本发明的实施方式
以下具体说明本发明。
本发明中所说的糖醛酸、糖醛酸衍生物、含糖醛酸的糖化合物、含糖醛酸衍生物的糖化合物、含有含糖醛酸的糖化合物的物质或者含有含糖醛酸衍生物的糖化合物的物质,其热处理产物具有抗癌作用和细胞凋亡作用等,而对所说的热处理产物中生成的抗癌活性物质和/或细胞凋亡诱导性物质并没有特别限制。
糖醛酸也叫葡糖醛酸,其通称是羟基醛酸,其中保留醛糖的醛基而另一端仅有伯醇基被氧化成羧基,以动植物的各种多糖的构成成分形式存在于自然界中。作为含有糖醛酸的多糖,已知有果胶、果胶酸、藻酸、透明质酸、肝素、岩藻依聚糖、硫酸软骨素、硫酸皮肤素等,具有各种生理功能。
可以在本发明中使用的糖醛酸没有特别限制,例如有半乳糖醛酸、葡糖醛酸、古洛糖醛酸(guluronic acid)、甘露糖醛酸、艾杜糖醛酸等,而糖醛酸的衍生物有糖醛酸的内酯、酯、酰胺、盐等;经热处理生成的抗癌活性物质和/或细胞凋亡诱导活性物质都包括在本发明的衍生物内。所说的糖醛酸内酯,可以举出的实例有葡糖醛酸-6,3-内酯(以下简记作葡糖醛酸内酯)、甘露糖醛酸-6,3-内酯、艾杜糖醛酸-6,3-内酯等。所说的糖醛酸酯有例如甲酯、乙酯、丙二醇酯、羧甲基酯等,可以用糖醛酸制造。而且这些盐可以利用惯常方法制造。
此外,本发明说明书中所说的含有糖醛酸、糖醛酸衍生物的糖化合物,是指含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖化合物,关于这些化合物并没有特别限制,例如可以使用果胶、果胶酸、藻酸、透明质酸、肝素、岩藻依聚糖、硫酸软骨素、软骨素、硫酸皮肤素,其化学、酶催和物理处理产物,其分解产物,分解产物的衍生物,以及分解产物的盐。
作为上述的化学处理方法,例如将原料糖化合物在室温至200℃下处理数秒钟~数小时,优选在50~130℃下处理数秒种~60分钟;对于果胶来说,通过例如在pH6.8和95℃下处理数分钟~几十分钟产生β-脱离反应,得到一种在235 nm波长附近光密度增大的含有不饱和糖醛酸和/或不饱和糖醛酸酯的糖化合物。本发明的化合物中包含在非还原端含有不饱和糖醛酸和/或不饱和糖醛酸酯的糖化合物,这种糖化合物是通过含有糖醛酸和/或糖醛酸酯的多糖产生β-脱离反应生成的。
所说的酶催处理方法,可以举出利用含有原料糖化合物的糖醛酸和/或糖醛酸酯等多糖的水解酶,分解含有糖醛酸和/或糖醛酸酯等多糖的公知分解法。例如,对于果胶和果胶酸来说,经过果胶分解酶(EC4.2.2.10)、果胶酸分解酶(EC4.2.2.2)、外聚半乳糖醛酸分解酶(EC4.2.2.9)等各种已知分解酶的分解,可以得到在非还原端具有4-脱氧-L-苏-六-4-eno吡喃糖基酯(4-dexo-L-threo-fex-4-enopyranosyl uronate)或其甲酯的糖化合物。这些在非还原端具有4-脱氧-L-苏-六-4-eno吡喃糖基酯或其甲酯的酶分解产物也包括在本发明的糖化合物之中。
所说的物理处理方法可以举出例如使用近红外线、红外线、微波、超声波等处理原料糖化合物;例如将果胶和/或果胶酸置于pH中性或碱性溶液中,在高于室温的适当温度下和适当的还原条件(例如在抗坏血酸存在下)下,用超声波处理1秒钟以上,优选处理5秒~1小时,以此方式给予振动能量。除使用超声波之外,使用微波、近红外线、红外线等照射也是有效的,而且也可以将这些射线组合使用。所说的照射既可以连续式进行,也可以断续进行。
本发明中所说的含有这些糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖化合物,既可以直接使用例如水果、果皮、水果榨汁、蔬菜、蔬菜榨汁、海藻等,也可以将其干燥、粉碎之后使用,此外还可以使用从含有这些糖醛酸和/或糖醛酸衍生物糖化合物的物质中得到的含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物糖化合物的提取液以及提取液的精制物等。关于这些含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖化合物提取液的制备方法,以及提取液的精制方法,可以按照公知方法进行,而且没有特别限制。
作为含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖化合物的物质,例如可以举出下列生物:密桔、柠檬等柑桔类,香蕉、白菜、甘蓝、莴苣、紫苏、南瓜、芹菜、牛蒡、青葱、花椰菜、青菜椒、菠菜、胡萝卜、胡萝卜叶、萝卜叶、茶叶、芝麻、豆类、薯类等双子叶植物的果实、蔬菜、叶、种子等,小麦、水稻等单子叶植物的谷物,褐藻类(例如海带、裙带菜等)、红藻类、绿藻类、单细胞绿藻类等藻类,担子菌纲(例如Lyo phyllumulmarium、荷叶离褶伞、光帽鳞伞、Cortinellus shiitake、Flammulinaverutipes、Agaricus ostreatus、Pasalliota campestris等)、子囊菌纲(蛹虫草菌和其他冬虫夏草菌株)、酵母菌、丝状菌(曲酶菌株)和细菌(例如纳豆芽孢杆菌和乳酸菌)等微生物,脊椎动物和无脊椎动物等动物;而且可以使用来源于这些植物、微生物或动物的含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖化合物的物质。
含有糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖化合物的糖类,可以利用公知的化学、酶催学、物理学处理方法制造。例如,可以使用从柑桔的果皮和苹果中提取出来的高分子多糖类作为果胶。制造果胶的工业原料是水果,除了可以使用柠檬、酸橙等柑桔类果汁的榨渣(主要是果皮)之外,还可以使用苹果果汁的榨渣。在果汁的榨渣中主要含有不溶性原果胶,在制造过程中被可溶化(提取)制成果胶。所说的可溶化过程可以利用酸性温水或热水提取的方式进行,通过将提取时的温度、pH和时间等条件控制得适于所使用的原料可以在高产率下制造分子量和酯化度一定的果胶。提取液用离心分离过滤的方法精制,浓缩后加入乙醇,可以沉淀回收果胶。所回收的沉淀经过干燥和粉碎,可以制成具有预定干燥程度的果胶。
果胶的主要结构是被部分甲基化的半乳糖醛酸聚合物。羧基可以被甲基酯化、依然处于游离酸形式、或者被盐化成胺盐、钾盐或钠盐。按照果胶的甲基酯化度(DM度:甲氧基在全部羧基中所占的比例),可以将果胶分成DM度高的HM果胶和DM度低的LM果胶(古积智司等编,光琳株式会社发行,《开发新食品用材料便览》,114~119页,1991年),本发明中可以使用市售的食品添加剂果胶(外山章夫编,食品与科学株式会社发行,《(天然物便览》,第12版,第138页,1993年)、市售的HM果胶和LM果胶等(参见上述《开发新食品用材料便览》)。
包含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖化合物的分解物,可以采用公知的化学方法、酶催学方法、物理学方法制造。而且以合成法合成的糖醛酸、糖醛酸衍生物、低聚糖也包含在本发明之中。
本发明中使用的热处理产物,可以用从(a)糖醛酸或糖醛酸衍生物,(b)含糖醛酸的糖化合物或含糖醛酸衍生物的糖化合物,和(c)含糖醛酸的糖化合物的含有物质或含糖醛酸衍生物的糖化合物的含有物质中选出的物质为原料制造。
本发明中制造热处理产物用的热处理方法,例如可以将糖醛酸、糖醛酸衍生物、含糖醛酸的糖化合物、含糖醛酸衍生物的糖化合物、含糖醛酸的糖化合物的含有物质和/或含糖醛酸衍生物的糖化合物的含有物质在60~350℃热处理数秒~数日,优选在80~150℃热处理数分~数日,对于果胶来说例如可以在80~150℃热处理数分~数日,这样能够得到具有抗癌作用之细胞凋亡诱导性等生理活性的热处理产物。而且糖醛酸、糖醛酸内酯、糖醛酸酯经过60~150℃下数分~数日热处理可以得到目的热处理产物。
热处理时的pH虽然没有特别限制,但是优选在中性至酸性的条件下进行,可以根据原料选择热处理时的pH,而且通常利用酸性条件下的热处理,可以加速抗癌活性物质、细胞凋亡诱导活性物质等生理活性物质的生成。
热处理时的原料浓度,只要处于通过对其热处理能够生成抗癌活性物质、细胞凋亡诱导活性物质等生理活性物质的范围内,就没有特别限制,可以参考操作性和收率等设定。
本发明中所说的热处理,既可以采用湿法加热,也可以采用干法加热。所说的湿法加热,可以采用水蒸汽加热、水蒸汽加压加热、加压式加热等湿式加热法。所说的干法加热,可以采用干燥热风直接加热法、利用隔壁得到的热源热量加热的间接加热法等。所说的直接加热法有干式气流加热法和干式喷雾加热法等,而所说的间接加热法可以采用干式转鼓加热法。此外本发明加热处理产物的原料,可以利用通常的煮、烤、烧、炒、煎、蒸、炸等方法中任何加热方法进行处理。
本发明的热处理产物,可以分为含有用上述加热方法得到的热处理产物的,和含有所说的热处理产物中的生理活性物质两种。
