CN109991422A - 基于特异抗血清的棕榈酰化修饰蛋白质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属生化分析领域，涉及一种新的基于特异抗血清的棕榈酰化修饰蛋白质的检测方法，本方法中将棕榈酰化修饰的短肽(Cys‑Acp‑Cys(Pal))偶联到载体蛋白质上作为抗原，制备出抗蛋白质棕榈酰化修饰的泛抗血清，并利用该抗血清特异性地分析生物样品中蛋白质的棕榈酰化修饰状态。本发明制得的泛抗血清特异性更好，效价更高；本方法能利用抗血清的特异性直接指示各类复杂样品中如细胞、体液或组织样本的棕榈酰化修饰蛋白质，假阳性率低，结合色谱‑质谱分析，可实现生物样本中棕榈酰化修饰蛋白质的高通量鉴定分析，操作简便、易行。本发明为高通量检测生物样本中蛋白质棕榈酰化修饰提供了有效的手段。

Description

基于特异抗血清的棕榈酰化修饰蛋白质的检测方法
技术领域
本发明属于生化分析领域，涉及一种基于特异抗血清的棕榈酰化修饰蛋白质的检测方法。本发明尤其涉及制备特异识别蛋白质棕榈酰化修饰的泛抗血清，以及将其应用于生物样本中棕榈酰化修饰蛋白质的检测方法中。
背景技术
现有技术公开了棕榈酰化修饰(palmitoylation)更准确地说是S-酰化修饰(S-acylation)，是一种动态、可逆的蛋白质翻译后脂质修饰，通常是指16-碳的饱和脂肪酸棕榈酸在S-酰基转移酶的作用下通过硫酯键共价修饰到蛋白质半胱氨酸残基上，该修饰通过增加蛋白质的疏水性，调控蛋白质(如离子通道和激酶等)的结构、组装、成熟及其功能，对细胞信号转导、代谢和疾病的发生、发展等都起着重要作用。蛋白质棕榈酰化修饰的传统分析方法是放射性棕榈酸盐代谢标记法，利用放射自显影的信号进行检测，但该方法操作繁琐，放射性同位素有害、处理费用高，灵敏度不高，只能检测活细胞中的棕榈酰化修饰蛋白质。现有高通量分析棕榈酰化蛋白质的方法均为化学方法，主要有两类：一类以“棕榈酸盐”为中心，利用叠氮或炔基棕榈酸类似物代谢标记细胞蛋白质，结合施陶丁格连接或点击化学实现棕榈酰化修饰蛋白质组定性(含位点确定)甚至定量分析，但该法不能分析组织样品和体液，在细胞培养过程中引入棕榈酸盐类似物，可能会导致无法预测的生物学效应，且对具有不同更新速度的修饰蛋白质分析能力不同；另一类则是以“半胱氨酸”为中心，利用半胱氨酸和脂肪酸修饰基团之间的巯酯键不稳定，能被中性羟胺溶液选择性水解生成自由巯基的特点，发展起来的酰基-生物素置换(Acyl-biotinyl exchange，ABE)及其衍生方法，尽管该法应用广泛，但属于间接检测法，假阳性率较高。目前尚未见商品化的棕榈酰化修饰泛抗体报道。在前期工作中，本申请的发明人曾以半胱氨酸棕榈酰化修饰短肽Cys-Cys(Pal)[其中：Pal为棕榈酰化修饰]为半抗原，与载体蛋白质如KLH偶联后作为抗原免疫实验动物，获得了首个棕榈酰化修饰泛抗血清，并用于生物样本中棕榈酰化修饰蛋白质的特异检测分析。尽管上述研究取得了很大的进展，利用该泛抗血清能直接检测蛋白质的棕榈酰化修饰状态，但其特异性和效价均有待于进一步改进，其用于免疫化学检测时的稀释比例较低(1∶20～30)。
鉴于现有技术存在的不足，本申请的发明人拟通过改进半抗原的组成、免疫剂量和免疫次数等手段，提高抗原对实验动物的免疫效果，进而产生特异性更高的棕榈酰化修饰泛抗血清，并建立一种基于此特异抗体的棕榈酰化修饰蛋白质的检测方法。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术存在的不足，提供一种简便地检测蛋白质棕榈酰化修饰状态的方法；尤其是一种利用特异识别蛋白质棕榈酰化修饰泛抗血清及该泛抗血清在大规模检测棕榈酰化修饰蛋白质的方法。
