，它包括以下步骤：
提供权利要求1中所述的载体；
将所述载体导入待检胰岛细胞；
分析所述的可检测信号，确定待检胰岛细胞是否表达所述的报道基因，其中有信号存在表示有产胰岛素的胰岛细胞存在，而没有信号表示没有产胰岛素的细胞。
本发明实施方式之一提供了一种检测诱导STF-1转录的化合物的方法。
用磷酸钙共沉淀法分离出表达STF-1/lacZ融合基因的胰岛细胞系。为了检查各种化合物对STF-1表达的作用，目标化合物被加入表达STF-1/lacZ融合基因的细胞中。然后利用比色分析定量检测对照和经处理细胞内的lacZ活性。利用此方法，可以筛选大量的化合物并方便地鉴定出STF-1诱导性化合物。
本发明实施方式之二提供了一种利用STF-1体内标记产胰岛素的胰岛细胞的方法。其中，绿荧光蛋白(GFP)被用作指示物。如Ogawa等在美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)1995，92：11899-11903中所述，可以在不干扰细胞的情况下测得绿荧光蛋白的表达。为了便于从动物的胰腺回收β细胞，STF-1启动子被与编码GFP的基因融合。给猪引入STF-1-绿荧光蛋白转基因能够迅速高效地从胰腺中回收产胰岛素的细胞。简而言之，回收猪的胰腺，然后用胶原酶处理来分散细胞。利用基于STF-1绿荧光蛋白转基因的表达的荧光激活细胞分类术(FACS)有效地回收得到产胰岛素的胰岛细胞。纯化的β细胞群可以被用于对糖尿病患者的细胞疗法。
本发明的内容之一提供了一种测定待测化合物刺激胰岛细胞诱导STF-1转录的能力的方法，它包括以下步骤：提供包含STF-1增强子(具有选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或它们的片段的序列)、启动子和同时受所述STF-1增强子和所述启动子转录调控的报道基因的载体，所述的表达基因能够使所述的宿主细胞具有一个可检测的信号；将所述的载体转移到所述的宿主细胞内；在待测化合物存在下培养所述的宿主细胞来测定所述待测物质刺激所述宿主细胞产生所述的可检测信号的能力；分析所述的信号来测定所述待测化合物刺激所述宿主细胞产生所述信号的能力，其中所述信号的存在表示所述待测化合物刺激胰岛细胞诱导了STF-1的转录，没有所述信号则表示所述待测化合物没有刺激诱导细胞诱导STF-1的转录。
在本发明以此为目的的优选实施方式中，使用的报道基因是一种酶。在更好的实施方式中，该酶选自萤光素酶和β-半乳糖苷酶。
在本发明的另一实施方式中，所述的转移步骤是利用用转染或微注射法将转基因导入动物。
本发明的另一目标中提供了体内标记产胰岛素胰岛细胞的方法，步骤是：它包括提供包含STF-1启动子和受所述STF-1启动子转录调控的报道基因的载体，其中所述的报道基因能够使胰岛细胞具有一个可检测的信号；将所述的载体作为转基因引入动物胚胎；将所述的胚胎培育成具有胰岛细胞的动物体；分析所述的可检测信号来测定所述动物的胰岛细胞是否表达所述的报道基因，其中信号的存在表示有产胰岛素胰岛细胞存在，而没有信号则表示没有产胰岛素的胰岛细胞。
在本发明以此为目的的优选实施方式中，报道基因产生荧光蛋白，而且该方法还包括一步利用荧光激活细胞分类术(FACS)将产胰岛素胰岛细胞与非产胰岛素胰岛细胞分选开来。
通过对本发明优选实施方式的说明，本发明的其它内容、特征和优点将更为清楚。
                             附图概述
为了更详细的理解本发明的上述特征、优点和目的是如何获得的，以下将结合附图中表示的特定优选实施方式更具体的说明以上概括的本发明内容。这些附图属于说明书的一部分。但是必需指出，附图说明的只是本发明的优选实施方式，所以不能理解成对本发明的范围构成限定。
图1显示STF-1在染色体上的位置。图1A显示STF-1基因是由鼠5号染色体远端区域内一同源异型框孤独基因编码的，该图中显示了STF-1(被称为“Pdx1”)在5号染色体上相对于其它标记的位置。右边显示的是厘摩标度。左栏所示的是染色体排布所使用的标记。STF-1在此称为Pdx1。
图2显示STF-1没有TATA，使用多转录起始位置。图2A显示了15kb的STF-1基因组克隆的图示，同时在上方给出kb标尺。所示的有6.5kb的5’侧翼区4kb的内含子和3kb的3’侧翼。IVS表示将外显子I(被打上了阴影并以I表示)和II(被打上了阴影并以II表示)打断的4kb内含子。图2B显示STF-1基因5’侧翼区的核苷酸序列。利用RNase保护法(实心箭头)和引物的延伸(空心箭头)制图测得的转录起始位置在物理图谱中以S1(主起始位置，以黑体表示)、S2和S3表示。bHLH/bHLH-ZIP(E框)、CTP/NF-1(CAAT)和C/EBP的潜在上游因子结合位置被加以下划线并标识了相对于主起始位置的位置。图2C显示的是利用反义STF-1RNA探针进行的Tu6 RNA(Tu6，泳道2)或对照酵母tRNA(酵母，泳道3)的RNase保护试验。左侧显示未被消化的探针(泳道1)。图2D用反义STF-1 RNA引物对酵母(泳道4)、Tu6 mRNA(泳道5)或RIN mRNA(泳道6)进行的引物延伸分析结果。右侧显示测序梯(GATC，泳道7至10)。RNase保护产物和引物延伸产物之间的对应性是明显的，还显示了前三个起始位置S1、S2和S3(见图2B底部)。
图3显示的是STF-1启动子的6.5kb片段使得β-半乳糖苷酶报道基因的表达定向于转基因小鼠的胰岛细胞。用Xgal作为生色底物对转基因(上方)和对照(下方)同窝生子的成年胰腺的代表性低温切片进行了lacZ活性评定。箭头所指为胰岛细胞。
图4显示，STF-1启动子内的远端和近端元件使得STF-1的表达定向于胰岛细胞。图4A显示与转染到非胰岛细胞(PC12，COS，HeLa)内相比，转染到胰岛细胞(βTC3，HIT)内后-6500 STF-1萤光素酶报道质粒的活性。一代表性的试验显示了在以共转染的RSV-CAT对照质粒归一化后，STF-1启动子相对于在其它细胞系内的在HIT细胞内的活性(100％)。图4B显示STF-1萤光素酶启动子结构物(STFluc)在转染到HIT细胞内后的代表性试验。结构物根据相对于主转录起始位点(S1，见图2A和2B)的其5’启动子边界来命名。图中显示的是细胞核因子的潜在结合位点；主转录起始位点以实心箭头表示。星号表示在远侧3kb内的未确定的结合活性。对每个结构物来说，在以RSV-CAT作为内部对照就转染效率进行了归一化后，相对-6500STF Luc(100％)计算其活性。试验至少重复4次。
图5显示STF-1启动子内的近端E框结合上游因子USF。图5A显示用32P标记的-182至-37(145碱基对(bp))的STF-1启动子片段进行的DNase I保护试验的结果。放射自显影图显示不加提取物(泳道1和4)、加HIT或Hela细胞核提取物(分别为泳道2和3)或加重组USF-1(泳道5)时的消化图谱。
图5B显示的是与以32P标记的包含STF-1 E框(-118/-95)(泳道1)的双链寡核苷酸一起孵育的HIT细胞核提取物的电泳迁移率变化试验。如下所述在结合反应中加入非标记的竞争寡核苷酸(摩尔数过量50倍)：STF E是野生型STF-1E框寡核苷酸；STF-E MUT表示在E框内的-106(C/A)和-102(T/G)处有替换的突变STF-E寡核苷酸；Ins-1(P)是来自胰岛素I启动子的P元件；Gal4表示GAL4识别位置。
左侧的图5C显示以STF-E框为探针(泳道1)进行的HIT细胞核提取物的凝胶迁移试验的结果。如图所述在反应中加入USF或TFE-3抗体(泳道2和3)。复合物C1、C2和C3被标记了出来。右侧的图5C显示的是以STF-E探针进行的HIT提取物(泳道1至3)的凝胶迁移试验的结果。图中显示了在结合反应中加入USF-1和USF-2特异性抗血清。
