CN1214051A - 对所需决定基免疫应答的诱导 - Google Patents

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Abstract

本发明提供诱导患者免疫应答的组合物和方法。特别是,本发明提供用于诱导针对要求的免疫原、特别是多糖的体液应答的组合物。

Description

对所需决定基免疫应答的诱导
                  相关申请的参考
该申请为临时专利申请60/101,510号的部分继续，该临时专利申请与于1994年9月14日申请的共同未决专利申请美国序号08/305,871相关，后者为1993年9月14日申请的未决申请美国序号08/121,101的部分继续，所有这些专利通过引用结合到本文中。
                  发明背景
本领域一般已知产生的对特定疫苗抗原免疫应答的性质对该疫苗总的效力是重要的。在碳水化合物抗原的情况下，已经利用大量方法试图增强它们的免疫原性，包括化学修饰(Jennings等，Towards BetterCarbohydrate Vaccines Bell和Torrigiani(eds)第11-17页，J.Wiley&Sons,London,1987)、与辅助剂一起给药、与蛋白质非共价复合、共价连接到免疫原蛋白载体上(Schneerson等，Towards Better CarbohydrateVaccines见上述，第307-327页)以及用蛋白复制物，即或者从头合成的肽(所谓的mimitopes,Geyson等，Towards Better CarbohydrateVaccines见上述，第103-118页)或者抗个体基因型抗体(Soederstroem,Towards Better Carbohydrate Vaccines见上述，第119-138页)取代该碳水化合物的抗原决定基。
碳水化合物抗原共价连接到T-依赖性免疫原蛋白载体是已知的(参见例如Schneerson等，152:361-376(1980)；Lepow等，J.Pediatr.106:185-189(1985)；Chu等，Infect Immun.,50:245-256(1983)；Marborg et al.,Am.Chem.Soc.108:5282-5287(1985)；Anderson et al.,Infect.Immun.,39:233-238(1983)；Bartoloni等Vaccine 13:463-470(1995)；和Wessels等，J.Infect.Dis.171:879-884(1995))。
已经发现含有T辅助细胞识别的抗原决定基的免疫原肽可用来诱导免疫应答。例如Hervas-Stubbs等在Vaccine 12:867-871(1994)中描述了用辅助肽增强对特定决定基的抗体应答。
尽管嵌入MHC等位基因的肽结合隐穴的等位基因-特异性多态残基倾向于赋予每个等位基因结合一组独特肽的能力，但也有已经表明特定肽结合多于一个MHC等位基因的许多例子。这在人DR同族型的情况下很好地记载，其中已经注意到几个DR等位基因似乎识别相似的结构域单元，并且几个研究人员独立地报道了在多个DR类型中的一些抗原决定基的简并结合和/或识别，产生一些肽可能代表“通用”抗原决定基的概念(Busch等，Int.Immunol.2:443-451(1990)；Panina-Bordtgnon等，Eur.J.Immunol.19:2237-2242(1989)；Sinigaglia等，Nature 336:778-780(1988)；O’Sullivan等，J.Immunol.147:2663-2669(1991)；Roache等，J.Immunol.144:1849-1856(1991)；Hill等，J.Immunol.147:189-197(1991))。尽管先前报道的肽确实具有结合几个DR等位基因的能力，但它们决不是通用的。
在WO 95/07707和Alexander等，Immunity1:751-761(1994)中已经描述了Pan-DR结合(PADRE)肽。已经表明这些肽帮助产生对所需蛋白抗原的CTL应答。
然而，现有技术不能指出提供有效体液应答的化合物或组合物。例如，在碳水化合物免疫原的情况下，抗体应答通常主要是IgM的短期表达，然后是不一致的IgG应答。这一应答在产生对该免疫原产生长期保护作用方面一般不如IgG介导的应答有效。本发明提出这些和其它需要。
                    发明概述
本发明提供包含少于50个氨基酸残基的PADRE寡肽和抗原决定基的组合物，其中该寡肽和抗原决定基可任选地相互共价结合。该抗原决定基可以来自细菌、病毒、癌细胞、真菌或寄生虫。当该PADRE寡肽和该抗原决定基相互共价结合时，它们或者直接连接，或者通过最好包含半胱氨酸残基的连接基团连接。
在一组实施方案中，该PADRE肽选自aAXAAAKTAAAAa、aAXAAAATLKAAa、aAXVAAATLKAAa、aAXIAAATLKAAa、aKXVAAWTLKAAa和aKFVAAWTLKAAa，其中a为D-丙氨酸，A为L-丙氨酸，X为环己基丙氨酸，K为赖氨酸，T为苏氨酸，L为亮氨酸，V为缬氨酸，I为异亮氨酸，W为色氨酸，以及F为苯丙氨酸。更优选该PADRE肽为aKXVAAWTLKAAa。在其它组实施方案中，所述肽的末端可以或者为D型或者为L型。
此外，本发明提供引起对免疫原碳水化合物的免疫应答的组合物，该组合物包含少于约50个氨基酸残基的PADRE寡肽和至少一种碳水化合物抗原决定基。该PADRE肽从N端至C端最好具有式R1-R2-R3-R4-R5，其中R1由至少2个残基组成；R2选自环己基丙氨酸残基、色氨酸残基、苯丙氨酸残基及其保守置换；R3为3-5个氨基酸残基；R4选自苏氨酸-亮氨酸-赖氨酸、赖氨酸-苏氨酸和色氨酸-苏氨酸-亮氨酸-赖氨酸及其保守置换；而R5由至少2个残基组成。
                    附图简述
图1A-1F显示12个不同供体中的3个的代表性应答。通过第0天加入或者肽965.10(实心方框)、906.09(空心方框)、760.50(实心圆)或破伤风类毒素830-843(空心圆)，在第14天(第二次刺激，图1A、1B、1C)和第28天(第三次刺激，图1D、1E、1F)测定的来自人PBMC T细胞系产生的抗原特异性T细胞应答。显示两个独立实验的代表。
图2A、2B显示人PBMC的抗原特异性T细胞应答的总结。图2A显示第二次刺激的结果，而图2B显示第三次刺激的结果。获得的最大Δcpm在纵坐标上作图。
图3A、3B显示人PBMC的抗原特异性T细胞应答的总结。图3A显示第二次刺激的结果，而图3B显示第三次刺激的结果。获得的最大Δcpm在纵坐标上作图。
图4A-4F显示通过已接触抗原的鼠***T细胞的增殖能力测定的各种肽抗原决定基体内免疫原性。给C57BL/6J小鼠注射20μg/小鼠(空心三角)、1μg/小鼠(实心方框)、50ng/小鼠(空心方框)、2.5ng/小鼠(实心圆)或0.125ng/小鼠(空心圆)的TT 830-843(图4A)、Ova 323-336(图4B)、HBV 128-140(图4C)、965.10(图4D)、1024.03(图4E)和760.50(图4F)、10天后，取出引流***，按以下详细描述的方法进行T细胞增殖测定。显示2个独立实验中的代表。
图5A、B和C指出戊糖岩藻戊糖Ⅱ及其共轭物；(A)岩藻戊糖Ⅱ-PADRE，(B)岩藻戊糖Ⅱ-PA14和(C)岩藻戊糖Ⅱ-HSA的结构。
图6A和B表示(A)十二糖-PADRE共轭物和(B)鼠伤寒沙门氏菌LPS的结构。
                    发明详述A．定义
本文所用的寡肽或肽是指至少4个氨基酸或氨基酸模拟物的链，优选至少6个、更优选8-10个，有时为11-14个残基，通常少于大约50个残基，更通常少于大约25个，优选少于15个，例如8-14个残基。寡肽或肽可以是多种长度，或者为它们的中性(未改变的)形式，或者为盐形式，或者没有诸如糖基化、侧链氧化或磷酸化的修饰或者含有这些修饰，条件为该修饰没有破坏本文所述多肽的生物学活性。
当涉及肽、寡肽或蛋白质中的氨基酸时，本文所用的术语“氨基酸残基”、“氨基酸”和“残基”可互换使用，是指通过酰胺键或酰胺键模拟物共价连接到至少一个其它氨基酸或氨基酸模拟物上的氨基酸或氨基酸模拟物。
本文所用的术语“氨基酸”当未限定时，是指“L-氨基酸”或L-氨基酸模拟物。
尽管所述肽最好基本不含其它天然存在的蛋白质及其片段，但在某些实施方案中，所述肽可以合成结合到天然片段或颗粒上。
本文所用的术语“生物学活性”是指结合适当MHC分子的能力，在用来刺激免疫应答的肽的情况下，诱导T辅助细胞应答，它再帮助诱导对靶免疫原或免疫原模拟物的免疫应答。在用来刺激抗体应答的肽的情况下，该肽诱导T辅助细胞应答，后者再帮助诱导对该靶免疫原的体液应答。
本发明的“pan DR结合肽(PADRE)”为能够结合12个最普通的DR等位基因(DR1、2w2b、2w2a、3、4w4、4w14、5、7、52a、52b、52c和53)中的至少大约7个的肽。
在整个该说明书中，结果以IC50表示。在一定的进行测定的条件(即限制MHC和标记肽浓度)下，这些值接近KD值。应该注意到，如果所述测定条件变化，IC50值可以改变，通常是急剧改变，并且取决于所用的特定试剂(例如MHC制剂等)。例如，过高浓度的MHC会增加特定配基的表观测量IC50。
为了避免这些不定因素，表达该结合数据的另一种方法为参比肽的相对值。每一测定都包括该参比肽。当特定测定变得在不同程度上敏感时，测试的所述肽的IC50可以稍微改变。然而，相对于该参比肽的该结合将不改变。例如，在使得参比肽的IC50增加10倍的条件下进行的测定中，所有的IC50值也会变化大约10倍。因此，为了避免不定性，评价一种肽是否好的、中等、弱的或负性结合物应该基于相对于该标准肽的其IC50。
如果在特定测定中测定的该标准肽的IC50不同于表1中报道的IC50，那么应该理解，用来测定好的、中等、弱的和负性结合物的所述阈值应该用相应的因子进行修正。
本发明的PADRE肽除促进对第二决定基的免疫应答外，它们本身也可以用作靶免疫原。因此，例如在所述PADRE肽连接到碳水化合物抗原决定基上的情况下，可以对该PADRE肽和该碳水化合物抗原决定基都进行该免疫应答。
术语“免疫原”和“抗原”可互换使用，是指直接对之产生细胞免疫应答或体液免疫应答的任何化合物。
本文所用的术语“抗原决定基”为可以引起、促进或被诱导产生免疫应答的任何结构，例如碳水化合物抗原决定基、脂质、蛋白质、肽或它们的组合物。
本发明的“CTL抗原决定基”为得自选择的潜在靶抗原抗原决定基区的抗原，诸如肿瘤相关抗原，包括(但不限于)肾细胞癌、乳腺癌、癌胚抗原、黑素瘤(MAGE-1)抗原和***癌特异性抗原、丙型肝炎抗原、EB病毒抗原、HIV-1和HIV-2抗原以及***瘤病毒抗原。
                                表1
等位基因     检测标准     序列 平均IC50nm
    DR1DR2w2bDR3DR4w4DR4w14DR5DR7DR52aDRw53Dr2w2aDO3.1IAbIAdIEdIAsIAkIEk     HA 307-319MBP 78-101MT 65 kd 3-13HA 307-319717.01组合Tet Tox 830-843Tet Tox 830-843Tet Tox 1272-1284717.01组合Tet Tox 830-843ROIVROIVOva 323-326Iambda rep 12-26ROIVHEL 46-61Iambda rep 12-26     PKYVKONTLKLATGRTODENPVWHFFKNIVTPRTPPPYKTIAFDEEARRPKYVKONTLKLATYARFOSQTTLKQKTQYIKANSKFIGITEQYIKANSKFIGITENGOIGNDPNRDILYARFOSQTTLKOKTQYIKANSKFIGITEYAHAAHAAHAAHAAHAAYAHAAHAAHAAHAAHAAISOAVHAAHAEINEYLEDARRLKAIYEKKKYAHAAHAAHAAHAAHAAYNTDGSTDYGILQINSRYLEDARRLKAIYEKKK     59.1250455020254705B201528110170542028
本发明的“体液应答”为抗体介导的导向抗原决定基各个区的免疫应答。技术人员会认识到，体液应答也可以对PADRE肽诱导，其中该PADRE肽也可以用该决定基诱导。因此，可以对诱导决定基的该抗体和该PADRE肽引起免疫应答。
本文所用的“碳水化合物抗原决定基”是指作为需要对其免疫应答的作为复合糖(诸如糖蛋白、糖肽、糖脂等)、DNA、RNA或多糖、寡糖或单糖存在的碳水化合物结构。该碳水化合物抗原决定基可以诱导广泛的免疫应答。技术人员会认识到，本文例举的各种碳水化合物结构可以按照标准方法进行各种修改，而不会不利地影响抗原性。例如，该糖的单糖单元可以进行各种置换或甚至用用作该单糖模拟物的小的有机分子取代。
短语“分离的”或“生物学纯”是指基本上不含在其天然状态中发现的正常伴随它的组分的物质。因此，本发明的肽不会含有通常于它们原位环境相关的物质，例如具有抗原提呈细胞的I类MHC分子。即使一种蛋白质已经分离为均一的或在电泳凝胶中的主带，但仍有5-10％的微量天然蛋白污染物与所需蛋白共纯化。本发明分离的肽确实不含有这类内源共纯化蛋白。
本文所用的“连接物”为用来提供共价连接和隔开两个官能团的任何化合物(例如PADRE肽和所需免疫原)。该连接物通常包含中性分子，诸如脂族碳链、氨基酸或氨基酸模拟物，它们在生理条件下基本未改变，可以具有线性或分支侧链。在某些情况下，该连接物本身可以为免疫原性的，尽管是非治疗导向的。用于本发明的各种连接物在下面更详细地描述。另外，动词“连接”和“结合”在本文中可互换使用，是指两种或多种物质的共价连接。
术语“T细胞克隆”是指一组T细胞，它们为单个纯淋巴细胞的后代，并且表达相同的T细胞受体蛋白。术语“纯”淋巴细胞这里按Stites等(Basic and Clinical Immunology，第8版，Prentice Hall,Englewood Cliffs,New Jersey(1994))所用的使用，该文献通过引用结合到本文中。
本文所用的“T辅助肽”是指由T辅助细胞的T细胞受体识别的肽。本发明的PADRE肽为t辅助肽。B．PADRE肽和抗原决定基
本发明的组合物一般包含两种组分，PADRE肽结合一个或多个抗原决定基或与其混合。连接所述两种组分的实施方案具有以下一般结构：
                (X)n-(A)m-p-(B)o-(Y)p
其中，P为本发明的PADRE肽；X和Y可以相同或不同，为抗原决定基，例如碳水化合物抗原决定基、脂质、蛋白质、肽或它们的组合物；而A和B可以相同或不同，为接头。字母n-p可以或者为l或0，条件是n和p对抗原决定基不能同时为0。下面更详细地描述本发明组合物的每种组分。
本发明可用于引起对抗原决定基的免疫应答，通常为对碳水化合物免疫原的体液应答。
用来描述肽化合物的名称按常规实行，其中每个氨基酸残基的氨基在左边(所述N末端)，而其羧基在右边(所述C末端)。在所述氨基酸结构式中，每个残基通常用标准的三个字母或单字母命名表示。L型氨基酸残基用大写单字母或三个字母第一个字母为大写字母的符号表示，D-型氨基酸用小写单字母或小写的三个字母的符号表示。甘氨酸没有不对称碳原子，简单地称为“Gly”或G。
用来描述碳水化合物的名称包括以下缩写：Ara=***糖基；Fru=果糖基；Fuc=岩藻糖基；Gla=半乳糖基；GlaNAc=N-乙酰半乳糖基；Glc=葡萄糖基；GlcNAc=N-乙酰葡萄糖基；Man=甘露糖基；而NeuAc=唾液酸基(N-乙酰神经氨酰)。
碳水化合物被认为具有还原末端和非还原末端，无论所述糖是否在该还原末端事实上都是还原糖。按照可接受的命名法，本文用左边非还原末端和右边的还原末端描述碳水化合物。
本文的所有碳水化合物都用非还原糖的名称或缩写(例如Gal)及糖苷键构型(α或β)、环键、涉及该键的非还原糖的环的位置，以及还原糖的名称或缩写(例如GIcNAc)来描述。两个糖之间的键可以例如表示为如2,3、2-3或(2,3)。每个糖都为吡喃糖。
1．Pan Dr-结合肽
本发明提供用于鉴定扩大其特异性的对起始肽的修饰的方法。例如，国际申请WO 92/02543描述了适用于鉴定能够结合DR分子的肽的方法。WO 92/02543描述了用来自流感病毒的血凝素(“HA”)作为与HLA-DR特异性反应的肽源。筛选该蛋白部分的反应性以便提供结合适当DR分子(诸如DR1、DR4w4或DR4w14)的序列。
一旦鉴定出结合选定MHC分子的免疫原或其肽，则可以通过合成重叠肽和/或施用N末端或C末端缺失(截断)或***确定该抗原或肽的“核心结合区”。在确定核心结合区或关键接触残基中，可以利用一系列具有单氨基酸置换的肽确定静电荷、疏水性等对结合的影响。
在该核心区内，可以通过单氨基酸置换、缺失或***鉴别“关键接触部位”，即必须存在于肽中以便保持结合MHC分子和抑制提呈给所述T细胞的那些残基(或它们的功能等价物)。此外，人们也可以用特定氨基酸(例如Ala)进行***扫描，以探测由关键接触残基的所述侧链所作的贡献。
本发明的肽对用中性氨基酸的单氨基酸置换相对不敏感，基本接触部位除外，已经被发现耐受多置换。特别优选的多置换为小的、相对中性的部分，诸如Ala、Gly、Pro或相似的残基。所述置换可以是同源寡聚体或异源寡聚体。被置换或加入的残基数或类型取决于基本接触点和寻找的某些功能属性(例如疏水性对亲水性)之间必需的间隔。也可以通过这类置换，得到与该亲本肽的亲和性相比，对MHC分子的较强的结合亲和性。在任何事件中，这类“间隔”置换应该利用选择的氨基酸残基或其它分子片段以避免例如可能破坏结合的空间和电荷干扰。
也可以用D-氨基酸探测单氨基酸置换的作用。可以用例如Merridfield(Science 232:341-347(1986))、Barany和Merrifield(ThePeptides,Gross和Meienhofer,eds(N.Y.,Academic Press)，第1-284页(1979))以及Stewart和Young(Solid Phase Peptide Synthesis,(Rockford,Ⅲ.,Pierce)，第2版(1984))描述的熟知的肽合成方法制备这类置换。
用于主题发明的肽不必与以下实施例部分公开的肽相同，只要主题化合物能够与适当的MHC分子结合或提供抗靶免疫原的体液或细胞毒性T淋巴细胞活性即可。因此，技术人员会认识到可以进行多种保守置换，而基本不影响该肽的活性。保守置换为氨基酸残基用生物学和/或化学相似的另一氨基酸残基取代，如一疏水残基取代另一疏水残基，或一极性残基取代另一极性残基。所述置换包括Gly、Ala；Val、Ile、Leu、Met；Asp、GIu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg和Phe、Tyr的组合。
另外，所述肽或寡肽序列可以不同于用末端-NH2酰化(例如用链烷酰基(C1-C20)或硫代羟乙酰基酰化)、末端羧基酰胺化(例如氨、甲胺等)修改的天然序列。在某些情况下，这些修饰可以提供连接载体或其它分子的位点。
可以使用另一方法，其中将含有对于结合该MHC重要的侧链的锚残基***13个残基的多聚丙氨酸肽中。Jardetzky等(Nature353:326-329(1990))已经使用该方法。他们证明，用单个主要的MHC接触残基(Tyr)修饰的多聚丙氨酸肽赋予该肽对DR1的高亲和结合能力。也可以利用环己基丙氨酸或苯丙氨酸，而不用酪氨酸作为主要的MHC接触残基。就肽结合那些能够高亲和性结合HA肽的DR等位基因的能力而言，这些残基可以与Tyr互换，此外也允许结合到在该DRβ链中残基86上含有G-V置换的MHC分子上。所述改变影响Ⅱ类MHC中的所述B结合隐穴的结合特异性，使得酪氨酸不再能够有效地结合，而环己基丙氨酸以及苯丙氨酸可以结合。