本发明的技术方案是：
利用特定的具有半胱氨酸棕榈酰化修饰的肽段作为半抗原，将其与载体蛋白质KLH偶联后作为免疫原，免疫新西兰白兔；经优化免疫剂量和免疫次数后，利用含棕榈酰化修饰的肽段及未修饰肽段进行鉴别筛选，获得特异识别蛋白质半胱氨酸棕榈酰化修饰的泛抗血清；收集免疫前后血清，用ELISA和免疫印迹技术检测该抗血清特异识别蛋白质棕榈酰化修饰的能力；建立一种基于该特异抗血清的检测简单/复杂生物样本中蛋白质棕榈酰化修饰状态的简便方法。
进一步，利用该基于抗血清特异识别棕榈酰化修饰蛋白质的免疫化学检测方法，分析全细胞样品中蛋白质的棕榈酰化修饰状态，为高通量分析各类样本(如细胞、组织和体液)中棕榈酰化修饰蛋白质提供了新的特异的分析方法。
利用本发明中的检测方法，定性定量分析重要目标蛋白质的棕榈酰化修饰状态，结合质谱分析可以准确分析蛋白质的棕榈酰化修饰位点。
具体而言，本发明中基于特异抗血清的棕榈酰化修饰蛋白质的检测方法包括以下步骤：
(1)利用半胱氨酸棕榈酰化修饰的肽段为半抗原，将其与载体蛋白质偶联后采用皮下多点注射的方式免疫实验动物；本发明的实施例中，将含16个碳的饱和脂肪酸棕榈酸通过硫酯键共价修饰到半胱氨酸的巯基上，合成具有棕榈酰化修饰的短肽Cys-Acp-Cys(Pal)，再与载体蛋白KLH偶联后免疫新西兰白兔，以获得抗棕榈酰化修饰的泛抗血清；
(2)第六次免疫后颈动脉放血收集抗血清，用ELISA技术检测抗血清的效价；
(3)利用收集的抗血清对不同浓度的半抗原Cys-Acp-Cys(Pal)进行免疫化学检测，考察该抗血清的检测灵敏度；
(4)利用制得的抗血清对具有不同转移潜能的肝癌细胞系97L和LM3中的棕榈酰化修饰蛋白质进行免疫化学检测，通过比对不同细胞系中检测到的免疫化学信号，评价该抗血清的特异性和有效性；
(5)利用基于制得的抗血清的免疫化学检测方法定量分析细胞系97L和LM3中重要蛋白质Lamin A的棕榈酰化修饰状态，并结合高分辨的质谱分析方法，鉴定了Lamin A的棕榈酰化修饰位点，评价方法的可行性。
本发明提供了一种基于Cys-Acp-Cys(Pal)为半抗原[其中：Acp为氨基己酸，Pal为棕榈酰化修饰]制备特异识别蛋白质棕榈酰化修饰泛抗血清以及利用该泛抗血清高通量检测生物样本中棕榈酰化修饰蛋白质的方法，经实验显示，本发明中制得的泛抗血清能特异识别蛋白质的棕榈酰化修饰，对棕榈酰化修饰蛋白质/肽段具有良好的免疫化学检测效果，能用于简单及复杂生物样本中棕榈酰化修饰蛋白质的高通量检测。
本发明的优点及有益效果为：
本发明方法首次采用带有氨基己酸连接臂的半胱氨酸棕榈酰化修饰的肽段Cys-Acp-Cys(Pal)[其中：Acp为氨基己酸，Pal为棕榈酰化修饰]为半抗原，制备了特异性强的棕榈酰化修饰泛抗血清，并利用该泛抗血清对蛋白质棕榈酰化修饰状态进行了检测。与现有分析方法相比，本法能用于直接指示各类样本(组织、细胞和体液等)中的棕榈酰化修饰蛋白质，特异性好，假阳性率低，与色谱-质谱分析相结合，能高通量地分析生物样本中棕榈酰化修饰的蛋白质，可操作性强，简便易行。与发明人在前期工作中以Cys-Cys(Pal)为半抗原制备得到的棕榈酰化修饰泛抗血清相比，本发明所采用的抗血清制备方法中，一方面，以Cys-Acp-Cys(Pal)为半抗原，改进了半抗原的结构，由于连接臂氨基己酸的引入，使抗原表位更突出；另一方面，由于免疫剂量和免疫次数的增加，在很大程度上克服了硫酯键不稳定以及由于棕榈酸强疏水性引起的水溶性和免疫原性差等问题带来的不足，因此本发明中制备得到的泛抗血清具有更好的特异性和检测灵敏度。