图6显示，USF与-104E框的结合对于STF-1启动子的活性十分重要。图6A显示E框突变对于USF结合活性的影响。用野生型(E-WT)或突变(E-MUT)STF-1 E框探针进行的HIT细胞核提取物的凝胶迁移试验结果，同时在下方显示了野生型和突变探针从-106至-102的序列。C1-3即复合物C1、C2和C3。图6B显示E框突变对STF-1启动子在HIT细胞内活性的影响。结合图中显示了用野生型、突变或缺失(-118/-95)STF-1 E框基元转染的HIT细胞的代表性分析，并结合了6500bp或190bp的STF-1启动子的试验结果。显示的是在以共转染的RSV-CAT对照质粒就转染效率归一化后相对于野生型-6500STF-1 Luc结构物(100％)的报道基因活性。试验至少重复3次。
图7证明，糖皮质素通过STF-1基因5’侧翼区内的一个胰岛特异性增强子抑制STF-1的表达。
图7A显示在用***(10-7M)或对照用乙醇媒质处理HIT-T15 18至24小时后STF-1启动子的活性。将-6.2/-5.67STF Luc报道基因的活性设定为100％。所有结构物都结合包含120碱基的5’侧翼区(近端侧翼区)的STF-1萤光素酶载体(STF-1 Luc)进行评价。插在STF-1 Luc报道基因内的STF-1序列以核苷酸编号表示。例如，-6.5/-6.2STF Luc包含与近端的120碱基5’侧翼区融合的-6500至-6200的STF-1序列。包含激活元件的远侧区以椭圆和方框表示，基本STF-1启动子以一矩形表示。还显示了标准误差立柱。试验至少重复3次。用共转染的CMV-βgal对照质粒将STF-1报道基因的活性全部归一化为转染效率。
图7B(上方)显示的是STF-1报道基因结构物瞬时转染HIT T15细胞的试验结果。包含6500碱基的5’侧翼区的-6500STF Luc的活性被设定为100％。各试验一式两份，至少重复4次。图中显示了标准误差(下方)。图中显示了STF-1萤光素酶报道质粒在瞬时转染到COS-7细胞内后的活性。启动子活性被归一化为CMV-βgal对照活性，以便直接比较HIT细胞内的STF-报道基因活性。
图7C显示的是STF-1基因内从-6.2kb至-5.67kb的基本胰岛特异性增强子的核苷酸序列。HNF-3和E框结合基元是黑体的并且加有下划线。
图8证明，STF-1基因内的胰岛特异性增强子包含HNF-3β和BETA-2的结合位置。
图8A显示的是用来自大鼠STF-1启动子-5870至-6100的32P标记的STF-1探针进行的HIT T15胰岛细胞、Hela或COS-7细胞的细胞核粗提取物的DNaseI保护试验结果。NONE；不加提取物的对照反应；HNF-3α；用重组蛋白进行的反应。
图8B显示的是来自Hela、HepG2、产胰高血糖素的αTC或产胰岛素的HIT或RIN细胞系(如在各泳道上方所示)的细胞核提取物的凝胶迁移率变化试验结果。试验是用包含H元件的32P标记的STF-1寡核苷酸探针进行的。下方显示了野生型(WT)和突变(MT)H元件的核苷酸序列。如泳道上所示，加入了过量100倍的非标记的野生型或突变的竞争DNA。
图8C显示的是用32P标记的-5907至-5927的STF-1 H元件探针进行的来自HIT胰岛瘤(HIT NE)和原代培养的成年大鼠胰岛细胞(ISLET NE)的细胞核粗提取物的凝胶迁移率变化试验。如每根泳道上方所示，在反应中加入了HNF3α，β或γ抗血清。-；没有加入抗血清。I和II分别是蛋白质-DNA和抗体超变(supershifted)复合物。
图8D显示的是用以32P标记STF-1启动子内从-5963至-5981的B元件探针进行的来自HIT T15细胞的粗细胞核提取物的凝胶迁移率变化分析结果。在每根泳道上显示在结合反应中加入了BETA-2、E2A或STF-1抗血清。如图所示，加入了过量100倍的非标记的野生型(WT：5’-TCAGTGACAGATGGAGTCCT-3’)或突变的(MT：5’-TCAGTGAAAGACGGAGTCCT-3’)竞争DNA。泳道7中显示了来自以BETA-2和E-47cDNA程序化的网织红细胞裂解物的结合活性。泳道7的最上方是网织红细胞裂解物原来的位置。
图9证明，糖皮质素通过抑制HNF-3对胰岛特异性增强子的活性而抑制STF-1的表达。
图9A显示STF-1报道质粒在HIT T15胰岛瘤细胞内的瞬时转染试验结果。包含基本胰岛特异性增强子(-6200至-5700)的-6.2/-5.7STF Luc结构物的活性被设定为100％。在H元件和B元件内含有点突变的结构物以椭圆或方框内加X表示，这些突变干扰HNF-3β与BETA2/E2A的结合。点突变与在凝胶迁移变化分析中使用的E框和H元件突变相对应(见图8)。
图9B显示在对照(-)和***处理(+)的HIT-IT15细胞内HNF-3β过量表达对野生型(阴影立柱)和H元件突变(空白立柱)的STF-1报道基因活性的影响。以含有基本胰岛特异性增强子(-6200至-5700)的-6.2/-5.7STF Luc结构物在对照细胞内的活性为100％。图中显示了标准误差立柱。实验至少重复4次。
图9C显示提高HNF-3β效应质粒的水平对野生型STF-1(-6500STF-1 LUC)报道质粒在HIT-IT15细胞内活性的影响。在各立柱下标明了HNF-3β效应质粒的量，以μg为单位。利用空载CMV表达载体进行补足以保持效应质粒的总量在各试验中保持不变。图中标明了对照(ETOH)和***(DEX)处理的细胞。
                             详细说明
本发明证明，在胰腺的形态发生和体内葡萄糖稳定中起作用的一种同源域蛋白STF-1是由位于鼠5号染色体上的一“孤单”同源异型框基因编码的。当来自STF-1基因的一段6.5kb的5’侧区基因组片段与β-半乳糖苷酶报道基因融合时，它在转基因小鼠内表现出胰岛特异性活性。STF-1启动子内两个独特的元件为胰岛限制性表达所必需：位于-3至-6.5kb之间的远端增强子序列和位于-104处的近端E框序列，后者主要被由碱性螺旋环螺旋(bHLH)/亮氨酸拉链(ZIP)细胞核因子USF识别。由于-104E框内的点突变干扰USF的结合从而降低了STF-1启动子的活性，所以，本发明证明，USF是将STF-1表达定向于胰岛细胞的调控机构中的重要组成部分。而且，我们还发现，糖皮质素强效抑制STF-1的表达，这是通过抑制识别两个内胚层因子：HNF-3β和BETA2/E47的远端胰岛特异性增强子的活性。由此，抑制HNF-3β或BETA2/E47结合的增强子内的突变将干扰STF-1启动子的活性。一HNF-3β表达载体恢复经糖皮质素处理的细胞内STF-1增强子活性的能力证明，HNF-3β的确是STF-1表达中重要的调节物。
本发明目的之一是提供测试诱导STF-1转录的化合物的方法。用磷酸钙共沉淀法来分离表达STF-1/lacz融合基因的胰岛细胞系。为了检测各种化合物对STF-1表达的作用，目标化合物被加入到STF-1/lacZ表达细胞中。用比色试验定量检测对照和经处理细胞内的LacZ活性。利用此方法，可以对大量的化合物进行筛选并方便地鉴定出STF-1诱导性化合物。
本发明的另一目的是提供用STF-1启动子体内标记产胰岛素的胰岛细胞的方法。此处，绿荧光蛋白(GFP)被用作目测指示物。如Ogawa等在美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)1995，92：11899-11903中所述，可以在不干扰细胞的情况下测得绿荧光蛋白的表达。为了便于从动物的胰腺回收β细胞，将STF-1启动子与编码GFP的基因融合。给猪引入STF-1-绿荧光蛋白转基因能够迅速高效地从胰腺中回收产胰岛素的细胞。简而言之，回收猪的胰腺，然后用胶原酶处理来分散细胞。利用基于STF-1绿荧光蛋白转基因的表达的荧光激活细胞分类术(FACS)能够有效地回收得到产胰岛素的胰岛细胞。纯化的β细胞群可以被用于对糖尿病患者的细胞疗法。