以上鉴定的肽的生物学活性可以在多种***中测定。通常测试抑制抗原特异性T细胞活化的能力。在一个典型方案中，将过量的肽与已知MHC表达(例如DR1)的抗原提呈细胞及已知抗原特异性(例如破伤风毒素)的T细胞克隆和MHC限制(再为DR1)、以及免疫原肽本身(例如破伤风毒素830-843)孵育。将该检测培养物孵育足够的时间，以进行T细胞增殖，诸如进行4天，然后用标准方法，诸如在持续18小时的孵育期间用[3H]-胸苷进行脉冲测定增殖。然后与不接受肽的对照相比，计算抑制百分比。
在体外检测中，肽抑制抗原提呈的能力与该肽抑制体内免疫应答的能力相关。可以在动物模式中，例如给与已知限于由该肽识别的特定MHC分子的免疫原和免疫调节肽，测定体内活性。随后从该动物中取出淋巴细胞，与剂量范围的免疫原一起培养。用常规方法，例如用[3H]-胸苷产生脉冲并且与适当的对照相比较，测定对刺激的抑制。当然，某些实验细节对技术人员是显而易见的。也参见Adorini等，Nature 334:623-625(1988)，该论文通过引用结合到本文中。
具有限定的MHC分子、特别是Ⅱ类MHC分子的大量细胞是已知的，并且容易得自例如美国典型培养物保藏中心(“细胞系和杂交瘤商品目录”第6版(1988)Rockville,Maryland，美国)。
本发明肽的优选实施方案包括对所述N末端和C末端残基的修饰。正如技术人员会理解的，可以修饰所述N末端和C末端，以改变该肽的物理或化学性质，诸如影响结合、稳定性、生物利用性、易于连接等。
用各种氨基酸模拟物或d-氨基酸例如在N末端或C末端修饰肽可用来例如增加该肽的体内稳定性。这类肽可以作为“反位(inverso)”或“后反位(retroinverso)”形式合成，即用D-氨基酸取代序列的L-氨基酸，或倒置所述氨基酸序列和用D-氨基酸取代所述L-氨基酸。因为所述D-肽实际上更抗肽酶，因此与他们的L-肽相似物相比，在血清中和组织中更稳定，D-肽在生理条件下的稳定性更多补偿与相应L-肽在亲和性方面的差异。此外，含L-氨基酸、具有或不具有置换的肽可以用D-氨基酸封端，以抑制外肽酶破坏所述免疫原肽。
可以以多种方式检测稳定性。例如，肽酶和多种生物学介质，诸如人血浆和血清，已经用来测试稳定性。参见例如Verhoef等，Eur.J.Drug Metab.PharmacoKin.11:291-302(1986)；walter等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.148:98-103(1975)；Witter等，Neuroendocrinology30:377-381(1980)；Verhoef等，J.Endocrinology 110:557-562(1986)；Handa等，Eur.J.Pharmacol.70:531-540(1981)；Bizzozero等，Eur.J.Biochem.122:251-258(1982)；Chang,Eur.J.Biochem.151:217-224(1985)，所有这些都通过引用结合到本文中。
通过在该肽的C末端和N末端导入D-氨基酸残基，也可以增加稳定性。先前的研究已经指出，当在含血清培养基中培养时，可以通过在C末端和C末端导入d-氨基酸，赋予所述肽对外肽酶的抗性，相当大地延长含L-氨基酸肽的体内和体外半衰期。
可以通过改变某些残基的顺序或组成，修饰本发明肽或类似物，容易认识到对生物学活性必要的某些氨基酸残基，例如在关键接触位点的那些残基，一般不能改变，那么对生物学活性没有不利影响。所述非关键氨基酸不必限于蛋白质中天然存在的那些氨基酸，诸如Lα-氨基酸或他们的D-异构体，但也可以包括非蛋白质氨基酸(诸如β-γ-δ-氨基酸)以及L-α-氨基酸的许多衍生物。正如所讨论的，本发明的肽一般可以包含L-氨基酸或D-氨基酸，但在核心结合区内不包含D-氨基酸。
本发明的肽可以以多种方式制备。因为它们相对短小，因此可以根据常规技术，在溶液中或在固相支持体上合成所述肽。各种自动合成仪是市售的，并可以按照已知方案使用。参见例如Stewart和Young,Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，Pierce Chemical Co.(1984)，见上述。
另一方面，可以使用重组DNA技术，其中将编码目的免疫原肽的核苷酸序列***表达载体，转化或转染到合适的宿主细胞中，并在适于表达的条件下培养。这些方法一般是本领域已知的，如在Sambrook等：分子克隆，实验手册，冷泉港出版社，冷泉港，纽约(1989)。因此，可以使用包含一种或多种本发明肽序列的融合蛋白，以提呈合适的T细胞抗原决定基。
关于可以通过化学技术，例如Matteucci等(J.Am.Chem.Soc.103:3185(1981))的磷酸三酯方法合成本文设想长度的肽的编码序列，可以简单地通过用合适的碱基置换所述天然肽序列的那些碱基而进行修饰。然后可以将编码合适接头的核酸序列加入肽编码序列，并连接入本领域通常可利用的表达载体中，所述载体用来转化适当的宿主，以生产所需的融合蛋白。现在可利用多种这类载体和合适的宿主***。为了表达所述融合蛋白，提供操作性连接起始密码子和终止密码子、启动子和终止子区以及通常的复制***的该编码序列，以提供用于在所需细胞宿主中表达的表达载体。例如，在含有便于***所需编码序列的限制位点的质粒中提供与细菌宿主相容的启动子序列。将产生的表达载体转化入合适的细菌宿主中。当然，也可以使用酵母或哺乳动物细胞宿主，利用合适的载体和控制序列。
2．抗原决定基
抗原决定基可以与本发明的PADRE肽一起给与，或者连接该PADRE肽或者与其混合，以引起或增强免疫应答。来自多种免疫原生物分子的CTL和碳水化合物抗原决定基可以用于本发明的共轭物中。所用的特定免疫原(例如多糖、蛋白质、糖蛋白、脂质、糖脂、脂多糖等)对于本发明不是关键。关于适用于本发明的免疫原目录，例如参见BioCarb化学品目录；和The Jordan Report:Accelerated Development ofVaccine 1995 NIH,Bethesda,Maryland,1995)。
合适的免疫原实例包括得自细菌表面多糖、可以用于碳水化合物基疫苗的那些免疫原。细菌通常在其细胞表明面上表达碳水化合物作为糖蛋白、糖脂、脂多糖的O-特异性侧链、荚膜多糖等的部分。典型的细菌菌株包括肺炎链球茵、脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌、克雷白杆菌菌株、假单胞茵菌株、沙门氏茵菌株、志贺氏菌菌株和B群链球菌。
在现有技术中(例如Sanders等，Pediatr.Res.37:812-819(1995)；Bartoloni等，Vaccine 13:463-470(1995)；Pirofski等，Infect.Immun.63:2906-2911(1995)和国际公开WO 93/21948)中描述了多种合适的细菌碳水化合物抗原决定基，以下提供所述碳水化合物抗原决定基。1：与人肿瘤相关的碳水化合物：1.1大多数肿瘤：Gaβ4G1cβCer                                 乳糖基神经酰胺1.2黑素瘤：NeuAcα8NeuAcα3Galβ4GlcβCer                GD39-0-Ac-GD3NeuAcα8NeuAcα3(GalNAcβ4)Galβ4GlcβCer     GD29-0-Ac-GD2这些碳水化合物的内酯化形式1.3结肠癌和其它类型的癌：GalNAα-Ser(Thr)(糖蛋白)                            Tn-抗原NeuAcα6GalNAcα-Ser(Thr)                           唾液酸基-Tn-抗原Galβ3GlcNAc                                        1型链NeuAcα3Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ                      唾液酸基-Lewis aNeuAcα3Galβ3(Fucα4)[NeuAcα6]GlcNAcβ            二唾液酸基-LewisaGalβ3(Fucα4)GlcNAcβGalgβ3(Fuicα4)GlcNAβ       二聚Lewis aNeuAcα-3Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ                     唾液酸基-Lewis xGalβ4(Fucα-3)GlcNAcβ3Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ    二聚体Lewis xGalβ4(Fucα3)GlcNAcβ3Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ3Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ                              三聚体Lewis xNeuAcα3-二聚体Lewis xNeuAcα3-三聚体Lewis xNeuAcα6-寡聚体Lewis x在唾液酸的情况下这些的内酯化形式1.4肺癌和其它类型癌：Galβ4GlcNAcβ3Galcβ4GlcNAcβ                      i-抗原(rep.lactosamine)Galβ3(Fucα4)GlcNAcβGalβ4(Fucαl3)GlcNAco        Lewis a-Lewis xFucαt2Galβ3GalNAcβ4(NeuAcα3)Galβ4GlcβCer      Fuc-GM1Fuc-GM1的内酯化形式1.5 Bukitt氏淋巴瘤：Galα4Galβ4GlcβCer                                Gb31.6乳腺癌：Fucα2Galβ3GalNAcβ3Galα4Galβ4GlcβCer           Fuc-GloboβentaTn-抗原唾液酸基-Tn-抗原1.7畸胎癌：NeuAcα3Galβ3GalNAcβ3Galα4Galβ4GlcβCer        唾液酸基-Globopenta以上的内酯化形式2：与实验肿瘤有关的碳水化合物：2.1黑素瘤(仓鼠)NeuAcα3Galβ4GlcβCer                         GM3GD39-0-Ac-GD3GD2这些碳水化合物的内酯化形式2.2黑素瘤小鼠GM3内酯化GM33：与传染原有关的碳水化合物：来自白假丝酵母的甘露聚糖由牛结核分支杆菌菌株BCG分离的多糖来自硕大利什曼原虫的磷脂聚糖来自鼠伤寒沙门氏茵的抗原多糖4：与HIV有关的碳水化合物：Fucα2Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ                Lewis yGalNAcα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ             血液组ANeuAcα6GalNAcα-Ser(Thr)                   唾液酸基Tn抗原GalNAcrα-Ser(Thr)                          Tn抗原典型的病毒抗原包括得自HIV的抗原(例如gpl20)。典型的真菌抗原包括得自白假丝酵母、新型隐球菌、球孢子菌菌株(Coccidoidesspp.)、组织胞浆茵属菌株和曲霉属菌株的抗原。寄生虫抗原包括得自疟原虫属原虫、锥虫属原虫、血吸虫属原虫、利什曼虫属原虫等的抗原。
典型的碳水化合物抗原决定基包括(但不限于):Galαl、4Galβ-(用于细菌疫苗)；GalNAcα-(用于癌疫苗)；Mallβ1,2(Manlβ1,2)nManβ-(用于可用来抗例如白假丝酵母的真菌疫苗)，这里n=0→∞；GalNAcβ1,4(NeuAcα2,3)Galβ1,4GlGlcβ-O-神经酰胺(用于癌疫苗)；Glacα1,2(Tyvα1,3)Manα1,2Rhaα1,3Galα1,2(Tyα1,3)Manα1,4Rha- 和Galα1,2(Abecα1,3)Manα1,4Rhaα1,3Galα1,2(Abeα1,3)Manα1,4Rha1,3Glaαl,2(Abecα1,3)Manαl,4Rha-(两者对可用来抗例如沙门氏菌菌株)。
用于本发明的碳水化合物可以按照本领域技术人员已知的标准方法制备。通常由合适的单糖，通过形成糖苷键制备所述寡糖，或由天然来源分离并进行合适的修饰。例如，可以在含有1-卤代置换的一个糖和第二个具有至少一个未保护羟基的适当保护的糖之间形成β-糖苷键。这种转化通常在碳酸银(Ag2CO4)或三氟甲磺酸银的存在下进行。
另一方面并且最好是，可以通过酶催化法，采用WO 96/32492描述的方法形成糖苷键。简单地说，诸如唾液酸基转移酶的糖基转移酶可以用来构建具体的糖苷键。
多种唾液酸基转移酶是本领域技术人员已知的。该酶将唾液酸(NeuAc)转移至Gal，在所述两个糖之间形成α-键。所述糖之间的连接(键)在NeuAc的2位和Gal的3位之间。
通常称为唾液酸基转移酶的典型的α(2,3)唾液酸基转移酶(EC2.4.99.6)将唾液酸转移至Galβ1-3Glc双糖或糖苷的非还原末端Gal上。参见Van den Eijnden等，J.Biol.Chem.,256:3159(1981),Weinstein等，J.Biol.Chem.,257:13845(1982)和Wen等，J.Biol.Chem.,267:21011(1992)。另一典型的α-2,3-唾液酸基转移酶(EC 2.4.99.4h)将唾液酸转移至所述双糖或糖苷的非还原末端Gal。参见Rearick等。J.Biol.Chem.,254:4444(1979)和Gillespie等，J.Biol.Chem.,267:21004(1992)。其它典型的酶包括Gal-β-1,4-GlcNAcα2,6唾液酸基转移酶(参见Kurosawa等，Eur.J.Biochem.219:375-381(1994))。
本领域技术人员会理解，可以将其它糖基转移酶置换到相似的转移酶循环中，正如关于唾液酸基转移酶已经详细描述的内容。例如，该糖基转移酶也可以是例如葡糖基转移酶例如Alg8(Stagliov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5977(1994))或Alg5(Heesen等，Eur.J.Biochem.224:71(1994))。合适的N-乙酰半乳糖胺转移酶包括α(1,3)N-乙酰半乳糖胺转移酶、β(1,4)N-乙酰半乳糖胺转移酶(Nagata等，J.Biol.Chem.,267:12082-12089(1992)和Smith等，J.Biol.Chem.,269:15162(1994))和多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶(Homa等，J.Biol.Chem.,268:12609(1993))。合适的N-乙酰葡糖胺转移酶包括GnTI(2.4.1.101,Hull等，BBRC 176:608(1991))、GnTⅡ和GnTⅢ(Ihara等。J.Biochem.113:692(1993))和GnTV(Shoreiban等，J.Biol.Chem.268:15381(1993)、O-连接N-乙酰葡糖胺转移酶(Bierhuizen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:9326(1992))和hyaluronan合酶。合适的甘露糖基转移酶包括α(1,2)甘露糖基转移酶、α(1,3)甘露糖基转移酶、β(1,4)甘露糖基转移酶、Dol-P-Man合酶、OChl和Pmtl。
Ichikawa等[J.Am.Chem.Soc.114:9283(1992)]、Wong等[J.Org.Chem 57:4343(1992)]、DeLuca等[J.Am Chem.Soc.117:5869-5870(1995)]和Ichikawa等[Carbohydrates and Carbohydrate PolymersYaltami,ed.(ATL Press 1993)]描述了其它合适的糖基转移酶循环。
关于以上糖基转移酶循环，用于所述方法中的各种反应物的浓度或量取决于多种因素，包括诸如温度和pH的反应温度以及待糖基化受体糖的选择和量。因为，该糖基化方法允许在催化量的酶存在下再生活化核苷、活化的供体糖以及清除产生的焦磷酸盐，该方法受上述化学计量底物的浓度或量限制。可以按照本发明方法使用的反应物浓度的上限由这类反应物的溶解度决定。
合成包含合适抗原决定基的CTL肽，然后在例如使用纯化的Ⅰ类分子和碘化肽和/或表达空白Ⅰ类分子的细胞的测试中，通过例如免疫荧光染色和流动微量荧光测定法、肽依赖性Ⅰ类装配检测和通过肽竞争抑制CTL识别，来测试它们结合Ⅰ类MHC分子的能力。进一步评价结合I类分子的那些肽作为得自感染或免疫的个体的CTL的靶的能力，以及它们在体外或体内诱导初级CTL应答的能力，所述CTL应答可以产生能够与病毒感染的靶细胞或肿瘤细胞反应的作为潜在治疗剂的CTL群体。
一种或多种CTL和/或诱导抗体的肽可以与一种或多种pan DR肽混合给与，这可能涉及或不涉及所述肽之间的非共价连接。例如，可以将一种或多种所述肽脂质化。另一方面，所述肽可以共价连接，形成PADRE抗原决定基。
为了促进抗原决定基与该PADRE肽连接，可以将额外的氨基酸加入所述肽的末端。由于本文讨论的原因，或为了修饰该肽或寡肽等的物理或化学性质，肽也可以用额外的残基来偶联到载体、支持体或较大的肽上。可以在该肽或寡肽的c末端或N末端导入诸如酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸之类的氨基酸。另外，该肽或寡肽序列可以不同于通过末端-NH2酰化(例如通过链烷酰基(C1-C20)或巯乙酰基酰化)、末端羧基酰胺化(例如氨、甲胺等)修饰的天然序列。在某些情况下，这些修饰可以提供连接支持体或其它分子的位点。
关于所述PADRE肽而言，应该理解，可以修饰所述抗原决定基以提供其它所需的特性，例如改善的药理学特性，同时增加或至少基本保留该未修饰肽的所有生物学活性。例如可以通过在所述肽氨基酸序列中通过在得自本文公开序列的肽的氨基末端或者羧基末端或者两者加入或缺失氨基酸，进行延伸、减小或置换，来修饰所述肽。通常，待基本模拟CTL或刺激抗原决定基的抗体的序列的部分与所述靶抗原蛋白序列的差异不会高于约20％，为了修饰该肽物理性质或化学性质以易于连接或偶联等，在两个末端之一加入额外的氨基酸除外。在病毒亚型中发现所述肽序列区为多形肽的情况下，可能最好改变一个或多个特定氨基酸，以更有效地模拟不同于不定病毒株或亚型的毒害植物的T淋巴细胞抗原决定基。
在本发明鉴定的含有CTL或抗体抗原决定基(例如HBV特异性肽)的该肽序列区中，有残基(或基本为功能等价物的那些残基)允许该肽保留其生物学活性，即刺激1类受限毒害植物的T淋巴细胞对病毒感染细胞或表达病毒抗原的细胞的应答的能力。可以通过单氨基酸置换、缺失或***鉴定这些残基。另外，所述残基的侧链的贡献可以通过用特定氨基酸(例如Ala)***扫描而探测。耐受多置换的肽一般加入诸如小的、相对中性的分子的置换，例如Ala、Gly、Pro或相似的残基。可以置换、加入或减少的残基数和类型取决于必需抗原决定基点和寻找的某些构型和功能特性之间必需的间隔。如需要，也可以通过这类改变得到肽类似物对其提呈给CTL的MHC分子的较高的结合亲和性。一般来说，抗原决定基和/或构型上重要的残基之间的任何间隔置换、加入或缺失应该利用选择避免可能破坏结合的立体和电荷干扰的氨基酸或其它部分。也可以作为含有D-氨基酸的肽合成耐受置换，同时保留所需的生物学活性的肽，正如以上关于PADRE肽所描述的。
本发明的肽可以通过键结合，形成聚合物(多体)，或可以没有键配制为作为混合物的组合物。当肽连接到同一肽上，由此形成均聚物时，出现多个重复抗原决定基单位。例如，可以使用多抗原肽(MAP)技术构建含有CTL和/或抗体肽以及PADRE肽的聚合物。当所述肽不同时，例如表示不同病毒亚型的混合剂，提供亚型中的不同抗原决定基、不同HLA限制特异性或含有T辅助抗原决定基的肽、具有重复单位的杂聚物。除共价键外，也设想能够形成分子间的非共价键和结构内键。B．共轭物的制备