附图说明
图1利用dot blot实验考察抗血清的特异性和检测灵敏度，图中，Cys-Acp-Cys(Pal)为修饰肽段，Cys-Acp-Cys为非修饰肽段，其中，Acp为氨基己酸，Pal为棕榈酰化修饰基团，说明该抗棕榈酰化修饰的泛抗血清有效且具有较高的检测灵敏度。
图2利用具有不同转移潜能的肝癌细胞97L和LM3样品评价抗血清的检测效果：(A)以Cys-Cys(Pal)为半抗原制得的抗血清；(B)以Cys-Acp-Cys(Pal)为半抗原制得的抗血清。说明不同的细胞97L和LM3中具有不同的棕榈酰化修饰水平；对于同一细胞样品，利用两种抗血清进行免疫反应后得到的pattern相似，但存在一定的特异性；且以Cys-Acp-Cys(Pal)为半抗原制得的抗血清具有更好的检测效果，更低的检测灵敏度和更高的稀释比例。
图3利用抗血清western blot法检测97L和LM3中Lamin A的棕榈酰化修饰状态，图中，IP：LMNA表示先用抗Lamin A的单克隆抗体将97L和LM3细胞中的Lamin A免疫共沉淀，再将Lamin A等量上样，分别利用本发明获得的抗血清和商品化的抗Lamin A抗体对其棕榈酰化修饰水平和蛋白表达量进行检测，图示说明该抗血清能用于定量检测分析蛋白质的棕榈酰化修饰水平。
图4按现有ABE法验证本发明方法检测得到的结果，图中，“-”和“+”分别表示“不加”和“加”羟胺与TS-6B富集处理；图示表明，利用现有通用的ABE法检测得到的结果与本发明方法检测得到的结果一致，在97L细胞中lamin A的棕榈酰化修饰水平高于LM3中，说明该抗血清有效。
图5蛋白质Lamin A的肽段AQNTWGCGNSLR质谱串级图，图示说明Lamin A发生了棕榈酰化修饰，结论与本发明方法检测得到的结果一致，说明该抗血清有效。
具体实施方式
下面结合图表和具体实施例对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。
实施例1制备免疫抗原
采用本领域公知的方法合成含有棕榈酰化修饰的肽段及其对照肽段，并将含棕榈酰化修饰的肽段与载体蛋白偶联，本实施例中，由上海睿星生物技术有限公司完成所述肽段合成和蛋白偶联：合成不含棕榈酰化修饰的短肽Cys-Acp-Cys和含棕榈酰化修饰的短肽Cys-Acp-Cys(Pal)，并将Cys-Acp-Cys(Pal)偶联到载体蛋白质KLH上，表示为KLH-Cys-Acp-Cys(Pal)。
实施例2抗原免疫，制备棕榈酰化修饰泛抗血清
将实施例1中制得的KLH-Cys-Acp-Cys(Pal)作为抗原，分六次免疫新西兰白兔，其中，第一次的免疫剂量为200μg/兔，后续每次免疫剂量均为100μg/兔，六次免疫后，常规颈动脉放血，收集抗血清保存于-20℃。
实施例3采用竞争法ELISA考察抗血清的特异性
将Cys-Acp-Cys(Pal)(100μg/ml)作为抗原加入酶标板，4℃包被过夜，采用本领域公知的ELISA方法进行检测，通过检测不同稀释比例(1∶100开始，1∶3梯度稀释)的抗血清所产生的免疫信号，评价实施例2中获得的抗血清的最佳使用稀释比例；通过比较免疫前后血清所产生的免疫信号，并利用修饰肽段Cys-Acp-Cys(Pal)和非修饰肽段Cys-Acp-Cys进行竞争实验，考察该抗血清的有效性和特异性；结果如表1所示，免疫前的血清对修饰肽段和非修饰肽段均没有响应，而免疫后的抗血清对修饰肽段具有很强的免疫反应，且竞争实验的结果显示，该抗血清对于棕榈酰化修饰具有很好的选择性，尽管对非修饰肽段也有一定的响应，而且该抗血清的最佳稀释比例为～1∶900。