本发明的内容之一提供了一种测定待测化合物刺激胰岛细胞诱导STF-1转录的能力的方法，它包括以下步骤：提供包含STF-1增强子(具有选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或它们的片段的序列)、启动子和同时受所述STF-1增强子和所述启动子转录调控的报道基因的载体，所述的报道基因能够使所述的宿主细胞具有可检测的信号；将所述的载体转移到所述的宿主细胞内；在待测化合物存在下培养所述的宿主细胞来测定所述待测物质刺激所述宿主细胞产生所述的可检测信号的能力；分析所述的信号，测定所述待测化合物刺激所述宿主细胞产生所述信号的能力，其中所述信号的存在表示所述待测化合物刺激胰岛细胞诱导了STF-1的转录，没有所述信号则表示所述待测化合物没有刺激胰岛细胞诱导STF-1的转录。
在本发明以此为目的的优选实施方式中，使用的报道基因是一种酶。在更好的实施方式中，该酶选自萤光素酶和β-半乳糖苷酶。
在本发明的另一实施方式中，所述的转移步骤是利用将转基因导入动物的转染或微注射法。
本发明的另一目的提供了体内标记产胰岛素的胰岛细胞的方法，它包括提供包含STF-1启动子和受所述STF-1启动子转录调控的报道基因的载体，其中所述的报道基因能够使胰岛细胞具有一个可检测的信号；将所述的载体作为转基因引入动物胚胎；将所述的胚胎培育成具有胰岛细胞的动物体；分析所述的可检测信号来测定所述动物的胰岛细胞是否表达所述的报道基因，其中信号的存在表示有产胰岛素的胰岛细胞存在，而没有信号则表示没有产胰岛素的胰岛细胞。
在本发明以此为目的的优选实施方式中，报道基因产生荧光蛋白，而且还包括一步利用荧光激活细胞合类术(FACS)将产胰岛素胰岛细胞与非产胰岛素胰岛细胞分选开来。
人基因组含有4个基因簇，被称为Hox或同源异型选择者基因，它们是胚胎发生过程中中轴体图式形成(axial body pattern formation)的关键决定子(Krumlauf，1994，细胞(Cell)78：191-201)。4个基因簇各含13个基因，一个基因簇内的一个特定基因通常与另三族中的成员之一具有特别高的同源性。这样的相关基因被称为共生同源基因；因此，HoxA1、HoxB1、HoxC1和HoxD1都是密切相关的共生同源基因，各自位于不同染色体的不同Hox基因簇内。HoxB复合物在17号染色体的长臂上，例如，已经鉴定出了HoxB1至HoxB9。
胰岛素基因的葡萄糖依赖性调节作用似乎是与葡萄糖介导的胰岛素分泌增加相伴发生的。部分原因可能是细胞内钙的增加。此外，葡萄糖应答性胰岛素启动子的功能可能至少在一定程度上通过FLAT结合蛋白的活性来调节。HoxB13以高亲和性和功能上十分重要的胰岛素启动子的FLAT元件结合。此外，HoxB13和胰岛素ICE/Nir元件-结合因子Pan-1在一同加入时强效活化胰岛素启动子。这与以下发现是一致的，即FLAT和Nir元件在产胰岛素细胞内以协同方式发挥作用。总之，以上信息表明，钙依赖性信号发生路径可能调控着HoxB13的功能。
本发明可能用到本领域内常规的分子生物学、微生物学和重组DNA技术。在文献中对这些技术有祥尽的说明。可参见例如Maniatis，Fritsch & Sambrook“分子克隆：实验室手册(1982)”(“Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1982)”)；“DNA克隆：实践方法”(“DNA Cloning：A Practical Approach”)第I卷和第II卷(D.N.Glover编辑，1985)；“寡核苷酸合成法”(“OligonucleotideSynthesis”)(M.J.Gait编辑，1984)；“核酸杂交”(“Nucleic AcidHybridization”)(B.D.Hames & S.J.Higgins编辑，1985)；“转录和翻译”(“Transcription and Translation”)(B.D.Hames & S.J.Higgins编辑，1984)；“动物细胞培养”(“Animal Cell Culture”)(R.I.Freshney编辑，1986)；“固定化细胞和酶”(“Immobilized Cells and Enzymes”)(IRL出版社，1986)；B.Perbal，“分子克隆的实践指导”(“A Practical Guide To Molecular Cloning”)1984。
所以，本文中出现的下列术语具有以下定义。
“载体”指质粒、噬菌体或粘粒之类的复制子，在上面可以连接其它DNA片段，从而使连接上去的片段得以复制。
“DNA分子”指单链或双链螺旋形式的多聚脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)。它只涉及分子的初级和次级结构，不限定任何一种三级形式。所以，它包括除了线性DNA分子(例如限制性片段)内之外，病毒、质粒和染色体内的双链DNA。本文在论述结构时，按照常规只给出从5’至3’端的非转录DNA序列(即序列与mRNA一样的链)。
“复制起始点”指参与DNA合成的那些DNA序列。
DNA“编码序列”是处于正确的调控序列调控下时在体内被转录并翻译成多肽的双链DNA序列。编码序列的边界由位于5’(氨基)末端的起始密码子和位于3’(羧基)末端的翻译中止密码子确定。编码序列可以包括但不限于原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如哺乳动物的)DNA的基因组DNA和合成DNA序列，聚腺苷酸化信号和转录中止信号通常位于编码区的3’末端。
转录调控序列和翻译调控序列是DNA调控序列，例如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止子等，它们为编码序列在宿主细胞的表达所需。
“启动子序列”是能够在细胞内结合RNA聚合酶并引发下游(3’方向)编码序列的转录的DNA调控区。为了定义本发明，启动子序列在其3’末端以转录起始位置为界，向上游(5’方向)延伸，直至将引发高于背景的可测水平的转录所需的最小数量的碱基或元件包含在内。在启动子序列内有转录起始位置(一般用核酸酶S1通过物理图谱来确定)，以及负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合域(共有序列)。真核启动子常常但不总是包含“TATA”框和“CAT”框。原核启动子除了-10和-35共有序列之外还包含Shine-Dalgarno序列。
“表达调控序列”是控制和调节其它DNA序列的转录和翻译的DNA序列。当RNA聚合物酶将编码序列转录成mRNA，后者再被翻译成由编码序列编码的蛋白质时，编码序列即“受到转录和翻译调控序列的调控”。
“信号序列”可以被包含在编码序列之前。该序列编码一段位于多肽的N末端的信号肽，它与宿主细胞进行交流，将多肽导向细胞的表面，或者将多肽分泌到介质中，而且，该信号肽在蛋白质离开细胞之前被宿主细胞切除。信号肽被发现与许多原核和真核生物特有的蛋白质相关联。
“寡核苷酸”，例如在指本发明的探针时，其定义为包含两个或两个以上核糖核苷酸的分子，最好有8个以上。其确切大小取决于许多因素，这些因素又取决于寡核苷酸的最终功能和用途。
“引物”在此指以天然形式存在(象在纯化的限制性消化产物中那样)或者以合成法生成的这样一段寡核苷酸，它在处于诱导引物延伸产物合成的条件下时，能够作为合成起始位点，所述的引物延伸产物是与一段核酸链互补的，所述的条件即在核苷酸和例如DNA聚合酶的诱导剂的存在下并且处于合适的温度和pH下。引物即可以是单链也可以是双链，但是必须足够长，以便在诱导剂的存在下引发所需的延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，其中包括温度、引物来源和所用的方法。例如，对于诊断用途来说，根据目标序列的复杂性，寡核苷酸引物一般包含15至25个或更多个核苷酸，虽然它也可能包含少于上述数量的核苷酸。
本文中的引物经选择与不同的目标DNA序列链“基本上”互补。这意味着引物必须具有足够的互补性来与它们对应的链杂交。所以，引物序列不必反映出模板的确切序列。例如，非互补性核苷酸片段可以连接在引物的5’末端，而引物的其余序列与模板链是互补的。或者，非互补性碱基或更长的序列可以插在引物中间，只要引物序列与模板序列具有足够的互补性或者与它杂交，并由此形成合成延伸产物所需的模板。