本发明的热处理产物中可以形成多数具有细胞凋亡诱导作用、抗癌作用、抗菌作用、抗病毒作用等的物质,而且在本发明的热处理产物中还可以形成具有抗氧化作用的还原酮。根据所需的目的,通过改变热处理条件,可以制备含有所需物质的本发明的热处理产物。本发明的热处理产物,可以以其生理活性作为指标进行分级,例如利用硅胶过滤法、分子量分级膜分级法等公知方法进行热处理产物的分子量分级,通过制备各分子量级分可以制备本发明具有高活性的热处理产物。此外,利用溶剂萃取法、蒸馏法、采用离子交换树脂等的各种色谱法等可以制备所需的级分。
硅胶过滤法的实例:使用Cellulofine GCL-300可以制备分子量>25000,25000≥分子量≥10000,10000≥分子量≥5000和分子量小于等于5000等其下任意分子量的级分;而使用Cellulofine GCL-25可以制备例如分子量从5000至其下任何分子量的级分,例如5000≥分子量≥3000,3000≥分子量≥2000,2000≥分子量≥1000,1000≥分子量≥500和500≥分子量等任意分子量的级分。
此外,使用超滤膜可以进行工业规模的分子量分级,例如使用Daicel株式会社制造的FE10-FUS0382可以制造分子量≤30000的级分,而使用同一公司的FE-FUS-T653可以制造分子量≤6000的级分。此外使用毫微米过滤膜可以得到分子量≤500的级分;通过将这些硅胶过滤法、分子量分级法加以组合,可以制备任何分子量的级分。
本发明的热处理产物,分子量分级至30000以下的级分具有很强的抗癌活性和细胞凋亡诱导活性,特别是分子量分级至10000以下的级分,尤其是分子量500以下的级分,具有很强的抗癌活性、细胞凋亡诱导活性和抗菌活性等,因此根据需要可以将本发明的热处理产物的分子量分级产物,作为本发明热处理产物的有效成分。
本发明的热处理产物具有抑制癌细胞增殖的活性。本发明热处理产物抑制癌细胞增殖作用的机理虽然对本发明没有任何限制作用,但是例如对于癌细胞的细胞凋亡诱导作用也包含在本发明之中。
本发明的热处理产物对于癌细胞,例如对于人体前髓白血病细胞HL-60、人体急性成淋巴细胞的白血病细胞MOLT-3、肺癌细胞A-549、SV40变异肺细胞WI-38VA13、肝癌细胞Hep G2、结肠癌细胞HCT116、人体结肠癌细胞SW480、人体结肠癌细胞WiDr、胃癌细胞AGS、骨髓癌细胞等癌细胞的增殖具有抑制作用,而且具有细胞凋亡诱导活性;本发明热处理产物中的抗癌活性物质量可以用活性单位表示。
本发明说明书中所说的抗癌活性单位,是指以本发明的热处理产物为样品,使用其稀释液0.5毫升,加入到4.5毫升含有2.5×105个人体前髓白血病细胞HL-60细胞(ATCC CCL-240)的并含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液中,在37℃和5%二氧化碳气存在下培养24小时后,测定活细胞数目,将相当于1毫升培养液(其中细胞成活率为对照数值50%)的抗癌活性定义为一个单位,经计算当与1毫升培养液相当的抗癌活性时,1毫升试样具有10单位的抗癌活性。
其中,细胞成活率R(%)按下式计算:
R=Vs/(Vs+Ds)×100+Dc/(Vc+Dc)×100式中,Vs和Ds分别是添加试样时的活细胞数目和死细胞数目;Vc和Dc分别表示加入水时的活细胞数目和死细胞数目。
本发明的热处理产物来源于天然食物,无毒,既可以经口给以,也可以不经口给以。
对本发明的食品或饮料并没有特别限制,可以举出例如使用谷类、薯类和淀粉类、甜味料类、油脂类、种子类、豆类、鱼虾类、兽鸟鲸鱼肉类、蛋类、奶类、蔬菜类、果实类、蘑菇类、藻类等原料制造的点心类、罐头类、面类、饮料类(无酒饮料、含酒饮料)、调味品、酿造品(味精、酱油、食醋)、酒类及香辛料类等农产加工品、林产加工品、畜产加工品、水产加工品等。
关于本发明食品、饮料的制造方法没有特别限制,可以举出采用例如烹调、加工和一般使用的食品和饮料制造方法制造,在所制造的饰品或饮料之中可以含有本发明的热处理产物。
在烹调和加工中可以含有烹调、加工后具有抗癌作用和细胞凋亡诱导性等的本发明的热处理产物。
也就是说,既可以在烹调·加工前、烹调·加工时以及烹调·加工后添加具有抗癌作用、细胞凋亡诱导性等的本发明热处理产物,也可以向具有抗癌作用、细胞凋亡诱导性等的本发明热处理产物中添加烹调和加工品及其材料,来稀释所说的热处理产物。
其次,在制造本发明的食品或饮料时可以在任何工序进行热处理,使之含有具有抗癌作用和细胞凋亡诱导性等的本发明热处理产物,或者向其中加入具有抗癌作用和细胞凋亡诱导性等的本发明热处理产物,或者向具有抗癌作用和细胞凋亡诱导性等的本发明热处理产物中加入食品、饮料或其原料以便稀释所说的热处理产物。因而能够简便地制造出具有抗癌作用和细胞凋亡诱导活性的新型食品或饮料。此外,本发明中还包括这样一些食品或饮料,其中含有糖醛酸、糖醛酸内酯、糖醛酸酯、含糖醛酸和/或糖醛酸酯的糖化合物或含有糖化合物的物质,并且以具有制造时产生的抗癌作用和细胞凋亡诱导性等的所说的热处理产物为构成成分。含有经过任何工序制造的,具有抗癌作用和细胞凋亡诱导性等的本发明热处理产物的食品或饮料,添加有本发明热处理产物和/或稀释本发明热处理产物而成的食品或饮料,定义为本发明的食品或饮料。
对于具有抗癌作用、细胞凋亡诱导性和抗菌能力的本发明热处理产物,在食品中的含量没有特别限制,应当根据其功能和生理活性适当选择,热处理产物的含量,相对于100份食品来说如果按热处理产物的固形物计应当在,例如0.001份以上,从食品的功能、抗癌作用、细胞凋亡诱导作用和抗菌能力等生理活性观点及成本的角度出发,优选0.005~10份,更优选0.01~1份。
对于具有抗癌作用、细胞凋亡诱导性和抗菌能力的本发明热处理产物,在饮料中的含量没有特别限制,应当根据其功能和生理活性适当选择,热处理产物的含量,相对于100份饮料来说如果按热处理产物的固形物计应当在,例如0.001份以上,从饮料的味道、抗癌作用、细胞凋亡诱导作用和抗菌能力等生理活性观点及成本的角度出发,优选0.005~10份,更优选0.01~1份。
本发明热处理产物在具有抗癌作用的本发明食品中的含量,应当从抗癌活性的观点适当选择,每100克食品中应当具有0.1单位以上,优选10单位以上,更优选100单位以上的抗癌活性。
关于本发明热处理产物在具有抗癌作用的本发明饮料中的含量没有特别限制,应当从抗癌活性的观点适当选择,每100克食品中应当具有0.1单位以上,优选10单位以上,更优选100单位以上的抗癌活性。
本发明的食品或饮料含有、添加和/或由具有本发明的抗癌作用、细胞凋亡诱导性和抗菌能力的本发明的热处理产物而成,关于其形状没有特别限制,其中包括片状、颗粒状、胶囊、凝胶状、溶胶状等可以经口摄取的各种形状。
本发明的食品或饮料含有大量具有生理活性的本发明热处理产物,由于所说的的热处理产物具有各种生理活性、抗菌能力、细胞凋亡诱导作用、抗癌作用、抗真菌作用、抗溃疡作用、血管新生抑制作用、肝机能改善作用、食物纤维功能、铁·重金属等不需要金属的除去作用等,通过摄取这些产物具有预防癌症产生和抑制癌症的效果、抗溃疡效果、肝功能改善效果、便秘预防效果、流感病毒感冒预防效果和阿尔茨海默氏病预防效果,是一种健康食品或饮料,尤其是有利于保持肠胃健康的食品或饮料。而且因其抗菌能力而是一种储存性能极好的食品或饮料。
本发明的热处理产物可以用作提高食品或饮料储存性能的防腐剂。而且将本发明的热处理产物加入到食品或饮料之中,可以作为食品或饮料的防腐方法使用。
具有抗菌性的本发明热处理产物因为是加热处理糖醛酸、糖醛酸内酯、糖醛酸酯、含有糖醛酸的糖化合物和/或含有糖醛酸酯的糖化合物得到的,所以容易制备,将这种含有来源于天然食品的本发明热处理产物的抗菌剂用于食品或饮料之中具有极为优良的安全性。
向食品或饮料中添加含有本发明热处理产物的的抗菌剂,其形状可以是液体、糊状、粉末状、片状、颗粒状等。便于处理,而且与其他添加剂混合使用时优选干燥粉末状、片状和颗粒状。所说的干燥方法,可以采用通常的干燥方法,例如喷雾干燥法、转鼓干燥法、棚式干燥法、真空干燥法、冷冻干燥法等。
本发明的抗菌剂和防腐剂也可以采用本领域公知的任何方法制造;制造时,可以适当添加制剂上允许的公知添加剂,例如赋形剂、稳定剂、崩解剂、粘合剂和溶解助剂等。而且也可以与乙醇、甘氨酸、醋酸钠、抗坏血酸、脂肪酸甘油酯、食盐、EDTA等其他抗菌性物质组合使用。
本发明的热处理产物在食品或饮料中的添加量,依食品或饮料的种类而异,可以根据其使用目的确定添加量。
本发明抗菌剂的一种使用方法,是按照适当方法将所说的抗菌剂加入到食品或饮料之中。关于所说的添加方法并没有特别限制,无论哪种方法,只要能够使本发明的热处理产物包含在食品或饮料之中的都可以使用。因此,使用本发明的抗菌剂时所说的术语“添加”是指,能够将本发明的热处理产物包含在食品或饮料之中的任何方法。虽然通常方法是在食品或饮料制造过程中加入所说的产物,但是也可以采用将食品在含有本发明的热处理产物溶液中浸渍一定时间的方法。而且也可以采用在食品中添加的方法与浸渍方法并用的方法。适于采用浸渍方法的食品,在水中不损害其形状的食品,例如可以举出鱼或家畜的肉末(例如煮熟的鱼肉末和维也纳香肠)、面条(例如煮熟的面条)、冷冻前的鱼贝、虾等冷冻食品。