表1.利用ELISA方法考察抗血清的有效性
表中说明：第1列为抗血清的稀释比例，其中BLANK为该新西兰白兔的免疫前血清，作为对照组；第2～4列均以修饰肽段为抗原包被酶标板，其中第2列表示将抗血清按特定的比例稀释后进行免疫反应，第3列表示将修饰肽段与特定稀释比例的抗血清预先反应后，再将其加入酶标板中进行免疫反应，第4列表示将非修饰肽段与特定稀释比例的抗血清预先反应后，再将其加入酶标板中进行免疫反应；第5列，以非修饰肽段为抗原包被酶标板后用抗血清进行免疫反应。所采用的修饰肽段和非修饰肽段浓度均为100μg/ml。
实施例4利用抗血清进行dot blot实验鉴定抗血清的检测灵敏度
以不同浓度的修饰肽段Cys-Acp-Cys(Pal)(0，0.625，1.25，2.5，5，10fmol/μl)为样品(上样量均为1μl)，将实施例2中获得的抗血清以1∶1000稀释后，采用本领域公知的dotblot方法进行检测；结果表明，该抗血清对修饰肽段Cys-Acp-Cys(Pal)具有很强的免疫信号，相同条件下，几乎检测不到非修饰肽段的信号；而且，该抗血清对极低浓度的修饰肽段(如0.625fmol)仍具有很好的响应信号，说明该抗血清对棕榈酰化修饰肽段具有很好的检测特异性和灵敏度。
实施例5利用抗血清检测具有不同转移潜能的肝癌细胞97L和LM3中棕榈酰化修饰蛋白质
为进一步考察实施例2中获得的抗血清的效果，本实施例中采用本领域公知的western blot方法对肝癌细胞系97L和LM3中棕榈酰化修饰蛋白质进行了检测，同时比较实施例2中获得的抗血清和现有技术中以Cys-Cys(Pal)为半抗原制得的抗血清的检测效果。
抗血清使用前的预处理方法：
(1)以Cys-Cys(Pal)为半抗原制得的抗血清：收集后的抗血清需采用硫酸铵沉淀法预处理，即：抗血清在20000×g，4℃条件下离心30min，收集上清；取400μl上清与等体积生理盐水混合后，于搅拌条件下缓慢滴加400μl饱和硫酸铵，4℃沉淀过夜使蛋白充分沉淀；在20000×g，4℃条件下离心10min，弃上清；用240μl生理盐水溶解蛋白质沉淀，滴加160μl饱和硫酸铵，4℃条件下沉淀1hr；在20000×g，4℃条件下离心10min，弃去上清；加入240μl生理盐水溶解沉淀，并超滤除去过量的盐，收集为100μl溶液，备用；以1∶20稀释后使用。
(2)实施例2中获得的抗血清：以1∶1000稀释后直接使用，
细胞样品中棕榈酰化修饰水平的具体分析步骤包括：
1)按本领域公知的方法培养肝癌细胞系97L和LM3；
2)细胞蛋白质提取：收集97L和LM3细胞，分别加入裂解液(25mM HEPES，25mMNaCl，1mM EDTA，1×protease inhibitor cocktail(EDTA Free，Roche Diagnostics)和1×PMSF，pH 7.4)，4℃超声裂解进行蛋白质提取，所得的蛋白裂解产物于4℃20,000×g离心30min后，取上清利用紫外可见分光光度法按照本领域公知的BCA法进行蛋白质定量；