“限制性内切酶”和“限制性酶”都指细菌酶，都在或接近一段特定核苷酸序列处切断双链DNA。
当外源或异源DNA被引入到细胞内部后，则细胞被所述的DNA“转化”。转化DNA可能也可能不被整合(共价连接)到细胞的基因组内。在例如原核细胞、酵母和哺乳动物细胞内，转化DNA可能保持在例如质粒的游离元件上。就真核生物而言，稳定转化的细胞是指转化DNA整合到染色体内从而通过染色体复制被子代细胞继承的细胞。真核细胞能够建立由包含转化DNA的子代细胞群构成的细胞系或克隆证明了这种稳定性。“克隆”是由单个细胞或共同的祖先通过有丝***得到的一群细胞。“细胞系”是能够在体外稳定繁殖许多代的原代细胞的克隆。
当确定长度的DNA序列上有至少约75％的核苷酸相互匹配(至少约80％更好，至少约90或95％则最好)，则两段DNA序列“基本同源”。基本同源的序列可以利用可在序列信息库中获得的标准软件通过序列比较来鉴定，或者在就具体***而言的严谨条件下的Southern杂交实验来鉴定。确定合适的杂交条件是本领域的常规技术。参见例如Maniatis等，见上文；DNA克隆，第I和第II卷，见上文；核酸杂交，见上文。
DNA结构物的“异源”区是一段大DNA分子内的一段可鉴定DNA片段，后者并不天然地与所述的大分子相关联。所以，当异源区编码哺乳动物基因时，该基因两侧的DNA通常不是在哺乳动物基因组来源生物内位于该基因组DNA两侧的DNA。在另一实例中，编码序列是一种结构物，其中的编码序列本身并不天然存在(例如cDNA，其基因组编码序列包含内含子，或者是具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。等位变异或天然突变都不产生上述DNA异源区。
此类研究最常用的标记是放射性元素、酶、在接触紫外光时会发荧光的化学物质等。大量荧光物质是已知的，可以用作标记。其中包括例如荧光素、罗丹明、auramine、Texas红、AMCA蓝和萤光黄。一种特殊的检测材料是在山羊中制备并与荧光素通过异硫氰酸酯共价结合的的抗兔抗体。
同样，也可以使用酶标记，而且可以用目前使用的比色法、分光光度法、荧光分光光度法、电流分析法或气体分析法中的任何一种来检测。酶通过与碳化二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等桥连分子反应与选定的粒子共轭。已知有许多酶可以用于此方法。其中较好的是过氧化物酶、β-葡糖苷酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加过氧化物酶以及碱性磷酸酶。例如，美国专利3,654,090，3,850,752和4,016,043还公开了其它标记材料和方法。
以下实施例是为了说明本发明的各种实施方式，而不是对本发明的限定。
                          实施例1
染色体的制图
使用Jackson Laboratoray的(B6×SPRET)F1×SPRET回交DNA系列，以32P标记的STF-1cDAN片段为探针，进行STF-1基因的染色体制图。
                          实施例2
转基因鼠的产生和β-半乳糖苷酶染色
用标准克隆技术构建在β-半乳糖苷酶报道基因之前包含6500碱基对(bp)的上游STF-1序列的融合基因，并将它注入受精***的精核中。利用Southern印记法和PCR扩增鉴定出鼠建立者(founder mice)。在20μM的低聚甲醛固定化组织切片上以X-gal为生色底物对转基因组织中STF-1/β-半乳糖苷酶融合基因的表达进行评价。
                          实施例3
抗体
超变(supershift)实验中使用的无差别STF-1、2抗体是购自Santa CruzBiothchnology。TFE3抗体是K.Jones提供的。特异性识别USF-1或USF-2的抗体是M.Sawadogo提供的。(17，18)
                          实施例4
STF-1基因组克隆的分离
以32P标记的STF-1 cDNA片段作为杂交探针从EMBL3大鼠基因组文库中分离出STF-1基因。将STF-1阳性基因组片段亚克隆到SK II质粒(Strategene)的EcoRI位置内。
                          实施例5
RNase保护和引物的延伸
用Oligotex(dT)30***(Quiagen)制备聚A+RNA。用于引物延伸分析的寡核苷酸用γ-32P ATP和T4聚核苷酸激酶标记其5’末端。5μg聚A+RNA和末端标记的反义引物一起在80℃孵育5分钟，然后在42℃孵育16小时。引物延伸反应用AMV逆转录酶在37℃进行1小时，产物在5％变性聚丙烯酰胺凝胶上进行分析。用25μg从Tu6细胞中抽提的总RNA进行RNase保护分析(19)。利用一段相对翻译起始位置-185至+93位的STF-1基因组片段产生反义STF-1 RNA探针。用T7RNA聚合酶和32P-UTP体外合成32P标记的反义STF-1 RNA。STF-1反义RNA探针和mRNA在80℃退火5分钟，然后在65℃孵育16小时。退火反应系然后在室温下以40μg/ml RNase处理1小时，以5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析消化产物。
                          实施例6
报道基因克隆和瞬时转染
启动子片段都被利用标准克隆技术克隆到D.Helinski提供的P(A)3萤光素酶骨架中(20)。来自STF-1启动子的5’侧翼序列在相对主转录起始位置的+68位(-6500 STF Luc，-3500 STF Luc，-450 STF Luc，-410 STF Luc，-225 STF Luc，-140 STF Luc)或+78位(-190 STF Luc，-130 STF Luc，-120 STF Luc，-95 STF Luc，-35STF Luc)与萤光素酶基因融合。利用磷酸钙沉淀法将质粒转染到HIT-IT15细胞(ATCC)、βTC 3(D.Hanahan(21)提供)、PC12、COS和HeLa细胞内。在单光发光计上定量测定萤光素酶值，并归一化成由共转染的RSV-CAT内部对照质粒得出的CAT活性。
                          实施例7
凝胶变化试验和DNase保护试验
为了用于电泳迁移率变化试验，寡核苷酸探针利用Klenow片段通过补平反应以α32P-dCTP进行标记。4μg细胞核提取物与0.5纳克(ng)32P标记的双链寡核苷酸一起孵育并按照现有技术进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(9)。为了进行超变分析，蛋白质预先与抗体一起孵育，然后与放射性双链寡核苷酸一起孵育，然后电泳。按照现有技术进行DNase保护试验(22)。
用HP ScanJet 3C扫描原始照片，然后在Macintosh上用Canvas软件编辑成DNA结合试验图。扫描后的图像被复制在Tektronix Phaser II SDX上。
                          实施例8
STF-1基因的染色体定位和基因组组构
用STF-1 cDNA作为Jackson Laboratory的DNA回交系列的杂交探针，单拷贝的STF-1基因在物理图上位于鼠5号染色体的远端(图1A)。没有发现具有远端标记Pmv12或Iapls3-9的重组体，但是发现了6个具有更远的Actb基因组的重组体(图1B)。以上结果预示，STF-1基因将相应地存在于大鼠的14号染色体和人染色体7q上，在与4个同源异型基因簇都不相应的基因座上。以上结果显示，STF-1基因应该被归为“孤独”同源异型框基因。