使用本发明的抗菌剂作为防腐剂可以提高食品或饮料的储存性能。而且对于冷冻食品和冷冻甜点心来说,在冷冻之前的加工工序中可以抑制微生物繁殖,在卫生上可以得到极好的的结果。本发明的抗菌剂对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有杀菌效果,例如对于二甲氧苯青霉素耐药性金黄色酿脓葡萄球菌等耐药性细菌、沙门氏菌等造成食品中毒的细菌、产生肠毒素的金黄色酿脓葡萄球菌、呕吐型蜡样芽孢杆菌、腹泄型蜡样芽孢杆菌和肠出血型大肠杆菌O-157都是很有效的。而且对于酵母和病毒等微生物也是有效的。尤其是含有本发明热处理产物的防腐剂作为杀菌剂是预防食物中毒的良好的天然预防剂。使用本发明的杀菌剂可以对衣服和敷料等进行杀菌。利用散布本发明的杀菌剂后将其擦去等方法,可以对目的物进行除菌和杀菌。
本发明的杀菌剂对于牙齿携带菌和牙周病菌也具有杀菌活性,可以提供含有本发明杀菌剂的口内用剂。口内用剂的形状可以制成液态、糊状等公知形状。作为口内用剂可以举出洁齿剂(例如牙膏、牙粉等)。所说的洁齿剂既可以制成液态,也可以制成糊状或粉末状等公知的洁齿剂形状。关于本发明的热处理产物在洁齿剂中的含量并没有特别限制,其浓度应当能够有效地杀死牙齿细菌和牙周病菌。在洁齿剂中可以添加公知的添加剂,例如湿润剂、表面活性剂、粘合剂、香料、甜味剂等。作为本发明洁齿剂的有效成分,如上所述也可以使用含有糖醛酸,糖醛酸酯的糖化合物的物质,例如含有果胶的物质,例如蔬菜、水果等的热处理产物,其中包含含果胶蔬菜的热处理产物的口内用剂,例如洁齿剂也包括在本发明之中。
本发明的细胞凋亡诱导剂具有细胞凋亡诱导性。以本发明的热处理产物为有效成分,可以将其与公知的药用载体组合成制剂。一般而言,将本发明的热处理产物与药学上适用的液体或固体载体混合,必要时,加入溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等,可以将其制成锭剂、颗粒剂、散剂、粉剂、胶囊等固体剂型,以及通常的酊剂、悬浮剂、乳剂等液体剂型。而且在使用之前,利用加入适当载体的方法可以得到能成为液状的干燥品。
本发明的细胞凋亡诱导剂可以以口服剂,以及注射剂、点滴用剂等非经口投药的剂型给以。
所说的药用载体,可以按照上述给以方式和剂型适当选择,口服给以的情况下,可以使用例如淀粉、乳糖、白糖、甘露糖醇、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。而且配制口服剂时,还可以加入粘合剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、流动促进剂、调味剂、着色剂、香料等。
此外,对于非口服剂型而言,按照惯常方法制备,即将作为本发明有效成分的、具有细胞凋亡诱导活性的热处理产物,溶解或悬浮在作为稀释剂的注射用蒸馏水、生理食盐水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、香油、花生油、豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等之中,必要时加入杀菌剂、稳定剂、等张剂、止痛剂等。
本发明的细胞凋亡诱导剂可以根据制剂形态经适当给以途径给以。所说的给以方法没有特别限制,可以内用、外用和注射等。注射剂例如可以静脉、肌肉、皮下、皮内给以,而栓剂也包括在外用剂之中。
本发明细胞凋亡诱导剂的给以量,可以根据制剂形态、给以方法、使用目的以及用药患者的年龄、体重和症状适当确定,其用量虽然不定,但是制剂中所含本发明热处理产物的数量,对于成人而言一般为每天20~2000毫克/公斤体重。所说的给以量当然依各种条件而变,既有比上述给以量少的许多使用场合,也有必须超过所说范围的使用场合。本发明的药剂除了直接经口给以之外,也可以将其加入到任何饮食品中日常摄取。
以具有抗癌作用的本发明热处理产物为有效成分,将其与公知的药用载体组合成制剂,可以制造抗癌剂。抗癌剂的制造按上述方法进行。一般而言,将本发明的热处理产物与药学上适用的液体或固体载体混合,必要时加入溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等,可以将其制成锭剂、颗粒剂、散剂、粉剂、胶囊等固体剂型,以及通常的酊剂、悬浮剂、乳剂等液体剂型。而且在使用之前,利用加入适当载体的方法可以得到非液态干燥品。
作为抗癌剂,以口服剂,以及以注射剂、点滴用剂等非经口投药等任何剂型给以。
所说的药用载体,可以根据上述给以方式和剂型选择,可以比照上述细胞凋亡诱导剂的情况使用。
作为抗癌剂可以根据制剂形态经适当给以途径给以。关于给以方法没有特别限制,可以内用、外用和注射。注射剂例如可以静脉、肌肉、皮下、皮内给以,而栓剂也包括在外用剂之中。
本发明抗癌剂的给以量,可以根据制剂形态、给以方法、使用目的以及用药患者的年龄、体重和症状适当确定,其用量虽然不定,但是制剂中所含本发明热处理产物的数量,对于成人而言一般为每天20~2000毫克/公斤体重。所说的给以量当然依各种条件而变,所以既有比上述给以量少的许多使用场合,也有必须超过所说范围的使用场合。本发明的药剂除了直接经口给以之外,也可以将其加入到任何饮食品中日常摄取。
本发明的热处理产物具有抗癌作用,而且在低浓度下具有能够分化诱导癌细胞的能力,因而也可以将本发明的热处理产物用作癌细胞的分化诱导剂(脱癌剂)。以本发明热处理产物为有效成分的细胞分化诱导剂可以按照上述抗癌剂制成制剂,并可以按照上述抗癌剂的方法给以。
细胞分化诱导剂的给以量,可以根据该制剂的形态、给以方法、使用目的以及用药患者的年龄、体重和症状适当确定,其用量虽然不定,但是制剂中所含本发明热处理产物的数量,对于成人而言一般为每天0.2~500毫克/公斤体重。所说的给以量当然依各种条件而变,所以既有比上述给以量少的许多使用场合,也有必须超过所说范围的使用场合。本发明的药剂除了直接经口给以之外,也可以将其加入到任何饮食品中日常摄取。
本发明的热处理产物具有抗病毒作用和肝功能改善作用,可以按照上述抗癌剂的制剂方法和给以方法,将以本发明热处理产物为有效成分的抗病毒剂和肝功能改善剂制成制剂和给以。
抗病毒剂和肝功能改善剂的给以量,可以根据该制剂的形态、给以方法、使用目的以及用药患者的年龄、体重和症状适当确定,其用量虽然不定,但是制剂中所含本发明热处理产物的数量,对于成人而言一般为每天0.2~2000毫克/公斤体重。所说的给以量当然依各种条件而变,所以既有比上述给以量少的许多使用场合,也有必须超过所说范围的使用场合。本发明的药剂除了直接经口给以之外,也可以将其加入到任何饮食品中日常摄取,通过摄取含有本发明热处理产物的含有物可以预防和治疗流感病毒性感冒等病毒性疾病,而且还能够改善肝功能障碍,使GOT、GPT值正常化。
本发明的热处理产物具有70-kdaldons等热休克蛋白(heat shockprotein)诱导活性,而且对于肝炎病毒、爱滋病毒、流感病毒、疱疹病毒等RNA病毒和DNA病毒具有抗病毒作用。此外还有抗炎症等的生物体防御作用。
以具有抗溃疡作用的本发明热处理产物为有效成分,将其与公知的药用载体组合制剂,可以制造抗溃疡剂。抗溃疡剂的制造可以按照上述方法进行。一般而言,将本发明的热处理产物与药学上适用的液态或固态载体混合,必要时加入溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等,可以将其制成锭剂、颗粒剂、散剂、粉剂、胶囊等固体剂型,以及通常的酊剂、悬浮剂、乳剂等液体剂型。而且在使用之前,通过加入适当载体可以得到非液态干燥品。
作为抗溃疡剂,以口服剂,以及以注射剂、点滴用剂等任何非经口投药剂型给以。
药用载体可以根据上述给以方式和剂型选择,也可以按照上述细胞凋亡诱导剂的方式使用。
所说的抗溃疡剂可以根据制剂形态以适当给以途径给以。关于给以方法没有特别限制,可以内用、外用和注射。所说的注射剂例如可以静脉内、肌肉内、皮下和皮内给以,栓剂等也包括在外用剂之中。
抗溃疡剂的给以量,可以根据该制剂的形态、给以方法、使用目的以及用药患者的年龄、体重和症状适当确定,其用量虽然不定,但是制剂中所含本发明热处理产物的数量,对于成人而言一般为每天20~2000毫克/公斤体重。所说的给以量当然依各种条件而变,所以既有比上述给以量少的许多使用场合,也有必须超过所说范围的使用场合。本发明的药剂除了直接经口给以之外,也可以将其加入到任何饮食品中日常摄取。
本发明提供一种具有抗癌作用、细胞凋亡诱导作用,通过使癌症患者和病毒性疾病患者的病变细胞诱发抗癌作用和细胞凋亡作用,能够有效预防和治疗所说患者的食品或饮料。尤其是患有大肠癌、胃癌等消化***癌症的情况下,以本发明的热处理产物为食品、饮料,通过经口摄取能够产生癌细胞增殖的抑制作用和癌细胞的细胞凋亡作用,所以包含、添加或稀释本发明热处理产物制成的食品或饮料对于消化***癌症的治疗和预防具有优良效果。
本发明的热处理产物还具有抗病毒作用和抗菌作用,可以用作抗病毒剂、抗菌剂、洁齿剂类口内用剂、食品或饮料用防腐剂,因其抗溃疡作用所以还可以用作抗溃疡剂和溃疡预防剂。此外,利用其肝功能改善作用也可以用作肝功能改善剂。