将该PADRE肽连接到该抗原决定基的多种方法是可能的。通过所述末端或通过赖氨酸的ε-氨基的离子相互作用是可能的。所述残基的侧链基团和该抗原决定基之间的氢键也是可能的。该PADRE肽和该抗原决定基之间的构象相互作用最终可能产生稳定的连接。
如上所述，抗原决定基可能共价连接到所述PADRE肽上，以制备本发明的共轭物。通过间隔分子或接头连接特别优选的抗原决定基/PADRE肽共轭物。另一方面，该抗原决定基可以不用接头连接所述PADRE肽。
该间隔或接头通常由中性分子组成，这些分子诸如脂族碳链、氨基酸或氨基酸模拟物，它们在生理条件下基本不带电荷，可以具有线性或支链侧链。许多组合物和连接各种生物分子方法是本领域技术人员已知的。将PADRE肽共价连接到例如碳水化合物抗原决定基上的具体方法不是本发明的关键。例如在WO 93/21948中公开了适用于将PADRE肽连接到碳水化合物抗原上的方法。
多种接头是已知的，或者是市售的或者在科学文献中进行了描述。用于本发明的连接分子最好具有足够的长度，以允许该分子的两个部分独立并自由地与暴露于它们的分子相互作用。在碳水化合物抗原决定基的情况下，所述连接分子通常为1-50个原子长。所述连接分子通常为芳基乙炔、含有2-14个单体单元的乙二醇低聚物、二胺、二元酸、氨基酸或它们的组合物。其它合适的接头包括脂质分子，诸如神经酰胺和氨基酸残基，不同的碳水化合物部分通过该氨基酸侧链连接在其上。
所用的特定连接分子可以基于其化学/物理性质选择。该连接分子在每个末端都具有合适的官能团，一个基团适于连接该碳水化合物部分的反应位点，另一个基团适于连接该氨基酸/肽部分。例如，适于连接到该碳水化合物部分的基团为羧酸、酯、异氰酸酯、烷基卤、酰卤和异硫氰酸酯。相似的基团可以用来连接该氨基酸部分。官能团的适当选择取决于该氨基酸或肽的反应部分的性质。
在一组实施方案中，烷基或亚烷基将用作连接基团，具有1-20个碳原子，特别优选含有3-6个碳原子的烷基或亚烷基。例如，可以使用包含聚乙二醇和相关结构的接头。术语“聚乙二醇”用来指具有乙二醇重复单元的那些分子，例如六聚乙二醇(HO-(CH2CH2O)5-CH2CH2OH)。当术语“聚乙二醇”用来指连接基团时，本领域技术人员应该理解，也可以使用其它聚醚或多元醇(即聚丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物)。
在另一组实施方案中，将所述烷基或亚烷基连接基团全氟化，使得它们不易生物降解。参见美国专利5,055,562。特别优选的连接基团包括氨基己酸、4-羟基丁酸、4-巯基丁酸、3-氨基-1-丙醇、乙醇胺、全氟乙醇胺和全氟羟基丁酸。在一组实施方案中，两个部分通过聚乙二醇部分连接。
在PADRE肽和其它肽之间的接头情况下(例如PADRE肽和CTL诱导肽)，所述间隔通常选自Ala、Gly或非极性氨基酸或中极性氨基酸的其它中性间隔。在本文的某些优选实施方案中，该中性间隔为Ala。应该理解，可任选的本间隔不必由相同残基组成，因此可以是杂或同低聚物。优选的典型间隔为Ala的低聚物。当个间隔存在时，它通常至少为1或2个残基，更通常为3-6个残基。在其它实施方案中，PADRE肽与该CTL或抗体诱导肽结合，最好与位于所述氨基末端的PADRE肽结合。所述肽可以通过中性接头(诸如Ala-Ala-Ala等)连接，最好还含有脂质残基，诸如连接Lys残基的α和ε氨基的棕榈酸等((PAM)2Lys)，它通常通过Ser-Ser键等连接到该肽共轭物的氨基末端。
该CTL或抗体诱导肽可以直接或者在CTL肽的氨基末端或羧基末端通过间隔连接到该PADRE肽上。该CTL或抗体诱导肽或该PADRE肽的氨基末端可以酰化。另外，该CTL肽/PADRE共轭物可以通过一个或多个连接残基(诸如以下介绍的G1y、Gly-Gly、Ser、Ser-Ser)连接到某些链烷酰基(C1-C20)脂质上。其它有用的脂质部分包括胆固醇、脂肪酸等。
在某些实施方案中，可能最好在本发明的药用组合物中包括至少一种有助于引发CTL的组分。脂质已经被鉴定为能够有助于引发体内抗病毒抗原的CTL的药剂。例如，诸如胆固醇的类固醇、诸如棕榈酸残基的脂肪酸可以连接到半胱氨酸残基的巯基、Lys残基的α氨基和ε氨基上，然后例如通过一个或多个连接残基(诸如Gly、Gly-Gly-、Ser、Ser-Ser等)连接到免疫原肽(诸如PADRE肽)上。另一方面，长链烷基可以通过醚键代替脂肪酸连接到最后的氨基酸(例如半胱氨酸残基)上。
可以将脂化肽或者直接以加入脂质体中的微胶粒形式或在辅助剂(例如弗氏不完全辅助剂)中乳化的形式注射给药。在优选实施方案中，特别有效的免疫原包括连接到Lys的α氨基和ε氨基上的棕榈酸，它通过例如Ser-Ser键连接到该免疫原肽的氨基末端。
关于另一典型引发CTL应答的脂质，大肠杆菌脂蛋白诸如三棕榈酰-S-甘油半胱氨酰(cysteinlyseryl)-丝氨酸(P3CSS)当共价结合到合适的肽上时，可以用来引发病毒特异性的CTL。参见Deres等，Nature342:561-564(1989)。可以将本发明的肽结合到P3CSS上，例如给予个体的脂肽，以便特异性引发对所述靶抗原的CTL应答。此外，由于中和抗体的诱导也可以用与显示合适抗原决定基的肽结合的P3CSS引发，因此可以将所述两种组合物混合，以更有效地引起对感染的体液和细胞介导的应答。
在PADRE肽与碳水化合物抗原决定基结合的情况下，所述脂质部分可以连接到该碳水化合物的相反末端(例如碳水化合物与所述C-末端连接，而脂质与所述N-末端连接)。另一方面，该脂质和该碳水化合物部分可以都连接到该肽的同一末端。例如，所述两部分可以连接到同一接头的N-末端。C．药用组合物
本发明的化合物、其药用组合物和疫苗组合物可以给与哺乳动物，特别是人类，以用于预防和/或治疗目的。本发明可以用来引起和/或增强对免疫原的免疫应答。例如CTL/PADRE混合物可以用来治疗和/或预防病毒感染和癌症。另一方面，可以使用导致抗体应答的免疫原(例如碳水化合物)。可以用本发明治疗的疾病实例包括各种细菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生虫感染和癌症。
在治疗应用中，将本发明组合物给与已患癌或感染所研究的微生物的个体。在该疾病潜伏期或急性期的那些患者可以用本发明组合物单独治疗，或合适时结合其它治疗进行治疗。
在治疗应用中，给与患者一定量的本发明的组合物，该量足以引起对该微生物或肿瘤抗原的有效CTL应答或体液应答并治愈，或至少部分阻止症状和/或并发症。适于完成此目的的量定义为“治疗有效剂量”。用于此用途的有效量将部分取决于该肽组成、给药方式、治疗疾病的时期和严重性、患者的体重和一般健康状况以及处方医师的判断。
对于治疗或预防性给药的初次免疫而言，本发明组合物的治疗有效量对于70kg患者为大约1.0μg至大约10,000μg的肽，通常为大约100-8000μg，最好为大约200-6000μg。这些剂量后的加强剂量为大约1.0-1000μg肽，根据加强方案在几周至几个月之内给药，取决于通过测定特异性免疫应答的患者的反应和病情。
必须记住，本发明的组合物一般可以用于严重的疾病状态，即威胁生命或潜在威胁生命的状态。在这类情况下，由于外源物质的最小化和所述共轭物相对无毒性的性质，主治医师可能和可以感到需要给与实际过量的这些组合物。
此外，本发明的组合物也可以预防性防止和/或减轻细菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生虫感染和癌症。有效量如上所述。另外，本疫苗领域普通技术人员也知道如何通过利用加强和调节剂量和给药方案合适地调整或改善预防性治疗。
治疗性给药可以开始于疾病的最初征兆或检测或手术除去肿瘤，或在急性感染诊断后不久开始。然后加强剂量，直至症状基本减轻并再进行一段时间。在慢性感染中，初次高剂量后可能需要加强剂量。
用本发明组合物治疗受感染个体在急性感染个体中可以加快消退该感染。对于易(或倾向于)发展成慢性感染的那些个体而言，所述组合物在预防从急性演化为慢性感染的方法中特别有用。在感染之前或期间鉴别易感染个体，例如本文所述，所述组合物可以针对这些感染，减小给与较大群体的需要。
本发明组合物也可以用来治疗慢性感染，并刺激该免疫***，以消除具有潜伏感染个体体内的感染病毒的细胞。重要的是提供制剂中有效引起和/或增强免疫应答的本发明组合物的量和给药方法。因此，为了治疗慢性感染，对于70kg患者而言，每一剂量的代表性剂量为大约1.0-5000μg，最好为大约5-1000μg。可能需要免疫剂量后较长时间的规定的间隔期(例如1-4周)的加强剂量，以有效地免疫个体。在慢性感染中，应该继续给药直至至少临床症状或实验室检测表明个病毒感染已经消除或基本消退，并继续给药一段时间。
用于治疗性或预防性治疗的药用组合物将用于胃肠外、表面、经口或局部给药。所述药用组合物通常为胃肠外给药，例如静脉注射、皮下注射、皮内注射和肌内注射。因为本发明疫苗组合物易于给药，因此特别适用于口服。因此，本发明提供用于胃肠外给药的组合物，它包括溶于或悬浮于可接受载体(最好是水性载体)中所述肽或共轭物的溶液。可以使用多种含水载体，例如水、缓冲水溶液、0.9％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可以通过常规、熟知的灭菌技术消毒，或可以无菌过滤。可以包装以溶液使用产生的水溶液，或将其冻干，冻干制剂在给药前与无菌溶液混合。所述组合物可以含有药学上可接受的、接近生理条件所需的辅助剂物质，诸如缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨聚糖单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
在药用制剂中，本发明组合物的浓度的变化范围可以很宽，即低于约O.1％(通常为大约2％或至少2％)至多至20％-50％(重量)或以上，主要通过液体体积、粘性等，根据选定的特定给药模式进行选择。
本发明也可以通过脂质体给药，脂质体用来将所述共轭物导向特定组织(诸如淋巴组织)或选择性地导向感染细胞，以及增加所述肽组合物的半衰期。脂质体包括乳液、泡沫、微胶粒、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、多层等。在这些制剂中，待传递的组合物作为脂质体部分单独或与例如淋巴细胞中的普通受体结合的分子一起加入。这些分子包括结合到CD45抗原上的单克隆抗体或包括其它治疗或免疫原组合物。因此，加有本发明所需组合物的脂质体可以导向淋巴细胞部位，然后在此所述脂质体传递选择的治疗/免疫原肽组合物。用于本发明的脂质体由标准囊泡形成脂质而形成，它一般包含中性和带负电磷脂和固醇，诸如胆固醇。脂质的选择一般考虑所述脂质体在血流中的脂质体大小、酸不稳定性和稳定性。可利用多种方法制备脂质体，如在例如Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980)，美国专利4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369中所述的方法，这些文献通过引用结合到本文中。
为了导向免疫细胞，待加入所述脂质体的配基可包括对要求的免疫***细胞的细胞表面决定基特异性的抗体或其片段。含有本发明组合物的脂质体悬浮液可以通过静脉、局部、表面等给药，其剂量尤其可以根据给药方式、待传递的组合物和待治疗疾病的时期而改变。
另一方面，编码一种或多种PADRE肽和含有一种或多种CTL抗原决定基或抗体诱导肽的DNA或RNA可以导入患者中，以获得对所述核酸编码多肽的免疫应答。Wolff等(Science 247:1465-1468(1990))描述了核酸编码多肽的表达。
关于固体组合物，可以使用常规的非毒性固体载体。这些载体可以包括例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服而言，通过加入任何常用的赋形剂(诸如先前列出的那些载体)，形成药学上可接受的无毒组合物，其中活性组分(即一种或多种本发明共轭物)一般为10-95％，更优选的浓度为25-75％。
关于气雾剂给药，本发明的组合物最好以粉碎形式与表面活性剂和抛射剂一起提供。该组合物通常的百分比为0.01-20％(重量)，最好为1-10％。当然，该表面活性剂必须是无毒的，最好可溶于该抛射剂。这类药剂的代表为含有6-22个碳原子的脂肪酸，诸如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、olesteric acid和油酸与脂族多元醇或其环酐所成的酯或部分酯。可以使用混合酯，诸如混合或天然甘油酯。该表面活性剂可以构成该组合物的0.1-20％(重量)，优选0.25-5％。该组合物的其余部分一般为抛射剂。如果需要，也可以包括载体，正如用于鼻内传递使用卵磷脂一样。
在另一方面，本发明涉及含有作为活性组分的本文公开的免疫原有效量的本发明组合物的疫苗。可以将连接到其本身载体或作为活性肽单元的均聚物或杂聚物的所述组合物导入宿主，包括人类。这样一种聚合物的优点是提高免疫反应，在不同肽用来构成该聚合物时，提高诱导与不同抗原决定基反应的抗体和/或CTL的另外的能力。载体是本领域已知的，包括甲状腺球蛋白、诸如牛血清白蛋白的白蛋白、破伤风类毒素、诸如多聚(赖氨酸:谷氨酸)的多聚氨基酸、乙型肝炎病毒核心蛋白、乙型肝炎病毒重组疫苗等。所述疫苗也可以含有生理上可耐受(可接受)的稀释剂，诸如水、磷酸盐缓冲盐水或盐水，此外通常包括辅助剂。诸如弗氏不完全辅助剂、磷酸铝、氢氧化铝或明矾的辅助剂是本领域熟知的物质。并且如上所述，可以通过将本发明的组合物与脂质(诸如P3CSS)结合，引发免疫应答。用本文所述组合物通过注射、气雾剂、口服、经皮或其它途径免疫时，该宿主的免疫***通过产生增强的体液或细胞免疫应答进行应答。
将本发明的疫苗组合物给与易患疾病或者有患疾病风险的患者，以引起和/或增强对抗原决定基的免疫应答。这一用量定义为用于治疗用途或者预防用途的“免疫原有效剂量”。这样，精确的量也取决于患者的健康状况和体重、给药模式、该制剂的性质等，但一般为每70公斤体重大约为1.0-5000μg，更通常为大约10-500μg。
在某些情况下，最好将本发明组合物与诱导所研究的感染和癌症中和抗体应答的疫苗混合。
本发明组合物也用来制备单克隆抗体。这类抗体可以用作潜在的诊断剂或治疗剂。
发现本发明组合物也可以用作诊断剂。例如，本发明的一种组合物可以用来测定特定个体对使用所述抗原决定基的治疗方案的敏感性，因此可以有助于修改现有的治疗方案或确定感染个体的诊断。此外，本发明组合物也可以用来预测那些个体有发展为慢性感染的实际风险。
通过说明，而不是通过限制，提供以下实施例:D．实施例实施例1：实验步骤
a．细胞系和MHC纯化
各种细胞系用作纯化人和鼠Ⅱ类分子源。以下EB病毒(EBV)转化的纯合细胞系用作人HLAⅡ类分子(Valli等，J.Clin.Invest.91:616-628,1993):LG2[BD1*0101(DRl)]、3107[DRB1*1501(DR2w2b)]、MAT[DRB1*0301(DR3)DBR3*0101(DR52a)]、PREISS[DRB1*0401(DR4w4)]、BIN40[DRB1*0404(DR4w14)]、SWEIG[DRB1*11011(DR5)]、PITOUT[DRB1*0701(DR7)]、PF[DQA1*0301/DQB1*0310(DQ3.1)源。
在某些情况下，使用转染的成纤维细胞：L416.3[DRB5*0101(DR2w2a)]、TR81.19[DRB3*0101(DR52a)]和L257.6[DRB4*0101(Drw53)]。
对于鼠Ⅱ类分子而言，使用以下细胞系：A20(IAd,IEd)(Sette等，Science 258:1801-1804,(1992))、CH12(LAk,IEk(Sette等，1992)、LS102.9(IAs)(Wall等，Int.Imm.4:773-777,(1992))和DB27.4(IAb)(Wall等，J.Immuno.152:4526-4536(1994))。
b.MHC分子的纯化
基本上按所述(Gorga等，J.Biol.Chem.262:16087-16094(1987))纯化MHC分子。简单地说，用LB3.1(所有DR,Valli等，J.Clin.Invest91:616-628(1993))或IVD 12(DQ3.1,Sidney等，J.Immunol.152:4516-4525(1994))单克隆抗体，通过亲和层析纯化人Ⅱ类分子。通过使用MKD6(IAd,Sette等，Science 258:1801-1804,(1992))、10.3.6(IAk,Sette等，见上述)、14.44(IEd和IEk,Sette等，见上述)和Y3JP(IAs,Wall等，Int.Immunol.4:773-777,(1992))单克隆抗体纯化鼠Ⅱ类分子。
c．肽合成
通过在Applied Biosystems(Foster City,CA)430肽合成仪上，用标准Fmoc偶联循环(软件版本1.40)连续偶联N-α-Fmoc-保护的氨基酸合成肽。所有的氨基酸、试剂和树脂均得自Applied Biosystems或NovaBiochem(San Diego,CA)。溶剂得自Burdick&Jackson。固相合成从适当置换的Fmoc-氨基酸-Wang树脂起始。该起始树脂的荷载为0.5-0.7mmol/g聚苯乙烯，在每个合成中使用0.1-0.25meq。典型的反应循环如下进行：所述N末端Fmoc基团用含25％哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)除去5分钟，然后用DMF中的25％再处理15分钟。该树脂用DMF洗涤5次。将含过量4-10倍的预形成的适当的Fmoc-氨基酸的1-羟基苯并***酯的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液加入该树脂中，让该混合物反应30-90分钟。用DMF在制备中洗涤该树脂，以用于下一个延长的循环。使完全保护的连接树脂的肽经过几个哌啶循环，以除去该末端Fmoc基团。该产物用CH2Cl2洗涤并干燥。然后在适当的清除剂(例如在水中5％(v/v))存在下用三氟乙酸处理该树脂20℃60分钟。蒸发过量的三氟乙酸后，用***洗涤该粗肽，将其溶于水并冻干。通过反相HPLC，在Vydac,300A孔径大小，C-18制备型柱上使用含0.8％TFA修饰剂的H2O/CH3CN梯度，将所述肽纯化为＞95％的均一性。在分析型反相柱上分析所述合成肽的纯度，通过氨基酸分析和/或测序确定其组成。用于合成步骤中的环己基丙氨酸购自Nova Biochem(San Diego,CA)。在切割该肽之前，通过将棕榈酸偶联到连接该树脂的肽上产生棕榈基化肽。通过对称酸酐法，即2倍过量的棕榈酸和1倍的二异丙基碳二亚胺在CH2Cl2中1小时，完成偶联。
d-MHC肽结合分析
在蛋白酶抑制剂混合物存在下，将纯化的鼠或人Ⅱ类分子(5-500nM)与5nM125Ⅰ-肽在含5％DMSO的PBS中一起孵育48小时。用氯胺-T法(Buus等，Science 235:1353-1358(1987))碘化纯化的肽。蛋白酶抑制剂的终浓度为：1nM PMSF、1.3mM 1.10菲咯酮(phenanthrolone)、73μM抑胃肽A、8mM EDTA、6mM N-乙基马来酰亚胺和200μM Nα-对甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮。在孵育混合物中去污剂的终浓度为2.6％毛地黄皂苷(IAd和IAk)或0.05％NP-40(所有其它Ⅱ类分子)。通过在Sephadex G-50或TSK2000柱上进行凝胶过滤，从游离肽中分离Ⅱ类肽复合物，结合到MHC Ⅱ类分子上的肽组分按前述(Sette等，J.Immunol.142:35-40(1989))进行计算。在初步实验中，每种DR制剂在固定量的碘化肽存在下进行效价测定，以确定结合10-20％总放射活性所必需的Ⅱ类分子的浓度。然后用该Ⅱ类浓度进行所有随后的抑制和直接结合分析。在该抑制分析中，抑制肽的测试浓度通常为120-1.2μg/ml。然后将该数据作图，测量产生50％抑制的剂量。在两个至四个完全独立的实验中测试每种肽。