为了分离编码STF-1的基因，用32P标记的STF-1 cDNA探针筛选来自大鼠EMBL3基因组文库的106个噬菌体克隆，得到2个含有15kb的基因组***片段的阳性克隆。除了6.5kb的5’侧翼和3.5kb的3’侧翼序列，该15kb的STF-1基因组片段还包含完整的STF-1编码区，该区内紧靠同源异型框(氨基酸140-215)上游(Ala 135)插有一个4kb的内含子(图2A)。
STF-1基因组克隆中5’侧翼内的共有TATA框和起始序列(图2B)缺失。接着，对该基因的转录起始位置进行制图。利用对来自产胰岛素细胞系RIN和Tu6的mRNA进行的RNase保护和引物延伸分析，鉴定出了三个主起始位置，分别被称为S1、S2和S3，它们位于翻译起始位置上游第91、107和120/125核苷酸。还发现了位于翻译起始位置上游137个核苷酸处的第4个次转录起始位置。和其它没有TATA框的启动子一样，该STF-1启动子在S1和S2起始位置上游30bp处含有G/A和G/C丰富区。(23-25)
                          实施例9
STF-1启动子在胰岛细胞内的活性
为了确定STF-1基因5’侧翼内的序列是否足以使得STF-1的表达以胰岛细胞为目标，6500bp的STF-15’侧翼序列与β-半乳糖苷酶基因融合，并测定该STF-1-lac z报道基因在转基因小鼠内的表达。以x-gal为生色底物，在来自三种各自独立的建立系的转基因胰岛中检测到了β-半乳糖苷酶活性，但是在同窝生的对照中没有检测到(图3A)。
与目前所述的内源性STF-1蛋白的表达方式一样，在转基因鼠的外分泌腺细胞(图3B)和例如肝和肾的非胰岛组织中(未示)没有检测到明显的β-半乳糖苷酶活性。与报道中内源性STF-1基因在十二指肠中的表达一样(8，13)，以反义β-半乳糖苷酶RNA为探针进行的原位杂交研究也揭示了在转基因动物的十二指肠上皮细胞内转基因的表达(未示)。以上结果表明，6500bp的STF-1启动子足以使得STF-1的表达定向于胰岛和十二指肠细胞。
为了确定使STF-1表达定向于胰岛细胞的功能元件，在两个不同的胰岛细胞系(βTC 3，HIT)中对-6500STF Luc报道基因的活性进行了检查。正如根据转基因小鼠得出的结果所作的预计，STF-1报道基因在这些胰岛细胞中表现出比在例如HeLa、PC12和COS的非胰岛细胞系中强20至100倍的活性(图4)。相反，STF-1的4kb内含子和3’侧翼区当被***在基本SV40 CAT启动子质粒中时，没有显示出这样的活性(未示)，这表明是6.5kb的STF-1启动子片段专门负责将STF-1的表达定向于胰岛细胞。
为了描述提供胰岛细胞表达特性的STF-1启动子内的序列，制造了一系列的5’缺失结构物，并通过向HIT细胞内的转染对这些报道基因进行了分析(图4B)。从-6500STF-1报道基因结构物中缺失掉-6500至-3500bp序列使得STF-1报道基因的活性降低了4倍，这表明在该区域内存在着远端活化序列。进一步将STF-1启动子从-3500bp对截短至-190bp不明显影响报道基因在HIT细胞内的活性(图4B)。但是，缺失STF-1启动子内-190至-95bp的序列(SEQ ID NO：5)严重减弱了启动子在HIT细胞内的活性，这表明STF-1功能还需要一个近端元件。对STF-1启动子-190至-95区内序列的检视发现了3个共有E框基元(图2A)。虽然去除位于-177的两个双联E框不降低启动子的活性，但是缺失掉位于-104(-95 STF luc)的近端E框完全消除了STF-1在HIT细胞内的表达。
                         实施例10
STF-1启动子内的近端E框识别含USF复合物
为了确定与STF-1启动子内功能元件结合的上游因子，用来自HIT和HeLa细胞的细胞核提取物进行了DNase I保护试验(图5)。在两种提取物中都发现了一个主要的足迹蛋白活性，其边界与在功能上十分重要的近端E框一致(-118/-95)。为了在HIT和HeLa细胞核提取物中进一步确定与重要的-104E框基元结合的蛋白而进行了凝胶迁移率变化试验。用从-118至-95的一段双链STF-1寡核苷酸，用两种细胞核提取物都发现了3种复合物，称为C1、C2和C3(图5B，右面，泳道1和4)。在结合实验中，C1、C2和C3的形成被过量50倍的非标记STF-1 E框竞争寡核苷酸所抑制。但是，突变E框寡核苷酸或非特异性竞争DNA对它们的结合活性没有影响，这表明C1、C2和C3确实对STF-1 E框序列具有特异性(图5B)。HeLa和HIT提取物中的这些聚合物在图式上没有质的差异(未示)，这表明-104E框可能识别在两种细胞中类似表达的因子。
以前的报道证明，E框(例如-118/-95STF-1基元(CACGTG))优选结合bHLH-ZIP蛋白例如myc、max、TFE-3和USF。我们对C1、C2或C3复合物中是否含有上述候选蛋白进行了检查(26，27)。因为-118/-95E框结合蛋白具有耐热变性的能力(未示)，所以我们检查热稳定上游因子USF是否是C1、C2或C3的组成部分(28)。值得注意的是，在凝胶迁移率变化反应中加入抗USF抗血清抑制了所有3中复合物的形成(图5C)。但是抗TFE-3抗血清对C1、C2或C3复合物没有影响，这表明这些复合物很可能是由USF蛋白形成的。在凝胶变化试验中，重组USF-1产生了一种蛋白质DNA复合物，它和复合物C2在相同的相对位置发生迁移(未示)。而且，在DNaseI保护研究中，重组USF-1足迹蛋白活性与在HIT提取物中观察到的一样(图5A)。
两种USF，USF-1和USF-2似乎在大多数细胞类型中都表达(18)。为了分辨出这些USF蛋白中哪种包含在C1、C2和C3复合物内，将HIT或HeLa提取物与抗USF-1特异性抗血清或抗USF-2特异性抗血清一起孵育(图5D)。虽然USF-1抗血清能够“超变”所有3中复合物，但是USF-2特异性抗血清只抑制C1和C3复合物的形成。以上结果表明，C1和C3复合物对应于USF-1/USF-2异二聚体，而C2含有USF-1同源二聚体。
为了证实CACGTG E框序列是否为STF-1启动子活性所必需，我们构建了一个在E框内含有两处碱基对取代的突变STF-1寡核苷酸(-118/-95)。在以HIT提取物进行的凝胶迁移率变化试验中，该突变E框基元(AACGCG)不能形成C1、C2和C3复合物，也不能与野生型E框寡核苷酸竞争与USF-1的结合(图6A)。相应的，包含突变STF E基元的全长(6.5kb)STF-1和截短报道质粒(-190STF)在胰岛细胞中的活性比它们的野生型低近10倍(图6B)。以上结果表明，结合USF的近端E框对STF-1启动子活性来说确实是关键性的。
所以，前6500碱基对的STF-15’序列内的两个元件对于胰岛特异性表达来说是重要的：位于-6500至-3500之间的远端元件，和位于-104的近端元件。近端的-104元件含有一个共有E框基元，它识别上游活化物USF。许多信息证明，USF对于STF-1的活性十分重要。首先，无差别USF-1、2抗体和USF-1、2特异性抗体都识别STF-1 E框特异性复合物。其次，STF-1 E框在HIT细胞核提取物中的结合活性具有USF特有的特征：复合物具有热稳定性，具有与重组USF-1相近的半衰期。最后，STF E框上抑制USF复合物形成的点突变相应地减弱了STF-1报道基因的活性。以上结果表明，USF复合物对于STF-1启动子的活性确实十分重要，由此，对于胰腺的器官形成也十分重要。
除USF之外的其它核因子，最主要的是myc和max，也能够高亲和力地结合STF-1 E框(CACGTG)基元。myc已被证明通过与max以异二聚体的形式与E框基元结合来刺激靶基因的转录(32，33)。由于myc基因的表达在细胞有丝***后期(例如胰岛中的那些)中无法测得，所以那里的STF-1启动子调控作用可能不涉及myc-max复合物。但是，在发育过程中，STF-1的表达似乎集中在增殖性管细胞中(6)，所以，myc可能在那些条件下刺激STF-1的表达。在这方面，在胰腺发育过程中观察到的STF-1表达的复杂变化可能在一定程度上反映了E框结合活性的变化，后者最终将STF-1的产生限制在胰岛细胞。