按照本发明,可以在食品或饮料中含有大量具有生理活性的本发明热处理产物。本发明热处理产物因为具有的各种生理活性、细胞凋亡诱导作用、抗菌作用、抗癌作用、抗病毒作用、血管新生抑制作用、异常增殖细胞的抑制作用、抗溃疡作用、肝功能改善作用、食物纤维作用、铁·重金属等的除去作用等,所以本发明的食品或饮料是具有癌症预防和治疗效果、抗菌效果、抗菌剂效果、抗溃疡效果、便秘预防效果、肝功能改善效果、阿尔茨海默氏病预防效果、细胞凋亡诱导作用等维持生物体常态(体内平衡)功能的健康食品或饮料,本发明可以提供一种加入适于保持肠胃健康的功能性物质的食品或饮料。此外,通过加入本发明的热处理产物,特别是分子量处于500以下的级分,可以方便地增强食品或饮料的抗菌能力,所以本发明的热处理产物是一种极为有用的食品或饮料的防腐剂。本发明的热处理产物,特别是分子量处于10000以下的级分,其中尤其是分子量500以下的级分,具有各种生理功能,用在食品或饮料中能够简便地赋予食品或饮料以各种生理功能,例如赋予食品或饮料以抗菌性的添加剂,是极为有用的食品或饮料的防腐剂。
本发明还可以提供具有抗癌作用和细胞凋亡诱导作用,通过使癌症患者和病毒性疾病患者的病变细胞产生增殖抑制作用和细胞凋亡作用,有效的预防、治疗所说疾病的细胞凋亡诱导剂和抗癌剂。尤其对于大肠癌、胃癌等消化器官癌症来说,通过以食品或饮料形式经口摄取本发明的热处理产物,依靠抑制癌细胞增殖和诱发细胞的细胞凋亡,添加和/或稀释本发明热处理产物制成的食品或饮料具有治疗、预防消化器官癌症的优异效果。本发明还可以提供具有抗溃疡作用,能够预防、治疗溃疡患者所患溃疡病的有效抗溃疡剂。对于消化器官溃疡来说,通过以食品或饮料形式经口摄取本发明的热处理产物,能够发挥抗溃疡作用,所以添加和/或稀释本发明的热处理产物制成的食品或饮料,对于治疗和预防消化器官溃疡具有优异效果。本发明的药剂以食用水果果皮、食用海藻等为原料可以低价大量供应,因源于食品而安全性高。此外,本发明还提供一种简单的细胞凋亡诱导方法,利用本发明的方法可以查明有关细胞凋亡作用机理和开发细胞凋亡诱导阻碍剂。
实施例
以下列举实施例进一步具体说明本发明,但是本发明并不受这些实施例的丝毫限制。其中,实施例中的%是指重量%。实施例1
将500毫克苹果果胶(和光纯药株式会社制)悬浮在50毫升含有120mM NaCl的50 mM HEPES缓冲液(pH7.0)中,在高压釜中121℃下将果胶加热处理20分钟,调制成果胶加热处理溶液。
在含有10%经56℃30分钟处理的胎牛血清(ギブコ株式会社制)的RPMI1640培养基(日水株式会社制)中,于37℃下培养人体前骨髓白血病细胞HL-60(ATCC CRL-1964),培养后将其悬浮在ASF104培养基(味の素株式会社制)中,达到5×105个/9毫升。
在此悬浮液中加入1毫升果胶加热处理液,37℃和5%二氧化碳存在下培养16小时。为了对照使用已知的0.1毫升放线菌素D(Sigma公司制造)水溶液(0.1 mg/ml)作为诱导细胞凋亡作用的试剂和0.9 ml生理食盐水代替上述果胶进行了同样培养。
用光学显微镜观察培养细胞,发现在添加有果胶加热处理液和放线菌素D后得到的培养细胞中,分别出现细胞核的凝缩和细胞缩小,并形成细胞凋亡小体。而对于在添加1毫升生理食盐水的对组照中培养的细胞,没有发现这些现象。
此结果说明,果胶热处理液能够诱导对于HL-60细胞的细胞凋亡作用。实施例2
将市售的苹果果胶溶解在含有120 mM NaCl的50 mM HEPES缓冲液(pH 7.0)中,使最终浓度达到10 mg/ml,用1N氢氧化钠调节到pH7.0。将其在121℃下热处理30分钟,测定紫外吸收光谱后发现,与加热之前相比,热处理之后在235 nm附近的吸光度增大。
用1N氢氧化钠调节此试样为pH7.0,按照实施例1的方法测定细胞凋亡诱导活性。但是在以下各实施例中,使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基代替ASF104,细胞使用HL-60(ATCC CCL-240),测定各试样细胞凋亡诱导活性时用1N氢氧化钠调节pH7.0,然后测定其细胞凋亡诱导活性。向细胞悬浮液中加入二倍容积的0.4%锥虫蓝水溶液后,用光学显微镜观察,对于排出锥虫兰成为无色的活细胞和染色为蓝色的死细胞进行计数。
结果看到,果胶热处理产物对于HL-60细胞具有显著的细胞凋亡诱导活性。
将市售的柠檬果胶溶解在含有120 mM氯化钠的50 mM HEPES缓冲液(pH7.0)中,制成浓度达10 mg/ml,此时pH5.0。在121℃下对其热处理30分钟后测定紫外吸收光谱,热处理产物在235 nm附近的吸光度增大。
用1N氢氧化钠将此试样调节到pH7.0,按照上述方法测定HL-60细胞的细胞凋亡诱导活性,热处理产物显示出显著细胞凋亡诱导活性。
该结果示于附图1中。附图1表示在HL-60细胞培养液中加入柠檬果胶热处理产物溶液达到1mg/ml浓度时,培养时间与培养液中活细胞数之间的关系,其中横轴表示培养时间(时间),而纵轴表示培养液中活细胞数(×105个/5ml)。附图1中,白色方形符号(□)表示无试样的对照,而白色菱形符号(◇)表示加有柠檬果胶热处理产物的试验组,显示出柠檬果胶热处理产物具有抗癌作用。实施例3
(1)将市售苹果果胶溶解在含有120 mM NaCl的50 mM HEPES缓冲液(pH 7.0)中,使最终浓度达到10 mg/ml,在121℃下热处理20分钟,制备热处理液,一部分经过冷冻干燥后得到热处理液的冷冻干燥物。
进而,用纤维素透析膜(分级分子量12000~14000,三光纯药株式会社制)或Spectra/Por7透析膜(分级分子量1000,Spectra公司出品)将其余的热处理液对纯水透析,对各透析内液进行冷冻干燥后称量,与热处理前的果胶相比每个透析内液的冷冻干燥物重量都减少了大约10%。
将热处理液的冷冻干燥物和透析内液的冷冻干燥物分别溶解在水和含有120 mM NaCl的50 mM HEPES缓冲液(pH 7.0)中,使最终浓度达到10 mg/ml,用1N氢氧化钠调节到pH7.0,按照实施例2的方法对HL-60细胞进行细胞凋亡诱导活性测定。
与具有活性的热处理果胶溶液相比,经过透析的透析内液试样活性低。
试验结果示于附图2中。附图2表示在HL-60细胞培养液中分别加入热处理液的冷冻干燥物、纤维素透析膜内液的冷冻干燥物、Spectra/Por7透析膜内液的冷冻干燥物1 mg/ml时培养时间与培养液中活细胞数之间的关系,横轴表示培养时间(时间),而纵轴表示培养液中的活细胞数目(×105个/5ml)。附图2中,白色方形符号(□)表示无试样的对照,而白色菱形符号(◇)表示添加热处理液的冷冻干燥物,白色圆形符号(○)表示添加纤维素透析膜的冷冻干燥物,而白色三角形符号(△)表示添加Spectra/Por7透析膜内液的冷冻干燥物,说明热处理液的抗癌作用。
(2)使用1N氢氧化钠将上述果胶的热处理溶液调节到pH7.0后,用Centriplus10(分级分子量10000,Amicon公司出品)进行超滤,得到通过的级分。按照实施例2的方法测定此级分的细胞凋亡诱导后发现,与超滤之前的试样具有相同的活性。
试验结果示于附图3中。附图3表示在HL-60细胞培养液中加入果胶热处理液的Centriplus10通过级分达到1 mg/ml时,培养时间与培养液中活细胞数之间的关系,横轴表示培养时间(时间),而纵轴表示培养液中的活细胞数目(×105个/5ml)。附图3中,白色方形符号(□)表示无试样的对照,而白色菱形符号(◇)表示添加通过的级分。其中,果胶的热处理溶液显示出与白色菱形符号具有相同的结果,果胶的热处理溶液和通过的级分显示出抗癌作用。实施例4
将市售的苹果果胶溶解在含有120 mM NaCl的50 mM HEPES缓冲液(pH 7.0)中,使最终浓度达到10 mg/ml,用1N氢氧化钠调节pH7.0后,在121℃下热处理30分钟。将20毫升此试样加在经过纯水平衡过的Sephacryl S-300高分辨率色谱柱(Phamarcia公司出品)上进行凝胶过滤。移动相是纯水,流速定为1ml/分钟,使用差式折光计检出。
试样加入色谱柱后,以110~190分钟溶出的部分作为级分(1),190~270分钟溶出的部分作为级分(2),270~400分钟溶出的部分作为级分(3),分别用蒸发器浓缩。在各级分中加入氯化钠和HEPES制成20毫升,使之最终浓度分别达到120 mM和50 mM,用1N氢氧化钠调节pH7.0。
按照实施例2的方法测定对于HL-60细胞的细胞凋亡诱导活性后发现,最低分子侧的级分(3)具有强的活性。
试验结果示于附图4中。附图4表示在HL-60细胞培养液中加入上述级分(3)至1 mg/ml时培养时间与培养液中活细胞数之间的关系,横轴表示培养时间(小时),纵轴表示培养液中的活细胞数目(×105个/5ml)。附图4中白色方形符号(□)表示无试样的对照,而白色菱形符号(◇)表示添加了级分(3),表示级分(3)具有抗癌作用。实施例5