本文所用的＜50nM下的结合构成高亲和性结合，在50-500nM下的结合构成中等亲和性结合。
e.DR限制肽呈递的抑制
通过在含10％人血清(Gemini Bioproducts,Inc.,Calabasas,CA)的完全培养基RPMI 1640(Bio Whittaker,Wallkerswlle,MD)中，将丝裂霉素C处理的合适DR的EBV细胞与抑制肽一起孵育，来分析阻断MHC抗原呈递功能的肽的能力。在起始浓度为150μg/ml的40倍稀释范围内，在含有5×104细胞的96孔U底板(Costar,Cambridge,MA)中常规进行抑制肽的效价测定。分析除接受抑制肽外，也接受次最佳浓度的HA 307-319肽(DRl、DR4w4、DR5、DR52b)或HA 307-319、Y309＞F(DR4w14)或Lo1 P1 171-190(DR3)(Sidney等，J.Immunol.149:2634-2640(1992))，这些物质在缺乏抑制肽的情况下导致30-50最大增殖性应答。该浓度通常为50-200μg/ml。APC与肽于37℃在5％CO2培养箱中孵育2小时后，将2×104T细胞加入每个孔中。所用的T细胞克隆为C11(DR1和DR52b(Krieger等，J.Immunol.146:2331-2340(1991))、克隆42.19(DRw14)、克隆JK1(DR5)和细胞系(lime)132-132(DR3)。3天后测定所述T细胞的增殖。简单地说，加入T细胞后24小时，将[3H]-胸苷(1μCi/孔)(ICN,Irvine,CA)加入每个孔中孵育18小时。然后在玻璃纤维滤器(LKB Wallac细胞收获器1295-001,LKB,Galthersburg,MD)上收获细胞，测定胸苷的掺入(LKB β平板计数器1205)。计算抑制50％该增殖应答所需的每个剂量抑制肽的抗原呈递抑制百分比。实施例2：“通用”肽抗原决定基的DR结合特异性
已经鉴定出几种鼠和人Ⅱ类MHC等位基因的结合特征序列，已经描述了通过对天然具有的肽测序进行的各种Ⅱ类类型的序列分析(Rudensky等，Nature 353:622-627(1991)；Chicz等,Nature 358:764-768(1992)；Hunt等，Science 256:1817-1820(1992)和Rudensky等，Nature359:429-431(1992))。
特别是在DR分子的情况下，已经表明(Brown等，Nature 364:33-39(1993))连接所述MHC结合沟槽的相应疏水隐穴的大疏水锚是肽-DR相互作用的最关键决定基。几种其它锚起一定作用(尽管作用较不显著)并帮助决定等位基因的特异性。最近，也已经强调该肽分子的C末端一半的链主肽参与与所述MHC结合沟槽壁的直接氢键结合。
尽管排列MHC肽结合隐穴的等位基因特异性多形态残基倾向于赋予每个等位基因结合独特一组肽的能力，但有几个例子已经表明，测定肽结合不同特异性的MHC分子。已经最好地记载了人DR同族型的情况，其中先前已经注意到，几种DR等位基因似乎识别相似的特征序列，几个研究人员独立地报道了在多DR类型中，某些肽抗原决定基的简并结合和/或识别，导致某些肽可能代表“通用”抗原决定基的概念(Busch等，Int Immunol.2:443-451(1990；Panina-Bordignon等，Eur.J.Immunol.19:2237-2242(1989)；Sinigaglia等，Nature.336:778-780(1988)；O’SulIivan等，J.Immunol.147:2663-2669(1991)；Roache等，J.Immunol.144:1849-1856(1991)；和Hill等，J.Immunol.147:189-197(1991))。
用在实施例I、D段描述的分析方法，建立了先前描述的能结合一个以上DR分子的肽(HA 307-319、Tr 830-843、CS 378-398、MT17-31和HBVnc 50-69)的DR结合能力。获得的数据(表Ⅱ,A节)证明，尽管这些肽实际能够结合几种测试的DR分子，但它们不能够结合其它分子。例如，HA 307-319以高亲和力(＜50nM)或中等(50-500nM)亲和力地结合DR1、DR4w4、DR5、DR7和DR2w2a，对DRw53的亲和力弱(2.2μM)；而对于其余四种DR特异性检测不到结合。HBVnc 50-69也以高亲和力或中等亲和力地结合测试的10种DR特异性中的5种(DR1、DR2w2b、DR4w4、DR5和DR2w2a)。Tr 830-843和CS 378-398以高亲和力或中等亲和力地结合测试的10种DR分子中的4种(分别为DR1、DR5、DR7、DR2w2a和DR1、DR4w4、DR5、DR7)，而MT 17-31以高亲和力或中等亲和力地结合10种DR类型中的3种。
总之，尽管这些先前描述为结合几种DR类型的“通用”抗原决定基，但它们在其结合能力中不是完全交叉反应的，因为最大为测试的DR特异性的50％以高亲和力或中等亲和力地结合测定肽。
    表Ⅱ各种肽抗原决定基与不同DR等位基因的结合能力
    肽     序列     DRβ1等位基因     DRβ2等位基因
  DRI       DR2w2b    DR3  DR4w4  DR4w14   DR5 DR7     DR52a    DRw53     DR2w2a
AHA 307-319TT 830-843CS 378-398MT(Y)17-31HBVnc50-69 PKYVKONTLKLATQYIKANSKFIGITEDIEKKIAKMEKASSVFNVVNSYSGPLKAEIAORLEDVPHHTALBOAILCWGELMILA 5(1)   -   (2)     -      45    -     118   38552        -      3ε23   -     -     20    2517       1820    -       250   2272  154   14713       -       -       -     -     -     20870       9.1     -       85    505   263   676 --      2200     45--     --        20--     --       14306266    6538     3502765   ND  (4)   211
B760.50760.57 aA(X)AAAKTAAAAa(3)aA(X)AAAATLKAAa 3.1      569    6410     2.8   6.9   6.1   1924.5      479    2550     2     3.1   5.4   78 9400    560      57--      3300     5
C906.09906.11 aA(X)VAAATLKAAaaA(X)IAAATLKAAa 0.61     14     280     2.6   5.4    2.5   760.38     19     100     2.8   3.3    2.4   31 588      93     2.01120     41     1.3
 D965.101024.03 aK(X)VAAWTLKAAaaKFVAAWTLKAAa 0.91     40      86     1.1   9.1     9.1  1671.2      27      1470   2     8       18   208 979      75      6797      420     11
(1)nM IC50值(2)冲撞表明＞10,000nM(3)X=环己基丙氨酸(4)ND=未进行
实施例3：研制对多DR等位基因具有高亲和力的肽：760.50和760.57
产生一些能够以高亲和力地结合类风湿关节炎相关DR等位基因DR1、DR4w4和DR4w14的肽。为了产生这些肽，使用最初由Jardetzky等(EMBO J.9:1797-1803(1990))描述的策略，其中将含有对结合MHC关键性侧链的锚残基***13个残基的多聚丙氨酸肽中。特别感兴趣的是命名为760.50和760.57的两种肽及其广泛的DR结合特异性(这两种肽在其共同未决的专利申请08/121,101中被描述)。当测试与一组10个纯化DR分子的结合时，发现总体而言，这些肽的结合亲和力高于上述天然的“通用”抗原决定基，其特异性比上述天然“通用”抗原决定基广(表Ⅱ,B项)。760.50和760.57都不是完全交叉反应的，因为在分析的10个等位基因的4个(DR2w2b、DR3、DR52a和DRw53)中仅检测到低亲和力结合。实施例4：研制对多DR等位基因具有高亲和力的肽：906-09和906.11
为了进一步拓宽特异性，合成了906.09和906.11肽，其中在760.57肽的4位上引入Ⅴ或Ⅰ。如表Ⅱ的C节所示，906.09和906.11肽保留对DR1、DR2w2a、DR4、DR5和DR7良好的结合亲和力(范围为0.3-80nM)。此外，对分子DR2w2b、DR3、DR52a和DRw53的结合能力(与760.50和760.57相比)显著增加(10-25倍),IC50范围为20-1200nM。因此，测试的10个DR特异性中的9个与这些肽的以高或中等的亲和力结合，而其中1个DR52a以弱的亲和力结合。
总之，这些数据说明，研制了与大多数(如果不是全部)DR等位基因的以高亲和力结合的肽。由于不同DR分子中的这种广谱交叉反应性方式，我们已经测定906.09和906.11肽为PADRE肽。实施例5:Pan DR结合肽也结合DQ3.1和鼠Ⅱ类分子
进行分析以便确定所述PADRE肽是否也能够结合其它人Ⅱ类同族型或非人Ⅱ类分子。更具体地讲，测定所述PADRE肽与DQ3.1和几种鼠Ⅱ类分子特异性的结合能力，如表Ⅲ所示。为了参比，表Ⅲ的A项中也显示先前描述的鼠Ⅱ类抗原决定基的结合亲和力。所有这些先前描述的抗原决定基以高亲和力或中等亲和力(20-400nM)地结合它们相关限制元件。我们发现，一般而言，760系列的肽(表Ⅲ,B项)与6个受试等位基因中的5个(IAb、IAd、IEd、IAs、IEk)的结合亲和力中等，为80-700nM。有兴趣的是，906系列肽(表Ⅲ,C项)在上述等位基因的情况下结合亲和力显著地高，为10-100nM，而906.11与IAk的亲和力也为中等。对于与DQ3.1的结合，发现760.50、760.57、906.09和906.11与纯化DQ3.1分子的结合亲和力全都较高(为30-120nM)
作为对照，也检查760和906肽与人Ⅰ类分子的结合潜力。对纯化HLA-Al、HLA-A2.1、HLA-A3、HLA-A11和HLA-A24分子直至10μM没有检测到结合(数据未显示)。总之，这些数据提示906系列肽为PanⅡ类(而不是Ⅰ类) MHC结合肽。
                表Ⅲ.各种肽结合纯化DQ3.1和鼠Ⅱ类MHC的能力
肽 限制元件 序列     Ⅱ类等位基因
DO3.1 1Ab 1Ad IEd IAd IAk IEk
AHBVc128-140Ova 323-336Arep 12-26PLP 139-151HEL 46-61 IAbIAd,bIEd,kIAaIAk TPPAYRPPNAPILISOAVHAAHAEINEYLEDARRLKAIYEKKKHSLGKWLGHPDKFNTDGSTDYGILOINSR NDa577b----3750 255400--＞31007000 --1101100--1222 ----170--8500 --1038--86-- --1000----20 --70028----
B760.50760.57 aA(X)AAAKTAAAAaaA(X)AAAATLKAAa 3194 200377 688192 155172 491120 10.0005260 12778
C906.09906.11 aA(X)VAAATLKAAaaA(X)IAAATLKAAa 48115 3128 3825 3113 10498 1333154 1114
D965.101024.03 aK(X)VAAWTLKAAaaKFVAAWTLKAAa 2523 9444 7333056 3541133 6131059 3333-- 3263500
a ND，未检测b nMIC50值c -，检测不到结合(＞10,000nM)实施例6：用Pan DR结合物抑制T细胞增殖
因为PADRE肽具有简并Ⅱ类结合能力，因此它们为抑制参与同种移植排斥、过敏反应或自身免疫的T细胞介导事件的治疗物的候选物。因此，评价这些肽阻断抗原特异性体外T细胞增殖应答。实施例1的E段所述的抗原呈递抑制分析用来进行这些评价。
在保持这些肽的MHC结合能力中，发现它们为受至少6个不同DR分子限制的人T细胞的增殖应答的有效抑制剂(表Ⅳ)。更具体地讲，对DR1、DR4w4、DR4w14和DR5具有高结合亲和力的肽760.50和760.57抑制受那些等位基因限制的T细胞的增殖，IC50为1.0-25μM。相反，这些肽与DR3分子的结合仅很弱，为25-6.5μM，因此，对DR3限制T细胞增殖的抑制差(760.57的IC50为220μM)或根本没有(760.50的IC50＞250μM)。
906.09和906.11肽也相当有效地抑制DR1、DR4w4、DR4w14和DR5的应答(IC50为0.5-15μM)。正如预期的，具有中等DR3结合能力的906类似物也能够抑制DR3限制的抗原呈递，IC50为30-60μM。
在同一组实验中，我们也测试了760和906肽抑制DR52b限制的应答的能力。该实验是重要的，因为没有一个分子结合分析用于测量肽与DR52b分子的结合。获得的数据证明，906.09和906.1l肽都抑制DR52b分子中的HA307-319克隆1的呈递，具有好的IC50，为1-2μM，由此这些肽的PADRE能力延伸到第11个等位基因。
最后，这些肽不能抑制HA特异性DR限制的T细胞克隆对多克隆促细胞***素PHA应答的增殖，在最近描述的T细胞拮抗剂分析(DeMagistris等，Cell 68:525-634(1992))中也不能抑制，其中随后(不是同时)将肽加入所述抗原刺激物中(数据未显示)。这些发现排除了上述结果可能由760肽或906肽的某些非特异性细胞毒性引起的可能性。
                表Ⅳ Pan DR结合肽抑制T细胞的增殖
    肽     序列     抗原呈递的抑制(50％μM抑制浓度)
    DR1     DR3     DR4w4  DR4w14   DR5  DR52b
 760.50760.57906.09906.11  aA(X)AAAKTAAAAaaA(X)AAAKTLKAAaaA(X)VAAATLKAAaaA(X)IAAATLKAAa     4.32.10.881     ＞2502203156     3.20.940.580.74     2.80.790.430.59     25181113     ＞1807.51.61.7
实施例7：通过修饰广谱反应性Ⅱ类结合肽产生Pan DR T细胞抗原
      决定基
PADRE肽用来产生Pan DR限制的T辅助细胞抗原决定基，后者能够提供对体液应答和细胞毒应答的帮助。因为所述PADRE肽中所有的潜在TCR接触残基都为丙氨酸，假设由于所述甲基侧链能够参与有限的相互作用，因此体积更大的疏水性带电残基的导入可能提高与T细胞受体相互作用的可能性，并由此提高它们的免疫原性。
根据这种推理，进一步修饰所述906.09 Pan DR肽。通过在2、5和7位引入大体积或带电侧链基团产生几种类似物，根据HA 307-319肽先前的分析，它们为潜在的TCR接触残基。相反，已知影响DR结合的那些位置保持不变(3、4、8、9和11位)。另外，也产生3位携带中性氨基酸Phe而非环己基丙氨酸的类似物。然后测试这些肽的保持它们结合多DR等位基因的能力，然后测试没有显著降低其DR结合能力的那些肽诱导免疫应答的能力。下面讨论得自其中最好的两个肽965.10和1024.03的数据。
当测试这两个肽的HLA DR和鼠Ia结合(表Ⅱ的D项和表Ⅲ的D项)时，发现总体而言，它们保留与亲本肽906.09相关的对大多数DR等位基因的高结合能力和广谱反应性。对此的例外为1024.03与DR3仅有弱结合(1470nM)，与DRw53的结合亲和力也为中等(420nM)，而非高亲和力。此外，965.10和1024.03肽显示出大大降低的对大多数受试鼠Ⅱ类分子的结合能力。然而，保留对1Ab等位基因的好的结合能力，由此允许H-2b小鼠用来测试这些肽的体内这些肽的免疫原性(参见以下)。最后，也保留两个肽的好的DQ3.1的结合能力(范围为25nM)。实施例8:PADRE肽的体外免疫原性
比较PanDR抗原决定基965.10与其两个祖先肽906.09和760.50以及先前描述的天然抗原决定基TT 830-843的体外刺激来自正常个体的外周血单核细胞(PBMC)中的T细胞应答的能力。所用的方案要求用自身APC抗原和肽抗原重复刺激外周血淋巴细胞(PBL)，特别设计以允许研究体外初次反应。下面提供该方案，然后提供所述分析的结果。
a．分析方案
用由Manea等(J.Imunol.146:1964-1971(1991))改编的方案，刺激来自健康献血者的PBMC。在Ficoll-Paque(Pharmacia LKB,Uppsala,Sweden)上纯化PBMC，以4×106PBMC/孔接种于24孔组织培养板(Costar,Cambridge,MA)中的4个孔中。加入终浓度为10μg/ml的所述肽。然后于37℃、5％CO2下孵育培养物。第4天时，加入终浓度为10μg/ml的重组IL-2。此后每3天通过吸出1ml培养基，用含有IL-2的新鲜培养基取代，常规饲养培养物。
用在24孔组织培养板中的总共3个孔中的自体PBMC细胞(2×106辐射的细胞(7500拉德)/孔)作为抗原呈递细胞，用肽(10μg/ml)刺激T细胞(3×105/孔)。约第14天和第28天时，用抗原再刺激两次所述T细胞。另外，第14天和第28天时，如下测定T细胞增殖应答：2×104T细胞/孔、作为PAC的1×105辐射PBMC/孔，该肽浓度效价测定为在U形底96孔组织培养板(Costar,Cambridge,MA)中的终浓度为0.01-10μg/ml。第3天时按上述得到所述T细胞增殖分析结果。
b．结果
来自3个自愿献血者的代表性数据示于表1中。两轮刺激后获得的数据示于A-C组中，第3轮刺激后的数据示于D-F组中。如所预期的，在这些实验中亲本肽760.50和906.09的免疫原性差。两个肽在两轮刺激后都不诱导显著(＞10,000cpm)的应答。第3轮刺激后，760.50在3个受试献血者中的一个诱导应答。天然“通用”抗原决定基TT830-843在两轮刺激后也不能产生显著的应答，在第3轮刺激后，T-F830-843在所有3个献血者中也产生适度阳性的应答。与这些弱应答相反，仅在两轮刺激后，所有3个献血者都对修饰的Pan DR肽965.10快速应答。
图2A和2B总结了在第一系列实验中(分别为第2次刺激和第3次刺激)已经获得的所有体外刺激数据。在体外两轮刺激后(图2A)，肽965.10是唯一能够在大多数献血者(9/12)中显著刺激T细胞的肽。TT830-843在较少的个体(3/12)中产生应答，而760.50和906.09都不能刺激任何应答(0/3)。通过第3次刺激(图2B),965.10在受试的12个献血者中的11个中产生显著应答，而TT 830-843能够在大多数(7/12)献血者中确立显著的应答；760.50在3个中的1个献血者中诱导应答，而906.09不能刺激受试的3个献血者中的任何一个。