                         实施例11
凝胶变化试验和DNase I保护试验
为了进行电泳迁移率变化试验，双链寡核苷酸用Klenow片段通过32PdCTP补平反应进行标记。5微克(μg)细胞核提取物与0.5纳克(ng)标记过的寡核苷酸和1μg非特异性竞争DNA一起在冰上孵育30分钟，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。为了进行超变试验，细胞核提取物预先与抗血清一起在冰上孵育30分钟至1小时，然后加入标记过的探针。抗HNF-3α、HNF-3β和HNF-3γ抗体是由S.Duncan和J.Darell提供的。抗BETA-2抗体是M.J.Tsai提供的。抗-E2A抗体是向Santa Cruz Biochemicals购买的。如现有技术所述进行DNAse I保护试验(37)。重组HNF-3α由K.Zaret提供。
                         实施例12
Northen印迹
抑生长素细胞瘤/胰岛细胞瘤Tu6细胞在乙醇或10-7***中培养不同的时间。用苯酚胍法抽提总RNA。用15微克总RNA在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行电泳，然后转移到Zeta-Probe上。使用Amersham随机引发试剂盒形成随机引发STF-1和微管cDNA。
                         实施例13
内皮因子HNF-3β和BETA-2通过胰岛特异性增强子调控STF-1表达
包含STF-1基因从-6200至-5670的530碱基对的启动子结构物经***处理后被完全抑制，但含有遍在USF-1识别位置的基本STF-1启动子结构物却不受抑制(图7a)。STF-1基因的该相同530bp区域在HIT-T15细胞内比在COS-7细胞内活性高约5至10倍，这表明该片段具有胰岛细胞特异性活性(图7b)。对细胞特异性STF-1增强子内序列的检测显示有对应E框结合蛋白(-5.98至-5.963)和HNF-3(-5.927至-5.907)的共有基元(图7c)。该E框基元，被称为B元件，在序列上与大鼠胰岛素I和II启动子内的NIR和FAR元件是一样的(34)。HNF-3位置，被称为H元件，在12个位置的9各内与HNF-3共有结合位置是一致的。
为了确定B元件和H元件是否真的被胰岛特异性核蛋白识别，我们用以32P标记的从-5870至-6100的STF-1增强子片段进行DNAse I保护试验。从HIT T15细胞制备的核提取物被发现同时具有在B位置(E框基元)和H位置(HNF-3基元)上的DNA结合活性(图8a、比较泳道1和2)。在以来自HIT、HeLa和COS 7细胞的核提取物进行的DNAse I保护试验中，B元件都受到相同程度的保护，但是只有在来自HIT细胞的提取物中H元件受到保护(图8a，比较由此2和4)。在含有纯化重组HNF-3α蛋白的反应中，我们还注意到插在H元件足迹中间的一个突出的超敏位点，这使得我们怀疑HNF-3调节物家族中的一员与HIT-T细胞中的STF-1 H元件结合(图8a，比较泳道2和5)。
为了进一步确定识别STF-1增强子上H元件的核因子，我们用32P标记的STF-1 H元件探针进行了凝胶迁移率变化试验。在含有HIT或RIN核提取物的反应系中观察到主要为低迁移率复合物，而且该复合物的形成特异性地受到添加摩尔量过量100倍的非标记野生型H元件竞争DNA的抑制，但不受非标记突变H元件竞争DNA的抑制(图8b，比较泳道4-5，9-10，14-15)。在含有HeLa细胞核提取物的反应系中没有发现特异性蛋白质DNA复合物，这表明H元件可能识别具有限制性表达方式的细胞核因子(图8b，比较泳道1，6)。但是，在HepG2肝癌提取物中存在着迁移率与RIN/HIT-T15复合物一样的H元件特异性复合物表明，H元件结合蛋白可能在具有内皮性起源的细胞中普遍表达(图8b，比较泳道3-5)。
HNF-3核活化物家族由(α，β和γ)组成，它们通过高度保守的翼状螺旋主域结合DNA。为了确定HIT提取物中的H元件结合活性是否与HNF-3家族成员有关，我们用HNF-3成员各自的特异性抗血清进行了凝胶迁移率变化试验。虽然用Western印记分析在HIT-T15胰岛瘤细胞的细胞核提取物中测得了全部3种HNF-3蛋白(未示)，但是在使用相同的提取物和H元件探针时，只发现HNF-3β抗血清被发现抑制为主的蛋白质-DNA复合物的形成(图8c，泳道1-4)。以从成年大鼠胰岛细胞原代培养物制备的细胞核提取物进行的凝胶变化试验中也得出相同的结果(图8c，泳道5-8)。
STF-1增强子内的B元件含有与胰岛素启动子内的E框元件一致的共有E框基元。以前的研究证明，胰岛特异性因子BETA-2通过与遍在因子E47以异二聚体形式结合这些胰岛素启动子元件来激活胰岛素启动子活性，这促使我们对STF-1 B元件上BETA-2/E47的形成进行了测试。在HIT细胞核提取物的凝胶迁移率变化试验中，32P标记的B元件探针被发现形成4种特异性DNA蛋白质复合物，它们会被加入的非标记的野生型竞争抑制，但不受非标记突变型的竞争抑制(图8d，比较泳道1，5，6)。最慢的复合物其迁移位置与重组E2A/BETA2异二聚体相同(图8d，比较泳道1和7)。虽然非相关性抗血清对B元件结合活性没有影响(图8d，泳道4泳道2和3)，但是BETA-2或E2A抗血清特异性地抑制最慢的复合物的形成(图8d，泳道2和3)，这表明，E2A/BETA2异二聚体的确在HIT细胞核提取物中识别T元件。
为了测定HNF-3β和E2A/BETA-2识别位置在介导STF-1增强子活性方面的重要性，我们在B和H元件内进行了点突变，这样的突变在体外干扰上述识别因子的结合。当结合530bp的增强子进行测试时，含有B元件内或H元件内突变的STF-1报道质粒在HIT T15细胞内的活性比野生型结构物低得多(图9a)。但是，相反，突变的B元件和H元件结构物的活性在COS-7细胞内与野生型-6500STF-1报道质粒相同；这表明这些突变干扰特异性地与胰岛细胞相关联的转录活性。所以，B元件和H元件突变STF-1报道质粒在HIT-T15细胞内对***诱导也是没有反应的，这表明，这种激素特异性地干扰E2A/BETA 2或HNF-3β活性(图9b)。
为了评价***是否通过干扰HNF-3β或BETA 2/E47对远端增强子的活性来干扰STF-1的表达，我们用HNF-3β或BETA 2和E47效应质粒进行了瞬时转染试验。HNF-3β(图9b)或BETA 2/E47(未示)的过量表达在非受激HIT T15细胞内对STF-1报道基因的表达几乎没有影响(图9b，比较立柱1和5)。HNF-3β被发现抑制***对野生型STF-1报道基因活性的抑制作用(图9b，比较立柱1，3，7)，但是例如BETA 2/E47、STF-1和HNF-4的活化物不能恢复经***处理过的细胞内的STF-1启动子的活性(未示)。在以不断加量的效应质粒进行的滴定实验中，HNF-3β被发现以剂量依赖性方式恢复-6500STF-1 LUC报道基因的活性(图9c)。但是，HNF-3β不加强含有H元件内突变的突变STF-1报道质粒的活性，这表明该活化物的抑制作用是通过其在STF-1增强子内的识别位置产生的(图9b比较立柱2，4，6，8)。
本文引用了以下参考文献。
1.Pictet，R.L.等人，发育生物学(Develop.Biol.)；29，436-467(1972)。
2.Gttes，G.K.等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)；89，1128-1132(1992)。
3.Alpert，S.等人，细胞(Cell)；53，295-308(1988)。
4.Jonsson，J.等人，自然(Nature)；371，606-609(1994)。
5.Ohlsson，H.等人，欧洲分子生物学杂志(EMBO)12，4251-4259(1993)。
6.Guz，Y.等人，发育(Development)；121，11-18(1995).