3)免疫印迹实验：取100μg上述蛋白质样品，加入终浓度为20mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP)还原打开蛋白质中的二硫键，并加入终浓度为50mM的N-乙基马来酰亚胺(NEM)避光反应，封闭蛋白质中的自由巯基；进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，按本领域公知的方法在Bio-Rad电转移***上将凝胶中的蛋白质条带转移到PVDF膜上(Millipore公司)，将膜置于含5％脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜。分别加入上述两种预处理好的泛抗血清震荡4℃孵育过夜，用TBS-T洗膜后，加入1∶8000稀释的羊抗兔二抗(Thermo Scientific)，室温震荡孵育1小时，再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液(Thermo Scientific)，用ImageQuant ECL仪器(GE公司)捕获显色图像。如图2所示，具有不同转移潜能的细胞系97L和LM3，其棕榈酰化修饰水平具有明显的差异，97L中蛋白质的修饰水平明显高于LM3细胞；对于同一细胞样品，利用两种抗血清进行免疫反应后得到的pattern相似，但由于抗原不同，两种抗血清检测所得到的免疫信号存在一定的特异性；且利用实施例2中获得的抗血清所产生的条带多于以Cys-Cys(Pal)为半抗原制得的抗血清，结果显示，本发明制得的抗血清对棕榈酰化修饰具有更好的检测效果，更低的检测灵敏度和更高的稀释比例。
实施例6利用抗血清定量分析肝癌细胞系97L和LM3中蛋白质Lamin A的棕榈酰化修饰水平
(1)按实施例5进行97L和LM3细胞培养，按本领域公知的免疫共沉淀方法，以抗Lamin A的单克隆抗体从等量97L和LM3细胞中免疫纯化Lamin A蛋白；将纯化得到的LaminA蛋白样品采用实施例5所述的方法进行凝胶电泳分离、转膜后，利用实施例2中获得的泛抗血清western blot检测Lamin A的棕榈酰化修饰水平；
如图3示，对于相同上样量的Lamin A蛋白，利用该抗血清孵育后，在97L细胞中Lamin A具有明显的免疫信号，说明Lamin A发生了棕榈酰化修饰，而LM3细胞蛋白中几乎检测不到它的免疫信号，说明在不同转移潜能的细胞中Lamin A的棕榈酰化修饰水平是不同的，且该抗血清能用于定量检测分析蛋白质的棕榈酰化修饰水平；
(2)采用现有ABE法对Lamin A蛋白的棕榈酰化修饰状态进行了验证：
将实施例5(2)中得到的97L和LM3细胞蛋白质按实施例5(3)所示方法进行还原烷基化处理后，采用甲醇-氯仿沉淀蛋白质样品除去其中过量的TCEP和NEM后，用含1％SDS的50mM Tris-HCl(pH 7.4)重溶后，取等量的97L和LM3蛋白质样品进行后续处理；分别将上述蛋白质样品分成两份，一份不加羟胺处理(目的是检测97L和LM3中Lamin A的蛋白表达水平)；另一份加入pH 7.4的羟胺溶液室温处理2～3hr，用商品化的固相载体材料ThiopropylSepharose 6B(TS-6B)按产品说明书操作进行选择性富集(目的是检测97L和LM3中发生了棕榈酰化修饰的Lamin A蛋白水平)；加入终浓度10mM二硫苏糖醇溶液将目标蛋白质从TS-6B材料上解离，然后进行SDS-PAGE分离，以抗Lamin A的单克隆抗体孵育进行western blot分析；由于棕榈酰化修饰是棕榈酸通过巯酯键修饰到蛋白质半胱氨酸残基上的，而巯酯键不稳定，在中性羟胺溶液中会被水解，在修饰位点处产生自由巯基，从而可以利用能与巯基特异反应的固相载体材料如TS-6B对它实现选择性富集；如图4示，Lamin A蛋白经羟胺水解后能被TS-6B富集，说明Lamin A中存在对羟胺敏感的巯酯键，即可能发生了棕榈酰化修饰，而且在97L细胞中能富集到的Lamin A蛋白更多，说明97L细胞中Lamin A的棕榈酰化修饰水平比LM3高。这与实施例6(1)中得到的结果是一致的；