在我们的下一系列实验中，检测965.10类似物诱导PBMC生长的能力。体外2次刺激后(图3A)，肽965.10为唯一能够在所有5个受试个体中诱导PBMC培养物生长至背景(10,000cpm)以上。然而，所述类似物对于少数个体而言是成功的(965.08(1/5),965.09(4/5),965.14(1/5),965.15(2/15),965.16(0/5)和965.17(2/5))。通过第3次刺激(图3B),965.10保持在所有5个个体中诱导PBMC培养物生长的能力。所述类似物也有有限的成功(965.08(2/5),965.09(4/5),965 14(3/5),965.15(4/5),965.16(1/5)和965.17(4/5))。然而，两个类似物965.09和965.17能够在4/5个体中诱导PBMC培养物的生长。应该注意是同前一实施例一样，965.10在诱导PBMC培养物生长方面优于TT 830-843(553.01)。
早至第2次刺激时，965.10体外诱导特异性T细胞群生长的能力加上它实际上通过第3次刺激在所有献血者中产生显著的T细胞应答的能力，证明该肽相对于肽TF 830-843、760.50或906.09、965.08、965.09、965.14、965.15、965.16、965.17或553.02的优越的免疫原性能力。实施例9:Pan DR抗原决定基在小鼠中的体内免疫原性
在C57BL/6J(H-2b+)小鼠中测试所述760.50、965.10和1024.03肽的体内免疫原性。
为了进行这些分析，在C57BL/6J小鼠的尾部基部，皮下注射100μl体积的PBS/CFA(Difco,Detroit,MI)中的各种肽剂量效价(0.000125、0.0025、0.05、1和20μg/小鼠)。第10天时，收集、合并三个小鼠/肽剂量为一组的腹股沟和主动脉旁(paraaortic)的***，并将其均浆为单细胞悬液。将细胞洗涤2次，随后接种于(1×106细胞/孔)96孔微量滴定组织培养板中。加入对数剂量肽效价(0.01-100μg/ml)的所述免疫肽，按上述进行标准的3天T细胞增殖分析。
在这些实验中，比较非天然抗原决定基对两个其它先前定义的天然IAb限制抗原决定基Ova 323-336和HBV核心128-140的活性。这两个天然抗原决定基的结合亲和力略低于(3-14倍)965.10(表Ⅲ的A项)。包含不能适当结合IAb的TT 830-843肽(未给出数据)作为阴性对照。
如图4所示，发现TT 830-843不能产生特异性T细胞增殖应答，与其不能结合IAb一致。所述已知的IAb限制的辅助抗原决定基Ova323-336(图4的B组)和HBVc 125-140(图4的C组)在用于免疫的两个最高肽剂量(1和20μg/小鼠)下，在25,000-70,000cpm范围内诱导应答。所述DR抗原决定基965.10(图4的D组)和1024.03(图4的E组)刺激最强的应答，获得的有效免疫剂量小至0.05μg/小鼠，数值范围为100,000-150,000cpm。相反，肽760.50(图4的F组)仅有临界的免疫原性，诱导的增殖应答非常弱，并且仅在最高剂量(20μg/小鼠)下测试到。这些结果表明，所述Pan DR抗原决定基965.10和1024.03在体内以及体外作为高度有效的辅助抗原决定基发挥作用。它们与人类免疫原性数据一起，提示除高的MHX结合能力外，潜在TCR接触位置上“免疫显性”氨基酸残基的存在还是产生激烈的T细胞应答的重要元件。实施例10:Pan DR肽作为小鼠中体内CTL诱导的辅助抗原决定基
一般假定，诱导T细胞增殖应答的能力为肽抗原决定基辅助能力的指标。我们试图通过测定965.10肽在产生CTL应答中传递辅助的能力而将其验证。按照以下提供的方案进行所述CTL诱导实验。
a．CTL诱导方案
3-6个C57BL/J小鼠为一组的小鼠在其尾部基部皮下注射溶于磷酸盐缓冲液、5％DMSO中的脂化CTL抗原决定基(二棕榈酰化Ova257-264)和一辅助抗原决定基的混合物进行免疫。11天后，杀死小鼠，通过加入Ova 257-264(1μg/ml)体外刺激脾细胞(3×107/10ml/T25烧瓶)并孵育6天。用51Cr标记的EL4靶细胞测定细胞毒性，所述细胞与所述CTL抗原决定基肽于37℃孵育1小时。加入51Cr标记靶细胞(10×104)，以改变U形底96孔板中的效应细胞数，6小时后测定51Cr的释放。数据以裂解单位/106效应细胞表示。一个裂解单位定义为达到裂解30％1×104 51Cr标记靶细胞所需的淋巴细胞数。
b．结果
获得的结果示于表Ⅴ。发现Pan DR抗原决定基965.10以剂量依赖性方式诱导CTL应答，当与脂化Ova 257-264 CTL抗原决定基共注射5nmole/小鼠965.10肽时，观察到的最适307裂解单位。相反，Ova323-336和HBVC 128-140抗原决定基的辅助活性在所述辅助效应大小(分别增加4倍和3倍)和诱导最适辅助活性所需的剂量大小(10nM/小鼠)方面相当显著地低。
表Ⅴ．CTL诱导中IAb限制的抗原决定基的辅助活性
T辅助抗原决定基 辅助肽的最适剂量(nmoles/小鼠) CTL应答(裂解单位/106细胞)
    -Ova 323-336HBV核心128-140965.10     -1001005     12+/-250+/-535+/-1o307+/-55
实施例11：用PADRE肽诱导抗体
a．材料和方法
ⅰ．线性构建物
所用的构建物主要基于来自重组间日疟原虫CS重复区的9个氨基酸残基重复的二聚体，该重复区含有大约60％的CS蛋白序列。该肽(序列为GDRADGQPAGDRADGQPA，称为B2肽)在H-2k和H-2a单体型小鼠中表现出免疫原性(Nardin等，Eur J.Immunol.(1988))，但在d或b单体型中没有免疫原性。
除B2肽外，在我们的实验中我们也使用两个构建物，其中B2通过其N末端共价连接到PADRE 965.10肽(序列为aK(X)VAAWLKAa；x=环己基丙氨酸)或对照IAb限制的辅助抗原决定基OVA 323-336(序列为ISQAVHAAHAEINIE)上。
ⅱ．多价构建物
先前已经表明，含有对应于单价免疫显性B细胞抗原决定基的合成疫苗或者本身或者当偶联到单价辅助抗原决定基时，仅诱导低的抗体应答，没有适当的保护效应。基于这些结果，最近的疫苗设计集中在同时加入多种B细胞抗原决定基和T辅助(Th)抗原决定基(Tam等，J.Exp.Med.171:229-306(1990))。多抗原肽(MAP)技术(Tam,J.P.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5409-5413(1988))的开发提供一种方法以设计含有T辅助抗原决定基和多种B细胞位点的这类构建物。使用三种MAP构建物。
ⅲ．免疫
在C57B16(H-2b)小鼠的尾部基部注射100μl CFA中的100μg肽，四周后取血。随后用100μl IFA中的等量肽增强它们，再过2周后取血。使用ELISA分析，使用包被0.1μg/孔B3肽(序列为GDRADGQPAGDRADGQPA GDRADGQPA)的板测定抗体效价(初次反应和二次反应)。B10A小鼠(H-2k)用作抗B2肽反应的阳性对照。B,MAP4:
Figure A9719322100521
OVA B2MAP4:
Figure A9719322100522
PADRE B2 MAP4:
Figure A9719322100523
ⅳ．ELISA
用(GDRAIDGQPA)3作为包被肽进行标准ELISA。
b．结果
获得的结果(表Ⅵ)表明，B10A小鼠对肽B2肽的应答非常好。或者用B2或者用B2 MAP 4构建物观察到相似水平的初次反应。增强将多价B2 MAP 4的反应提高大约10倍，但不提高单价B2抗原的反应。
在H-2b小鼠的情况下，或者在单注射后或者在增强后，没有观察到对B2或者B2 MAP 4的反应。包含OVA或PADRE辅助抗原决定基的MAP构建物相当有效，在单次注射后产生的效价为1-3×105,在增强后效价为3-8×105。
如果提供T细胞辅助物，甚至单价构建物也略微有效。OVA B2构建物达到的效价为3×104(或者在1次注射后，或者在2次注射后)。最有趣的是，甚至在对单价PADRE B2构建物的反应中，获得的效价为6×104和3.7×105。
                                  表Ⅵ
            小鼠初次反应处理           B10A(H-2k)       BL6(H-2b)B2             101675*/1.771   776/1.8OVA B2         ND2             31963/4.7PADRE-B2       ND               62764/1.54B2 MAP4        75755*/1.77     90/1.3OVA-B2-MAP4    ND               257306/3.4PADRE-B2-MAP4  ND               130113/2.14二次反应B2             93364*/1.4      107/1.34OVA-B2         ND               37443*/1.8PADRE-B2       ND               370334/3.25B2-MAP4        1012119/2.3      155/1.17OVA-B2-MAP4    ND               333850/1.78PADRE-B2-MAP4  ND               749979/1.79
c．总结
总之，这些实验证明，PADRE肽可以用来提高强大的抗体应答。因为它们的反应性非常广，预计使用PADRE肽提供非常高部分的人群覆盖率，应该高于用“通用”T细胞抗原决定基之一的覆盖率。在某些情况下，使用PADRE也可能允许使用简化的构建物，而对生产和表征的容易性和成本有非常好的影响。结果以来自每组3-6只小鼠的效价的几何平均值*/标准偏差表示。ND表示未检验。实施例12：与碳水化合物结合的PADRE肽
该实施例描述诱导抗体应答的PADRE/碳水化合物共轭物的合成和用途。
a．肽的合成
按照标准的固相肽合成法，按照Fmoc合成策略制备肽aKXVAAWTLKAAaZC(X=L-环己基丙氨酸，z=氨基己酸)。
b．碳水化合物的合成
如流程Ⅰ所示进行碳水化合物的合成。
ⅰ．1,2,3,6-四-O-苯甲酰-α-D-吡喃半乳糖苷(1)
在氩气下将含半乳糖(10g,55.5mmole)的200ml吡啶溶液冷却至0℃，在15分钟内滴加在10ml吡啶中稀释的苯甲酰氯(26.2ml,225mmole)。于0℃将该混合物搅拌2小、时。然后将冰加入该溶液，用CH2Cl2(500ml)稀释该反应混合物，用20％H2SO4(300ml)、饱和NaHCO3(300ml)、水(500ml)洗涤并干燥(Na2SO4)。过滤和浓缩后，将该粗产物进行色谱分离(硅胶，10％乙酸乙酯/甲苯)，产生10.43g(31％)的白色固体：Rf=0.3(硅胶，10％乙酸乙酯/甲苯)。
1H-NMR(CDCl3)δ8.10(d,2H，芳氢)，8.00(t,4H,芳氢)，7.86(d,2H，芳氢),7.80-7.36(m,9H，芳氢)，7.27(t,3H，芳氢)，6.82(d,J=3.7Hz,1H,H-1),6.07(dd,J=3.7,10.7Hz,1H,H-2),5.88(dd,J=2.9,10.7Hz,lH,H-3),4.78(dd,J=6.3,10.6Hz,1H,H-6),4.574.46(m,3H)
ⅱ．1-氯-2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃半乳糖苷(2)
于-20℃氩气下，非常缓慢地将草酰氯(8.8ml,100mmole)加入含2,3,4,6-四-O-苄基-D-吡喃半乳糖(4.5g,8.2mmole)的DMF(80ml)溶液中。然后让该混合物温至0℃,2小时后，加入5ml额外的草酰氯。再过3小时后，用CH2Cl2(150ml)稀释该反应物，并用冰水(200ml)、饱和NaHCO3(150ml)、水(150ml)洗涤并干燥(Na2SO4)。浓缩产生粗产物不用纯化而使用；Rf=0.8(硅胶，10％乙酸乙酯/甲苯)。
ⅲ．(2,3,4,6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-1,2,3,6-四-
O-苯甲酰-α-D-吡喃半乳糖苷(3)
在氩气下，将含4分子筛(400mg)、化合物1(2g,3.35mmole)、可力丁(1ml,7.37mmole)、AgOTf(2.58g,10mmole)的10ml甲苯悬浮液冷却至-20℃。然后滴加含化合物2的10ml甲苯溶液，并于-20℃搅拌1小时。让该反应物温至室温过夜，该悬浮液通过硅藻土过滤，该滤液用1N HCl(50ml)、水(50ml)、饱和NaHCO3(50ml)、水(50ml)洗涤并干燥(Na2SO4)。浓缩和色谱分离(硅胶，2％-10％乙酸乙酯/甲苯)提供3.1g(82％)的白色固体；Rf=0.7(硅胶，5％乙酸乙酯/甲苯)。
                                                        1H-NMR(CDCl3)δ806(d,2H,芳氢)，7.96(m,4H，芳氢)，7.83(dd,2H，芳氢)，7.62-7.11(m,32H，芳氢),6.84(d,J=3.7Hz,1H,H-1),6.06(dd,J=3.7,11Hz,1H,H-2),5.77(dd,J=2.6,11Hz,1H,H-3),4.97(d,J=3.4Hz,1H,H-4),4.89-4.06(m,14H),3.97(s,2H，苄基)，3.37(dd,J=7.9,7.9Hz,1H),2.88(dd,1H)
ⅳ．(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-1,2,3,6-四-O-苯甲酰-α-D-吡喃
半乳糖苷(4)
将化合物3(3.08g,2.75mmole)溶于30ml乙酸中并脱气。然后加入钯碳(0.5g,10％(重量))，将该混合物置于H2氛围(气囊)下3天。将该溶液脱气，通过硅藻土过滤并浓缩。将该残留物通过色谱分离(硅胶，5％CH3OH/CH2Cl2)，提供1.48g(70％)的白色固体：Rf=0.35(硅胶，5％CH3OH/CH2Cl2)。1H-NMR(CDCl3)d8.09(d2H，芳氢),8.00-7.91(m,4H，芳氢),7.83(d,2H,芳氢),7.65-7.36(m,10H，芳氢),7,27(d,1H，芳氢),7,25(d,1H，芳氢),6.82(d,J=3.7Hz,lH,H-1),6.06(dd,J=3.7,10.9Hz,lH,H-2),5.81(dd,J=2.6,11Hz,1H,H-3),5.14(d,J=2.9Hz,1H,H-4),4.77-4.61(m,3H),4.17-3.95(m,5H),3.38-3.18(m,2H)
ⅴ．(2,3,4,6-四-O-苯甲酰-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-1,2,3,6-四
-O-苯甲酰-α-D-吡喃半乳糖苷(5)
在氩气下，将含化合物4(1.48g,1.95mmole)的20ml吡啶溶液冷却至0℃，滴加苯甲酰氯(1.81ml,15.6mmole)，并让其温至室温过夜。然后用CH2Cl2(100ml)稀释该溶液，用2 M H2SO4(100ml)、饱和NaHCO3(100ml)、水(100ml)洗涤并干燥(Na2SO4)。浓缩和色谱分离(硅胶，5％乙酸乙酯/甲苯)提供2.03g(88％)油：Rf=0.35(硅胶，5％乙酸乙酯/甲苯)。1H-NMR(CDCl3)δ8.12(d,2H，芳氢)，8.08-7.94(m,5H，芳氢)，7.88-7.79(m,7H,芳氢)，7.63-7.12(m,26H，芳氢)，6.88(d,J=3.8Hz,1H,H-1),6.26-6.16(m,3H,H-2,H-2＇,H-4＇),5.87(dd,J=2,5,11Hz,1H,H-3),5.85(dd,J=3.4,10.9Hz,1H,H-3),5.67(d,J=3.6Hz,1H,H-1＇),5.03(dd,J=7.6Hz,1H),4.78(d,J=2.6Hz,1H,H-4),4.64-4.55(m,2H),4.36-4.31(m,1H),4.04(dd,J=8.4,10.9Hz,1H),3.94(dd,J=5.6,11Hz,1H)
ⅵ．溴代(2,3,4,6-四-O-苯甲酰-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-
2,3,6-三-O-苯甲酰-α-D-吡喃半乳糖苷(6)
于0℃，将含溴化氢(33％)的乙酸(ml)缓慢注入含化合物5(2.03g,1.73mmole)的乙酸(ml)溶液中。将该溶液于室温下搅拌1小时，然后用CH2Cl2(200ml)稀释，用冰水(200ml)、饱和NaHCO3(200ml)洗涤直至中性并干燥(Na2SO4)。浓缩提供直接用于下一步的浅黄色固体(1.84g,94％)；Rf=0.4(硅胶，5％乙酸乙酯/甲苯)。
ⅶ．2-溴乙基(2,3,4,6-四-O-苯甲酰-α-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-
2,3,6-三-O-苯甲酰-β-D-吡喃半乳糖苷(7)
于0℃氩气下，将溶于10ml甲苯中的化合物6(1.845g,1.63mmole)的溶液滴加到2-溴乙醇(0.49ml,6.92mmole)、三氟甲磺酸银(0.53g,2.076mmole)、可力丁(114μl,0.865mmole)和甲苯(15ml)的混合物中。让该悬浮液温至室温过夜，用2 M H2SO4(100ml)、饱和NaHCO3洗涤直至中性并干燥(Na2SO4)。浓缩和色谱分离(硅胶，3％乙酸乙酯/甲苯)提供1.38g(72％)白色固体；Rf=0.3(硅胶，5％乙酸乙酯/甲苯)。
                                  1H-NMR(CDCl3)δ7.98-7.78(m,16H，芳氢)，7.59-7.20(m,19H，芳氢)，6.21(dd,J=3.3,10.8Hz,1H,H-2＇),6.14(bd,1H,H-4＇),5.88(dd,J=7.7,10.5Hz,1H,H-2),5.79(dd,J=3.6,10.9Hz,1H,H-3＇),5.61(d,J=4.4Hz,1H,H-1＇),5.34(dd,J=2.8,10.6Hz,1H,H-3),4.98(bt,1H),4.85(d,J=7.6Hz,1H,H-1),4.70(dd,J=6.5,11.2Hz,1H),4.57(d,J=2.6Hz,1H,H-4),4.36(dd,J=7.5,11.2Hz,1H),4.18-4.00(m,4H),3.93-3.05(m,1H),3.46-3.39(m,2H)
ⅷ．2-溴乙基(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-β-D-吡喃半乳糖苷
    (8)
将含甲醇钠的甲醇(25％(重量),2ml)滴加到含化合物7(1.38g,1.18mmole)的100ml甲醇中。将该混合物在氩气下搅拌2天，用AG50WX8(H+)树脂中和、过滤并浓缩。将该残留物进行色谱分离(C-18硅胶，水至5％CH3OH/水)提供570mg(100％)白色固体；Rf=0.1(硅胶，CH2Cl2/CH3OH/水(80/20/1))。1H-NMR(D2O)d 4.95(d,J=3.8Hz,1H,H-1′),4.52(d,J=7.1Hz,1H,H-1),4.37(dd,J=6.6,6.6Hz,1H),4.25-4.17(m,1H),4.07-4.00(m,3H),3.93-3.54(m,18H)；MS(FAB+)m/z 471(M++Na+),473(M(11Br++Na+)
c．2-溴乙基(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(8)与多肽aKXVAAWTLKAAaZC的反应