(1)将D-α-半乳糖醛酸和D-葡糖醛酸溶解在含有120 mM NaCl的50 mM HEPES缓冲液(pH 7.0)中,使最终浓度分别达到10 mg/ml,在121℃下热处理20分钟后用1N氢氧化钠调节pH7.0。按照实施例2的方法测定这些试样对于HL-60细胞的细胞凋亡诱导活性后发现,具有特别显著的活性。
试验结果示于附图5中。附图5表示在HL-60细胞培养液中加入热处理半乳糖醛酸和热处理葡糖醛酸使之浓度分别达到1 mg/ml时培养时间与培养液中活细胞数之间的关系,横轴表示培养时间(小时),纵轴表示培养液中的活细胞数目(×105个/5ml)。附图5中白色方形符号(□)表示无试样的对照,而白色菱形符号(◇)表示添加热处理半乳糖醛酸,白色圆形符号(○)表示添加热处理葡糖醛酸,各种热处理产物都显示出抗癌作用。
(2)将半乳糖醛酸溶解在含有120 mM NaCl的50 mM HEPES缓冲液(pH 7.0)中,使最终浓度分别达到10 mg/ml,对于用1N氢氧化钠分别调节到pH7.0和pH8.0的样品在121℃下热处理20分钟,然后再用1N氢氧化钠将各试样调节到pH7.0。按照实施例2的方法测定这些试样对于HL-60细胞的细胞凋亡诱导活性后发现,pH7.0下热处理的试样比pH8.0下热处理的试样具有更强的活性。
试验结果示于附图6中。附图6表示在HL-60细胞培养液中分别加入pH7.0下热处理的半乳糖醛酸和pH8.0下热处理的葡糖醛酸使之浓度分别达到1 mg/ml时培养时间与培养液中活细胞数之间的关系,横轴表示培养时间(小时),纵轴表示培养液中的活细胞数目(×105个/5ml)。附图6中白色方形符号(□)表示无试样的对照,而白色菱形符号(◇)表示添加pH7.0下热处理的半乳糖醛酸,白色圆形符号(○)表示添加pH8.0下热处理的葡糖醛酸,pH7.0下热处理产物显示出抗癌作用。实施例6
将市售的苹果果胶溶解在含有120 mM NaCl的50 mM HEPES缓冲液(pH 7.0)中,使最终浓度达到10 mg/ml,在121℃下热处理20分钟后得到加热试样(1)。使用上述纤维素透析膜,将试样(1)相对于含有120 mM NaCl的50 mM HEPES缓冲液(pH 7.0)进行透析,得到透析内液试样(2)。进而将透析内液试样(2)在121℃下热处理1小时,用1N氢氧化钠调节到pH7.0,得到再加热试样(3)。
按照实施例2的方法,测定经1N氢氧化钠调节到pH7.0的试样(1)~(3)对于HL-60细胞的细胞凋亡诱导活性后发现,试样(1)和(3)具有活性,而试样(2)的活性低。
由此查明,经透析使活性降低的热处理果胶透析内液,通过再次加热活性将会恢复。实施例7
将市售苹果果胶溶解在1N盐酸中,使浓度达到10mg/ml,在121℃下加热1.5小时,制备了热处理产物。然后用氢氧化钠将所说的热处理产物调节到pH7.0后,按照以下方法测定了对于人体前骨髓白血病细胞HL-60的细胞凋亡诱导活性。
在含有10%经56℃30分钟处理的胎牛血清(ギブコ株式会社制)的RPMI1640培养基(日水株式会社制)中,于37℃下培养HL-60(ATCC CCL-240),培养后将其悬浮在RPMI1640培养基中,使浓度达到2.5×105个/4.5毫升。
在4.5ml这种悬浮液中加入0.5毫升上述热处理产物溶液,37℃和5%二氧化碳存在下培养16小时。为了对照,使用0.05毫升已知的放线菌素D(Sigma公司制造)水溶液(0.1 mg/ml)作为诱发细胞凋亡作用的试剂和0.45 ml生理食盐水代替上述热处理产物溶液,进行了同样培养。
用光学显微镜观察培养细胞,发现加入热处理溶液和放线菌素D后得到的培养细胞中,分别产生细胞核凝缩和细胞的缩小,并形成细胞凋亡小体。而作为对组照中添加了0.5毫升生理食盐水的培养细胞,却没有发现这些现象。
此外,向细胞悬浮液中加入二倍容积的0.4%锥虫蓝水溶液后,用光学显微镜观察,对排出锥虫兰后变成无色的活细胞和染色为蓝色的死细胞进行计数。
试验结果示于附图7中。附图7表示在HL-60细胞的培养液中加入果胶热处理产物溶液使浓度达到1 mg/ml时,培养时间与培养液中活细胞数之间的关系,横轴表示培养时间(小时),纵轴表示培养液中的活细胞数目(×105个/5ml)。附图7中白色方形符号(□)表示无试样的对照,而白色菱形符号(◇)表示添加果胶热处理产物,果胶热处理产物显示出抗癌作用。实施例8
将市售的苹果果胶溶解在水中,使浓度达到10 mg/ml,用氢氧化钠调整到pH7.0后在121℃下加热1小时。热处理后pH为4.5。进而再次用氢氧化钠将热处理产物调节到pH7.0,离心分离(10000×g,10分钟)并用0.22μm过滤器过滤除去不溶物后,分别加入等量乙醇后离心分离(10000×g,10分钟)得到的上清液和沉淀减压浓缩干固,将果胶溶解在最初溶解量的水中。使用氢氧化钠将乙醇处理液的上清液部分的水溶液和沉淀部分的水溶液调整到pH7.0后,各取0.5ml加入到4.5mlHL-60细胞培养液中,按照实施例7的方法测定细胞凋亡诱导活性。
结果查明,上清液部分对HL-60细胞具有细胞凋亡诱导活性。使用异丙醇代替乙醇得到了同样的结果。结果示于附图8之中。附图表示在HL-60细胞培养液中加入乙醇或异丙醇处理后得到的上清液部分水溶液或沉淀部分水溶液时,培养时间与培养液中活细胞数目之间的关系,横轴表示培养时间(时间),纵轴表示培养液中的活细胞数目(×105个/5ml)。图中,白色方形符号(□)表示无试样的对照,而白色园形符号(○)表示添加乙醇处理的沉淀部分,黑色圆形符号(●)表示加入乙醇处理的上清液部分,白色三角形符号(△)表示加入异丙醇处理的沉淀部分,而黑色三角形符号(▲)表示加入异丙醇处理的上清液部分,各种溶剂处理的上清液部分都具有抗癌作用。
将在果胶热处理产物中添加的乙醇量或异丙醇量改变成0.5倍、1.5倍和2倍,并按照与上述同样方法制备了试样后,上清液部分存在的活性与加入等量乙醇或异丙醇的情况相同。但是,细胞凋亡诱导活性是按照以下方法测定的。也就是说,在96穴微量点滴板(microtiter plate)的每个穴中,加入100微升包含5000个HL-60细胞的、含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基、10微升试样和10微升alamar蓝(alamar生物科学公司出品),在5%二氧化碳存在下于37℃培养48小时后测定560 nm处吸光度减去590 nm处吸光度的差值,以此作为细胞的增殖度。实施例9
将市售的苹果果胶溶解在0.1M碳酸缓冲液中,使浓度达到10 mg/ml,调整到pH9.5后在121℃下加热处理30分钟。热处理产物的pH为9.2。进而用盐酸将一部分热处理产物的pH调节到pH7.0(试样A),其余部分调节到pH4.5。调节到pH4.5的试样于121℃下再热处理30分钟,接着调节到pH7.0(试样B)。按照实施例7的方法测定试样A和B对HL-60细胞的细胞凋亡诱导活性后发现,试样A没有活性,而试样B(果胶热处理液Ⅱ)具有活性。
结果示于附图9之中。附图9表示在HL-60细胞培养液中加入试样A或试样B使浓度达到1 mg/ml时,培养时间与培养液中活细胞数目之间的关系,横轴表示培养时间(时间),纵轴表示培养液中的活细胞数目(×105个/5ml)。图中,白色方形符号(□)表示无试样的对照,而白色菱形符号(◇)表示添加试样A,白色圆形符号(○)表示加入试样B,果胶热处理液显示出抗癌作用。实施例10
(1)将D-α-半乳糖醛酸溶解在水中至浓度10 mg/ml时pH=2.4。在121℃下将其热处理20分钟。此热处理产物的pH=2.2。进而用氢氧化钠将此热处理产物调节到pH7.0。按照实施例7的方法,但是使用HL-60细胞浓度调整到3×105个/4.5 ml的细胞悬浮液,测定对HL-60细胞的细胞凋亡诱导活性后发现,本试样具有活性。
试验结果示于附图10中。附图10表示在HL-60细胞培养液中加入半乳糖醛酸的酸性下热处理产物至浓度达到1 mg/ml时,培养时间与培养液中活细胞数之间的关系,横轴表示培养时间(时间),纵轴表示培养液中的活细胞数目(×105个/5ml)。附图10中白色方形符号(□)表示无试样的对照,而白色菱形符号(◇)表示添加半乳糖醛酸的热处理产物,此热处理产物显示了抗癌作用。
(2)将D-葡糖醛酸溶解在含有120 mM NaCl的50 mM HEPES缓冲液(pH 7.0)中至浓度10 mg/ml后,pH=3.18。121℃下将其热处理20分钟后,用氢氧化钠将pH调节到pH=7.0,按照实施例7的方法测定对于HL-60细胞的细胞凋亡诱导活性后发现,本试样具有活性。
试验结果示于附图11中。附图11表示在HL-60细胞培养液中加入葡糖醛酸热处理产物至浓度1 mg/ml时培养时间与培养液中活细胞数之间的关系,横轴表示培养时间(时间),纵轴表示培养液中的活细胞数目(×105个/5ml)。附图11中白色方形符号(□)表示无试样的对照,而白色圆形符号(○)表示添加葡糖醛酸的热处理产物,葡糖醛酸的热处理产物显示了抗癌作用。实施例11