7.Leonard，J.等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)；89，6247-6251.(1992).
8.Leonard，J.等人，分子内分泌学(Mol Endocrinol)；7，1275-1283(1993).
9.Peers，B，等人，分子内分泌学；8，1798-1806(1994).
10.Walker，M.D.等人，自然；306，557-561(1983).
11.Vallejo，M.等人；分子生物学(J.Biol.Chem.)；267，12868-12875(1992).
12.Karlsson，O.等人，美国科学院院报；84，8819-8823(1987).
13.Miller，C，等人欧洲分子生物学杂志；13，1145-1156(1994)
14.Naya，F.等人.，基因与发育(Genes and Dev.)；9，1009-1019(1995).
15.Gernam，M.等人，基因与发育；6，2165-2176(1992)
16.Peshavaria，M.等人，分子内分泌学；8，806-816(1994)
17.VanDyke，M.W.等人，基因III(Gene III)；99-104(1992)
18.Sirito，M，等人，核酸研究(Nucleic Acids Res)；22，427-433(1994)
19.Madsen，O.D.等人，细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)；103，2025-2034(1086)
20.Maxwell，I.H等人.，生物技术(Biotechniques)；7，276-280(1989)
21.Hanahan，D.等人；自然315，115-122(1985)
22.Montminy，M.R.等人，自然；328，175-178(1987)
23.Weis，L.等人，Faseb J.；6，3300-3309(1992)
24.Ishi，S.等人，科学(Science)；230，1378-1381(1985)
25.Geng，Y.等人，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)；13，4894-4903(1993)
26.Beckmann，H.等人，基因与发育；4，167-179(1990)
27.Gregor，P.D.等人，基因与发育；4，1730-1740(1990)
28.Sawadogo，M.等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem)；263，11985-11993(1988)
29.Krumlarf，R.等人，细胞；78，191-201(1994)
30.Boncinelli，E.等人，人类生殖学(Hum.Reproduc.)；3，880-886(1988)
31.Lewis，E.B.等人，自然；276，565-570(1978)
32.Kretzner，L.等人，自然；359，426-429(1992)
33.Blackwood，E.等人，科学；251，1211-1217(1991)
34Edlund，T.等人，科学；230：921-916(1985)
35.Clark，K.等人，自然；364：412-420(1993)
36.Lai，E.等人，美国科学院院报(PNAS)；90：10421-10423(1993)
37.Sharma，等人，生物化学杂志(JBC)；271：2294-2299(1996)
序列表
(1)一般信息：
(i)申请人：Montminy和Sharma
(ii)发明名称：新的鉴定刺激STF-1在胰岛细胞内表达的化合物的方法
(iii)序列数量：4
(iv)通讯地址：
(A)地址：James F.Weiler，Attorney-at-Law
(B)街道：One Riverway，Suite 1560
(C)城市：Houston
(D)州：Texas
(E)国家：USA
(F)邮编：77056
(V)计算机可读形式：
(A)介质类型：DS，HD 1.44Mb/1.44Mo
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作***：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：WordPerfect 6.0
(vi)当前申请信息：
(A)申请号：尚未获得
(B)申请日：
(C)申请类型：用途
(viii)律师/代理人信息：
(A)姓名：Weiler，James F.
(B)注册号：16,040
(C)文献/卷宗号：D-5848
(ix)电传信息：
(A)电话：713-626-8646
(B)电传：713-963-5853
(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：403bp
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：
(A)说明：其它核酸
(iii)假设：非
(iv)反义：非
(vi)原始来源：
(B)菌株：
(C)具体分离株：
(D)发育阶段：
(F)组织类型：
(G)细胞类型：
(H)细胞系：
(xi)SEQ ID NO：1的序列描述：
TTAAGCTCTA ATGGAGCGGT TTTGTAACGG AGTAAAGGTT CTGATATTTT TGCGCTCCCC  60
GGTTTGGAGA GCTCCGCAGC AGGACAGGAG AGATCAGCCT GCTGAGAGAG AAAATTGAAA  120
CAAGTGCAGG TGTTCGCGGG CCTGGGCCTC CTTCTTAAGG CAGGGCCAGG CCAATGGTGG  180
CCCCAGGCTG AACCACGTGG GGTGCCTCAG AGCCTATGGC ACGGCGACCG GCTTCTCTGT  240
CTCTCGCCAG CCTGTGGTTC CCCGGGAGAG CAGTGGAGAA CTGTCAAAGC GATCTGGGGT  300
GGCGCTGAGA GTCCGTGAGC TGCCAGCGCC TTAAGGCCTG GCTTGTAGCT CCCTACCCCG  360
GGCTGCCGGC CCCGAAGTGC CGGCTGCCAC CATGAATAGT GAG                    403
(3)SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：490bp
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：
(A)说明：其它核酸
(iii)假设：非
(iv)反义：非
(vi)原始来源：
(B)菌株：
(C)具体分离株：
(D)发育阶段：
(F)组织类型：
(G)细胞类型：
(H)细胞系：
(xi)SEQ ID NO：2的序列描述：
TCTAGAGAGT TCTCCTGTTC GCTAGATAAG AAAGCCTGTT CTGCCATCCC AGCAGGCATA  60
GGCTGTTTAA GTTACTAGAT AACAGAGTTG TTATTGATTC TATTATTATT ATTTTTTCTA  120
CTCTTCCTGA TTCCCTGAAG TCCAAGGGAA GTTTTGTCAA CTAGGAATGA TTTTTGTTTA  180
AAAAAAAAAA AAAAAGGCTC CTTGTTGTGT CTTAGCTGGT CAGTGACAGA TGGAGTCCTG  240
AGTTTCCTAG GAGCCCTTTA CTCAGGAGTG GGAGAACAGA AAGTAAATAA GCGCTCTTAG  300
TCATCTGCTT TCTCAGAGCA GCGTTGGGCC CCAGCACTTG GAAAGCGAAT GCTGGCTCCT  360
CCTGGACTCC CCCGTCAGCC TGATGTTGTT AACCCGTTTA ACATTCCCTT ATCACATGCT  420
CATTGTGGGC AGAATTAAGT GGAATTAGCT AACAAATTAT ATAAAATTCA TTTACCTTTC  480
AAGGAAGCTG                                                         490
(4)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：20bp
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：
(A)说明：其它核酸
(iii)假设：非
(iv)反义：非
(vi)原始来源：
(B)菌株：
(C)具体分离株：
(D)发育阶段：
(F)组织类型：
(G)细胞类型：
(H)细胞系：
(xi)SEQ ID NO：3的序列描述：
TCAGTGACAG ATGGAGTCCT   20
(5)SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：20bp
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：
(A)说明：其它核酸
(iii)假设：非
(iv)反义：非
(vi)原始来源：
(B)菌株：
(C)具体分离株：
(D)发育阶段：
(F)组织类型：
(G)细胞类型：
(H)细胞系：
(xi)SEQ ID NO：4的序列描述：
TCAGTGAAAG ACGGAGTCCT  20
(6)SEQ ID NO：5的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：96bp
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：
(A)说明：其它核酸
(iii)假设：非
(iv)反义：非
(vi)原始来源：
(B)菌株：
(C)具体分离株：
(D)发育阶段：
(F)组织类型：
(G)细胞类型：
(H)细胞系：
(xi)SEQ ID NO：5的序列描述：
AAAATTGAAA CAAGTGCAGG TGTTCGCGGG CCTGGGCCTC CTTCTTAAGG CAGGGCCAGG 60
CCAATGGTGG CCCCAGGCTG AACCACGTGG GGTGCC                           96

Claims (9)

1.一种测定被测化合物刺激胰岛细胞诱导STF-1转录的能力的方法，它包括以下步骤：