通过半胱氨酸残基的巯基与糖苷的溴乙基反应，将该肽与2-溴乙基(α-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-O-β-D-吡喃半乳糖苷结合。所述肽残基、氨基己酸和半胱氨酸与糖苷的亚乙基部分一起，在双糖Gal-Gal和该肽序列aKXVAAWTLKAAa之间形成间隔。
在典型方法中，将1.27μmole肽、2.55μmole溴乙基葡糖苷和25μmole CS2CO3加入1ml小心脱气、干燥的二甲基甲酰胺中，在氩气氛围下保持反应时间。将该混合物超声处理5分钟，然后于室温下搅拌2小时。真空蒸发二甲基甲酰胺。将该残留物溶于2ml 20％乙酸水溶液中，通过制备型高效液相色谱纯化。
d．免疫
在8-16周龄的C57BL/6J(H-2b)小鼠的尾部基部注射在100μl弗氏完全辅助剂(CFA)(Difco Lab,Detroit,MI)中的70μg/小鼠PADRE-糖，4周后取血。这些小鼠随后用在弗氏不完全辅助剂(IFA)中的等量肽-糖化合物加强，2周后取血。用ELISA检测测定抗体效价(初次反应和二次反应)。
e．ELISA
将100μl的在PBS中结合的羧乙基硫代乙基4-O-α-O吡喃半乳糖基-β-O-吡喃半乳糖苷-BSA(Sigma,St.Louis,MO)(10μg/ml)加入96孔平底板(ImmunolⅡ,Dynatech)中的每个孔中。用含0.1％BSA、0.05％吐温20的PBS液封闭后，加入免疫小鼠血清的系列稀释液，将所述板于37℃孵育1小时。所述板用PBS+0.05％Tween-20洗涤，然后于室温下与生物素结合的亲和纯化的山羊抗鼠抗体(完整分子)IgG(Cappel,Durham,NC)和IgM(Caltag Lab,San Franciso,CA)一起孵育2小时。然后将洗过的板与抗生物素蛋白DH和生物素化辣根过氧化物酶H(Vectastain ABC试剂盒，Vector Lab,Burlingame,CA)一起孵育。用TMB过氧化物酶底物(Kirkegaard and Perry Laboratories,Gauthersberg,MD)检测结合的抗糖抗体。所有测量都进行两次重复，所述抗体效价定义为产生0.3 O.D．单位的血清稀释度。
                          流程1
Figure A9719322100601
e．结果
获得的结果(表Ⅶ)表明，C57B1/6J小鼠对双糖Gal-Gla应答非常好。在单次注射后，体液应答主要为IgG，平均效价大约为4.3×104。
                          表Ⅶ
    对PADRE-糖1-10-96的抗体应答免疫原       同族型           第一次免疫后1个月CFA          IgG                127*/2.24
         IgM                77*/1.05PADRE-糖     IgG                42654*/2.69
         IgM                100*/11.5实施例13：对戊糖和十二糖的抗体应答
图5A、B和C以及图6A和B给出了所述糖类、糖-PADRE共轭物和免疫对照的结构。
a．碳水化合物的合成
ⅰ．N-6-溴己酰基β-D-吡喃半乳糖基-(1→3)-[α-L-吡喃岩藻糖
基](1→4)-β-D-2-N-乙酰亚氨基吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃
半乳糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖胺(溴己酰乳糖-N-岩藻戊糖
  Ⅱ)(9)
将含乳糖-岩藻戊糖Ⅱ(10.0mg,11.7μmole)的饱和NH4HCO3(5ml)溶液于室温下搅拌3天，在此期间分步加入固体NH4CO3，以确保饱和。将该混合物重复冻干，直至获得恒重。这产生白色绒毛状固体，后者不用进一步纯化，直接用于下一步。
将产生的固体悬浮于THF(2.0ml)中，冷却至4℃。然后将饱和NH4CO3加入该溶液中，然后加入6-溴己酰氯(20μl,131μmol)。10分钟后，再加入一份6-溴己酰氯(20μl,131μmol)，继续于0℃搅拌2小时，然后于室温下搅拌2小时。然后将水(5ml)加入该反应混合物中，加入1.0M HCl，将该溶液酸化为pH5。用***(5ml×3)萃取该反应混合物后，将水相浓缩为大约2ml，然后进行色谱分离(C-18硅胶，水中0％甲醇至水中20％甲醇)。浓缩和冻干后，获得白色固体(6.5mg,53％收率)。
1H NMR(D2O,300MHZ)δ1.96(d,1H,J=1.0Hz),4.92-4.6(m),4.45(d,1H,J=7.1Hz),4.4(d,J=7.1Hz),4.1 3.35(m,30H),2.3(t,1H,J=7.0Hz)2.1(t,1H,J=7.0Hz),1.9(s,3H),1.8-1.72(m.2H),1.60-1.50(m,2H),1.45-1.32(m,2H),1.1(c,J=7.0Hz,3H)
ⅱ．N-6-溴己酰基α-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-[α-L-阿比可糖
基](1→3)-α-D-吡喃甘露糖基-(1→4)-α-D-鼠李糖基-(1→3)-α-
D-吡喃半乳糖基-(1→2)-[α-L-阿比可糖基](1→3)-α-D-吡喃甘
露糖基-(1→4)-α-D-鼠李糖基-(1→3)-α-D-吡喃半乳糖基-
(1→2)-[α-L-阿比可糖基](1→3)-α→D-吡喃甘露糖基-(1→4)-α-
D-鼠李糖胺(溴己酰十二糖)(10)
将饱和NH4CO3(1.5ml)中的十二糖(6.0mg,3.29μmol)溶液于室温下搅拌4天，在此期间分步加入固体NH4HCO3，以确保饱和。将该反应混合物重复冻干，直至获得恒重，提供白色绒毛状固体，后者不用进一步纯化，直接用于下一步。
将产生的固体悬浮于THF(0.5ml)中，冷却至0℃。然后将饱和NaHCO3加入该溶液中，然后加入6-溴己酰氯(2μl,13.1μmol)。10分钟后，再加入一份6-溴己酰氯(8μl,542μmol)，继续于0℃搅拌。再过2小时后，再加入一份6-溴己酰氯(8μl)，将反应混合物于0℃搅拌2小时，然后于室温下搅拌2小时。然后用水(5ml)稀释该反应混合物，加入1.0M HCl酸化为pH5。用***萃取该溶液，将分离水相浓缩为大约2ml，然后进行色谱分离(C-18反相硅胶，水中0％甲醇至水中20％甲醇)。浓缩和冻干后，获得白色固体(3.28mg,50％收率)。
        1H NMR(D2O),300MHZ)δ5.25(s),5.08(d,1H,J=3.3Hz),5.00(d,1H,J=3.6Hz),1.97(s,1),4.85(d,lH,J=2.2Hz),4.05-3.30(m),2.25(t,lH,J=7.0Hz),210(t,1H,J=7.3Hz),1.90(br,d,3H,J=8.8Hz),1.82-1.74(m,2H),1.60-1.45(m,2H)1.4-1.3(m,2H),1.21(d,3H,J=6.0Hz),1.10-1.02(m,6H)；MS(电子喷射)m/z计算值C71H132BrNO52..1995实测值1993,1995。
b．糖-PADRE结合
ⅰ．乳糖-N-岩藻戊糖Ⅱ-PADRE共轭物(戊糖-PADRE)
在氩气氛围下,将溴己酰基乳糖-N-岩藻戊糖(2.3mg,2.2μmol)、PADRE肽(3.1mg,2.2μmol)和碳酸铯(14mg,44μmol)在无水DMF(1.0ml，使用前用氩气脱气)的混合物于室温下搅拌24小时。真空浓缩该反应混合物，将产生的固体溶于水(0.5ml)中。通过HPLC(Vydac C-18柱，在55分钟内用25％CH3CN、75％H2O至35％CH3CN、65％H2O洗脱，流速为2.0ml/min)纯化，产生乳糖-N-岩藻戊糖Ⅱ-PADRE共轭物(2.5mg,45％的收率)。
        1H NMR(D2O,300MHZ)δ1.96(d,1H,J=4.0Hz),4.92-4.6(m),4.45(d,1H,J=7.1Hz),4.4(d,J=7.1Hz),4.13.35(m,30H),2.3(t,1H,J=7.0Hz),2.1(t,1H,J=7.0Hz),1.9(s,3H),1.8-1.72(m,2H),1.60-1.50(m,2H),1.45-1.32(m,2H),1.1(t,J＝7.0Hz,3H)
ⅱ．十二糖-PADRE共轭物
在氩气氛围下,将溴己酰基十二糖(1.61μmol)、所述PADRE肽(3.8mg,2.46μmol)和碳酸铯(10.7mg,33μmol)在无水DMF((1.0ml，使用前用氩气脱气)的混合物于室温下搅拌14小时。真空浓缩该反应混合物。将产生的固体溶于H2O(1.8ml)、DMSO(0.2ml)和乙酸(0.1ml)中，并通过HPLC(Vydac C-18柱，在55分钟内用25％CH3CN、75％H2O至42％CH3CN、58％H2O纯化，流速为2.0ml/min)纯化。浓缩和冻干后，获得白色固体(3.1mg,54％收率)。
      1H NMR(DMSO-d6；500MHZ)δ8.52(d,1H,J=8.07Hz),8.18(d,1H,J=7.67Hz),8.10-7.61(m),7.75(d,J=7.86Hz),7.46(s,1H),7.31(d,1H,J=8.03Hz),7.2-7.5(m),7.04(t,1H,J=7.32Hz),6.94(t,1H,J=7.32Hz),5.01-0.80(m):MS(电子喷射)m/z计算值C152H255N19O69S:3482实测值3483(Mavg),3505(M+Na+),3521(M+K+)．
c．免疫
在3只8-16周龄C57BL/6J(H-2b)小鼠的尾部基部注射在100μlCFA中的100μg/小鼠的免疫原，4周后取血。这些小鼠随后用在100μl IFA中的等量免疫原加强，2周后取血。用ELISA检测测定IgG和IgM的效价。
d．ELISA
将1μl/孔的乳糖-N-岩藻戊糖Ⅱ-HSA(Biocarb,Cat.NO.61-03(1990))加入96孔平底板(Immunol Ⅱ,Dynatech)中的每个孔中。用含0.1％BSA、0.05％吐温20的PBS封闭后，加入免疫小鼠血清的系列稀释液，将所述板于37℃孵育1小时。所述板用PBS+0.05％吐温-20洗涤，然后于室温下与辣根过氧化物酶(HRP)-大鼠抗小鼠IgG和HRP-山羊抗鼠IgM孵育1小时。然后用TMB过氧化物酶底物(Kirkegaard and Perry Laboratories,Gaithersberg,MD)检测结合的抗糖抗体。所有测量都进行两次，所述抗体效价定义为产生0.3 O.D.单位的血清稀释度。针对戊糖免疫原的抗体应答示于表Ⅹ中。
针对十二糖免疫原的抗体应答示于表Ⅺ中。在该ELISA中，所述孔用10μg/ml LPS包被。所用的ELISA试剂与戊糖ELISA的相同。效价定义为产生0.3 O.D．单位的血清稀释度。表Ⅹ：对戊糖的抗体应答(12/17/96)
免疫原 同族型     第一次免疫后1个月的抗体效价 加强
CFA  IgGIgM     038     056
乳糖-N-岩藻戊糖Ⅱ-PA14  IgGIgM     037     050
 PADRE-戊糖Ⅱ  IgGIgM     3632200     27968198
表Ⅺ：对十二糖的抗体应答(12/17/96)
免疫原 同族型 第一次免疫后1个月的抗体效价 加强
CFA  IgGIgM     0528     4994
LPS  IgGIgM     5368     882724
 PADRE-十二糖  IgGIgM     71091284     87435698
e．讨论本文提出的实验证明，PADRE肽可以用来提高对碳水化合物部分的强大的抗体应答。当与戊糖结合时，与单独的戊糖相比，免疫后1个月的IgG应答大大提高。加强注射后，该抗体效价表现为甚至更大的提高。与IgM相比，IgG应答的增加也是重要的。IgG应答为长期的，通常IgG抗体的亲和力更大。
用十二糖PADRE共轭物观察到相似的结果。当LPS衍生多糖与PADRE结合时，与单独用LPS免疫相比，IgG应答仍然大大增加。此外，个IgG应答的强度是重要的，因为该应答是长期的，并且通常IgG抗体的亲和力高于IgM抗体。
总之，本文提出的实验证明，PADRE肽可以用来提高对碳水化合物部分的强大的抗体应答。因为它们的反应性非常广，因此预期使用PADRE肽应该提供非常高部分的人群覆盖率，高于用诸如TT830-843和其它抗原决定基(参见Alexander等，在所引的书中)的“通用”T细胞抗原决定基之一的覆盖率。使用PADRE肽可以简化构建物，而对生产和表征的容易性和成本有非常好的影响。我们预计，与各种碳水化合物部分(来源可以包括病毒、细菌、真菌、肿瘤或寄生虫)结合的PADRE肽可以开发用于诊断、预防或治疗疾病的用途。实施例14：使用已知DR结合物的类似物以产生具有广谱H类结合
        能力的肽
产生具有广谱特异性和对MHC Ⅱ类分子具有高亲和力的肽的另一方法，需要使用已知的DR结合肽并在先前鉴定为关键MHC特征序列残基以外的位置上引入各种氨基酸变化。然后在先前实施例所述分子结合分析中测试这些类似物每种对Ⅱ类的结合。
在本文所述的该组实验中，将肽760.57(aAXAAAATLKAAa)选为进一步修饰的起点。肽760.57尽管对等位基因DR3、DR52a和DRw53的结合不是适当地结合，然而对DR1、2、4、5和7的结合很好。为了不干扰对这些等位基因的结合能力，在3位不引入对芳族残基的置换，在8位不置换苏氨酸残基，在11位不置换丙氨酸残基。N末端和C末端以降低对蛋白分解酶降解敏感性包括的所述D-氨基酸也保持不变。在其它位置(2、5、6、7、9、10和12)引入4-6个氨基酸变化，由此产生其它906系列类似物。
一般而言，所述氨基酸置换包括带正电氨基酸(K)和带负电氨基酸(E)，亲水性氨基酸(Q)、一个脂族氨基酸(V和/或L和/或I)和所述芳族氨基酸(F)。测试这些肽与一组人类Ⅱ类分子的结合时获得的结合数据示于表Ⅷ中。一般而言，由于对DR1、2、4、5和7结合关键的位置(位置3、8和11)尚未修饰，因此保持良好的结合能力。除非另外指出，否则对于这些等位基因的结合能力不会变化5倍以上。为了便于讨论，在该实施例中，位置从N至C称为1-13。
a位置2[A]：
亲水性Q(906.03)或脂族V(906.04)置换诱导DR53反应性提高印象深刻的30-100倍。通过同样的置换也诱导DR3反应性更适当地提高(3倍)。此外，在该位置测试的所有置换都观察到DQ3.1结合反应性提高大约10倍。最后，用类似物K(906.01)和Q(906.03)得到某些DR52a的反应性。
b．位置5[A]：
用V(906.16)或F(906.17)完成2-4倍DR3结合的中等提高。此外，用同样的类似物906.16和906.17也证明DR53反应性印象深刻的提高(≈100倍)。E(906.14)修饰观察到DR1结合反应性的中等损失(7倍)。在该位置的大多数修饰导致(F(906.17)例外)DQ3.1结合能力的显著损失。
c．位置6[A]：
用带负电氨基酸置换E(906.19)证明适当的DR3反应性(IC50≈1500nM)和对DR52a结合的某些反应性。用同样的906.19类似物也观察到印象深刻DR53反应性的提高(20倍)。然而，DR7反应性丧失。K修饰(906.18)降低DR1(8倍)、DR4w14(10倍)和DR7(检测不到结合)的结合活性。亲水性修饰Q(906.20)导致DR3结合的丧失，并且DR7结合降低30倍。最后，在该位置测试的所有置换也都观察到DQ3.1结合能力的降低。
d．位置7[A]、9[L]和10[K]：
用在这些位置进行的置换仅得到适当的DQ3.1结合反应性(≈10倍)。例外是906.29(9位的K)和906.30(9位的E)，没有获得反应性。也有趣地注意到，类似物906.30证明对DR1(8倍)、DR4w4(7倍)、DR4w14(8倍)、DR5(10倍)和DR7(10倍)结合反应性的损失。此外，注意到9位上6个置换中的4个的DR3反应性的损失。
e．位置12[A]：
具有芳族F置换的肽类似物906.50分别将DR3和DRw53的反应性提高8倍和40倍。此外，用F置换得到DR52a的结合反应性。
用上述一组实验中增加的DR3和/或DR52a反应性的置换组合(2位的906.04(V)、4位的906.09(V)、5位的906.16(V)或906.17(F)、以及12位的906.50(F))，合成第二代(906.51、906.52、906.53、906.55和906.56)类似物。一般而言，这些第二代类似物也证明对大多数测试的DR等位基因良好的反应性(906.55类似物与DR52a的结合例外)。
在下一系列965.01-965.19中，通过在非关键MHC接触残基上引入大体积或带电氨基酸，产生906.09类似物。一般而言，对DR1、2w2β2、4w4、4w14、5、7和DRw53保持高能力结合或中等能力的结合(表Ⅸ)。对DR3的结合能力可改变。表ⅤⅨ  A                                                                        PADREⅡ类结合亲和力肽          LEN                序列                     来源       DRl       DR2w281    DR2w282    DR3       DR4w4    DR4w14     DR5           DR7          DR52a         DRw53        DO3.1