(1)将D-α-半乳糖醛酸溶解在水中至1%浓度时pH=2.4。在121℃下将其热处理20分钟后,此热处理产物的pH=2.2。减压下将其浓缩40倍后,将其中20微升供给使用PALPAK S型柱(4.6×250 mm)(宝酒造株式会社制)的HPLC。在1ml/分钟流速下,开始的30分钟使用90%乙腈水溶液,其后20分钟采用90%至50%乙腈水溶液的线性梯度洗脱法对半乳糖醛酸的酸性下热处理产物进行分离。每90秒分取一个级分,将各级分减压浓缩至干,溶解在80微升水中,使用其中的10微升按照以下记载的MTT法测定了对于HL-60细胞的细胞凋亡诱导活性。
结果发现,溶出时间在4.5~12分钟和45~48分钟的两个级分具有活性。
MTT法:将各被检液的5微升稀释液和5微升水分别置于96穴微量点滴板的穴中。向其中加入100微升含有5000个HL-60细胞的并且含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中,在5%二氧化碳存在下于37℃培养48小时。加入10微升含5 mg/ml3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT,sigma公司出品)的磷酸缓冲溶液,再继续培养4小时后,用显微镜观察细胞的生育状态。加入100微升含0.04N盐酸的异丙醇并搅拌,测定590 nm处的吸光度,以此吸光度作为细胞的增殖度。实施例12
(1)将市售的苹果果胶悬浮在水中至浓度2.5%,进而用氢氧化钠调节到pH=7.0后,置于分级分子量处于12000~14000之间的透析管中,用15倍量水透析四次。透析后再调节到pH=7.0,于121℃下加热1小时,用这种方法制备了热处理液。此热处理液的pH=5.4。用氢氧化钠将此热处理液的pH调节到7.0,离心分离除去不溶物后,按照0.8微米过滤器-0.45微米过滤器-0.22微米过滤器的顺序过滤,得到了过滤器处理液。接着用分级分子量为10000的超滤膜过滤此处理液。然后将这种超滤膜过滤液减压至干,再将干燥物溶解在最初使果胶悬浮用水量1/40量的水中,制备了果胶热处理产物溶液。
将此果胶的热处理溶液置于经水平衡过的TOYOPEAL HW-40C(4.4×92cm;东ソ-株式会社出品),在2.5 ml/分钟流速下进行硅胶过滤,按照实施例8使用alamar蓝的方法测定了各级分的细胞凋亡诱导活性。结果发现,溶出时间为448~472分钟之间的级分具有活性。
(2)将D-α-半乳糖醛酸溶解在水中至1%浓度下,用氢氧化钠调节pH至7.0。121℃下将其加热20分钟,按照实施例7的方法测定了热处理液对HL-60细胞的细胞凋亡诱导活性,发现所说的热处理产物具有细胞凋亡诱导活性。实施例13
将果胶(和光纯药工业株式会社出品,代码:167-00542)、藻酸(非膨润型,和光纯药工业株式会社出品,代码:011-13341)、D-α-半乳糖醛酸(ナカライテスク株式会社出品,代码:165-18)和D-葡糖醛酸(ナカライテスク株式会社出品,代码:169-28)分别溶解在蒸馏水中至1%浓度,制备了各溶液。进而还制备了将果胶溶解在1N醋酸水溶液中得到的溶液。
然后在121℃下对这些1%浓度的溶液分别进行了30分钟、1小时、2小时、4小时、16小时热处理。用氢氧化钠调节各热处理产物至pH=7.0后,用0.22μm过滤器灭菌,以此方法制备了测定细胞凋亡诱导活性用试样。
制备了此试样的2倍、5倍、10倍、20倍、50倍和100倍的稀释液,按照实施例11中记载的MTT法测定其细胞凋亡诱导活性,并比较了活性的强弱,结果示于下表1~5中。
(A)果胶的1%水溶液pH3.4。果胶热处理产物的活性以可以确认活性的最大稀释倍数表示。如表1所示,经120℃4小时热处理后活性显著增加。
表1果胶水溶液的热处理
加热时间(小时) |
加热前pH |
加热后pH |
调整后pH |
活性(最大稀释倍数) |
2416 |
3.43.43.4 |
3.33.23.5 |
7.07.27.0 |
2倍10倍20倍 |
(B)果胶的1%醋酸水溶液加热前pH2.6。果胶醋酸溶液热处理产物的活性以可以确认活性的最大稀释倍数表示。如表2所示,经120℃16小时热处理后活性显著增加。
表2果胶醋酸溶液的热处理
加热时间(小时) |
加热前pH |
加热后pH |
调整后pH |
活性(最大稀释倍数) |
2416 |
2.62.62.6 |
2.72.62.8 |
7.07.27.1 |
2倍5倍20倍 |
(C)半乳糖醛酸水溶液加热前pH2.5。半乳糖醛酸热处理产物的活性以可以确认活性的最大稀释倍数表示。如表3所示,经120℃1小时热处理,活性显著增加。
表3半乳糖醛酸水溶液的热处理
加热时间(小时) |
加热前pH |
加热后pH |
调整后pH |
活性(最大稀释倍数) |
0.512416 |
2.52.52.52.52.5 |
2.42.42.42.42.6 |
6.86.96.96.86.9 |
2倍10倍20倍50倍100倍 |
(D)葡糖醛酸水溶液加热前pH2.4。葡糖醛酸热处理产物的活性以可以确认活性的最大稀释倍数表示。如表4所示,经120℃30分钟热处理活性显著增加。
表14葡糖醛酸水溶液的热处理
加热时间(小时) |
加热前pH |
加热后pH |
调整后pH |
活性(最大稀释倍数) |
0.512416 |
2.42.42.42.42.4 |
2.62.72.72.62.8 |
6.96.96.97.07.0 |
10倍20倍50倍100倍100倍 |
(E)藻酸水溶液加热前pH3.3。藻酸热处理产物的活性,以可以确认活性的最大稀释倍数表示。如表5所示,经120℃2小时热处理,活性显著增加。
表5藻酸水溶液的热处理
加热时间(小时) |
加热前pH |
加热后pH |
调整后pH |
活性(最大稀释倍数) |
12416 |
3.33.33.33.3 |
2.52.62.72.9 |
6.86.97.07.3 |
2倍10倍10倍20倍 |
实施例14
将经乙醇洗涤(经80%乙醇洗涤→50%乙醇洗涤→80%乙醇洗涤→100%乙醇洗涤→减压干燥→粗精制的果胶粉末)的果胶(和光纯药株式会社制,代码:167-00542)、未经洗涤的果胶(和光纯药株式会社制,代码:167-00542)、藻酸(非膨润型:D-甘露糖醛酸型,和光纯药株式会社制,代码:011-13341)、藻酸(膨润型:L-葡糖醛酸型,和光纯药株式会社制,代码:014-13331)、D-葡糖醛酸(ナカライテスク株式会社制,代码:169-28)、D-α-半乳糖醛酸(ナカライテスク株式会社制,代码:165-18)各0.5克置于10支试管(一支是未加热的对照)中,在空气中于120℃、150℃和180℃三种温度条件下,边观察试样颜色变化边干热处理,按照颜色的变化分三点取样,用以下方法提取活性成分。
将试样悬浮在12.5 ml50%的乙醇中。悬浮液室温下振荡16小时后离心分离,得到提取液。浓缩此提取液至干,将其再次溶解在蒸馏水中使浓度达到按照最初试样计算为1%。调节pH至7附近,用0.22μm过滤器过滤灭菌后作为活性测定用试样。使用这些试样,按照实施例11中记载的MTT法进行活性检定。试验结果与干热温度、时间、再溶解时的pH、调节后的pH一起示于表6~11中。其中,对未加热的试样也进行同样操作后没有发现活性。表6~11中的活性表示具有活性的试样稀释倍数。
表6经乙醇洗涤果胶的热处理
干热温度(℃) |
时间(分钟) |
再溶解时的pH |
调节后pH |
活性(稀释倍数) |
180180 |
60120 |
3.73.5 |
6.96.8 |
11 |
表7果胶的热处理
干热温度(℃) |
时间(分钟) |
再溶解时的pH |
调节后pH |
活性(稀释倍数) |
180 |
120 |
3.9 |
7.0 |
1 |
表8藻酸(D-甘露糖醛酸型)的热处理
干热温度(℃) |
时间(分钟) |
再溶解时的pH |
调节后pH |
活性(稀释倍数) |
150150180180180 |
4060203040 |
3.03.03.03.03.1 |
6.86.86.86.86.9 |
11111 |
表9藻酸(L-葡糖醛酸型)的热处理
干热温度(℃) |
时间(分钟) |
再溶解时的pH |
调节后pH |
活性(稀释倍数) |
150180180180 |
60203040 |
3.33.33.33.2 |
6.76.76.76.8 |
1111 |
表10葡糖醛酸的热处理
干热温度(℃) |
时间(分钟) |
再溶解时的pH |
调节后pH |
活性(稀释倍数) |
150150150180180180 |
203040102030 |
3.23.33.33.13.33.3 |
6.86.96.97.06.86.9 |
111112 |
表11半乳糖醛酸的热处理
干热温度(℃) |
时间(分钟) |
再溶解时的pH |
调节后pH |
活性(稀释倍数) |
120120150150150180180180 |
60120203040102030 |
2.92.92.92.92.92.92.92.9 |
6.96.96.86.96.87.16.86.8 |
11222221 |
实施例15
将市售苹果果胶溶解在水中至1%浓度,将其加入到备有回流冷凝器的茄形烧瓶中,于设定在110~120℃的油浴中分别加热18、42和66小时。加入过程中,果胶溶液的温度为100~102℃。