提供包含操作性相连的STF-1增强子，STF-1启动子和报道基因的载体，所述STF-1增强子是SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.2或它们的具有STF增强子活性的片段，所述STF-1启动子包含选自S1，S2或S3的转录起始位点，所述S1，S2或S3分别位于翻译起始位置上游第91、107和120/125位核苷酸，所述报道基因的表达使胰岛宿主细胞具有可测信号；
在体外将所述载体转移到所述宿主细胞内；
在被测化合物存在下培养所述的宿主细胞；
分析所述被测化合物刺激所述宿主细胞产生所述可检测信号的能力，其中有所述信号的存在表示所述被测化合物刺激胰岛细胞诱导了STF-1的转录，而没有所述信号则表示所述的被测化合物没有刺激胰岛细胞诱导STF-1的转录。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的报道基因是酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的酶选自萤光素酶和β-半乳糖苷酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的转移步骤是通过转染进行的。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的胰岛细胞是HIT细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述的转移步骤是通过微注射将转基因导入动物体内来进行的。
7.一种体外标记产胰岛素的胰岛细胞的方法，它包括以下步骤：
提供权利要求1中所述的载体；
将所述载体导入待检胰岛细胞；
分析所述的可检测信号，确定待检胰岛细胞是否表达所述的报道基因，其中有信号存在表示有产胰岛素的胰岛细胞存在，而没有信号表示没有产胰岛素的细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的报道基因产生荧光蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的方法还包括利用荧光激活细胞分类术将产胰岛素的胰岛细胞与不产胰岛素的胰岛细胞分选开来的步骤。
CNB971917825A 1996-01-22 1997-01-22 新的鉴定刺激stf-1在胰岛细胞内表达的化合物的方法 Expired - Fee Related CN1154738C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1041496P 1996-01-22 1996-01-22
US60/010,414 1996-01-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1209843A CN1209843A (zh) 1999-03-03
CN1154738C true CN1154738C (zh) 2004-06-23

Family

ID=21745661

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB971917825A Expired - Fee Related CN1154738C (zh) 1996-01-22 1997-01-22 新的鉴定刺激stf-1在胰岛细胞内表达的化合物的方法

Country Status (14)

Country Link
US (1) US5969210A (zh)
EP (1) EP0876492B1 (zh)
JP (1) JP4472025B2 (zh)
KR (1) KR100454621B1 (zh)
CN (1) CN1154738C (zh)
AT (1) ATE304055T1 (zh)
AU (1) AU726356C (zh)
CA (1) CA2244176C (zh)
DE (1) DE69734143T2 (zh)
IL (2) IL125153A0 (zh)
NZ (1) NZ330866A (zh)
RU (1) RU2183465C2 (zh)
WO (1) WO1997026360A1 (zh)
ZA (1) ZA97476B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107663233A (zh) * 2017-11-16 2018-02-06 中国农业科学院生物技术研究所 植物转录因子stf1及其编码蛋白和应用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5861313A (en) * 1995-06-07 1999-01-19 Ontogeny, Inc. Method of isolating bile duct progenitor cells
FR2775003A1 (fr) * 1998-02-19 1999-08-20 Transgene Sa Methode de criblage de composes capables d'inhiber la fixation entre le facteur de transcription stat1 et le facteur de transcription usf1
FR2847263B1 (fr) * 2002-11-18 2006-01-13 Commissariat Energie Atomique Polynucleotide specifique de la cellule pancreatique beta des ilots de langerhans
KR100834439B1 (ko) * 2004-05-29 2008-06-04 삼성전자주식회사 그래픽 데이터 압축 및 복원 장치와 그 방법
EP1728873A1 (en) * 2005-05-30 2006-12-06 DeveloGen Aktiengesellschaft Use of an insulinoma cell for identifying pancreatic beta-cell mitogens
EP2542667A4 (en) * 2010-03-01 2013-07-31 Janssen Biotech Inc PROCESS FOR CLEANING CELLS OBTAINED FROM PLURIPOTENTIAL STEM CELLS
CN105778515A (zh) * 2014-12-26 2016-07-20 广东生益科技股份有限公司 一种无卤无磷硅树脂组合物以及使用它的预浸料、层压板、覆铜板以及印制电路板

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107663233A (zh) * 2017-11-16 2018-02-06 中国农业科学院生物技术研究所 植物转录因子stf1及其编码蛋白和应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR100454621B1 (ko) 2005-01-13
AU1835797A (en) 1997-08-11
RU2183465C2 (ru) 2002-06-20
JP2000503211A (ja) 2000-03-21
DE69734143D1 (de) 2005-10-13
EP0876492B1 (en) 2005-09-07
US5969210A (en) 1999-10-19
NZ330866A (en) 2001-04-27
WO1997026360A1 (en) 1997-07-24
ATE304055T1 (de) 2005-09-15
AU726356B2 (en) 2000-11-02
EP0876492A4 (en) 2001-04-11
ZA97476B (en) 1998-07-21
DE69734143T2 (de) 2006-07-13
CA2244176A1 (en) 1997-07-24
KR19990081853A (ko) 1999-11-15
AU726356C (en) 2002-11-07
IL125153A0 (en) 1999-01-26
CN1209843A (zh) 1999-03-03
EP0876492A1 (en) 1998-11-11
JP4472025B2 (ja) 2010-06-02
IL125153A (en) 2009-07-20
CA2244176C (en) 2008-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1048731C (zh) 编码细胞因子抑制性抗炎药物结合蛋白质的多核苷酸
CN1117876C (zh) 刺激促生长素抑制素和胰岛素产生的化合物的筛选方法
CN1416467A (zh) 锌指结构域及其鉴定方法
CN1191568A (zh) 包含蜕皮激素受体的基因开关
CN1128049A (zh) 多肿瘤抑制因子基因种系突变及检测该基因癌肿倾向性的方法
CN1230991A (zh) 仓鼠EF－1α转录调节DNA
CN1191574A (zh) 合成的哺乳动物染色体和其构建方法
CN1154738C (zh) 新的鉴定刺激stf-1在胰岛细胞内表达的化合物的方法
CN1224464A (zh) 一种新的生长因子和编码这种生长因子的基因序列
CN1270637A (zh) 新的衰老因子基因p23的分离
CN1323583C (zh) 开发动物模型的方法
CN1330663A (zh) 低氧－诱导因子1αHIF－1α变体和鉴定HIF－1α调节剂的方法
CN1751065A (zh) 棉蚜(Aphis gossypii)抗性基因
CN1932016A (zh) 影响sre活性的多核苷酸及其编码多肽和用途
CN101058832A (zh) 人体内生长激素变异的检测方法、该变异及其应用
CN1157635A (zh) α-乳清蛋白基因构建物
CN1778919A (zh) 一种人mdr1基因表达调节剂筛选***及其筛选基因表达调节剂的方法
CN1478097A (zh) 用于检测rgs蛋白质调节物的方法和细胞
CN1272139A (zh) 编码能与早老素相互作用的蛋白质的核酸
CN1444661A (zh) 人体内生长激素变异的检测方法、该变异及其应用
CN1370240A (zh) 利用ppar核受体的表达调节***
CN113388639B (zh) 一种基因敲入选育斑马鱼vmhcEGFP-KI品系的方法
CN1564944A (zh) 泛醌缺乏的表型效应及其筛选方法
CN1154507C (zh) Hox和含有同源域的蛋白质结合的抑制及其用途
CN1229386C (zh) 具有抑癌功能的新的人蛋白及其编码序列

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20040623

Termination date: 20120122