                                                               nM        nM         nM         nM        nM       nM         nM            nM           nM            nM           nM906.01       13      aK(14)AAAATLKAAa-NH2          760.57 SAAS     1.70                 2.7        3782      1.9      5.0        4.9           83.3         5663                       25.3906.02       13      aE(14)AAAATLKAAa-NH2          760.57 SAAS     3.60                 4.5        2406      3.0      11.4       5.4           168.7        16877                      29.9906.03       13      aO(14)AAAATLKAAa-NH2          760.57 SAAS     1.70      41.94      1.8        1480      2.4      2.1        3.7           53.2         5341          35.3         l6.3906.04       13      aO(14)AAAATLKAAa-NH2          760.57 SAAS     1.20                 3.7        9184      2.9      2.5        3.3           100.0        4700000                    12.3906.05       13      aV(14)AAAATLKAAa-NH2          760.57 SAAS7    0.50      121.33     2.2        1654      2.8      3.7        3.0           125.0        111750        10.7         38.2906.06       13      aF(14)AAAATLKAAa-NH2          760.57 SAAS     0.90                 1.8        2727      1.7      2.4        3.4           49.0         4608                       23.7906 06       13      aA(14)KAAATLKAAa-NH2          760.57 SAAS     0.40                 3.8        2980      2.2      5.1        2.9           52.1         2009                       34.6906.08       13      aA(14)EAAATLKAAa-NH2          760.57 SAAS     2.90                 16.0       6610      2.4      3.7        4.3           227.3        11190                      65.5906.09       13      aA(14)OAAATLKAAa-NH2          760.57 SAAS     1.70                 3.1        3041      6.7      4.3        5.4           166.7        1114                       53.0906.09       13      aA(14)VAAATLKAAa-NH2          700.57 SAAS     0.60      14.29      1.9        504       2.7      5.4        2.5           75.8         589           31.0         49.0906.10       13      aA(14)FAAATLKAAa-NH2          760.57 SAAS     1.30                 4.0        3013      4.5      2.4        4.8           32.9         3287                       87.7906.11       13      aA(14)IAAATLKAAa-NH2          760.57 SAAS     0.40      19.00      1.3        180       2.9      3.4        2.4           30.5         1121          42.8         112.8906.12       13      aA(14)LAAATLKAAa-NH2          760.57 SAAS     O.30      44.51      1.5        1293      3.7      3.4        4.8           44.6         1042          42.9         57.0906.13       13      aA(14)AKAATLKAAa-NH2          760.57 SAAS     2.40      606.67     3.2        2848      5.9      4.6        2.9           92.5         94000         545.5        15000.0906.14       13      aA(14)AEAAATLKAAa-NH2         760.57 SAAS     6.lO                 33.3       15517     4.2      13.9       14.3          328.9        42727                      2142.9906.15       13      aA(14)AOAATLKAAa-NH2          760.57 SAAS     2.60                 1.7        7258      4.0      8.5        5.7           100.0        58750                      348.8906.16       13      aA(14)AVAATLKAAa-NH2          760.57 SAAS     O.90      75.03      1.1        1090      5.2      5.7        6.9           108.7        8103          7.3          2142.9906.17       13      aA(14)AFAATLKAAa-NH2          760.57 SAAS     1.50      14.80      1.0        2206      5.0      4.5        3.0           33.8         7460          18.2         76.6906.18       13      aA(14)AAKATLKAAa-NH2          760.57 SAAS     6.60                 3.5        4500000   3.5      29.4       2.2           25000.0      4700000                    348.8906.19       13      aA(14)AAEATLKAAa-NH2          760.57 SAAS     3.30      4550.00    9.5        1719      4.5      4.2        6.5           250000.0     1451          50.0         681.8906.20       13      aA(14)AAOATLKAAa-NH2          760.57 SAAS     1.00                 3.3        56250     1.8      2.8        4.1           2500.0       4700000                    652.2906.21       13      aA(14)AAVATLKAAa-NH2          760.57 SAAS     0.20                 1.5        21429     3.0      4.1        3.2           42.4         13624                      428.6906.22       13      aA(14)AAFATLKAAa-NH2          760.57 SAAS     1.70                 3.3        50000     2.4      2.6        3.4           69.4         13429                      1875.0906.23       13      aA(14)AAAKTLKAAa-NH2          760.52 SAAS     0.70                 1.5        3333      2.0      5.5        2.2           29.8         20435                      26.1906.24       13      aA(14)AAAETLKAAa-NH2          760.52 SAAS     2.10                 6.0        4891      2.8      4.5        11.1          373.1        1253                       46.6906.25       13      aA(14)AAAOTLKAAa-NH2          760.57 SAAS     1.60                 1.7        2830      2.3      4.5        3.0           156.3        21364                      42.5906.26       13      aA(14)AAAVTLKAAa-NH2          760.57 SAA5     1.O0                 1.4        3191      2.2      3.9        3.9           65.8         979                        27.9906.27       13      aA(14)AAATTLKAAa-NH2          730.57 SAAS     O.50                 3.4        6081      2.2      1.7        2.6           65.8         23500                      44.1906.28       13      aA(14)AAATILKAAa-NH2          760.57 SAAS     1.00                 1.3        4839      4.5      7.4        5.0           69.4         10217                      28.5906.29       13      aA(14)AAAATKKAAa-NH2          760.57 SAAS     2.80                 2.9        4500000   4.6      38.5       7.7           290.7        4700000                    283.0906.30       13      aA(14)AAAATEKAAa-NH2          760.57 SAAS     0.90                 25.9       30000     14.5     26.0       51.5          757.0        3219                       148.5906.31       13      aA(14)AAAATOKAAa-NH2          760.57 SAAS     0.50                 1.9        18000     4.2      12.2       11.8          1000         6528                       52.0906.32       13      aA(14)FAAATVKAAa-NH2          760.57 SAAS     0.40                 2.6        18750     3.3      3.1        4.2           58.1         5402                       26.0906.33       13      aA(14)AAAATFKAAa-NH2          760.57 SAAS     0.70                 1.7        11538     1.5      3.0        2.4           43.1         22381                      13.4906.34       13      aA(14)AAAATIKAAa-NH2          760.57 SAAS     0.50                 2.3        6818      2.3      3.0        3.1           55.6         4017                       30.6906.35       13      aA(14)AAAATLEAAa-NH2          760.57 SAAS     1.70                 15.3       11538     3.7      3.9        10.5          l66.7        9400                       39.5906.36       13      aA(14)AAAATLOAAa-NH2          760.57 SAAS     2.30                 3.5        4945      2.8      3.7        8.3           119.0        24737                      23.7906.37       13      aA(14)AAAATLVAAa-NH2          760.57 SAAS906.38       13      aA(14)AAAATLFAAa-NH2          760.57 SAAS     2.60                 3.9        4500000   2.7      6.8        19.2         60.8         12051                       14.3906.39       13      aA(14)AAAATLRAAa-NH2          760.57 SAAS     1.10                 1.0        3846      3.5      2.9        4.3          86.2         24737                       28.8906.40       13      aA(14)AAAATLKKAa-NH2          760.57 SAAS     71.40       4550.00  0.5        1931      11.0     29.4       16.7         555.6        4700000       2307.7        36.0906.41       13      aA(14)AAAATLKEAa-NH2          760.57 SAAS     238.10               28.5       20455     8.8      228.3      285.7        252.6        470000                      227.3906.42       13      aA(14)AAAATLKOAa-NH2          760.57 SAAS     11.00                5.8        5556      5 2      9.1        29.4         138.9        24737                       483.9906.43       13      aA(14)AAAATLKVAa-NH2          760.57 SAAS     0.50        46.67    1.9        1300      1.7      15.6       9.5          490          392           1875.0        24.7906.44       13      aA(14)AAAATLKFAa-NH2          760.57 SAAS     1.70        3033.33  2.0        281       3.8      33.3       103.8        25.0         81            821.9         160.7906.45       13      aA(14)AAAATLKIAa-NH2          760.57 SAAS     1.00                 2.5        4455      2.0      19.2       28.2         25.0         84                          50.2906.46       13      aA(14)AAAATLKAAa-NH2          760.57 SAAS906.47       13      aA(14)AAAATLKAEa-NH2          760.57 SAAS     1.60                 5.2        30000     2.7      8.2        25.5          131 .6       3917                       60.2906.48       13      aA(14)AAAATLKAOa-NH2          760.57 SAAS     0.70                 2.1        12162     2.3      5.5        20.0          982          2938                       18.4906.49       13      aA(14)AAAATLKAVa-NH2          760.57 SAAS     0.60                 2.1        2446      3.2      5.5        4.5           28.4         4273                       14.8906.50       13      aA(14)AAAATLKAFa-NH2          760.57 SAAS     0.30        15.69    3.7        584       1.7      3.2        0.5           73.5         2238         25.0          20.0表Ⅸ                                                     PADREII类结合亲和力肽         IEN              序列        来源        DR1     DR2w281 DR2w282 DR3   DR4w4  DR4w14  DR5    DR7    DR52a    DRw53    DO3.1