(3)取100μg的97L细胞全蛋白样品，加入终浓度为20mM TCEP溶液于56℃振荡反应1hr以打开蛋白质中的二硫键；加入终浓度为50mM NEM避光反应1hr封闭自由巯基；采用甲醇-氯仿沉淀蛋白质样品除去其中过量的TCEP和NEM后，用含1％SDS的50mM Tris-HCl(pH7.4)重溶后，向蛋白质样品中加入pH 7.4的羟胺溶液室温处理2～3hr，用商品化的固相载体材料TS-6B按产品说明书操作进行选择性富集；加入终浓度10mM二硫苏糖醇溶液将目标蛋白质从TS-6B材料上解离后，加入终浓度为100mM碘乙酰胺溶液室温、避光条件下反应45min进行烷基化反应；按1∶50(酶∶蛋白质)加入测序级胰蛋白酶(Promega)，按本领域公知的蛋白质酶解方法于37℃酶解过夜后，按本领域公知的C18柱除盐、真空冻干浓缩，用0.1％FA水溶液重悬，取15μl肽段混合物进行LC-MS分离分析，采用Acclaim PepMap C18柱，75μm×50cm(Thermo Scientific公司)进行色谱分离，色谱梯度：B相(ACN-0.1％FA)在120min梯度中从2％线性上升到45％，流速为300nL/min；采用Q Exactive质谱仪(ThermoScientific公司)进行质谱分析，质谱分析的结果表明，Lamin A蛋白的肽段AQNTWGCGNSLR中的半胱氨酸残基发生了棕榈酰化修饰，如图5示，与实施例6(1)得到的结论一致。

Claims (4)

1.一种基于特异抗血清的棕榈酰化修饰蛋白质的检测方法，其特征在于，利用特异识别棕榈酰化修饰泛抗血清检测蛋白质的棕榈酰化修饰状态，其包括步骤：
(1)以棕榈酰化修饰的短肽(Cys-Acp-Cys(Pal))作为半抗原，将其与载体蛋白质KLH偶联免疫实验动物，获得抗棕榈酰化修饰的泛抗血清；所述的Cys-Acp-Cys(Pal)中：Acp为氨基己酸，Pal为棕榈酰化修饰；
(2)免疫后收集抗血清，并用ELISA技术检测抗血清的效价；
(3)用收集的抗血清按不同的稀释比例对不同浓度的半抗原短肽进行免疫化学检测，考察抗血清的检测灵敏度和稀释比例；
(4)用收集的抗血清免疫化学检测不同的细胞中的蛋白质棕榈酰化修饰状态及其水平的变化；
(5)结合高分辨的质谱方法，对western blot检测结果阳性的蛋白质Lamin A进行鉴定分析，评价方法的可行性。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，将棕榈酸通过硫酯键共价修饰到半胱氨酸的巯基上，与载体蛋白质KLH偶联后免疫实验动物；通过连接臂氨基己酸的引入，使抗原表位更突出，从而提高免疫效果。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的抗血清为第6次免疫后收集。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的细胞是具有不同转移潜能的细胞97L和LM3。
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