对上述果胶溶液离心分离除去沉淀,上清液用三倍和十倍水稀释后制成试样。将10微升稀释试样和100微升含有5000个HL-60细胞及10%胎牛血清的RPMI1640培养基置于96穴微量点滴板的孔穴中,在5%二氧化碳存在下于37℃培养48小时后,按照实施例11记载的MTT法测定。
试验结果,对于18小时加热果胶的三倍稀释液、42小时和66小时加热果胶的三倍和十倍稀释液没有发现活细胞,而在这些稀释浓度下经100℃加热的果胶显示出活性。
此外,经18小时加热果胶的十倍稀释液几乎都是活细胞,与加入水的对照相比在590nm处吸光度降低。实施例16
在100升自来水中加入5千克Pomosin果胶LM-13CG(Hercules公司出品),通入水蒸汽加热升温35分钟使液体温度从28℃升至120℃,然后在搅拌下于120℃保温5小时,进而冷却,制备了135升冷却物。作为过滤助剂,加入1.35千克Celite#545(Celite公司出品)和1.35千克二氧化硅#600-S(中央Silica株式会社制),然后用经0.1千克Celite#545和0.1千克二氧化硅#600-S预涂的紧凑型漏斗(Advantac#327,内有16级6英寸滤纸)过滤。得到的液体用电热板(日阪制作所出品)进行连续瞬间加热(98℃、60秒)后冷却,制成150升果胶热处理液Ⅰ。
果胶热处理液Ⅰ的pH大约3.5,酸度6.2 ml,糖度为5.8Brix%。其中所说的pH是用pH计测定的,酸度用中和10毫升试样至pH=7.0所需0.1N氢氧化钠的量(ml)表示的。而糖度是使用Brix糖度计测定的。
这种果胶热处理液Ⅰ对于人体前骨髓白血病细胞HL-60的活性,按以下方法测定。
将在含有10%经56℃30分钟处理的胎牛血清(ギブコ公司出品)的RPMI1640培养基中,经37℃培养的HL-60(ATCC CRL-240),悬浮在上述培养基中使其中含有2.5×105个细胞/4.5 ml。在4.5 ml此悬浮液中分别加入0.5 ml用水分别稀释到20 mg/ml、10 mg/ml、5mg/ml、2 mg/ml、1 mg/ml、0.5 mg/ml、0.2 mg/ml、0.1 mg/ml的上述果胶热处理溶液,37℃和5%二氧化碳下培养24小时和48小时。
在细胞培养液中加入锥虫兰水溶液,室温下放置数分钟后用光学显微镜观察,计数排除锥虫兰为无色的活细胞和染成蓝色的死细胞。而且用光学显微镜观察培养细胞时发现,加入1 mg/ml以上浓度热处理果胶溶液的试样产生细胞核的凝缩、细胞缩小和细胞凋亡小体形成现象,而加入0.5 mg/ml以下热处理果胶溶液的试样与对照样(0.5ml水)都没有发现这种现象。
结果示于附图12中。附图12表示在HL-60细胞培养液中加入各种浓度的果胶热处理溶液时,培养时间与培养液中活细胞数之间的关系,横轴表示培养时间(小时),纵轴表示培养液中的活细胞数目(×105个/5ml)。附图12中白色方形符号(□)表示无试样的对照,白色倒三角形符号()表示加入2 mg/ml加热果胶,黑色方形符号(■)表示加入1 mg/ml加热果胶,黑色菱形符号(◆)表示加入0.5 mg/ml加热果胶,黑色圆形符号(●)表示加入0.2mg/ml加热果胶,黑色三角形符号(▲)表示加入0.1 mg/ml加热果胶,加入5~20 mg/ml加热果胶的试样与白色倒三角形()表示的加入2 mg/ml加热果胶的试样具有同样的活性。试验表明加入1 mg/ml以上的加热果胶产生了抗癌作用。实施例17
将市售的D-葡糖醛酸(Sigma公司出品G5269)溶解在水中至浓度达1%,121℃下加热4小时,用氢氧化钠中和至pH=7后,制备了用水稀释10倍、40倍、80倍和160倍的稀释液。在4.5 ml含有2.5×105个HL-60细胞并含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中加入0.5 ml葡糖醛酸热处理产物稀释液,在5%二氧化碳存在下在37℃下培养24小时后,按照实施例7的方法测定了细胞增殖抑制活性作为抗癌活性。结果发现,在加入10~80倍稀释液的试样中细胞数和细胞成活率都低。而且,在加入40~80倍稀释液的试样中发现存在DNA低分子化现象。其中,所说的细胞成活率R(%)按下式计算:
R=Vs/(Vs+Ds)×100+Dc/(Vc+Dc)×100
式中,Vs、Ds分别表示加入试样时的活细胞数和死细胞数;Vc、Dc分别表示加入水时的活细胞数和死细胞数。R值等于50%的1 ml培养基中,抗癌活性为一个单位。
将得到的细胞成活率对葡糖醛酸热处理产物的稀释倍数的常用对数作图,各点均处于一条直线上,并由下式计算葡糖醛酸热处理产物的成活率R(%):
R=58.656X-31.884(式中,X是葡糖醛酸热处理产物的稀释倍数)
这条直线说明,葡糖醛酸热处理产物的非稀释物相当于250单位/ml。
结果示于附图13中。附图13表示在HL-60细胞中加入各种稀释倍数的葡糖醛酸热处理产物,并经24小时培养时,稀释倍数与细胞成活率之间的关系,横轴表示稀释倍数(倍,对数值),而纵轴表示细胞成活率(%)。实施例18
(1)分别制备了苹果剥皮果泥(丸善食品工业株式会社制)、香蕉果泥(小川香料株式会社制)、白苏提取物1/4(Dan foods出品)、南瓜提取物60(Dan foods出品)、南瓜泥(Dan foods出品)、芹菜泥(Dan foods出品)、牛蒡泥(Dan foods出品)、エシヤロツト(echalote)提取物60(Dan foods出品)的25%溶液,在121℃下热处理了40分钟。同样又分别制备了各25%的溶液,并于121℃下热处理4小时。各处理液冷却后过滤,制备了各种热处理溶液。
121℃下20分钟热处理产物的糖度和pH示于表12中。
表12
原料 |
糖度(Brix) |
pH |
剥皮苹果果泥香蕉果泥白苏提取物南瓜提取物60南瓜泥芹菜泥牛蒡泥エシヤロツト提取物60 |
3.66.02.216.84.01.62.415.6 |
3.65.95.85.35.75.55.84.9 |
121℃下4小时热处理产物的糖度和pH示于表13中。
表13
原料 |
糖度(Brix) |
pH |
剥皮苹果果泥香蕉果泥白苏提取物南瓜提取物60南瓜泥芹菜泥牛蒡泥エシヤロツト提取物60 |
3.65.52.516.63.01.62.513.8 |
3.64.65.34.75.04.94.84.3 |
各热处理溶液分子量处于10000以下的级分确认有实施例17记载的抗癌活性。
进而将糖度(Brix)值调节到1,并对各热处理溶液的功能作了检查。各热处理溶液都显示出具有作为食品或饮料的良好性能。
(2)以香蕉泥、苹果泥和芹菜泥各自25%水溶液在121℃热处理4小时的热处理产物为代表,按照实施例17的方法测定了各热处理产物的抗癌活性。测定结果示于表14中。经过热处理,在各处理液中生成了抗癌活性物质。
表14
果泥种类 |
活性(单位/ml) |
香蕉果泥苹果果泥芹菜泥 |
23.49.50.5 |
实施例19
在160毫升水中各加入40克(1)萝卜叶、(2)胡萝卜叶、(3)胡萝卜、(4)甘蓝、(5)去皮茄子、(6)香蕉和(7)Hassaku橙子的albedo,用混合器混合均匀。在121℃下加热4小时后将其中一部分离心分离,上清液用氢氧化钠调整到pH=6后的物质作为试样A,其余部分用盐酸调整到pH=3后在121℃加热4小时,用氢氧化钠调整其离心上清液至pH=6的物质作为试样B。
稀释由(1)~(7)调整得到的各试样A、B,使用10微升稀释液,按照实施例11记载的MTT法测定抗癌活性。其结果示于表15中。表15中所示的数值是能够观察到活性的稀释倍数,“-”表示对加入未稀释液的级分没有观察到活性。对于各种水果和蔬菜的热处理产物,发现产生了活性。表中的稀释倍数标识细胞完全死亡的稀释倍数,而括弧内的数字表示对细胞产生影响的稀释倍数。
表15
蔬菜、水果的种类 |
活性稀释倍数试样A |
活性稀释倍数试样B |
萝卜叶胡萝卜叶胡萝卜甘蓝茄子香蕉hassaku |
1(4)-2(4)1(4)1(2)2(4)4(8) |
2(4)11(2)112(4)4(8) |
实施例20
将非膨润性藻酸(和光纯药株式会社制,代码:011-13341)和膨润性藻酸(和光纯药株式会社制,代码:014-13331)悬浮在水中至1%后,分别将其pH调整到3.32和3.38。将其于121℃下加热20分钟,按照实施例7的方法测定对于HL-60细胞的细胞增殖抑制活性,作为抗癌活性。但是,在开始培养时使HL-60细胞数为3×105个/5ml。
结果示于附图14中。附图14是表示向HL-60细胞培养液中加入非膨润性藻酸和膨润性藻酸的热处理产物溶液至1 mg/ml浓度时,培养时间与培养液中活细胞数目之间的关系的图,横轴表示培养时间(小时),而纵轴表示培养液中的活细胞数目(×105个/5ml)。图中,白色方形符号(□)表示未添加试样(对照),白色菱形符号(◇)表示加入非膨润性藻酸热处理产物的试样,而白色三角形符号(△)表示加入膨润性藻酸热处理产物的试样。