                                                nM      nM      nM      nM    nM     nM      nM     nM     nM       nM       nM905.011    13    aK(l4)VKANTLKAAa-NH2  Pan DR       1.50            12.5    592    2.8    3.8    11.8   480.8
                                   抗原决定基965.012    13    aK(14)VKANTLKAAa-NH2  Pan DR       1.30            10.5    4592   2.1    5.9    2.2    781.3
                                   抗原决定基985.021    13    aK(14)VKAWTLKAAa-NH2  Pan DR       0.80            5.7     1098   1.5    4.5    4.1    89．3
                                   抗原决定基955.022    13    aK(14)VKAWTtKAAa-NH2  Pan DR       0.70            9.0     12162  0.8    1.5    1.1    337.8
                                   抗原决定基905.031    13    aK(14)VWANTLKAAa NH2  Pan DR       0.80            5.4     348    2.1    5.2    8.3    208.3             200.9
                                   抗原决定基965.032    13    aK(14)VWANTLKAAa-NH2 Pan DR       0.50   233.33   9.0      849    0.7    2.9    2.9    347.2    17407              1668.7
                                   抗原决定基965.041    13    aK(14)VWAYTLKAAa-NH2  Pan DR       0.50           2.5     136     0.5    2.6    4.7    156.3
                                    抗原决定基965.042    13    aK(14)VWAYTLKAAa-NH2  Pan DR       0.20           9.5     3462    1.0    3.3    3.9    657.9
                                    抗原决定基965.051    13    aK(14)VWAYTLKAAa-NH2   Pan DR      0.50           7.1     281     0.3    4.2    5.7    833.3
                                    抗原决定基965.052    13    aK(14)VWAYTLKAAa-NH2   Pan DR      0.70           9.0     16071   0.8    5.5    0.9    252.5
                                    抗原决定基985.06     13    aK(14)VRANTIKAAa-NH2   PanDR       0.8            6.4     8333    1.3    5.0    5.6    73.5
                                    抗原决定基965.071    13    aK(14)VKAHTLKAAa-NH2   Pan DR      1.60           5.l     4945    18     9.4    10.5   166.7
                                    抗原决定基965.072    13    aK(l4)VKAHTLKAAa-NH2    Pan DR     1.20           6.6     6429    1.4    5.7    4.8    555.6
                                     抗原决定基965.081    13    aK(14)VAANTLKAAa-NH2    Pan DR     1.20           3.7     450     3.0    17.2   8.0    192.3          103.4
                                     抗原决定基965.082    13    aK(14)VAANTLKAAa-NH2    Pan DR     0.70           7.1     3214    1.3    5.0    12.5   113.6
                                     抗原决定基965.091    13    aK(14)VAAYTIKAAa-NH2    Pan DR     0.80           7.4     450     1.0    8.8    5.4    192.3          54.5
                                     抗原决定基965.092    13    aK(l4)VAAYTLKAAa-NH2    Pan OR     0.60           6.4     3214    1.0    8.8    8.5    54.3
                                     抗原决定基965.10     13    aK(14)VAAWTLKAAa-NH2    Pan DR     1.20           5.5     214     2.8    12.2   11.1   147.1   879    89.5    25.0
                                     抗原决定墨965.14     13    aK(14)VAAKTLKAAa-NH2    Pan DR     3.60           8.0     1400    7.4    78.1   34.5   227.3          33.3
                                     抗原决定基965.15     13    aK(14)VAAHTLKAAa-NH2    Pan DR     1.90           5.4     2500    3.2    17.2   29.9   156.3          50.0
                                     抗原决定基965.16     13    aK(14)VAAATLKAAa-NH2    Pan DR     4.20           6.0     2647    6.2    69.4   16.7   227.3          83.3
                                     抗原决定基905.17    13     AK(14)VAAWTLKAAa-NH2    Pan DR     2.00           5.8     3214    3.8    33.3    9.1   147.1          107.1
                                     抗原决定基965.19    16     KSSaK(14)VAAwTLKAAa-NH2 Pan DR     10.20          23.5            5.5    41.7    9.1   378.8
                                     抗原决定基14=环己基丙氨酸
f．结论
通过在非关键特征序列残基上引入各种置换，然后将这些合适的置换结合到下一代肽类似物中，可以产生比已知DR结合肽的特异性广和亲和力高的肽类似物。
提供以上实施例是为了说明本发明，而不是限制其范围。本发明的其它变体对于本领域技术人员是显而易见的，包括在所附的权利要求书内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用结合到本文中。
权利要求书
按照条约第19条的修改
1．引起对非蛋白性抗原决定基免疫应答的组合物，所述组合物包含少于约50个残基的PADRE寡肽和所述抗原决定基。
2．权利要求1的组合物，其中所述寡肽和所述抗原决定基相互连接。
3．权利要求2的组合物，其中所述寡肽和所述抗原决定基共价连接。
4．权利要求3的组合物，其中所述抗原决定基通过一接头共价连接到所述PADRE肽上。
5．权利要求4的组合物，其中所述接头包含一个半胱氨酸残基。
6．权利要求4的组合物，其中所述接头由一个氨基己酸残基和一个半胱氨酸残基组成。
7．权利要求1的组合物，其中所述抗原决定基连接到所述寡肽的C末端。
8．权利要求1的组合物，其中所述抗原决定基包含一个碳水化合物抗原决定基。
9．权利要求8的组合物，其中所述碳水化合物抗原决定基得自细菌。
10．权利要求8的组合物，其中所述碳水化合物抗原决定基得自病毒。
11．权利要求8的组合物，其中所述碳水化合物抗原决定基得自癌细胞。
12．权利要求8的组合物，其中所述碳水化合物抗原决定基得自真菌。
13．权利要求8的组合物，其中所述碳水化合物抗原决定基得自寄生虫。
14．权利要求1的组合物，其中所述PADRE肽进一步共价连接到脂质部分上。
15．权利要求14的组合物，其中所述脂质部分包含棕榈酸。
16．权利要求15的组合物，其中所述脂质部分为PAM2K，其中K为赖氨酸残基，而PAM为棕榈酸残基。
17．权利要求14的组合物，其中所述脂质部分连接到所述PADRE肽的N末端上。
18．权利要求1的组合物，其中所述PADRE肽从N末端至C末端具有式R1-R2-R3-R4-R5，其中：
R1由至少2个残基组成；
R2选自环己基丙氨酸残基、酪氨酸残基、苯丙氨酸残基和它们的保守置换；
R3为3-5个残基；
R4选自苏氨酸-亮氨酸-赖氨酸、赖氨酸-苏氨酸和色氨酸-苏氨酸-亮氨酸-赖氨酸和它们的保守置换；以及
R5由至少2个残基组成。
19．权利要求18的组合物，其中R3的每个氨基酸独立地选自丙氨酸、异亮氨酸、丝氨酸和缬氨酸。
20．权利要求18的组合物，其中R5的每个氨基酸独立地选自丙氨酸、丝氨酸和缬氨酸。
21．权利要求18的组合物，其中：
R1为D-丙氨酸，然后是L-丙氨酸或L-赖氨酸；
R2为环己基丙氨酸或苯丙氨酸；
R3的每个残基选自L-丙氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；以及
R5为2个或4个L-丙氨酸，然后是D-丙氨酸。
22．权利要求18的组合物，其中：
R1为L-丙氨酸，然后是L-丙氨酸或L-赖氨酸；
R2为环己基丙氨酸或苯丙氨酸；
R3的每个残基选自L-丙氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；以及
R5为2个或4个L-丙氨酸，然后是L-丙氨酸。
23．权利要求18的组合物，其中所述PADRE肽选自aAXAAAKTAAAAa、aAXAAAATLKAAa、aAXVAAATLKAAa、aAXVAAATLKAAa、aAXIAAATLKAAa、aKXVAAWTLKAAa和aKFVAAWTLKAAa,其中a为D-丙氨酸，A为L-丙氨酸、X为环己基丙氨酸，K为赖氨酸，T为苏氨酸，L为亮氨酸，V为缬氨酸，I为异亮氨酸，W为色氨酸，以及F为苯丙氨酸。
24．权利要求23的组合物，其中所述PADRE肽为aKXVAAWTLKAAa。
25．权利要求18的组合物，其中所述PADRE肽选自AAXAAAKTAAAAA、AAXAAAATLKAAA、AAXVAAATLKAAA、AAXVAAATLKAAA、AAXIAAATLKAAA、AKXVAAWTLKAAA和AKFVAAWTLKAAA，其中A为L-丙氨酸，X为环己基丙氨酸，K为赖氨酸，T为苏氨酸，L为亮氨酸，V为缬氨酸，I为异亮氨酸，W为色氨酸，以及F为苯丙氨酸。
26．权利要求18的组合物，其中所述PADRE肽选自AAXAAAKTAAAAa、AAXAAAATLKAAa、AAXVAAATLKAAa、AAXVAAATLKAAa、AAXIAAATLKAAa、AKXVAAWTLKAAa和AKFVAAWTLKAAa，其中a为D-丙氨酸，A为L-丙氨酸、X为环己基丙氨酸，K为赖氨酸，T为苏氨酸，L为亮氨酸，V为缬氨酸，I为异亮氨酸，W为色氨酸，以及F为苯丙氨酸。
27．权利要求18的组合物，其中所述PADRE肽选自aAXAAAKTAAAAA、aAXAAAATLAAA、aAXVAAATLKAAA、aAXVAAATLKAAA、aAXIAAATLKAAA、aKXVAAWTLKAAA和aKFVAAWTLKAAA，其中a为D-丙氨酸，A为L-丙氨酸、X为环己基丙氨酸，K为赖氨酸，T为苏氨酸，L为亮氨酸，V为缬氨酸，I为异亮氨酸，W为色氨酸，以及F为苯丙氨酸。
28．药用组合物，包含药学上可接受的载体、非蛋白性抗原决定基和少于大约50个残基的PADRE寡肽。
29．权利要求28的组合物，还包含辅助剂。
30．权利要求29的组合物，其中所述辅助剂为弗氏完全辅助剂或弗氏不完全辅助剂。
31．诱导体液免疫应答的方法，包括将权利要求28的组合物导入哺乳动物。
32．权利要求31的方法，其中所述导入为胃肠外导入。
33．权利要求31的方法，其中所述免疫应答为预防性的。
34．权利要求31的方法，其中所述免疫应答为治疗性的。
35．权利要求31的方法，其中所述免疫应答包括针对权利要求1的抗原决定基的IgG应答。

Claims (34)

1．引起对非蛋白性抗原决定基免疫应答的组合物，所述组合物包含少于约50个残基的PADRE寡肽和所述抗原决定基。
2．权利要求1的组合物，其中所述寡肽和所述抗原决定基相互连接。
3．权利要求2的组合物，其中所述寡肽和所述抗原决定基共价连接。
4．权利要求3的组合物，其中所述抗原决定基通过一接头共价连接到所述PADRE肽上。
5．权利要求4的组合物，其中所述接头包含一个半胱氨酸残基。
6．权利要求4的组合物，其中所述接头由一个氨基己酸残基和一个半胱氨酸残基组成。
7．权利要求1的组合物，其中所述抗原决定基连接到所述寡肽的C末端。
8．权利要求1的组合物，其中所述抗原决定基包含一个碳水化合物抗原决定基。
9．权利要求8的组合物，其中所述碳水化合物抗原决定基得自细菌。
10．权利要求8的组合物，其中所述碳水化合物抗原决定基得自病毒。
11．权利要求8的组合物，其中所述碳水化合物抗原决定基得自癌细胞。
12．权利要求8的组合物，其中所述碳水化合物抗原决定基得自真菌。
13．权利要求8的组合物，其中所述碳水化合物抗原决定基得自寄生虫。
14．权利要求1的组合物，其中所述PADRE肽进一步共价连接到脂质部分上。
15．权利要求14的组合物，其中所述脂质部分包含棕榈酸。
16．权利要求15的组合物，其中所述脂质部分为PAM2K，其中K为赖氨酸残基，而PAM为棕榈酸残基。
17．权利要求14的组合物，其中所述脂质部分连接到所述PADRE肽的N末端上。
18．权利要求1的组合物，其中所述PADRE肽从N末端至C末端具有式R1-R2-R3-R4-R5，其中：
R1由至少2个残基组成；
R2选自环己基丙氨酸残基、酪氨酸残基、苯丙氨酸残基和它们的保守置换；
R3为3-5个残基；
R4选自苏氨酸-亮氨酸-赖氨酸、赖氨酸-苏氨酸和色氨酸-苏氨酸-亮氨酸-赖氨酸和它们的保守置换；以及
R5由至少2个残基组成。
19．权利要求18的组合物，其中R3的每个氨基酸独立地选自丙氨酸、异亮氨酸、丝氨酸和缬氨酸。
20．权利要求18的组合物，其中R5的每个氨基酸独立地选自丙氨酸、丝氨酸和缬氨酸。
21．权利要求18的组合物，其中：
R1为D-丙氨酸，然后是L-丙氨酸或L-赖氨酸；
R2为环己基丙氨酸或苯丙氨酸；
R3的每个残基选自L-丙氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；以及
R5为2个或4个L-丙氨酸，然后是D-丙氨酸。
22．权利要求18的组合物，其中：
R1为L-丙氨酸，然后是L-丙氨酸或L-赖氨酸；
R2为环己基丙氨酸或苯丙氨酸；
R3的每个残基选自L-丙氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；以及
R5为2个或4个L-丙氨酸，然后是L-丙氨酸。
23．权利要求18的组合物，其中所述PADRE肽选自aAXAAAKTAAAAa、aAXAAAATLKAAa、aAXVAAATLKAAa、aAXVAAATLKAAa、aAXLAAATLKAAa、aKXVAAWTLKAAa和aKFVAAWTLKAAa，其中a为D-丙氨酸，A为L-丙氨酸、X为环己基丙氨酸，K为赖氨酸，T为苏氨酸，L为亮氨酸，V为缬氨酸，I为异亮氨酸，W为色氨酸，以及F为苯丙氨酸。
24．权利要求23的组合物，其中所述PADRE肽为aKXVAAWTLKAAa。AAXVAAATLKAAA、AAXVAAATLKAAA、AAXIAAATLKAAA、AKXVAAWTLKAAA和AKFVAAWTLKAAA，其中A为L-丙氨酸、X为环己基丙氨酸，K为赖氨酸，T为苏氨酸，L为亮氨酸，V为缬氨酸，I为异亮氨酸，W为色氨酸，以及F为苯丙氨酸。
26．权利要求18的组合物，其中所述PADRE肽选自AAXAAAKTAAAAa、AAXAAAATLKAAa、AAXVAAATLKAAa、AAXVAAATLKAAa、AAXIAAATLKAAa、AKXVAAWTLKAAa和AKFVAAWTLKAAa，其中a为D-丙氨酸，A为L-丙氨酸、X为环己基丙氨酸，K为赖氨酸，T为苏氨酸，L为亮氨酸，V为缬氨酸，I为异亮氨酸，W为色氨酸，以及F为苯丙氨酸。
27．权利要求18的组合物，其中所述PADRE肽选自aAXAAAKTAAAAA、aAXAAAATLKAAA、aAXVAAATLKAAA、aAXVAAATLKAAA、aAXIAAATLKAAA、aKXVAAWTLKAAA和aKFVAAWTLKAAA，其中a为D-丙氨酸，A为L-丙氨酸、X为环己基丙氨酸，K为赖氨酸，T为苏氨酸，L为亮氨酸，V为缬氨酸，I为异亮氨酸，W为色氨酸，以及F为苯丙氨酸。
28．药用组合物，包含药学上可接受的载体、非蛋白性抗原决定基和少于大约50个残基的PADRE寡肽。
29．权利要求28的组合物，还包含辅助剂。
30．权利要求29的组合物，其中所述辅助剂为弗氏完全辅助剂或弗氏不完全辅助剂。
31．诱导体液免疫应答的方法，包括将权利要求28的组合物导入哺乳动物。
32．权利要求31的方法，其中所述导入为胃肠外导入。
33．权利要求31的方法，其中所述免疫应答为预防性的。
34．权利要求31的方法，其中所述免疫应答为治疗性的。
35．权利要求31的方法，其中所述免疫应答包括针对权利要求1的抗原决定基的IgG应答。
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