确认非膨润性藻酸热处理产物具有高活性。实施例21
制备了藻酸HFD(大日本制药株式会社制)的1%水悬浮液,在120℃下热处理4小时。按照实施例17记载的方法测定了热处理液离心上清液的抗癌活性,算出抗癌活性单位。结果示于表16之中。据发现,藻酸的热处理产物中生成了活性物质。
表16
藻酸HFD的热处理产物 |
活性(单位/ml) |
热处理产物的1%溶液 |
83.3 |
实施例23
将1克藻酸HFD(大日本制药株式会社制)悬浮在50毫升水中,在121℃下分别加热处理30分钟、1小时、2小时和14小时。用离心分离法制备各热处理产物的溶液,测定其分子量。其中,所说的分子量测定是按照以下条件进行的:
防护柱:TSK防护柱PWH
柱:TSK硅胶G3000PW
洗脱液:0.2M氯化钠
检测:210 nm处的吸收
不同加热时间下分别生成了以下列分子量为主峰的低分子分解物:
加热时间 低分子分解物的分子量
30分钟 1800
1小时 1200和630
2小时 1100和630
4小时 1100和630
14小时 620和400同时生成了低分子分解物。其中不含分子量1万以上的高分子成分,在分子量500以下的级分中发现了抗癌活性和抗菌活性。实施例23
(1)将市售的葡糖醛酸内酯(Merck公司出品,代码:No.100282)溶解在水中至1%浓度,于121℃下加热0.5小时、1小时、2小时、4小时或16小时。按照实施例17的方法测定了这些热处理液的抗癌活性。据发现,在0.5小时加热下生成了抗癌活性物质,而且抗癌活性物质的生成随着加热时间的延长而增加,在4和16小时加热时间下,分别是0.5小时加热时间的大约10倍。
(2)将上述葡糖醛酸内酯溶解在水中制成0.1%、1%、2%、5%、10%或20%浓度,于121℃下加热4小时。按照实施例17的方法测定了这些热处理液的抗癌活性。据发现,虽然各种浓度下都生成了抗癌活性物质,但是与使用的葡糖醛酸内酯相当的热处理产物的抗癌活性强度,以使用0.1%浓度葡糖醛酸内酯时为最强。
(3)将上述葡糖醛酸内酯1%水溶液的pH,用盐酸或氢氧化钠调整到1、2、3或4.5,在121℃加热4小时。按照实施例17的方法测定了这些热处理液的抗癌活性。据发现,在各种pH下通过对葡糖醛酸内酯的热处理虽然都生成了抗癌活性物质,但是与所使用葡糖醛酸内酯相当的热处理产物的抗癌活性强度当pH=3~4.5时是pH=1时的大约15倍。
(4)将市售的葡糖醛酸(Sigma公司出品,G5269)溶解在水中至1%浓度,于121℃下加热4小时,制备了pH未调节的试样(pH=2.6)和用氢氧化钠调整到pH=6.6的试样。每个试样各取1毫升分注,经-20℃、4℃、37℃下保持后,按照实施例17的方法测定了抗癌活性。
结果发现,经过25日保存后,37℃下保存热处理产物的抗癌活性略有减少,而4℃和-20℃下保存大体上是稳定的。实施例24
将LM-13CG型Pomosin果胶(Hercules公司出品)、藻酸HFD(大日本制药株式会社出品)、D-葡糖醛酸(ナカライテスク株式会社出品)和葡糖醛酸内酯(Merck公司出品)溶解或悬浮在水中制成1%浓度,分别在95℃、121℃和132℃加热16小时,按照实施例17的方法测定了这些热处理产物的抗癌活性,结果示于表17之中。
表17
热处理产物 |
加热温度(℃) |
活性(单位/ml) |
果胶 |
95121132 |
1.232.31.4 |
藻酸 |
95121132 |
1.057.825.7 |
葡糖醛酸 |
95121132 |
40.834530.2 |
葡糖醛酸内酯 |
95121132 |
42.7537633.8 |
实施例25
(1)将1.5克苹果果胶(和光纯药株式会社出品)悬浮在100毫升水中,用氢氧化钠调整到pH=12。缓缓加入氢氧化钠使pH保持在12于4℃下搅拌。经过8小时之后,没有发现pH下降。经过24小时后用盐酸调整到pH=5,加入4倍容积的乙醇,4℃下搅拌1小时后用滤纸过滤。依次使用65%和99.5%乙醇洗涤,减压干燥后得到了1.32克果胶。
(2)将上面(1)中得到的果胶酸200毫克溶解在200毫升水中,缓缓加入2毫升浓盐酸。80℃下加热66小时后,离心(20000×g)30分钟,得到了上清液和沉淀。上清液用氢氧化钠调整到pH=7,用分级分子量为1000的透析膜对水进行透析后,经冷冻干燥得到18.4毫克酸溶性级分。将沉淀悬浮在30毫升水中,用氢氧化钠调整到pH=6,并用分级分子量1000的透析膜对水进行透析后,经过冷冻干燥得到了114毫克酸不溶性级分。
(3)将上述(2)中得到的酸溶性级分和酸不溶性级分分别溶解在水中至浓度达到1%,用盐酸调整到pH=3后,于121℃下加热20分钟。使用实施例2的方法测定这些热处理产物的细胞增殖抑制活性作为抗癌活性。结果发现,热处理产物的酸溶性级分具有抗癌活性。实施例26
(A)将D-葡糖醛酸(ナカライテスク株式会社出品,代码:169-28)溶解在蒸馏水中至1%浓度,于120℃加热一夜后,用氢氧化钠调整到pH7附近。按照以下方式用此葡糖醛酸热处理产物研究了抗菌活性。
被检细菌在L-肉汤(1%胰化胨,0.5%酵母提取液,5%氯化钠,pH7.0)中培养一夜。在5毫升L-肉汤中加入50、100、250、500、1000微升葡糖醛酸热处理产物的培养基中,以及在未添加任何物质的培养基中,接种5微升种培养液,在37℃和振荡下观察细菌生长情况。开始培养时和经过8小时培养后,使用富士数字浊度计(富士工业株式会社出售,秋山电机制作所制造),在调节刻度为82.3的条件下测定了培养物的浊度,以8小时后的浊度值减去开始培养时的浊度值的差值(生育浊度)确定被检细菌的生长情况。其中对于被检细菌(6)而言,使用脑心浸渍液代替L-肉汤。
作为被检细菌,使用了大肠杆菌HB101(ATCC 33694,被检菌(1))、鼠伤寒沙门氏菌LT-2(ATCC 27106,被检细菌(2))、绿脓假单孢菌(IFO 3080,被检细菌(3))、金黄色葡萄球菌3A(NCTC 8319,被检细菌(4))、枯草杆菌(IFO 3034,被检细菌(5))和链球菌突变株GS5(国立预防卫生研究所保藏菌株,被检细菌(6))。
表18(生长浊度)热处理产物的添加量(微升/5毫升培养基)
被检细菌 0 50 100 250 500
(1) 239 183 89 6 10
(2) 247 177 36 5 11
(3) 273 262 212 237 61
(4) 285 251 247 20 11
(5) 280 258 205 73 13
(6) 140 136 131 125 10
加入100~500微升/5毫升热处理产物的情况下,对于各种被检细菌都显示出抗菌活性。其中,热处理产物对于甲氧苯青霉素耐药性的金黄色葡萄球菌、产生肠毒素的金黄色葡萄球菌、呕吐型的蜡样芽孢杆菌、痢疾型的蜡样芽孢杆菌和肠出血性大肠杆菌O-157也都显示出抗菌活性。
(B)将作为食品添加剂用的藻酸(藻酸HFD,大日本制药株式会社出品)溶解在蒸馏水中至1%浓度,于120℃加热一夜后,用氢氧化钠调整到pH7附近。使用这种藻酸热处理产物,按照上述方法加入250~1000微升热处理液,研究其对于被检细菌(1)~(6)的抗菌活性。其中,在被检细菌(6)的情况下,加入了1500微升。结果示于表19之中。
表19(生长浊度)热处理产物的添加量(微升/5毫升培养基)
被检细菌 0 250 500 1000 1500
(1) 239 30 8 13 -
(2) 247 10 8 12 -
(3) 273 233 188 30 -
(4) 285 222 12 15 -
(5) 280 158 22 13 -
(6) 140 138 130 101 12
加入250~1500微升/5毫升热处理产物的情况下,对于任何细菌都显示出抗菌活性。其中,热处理产物对于甲氧苯青霉素耐药性的金黄色葡萄球菌、产生肠毒素的金黄色葡萄球菌、呕吐型的蜡样芽孢杆菌、痢疾型的蜡样芽孢杆菌和肠出血性大肠杆菌O-157也都显示出抗菌活性。实施例27
将5克市售的苹果果胶溶解在500毫升200mM氯化钠溶液中,用氢氧化钠调整到pH=7.0。121℃下将其热处理30分钟后,再用氢氧化钠调整到pH=7.0。在12000转/分(大约10000×G)下离心30分钟,研究了所得到上清液(本试样)的抗癌作用。
将鼠实体瘤Meth A(4×106个细胞/鼠)皮下注射到10周龄的BALB/c鼠(雌性,体重约20克)的腹部。然后在相同地方连续皮下注射10天本试样(100毫克/千克/日)。
另外,给对照组鼠同样皮下注射生理食盐水代替本试样。两周后,摘除在鼠腹部形成的实体癌组织,测定其重量。结果示于表20中。也就是说,在对照组鼠中,平均癌重量为1.26克,与此对照给以本试样的鼠群该重量为0.88克,表示具有大约30.1%的癌抑制率,因而确定本试样具有抗癌作用。
表20
|
摘除癌的重量(克) |
抑制率(%) |
对照组鼠 |
1.231.211.341.521.741.151.090.76平均1.26±0.10 | 0% |
给以本试样的鼠 |
1.691.610.330.140.170.991.21平均0.88±0.25 | 30.1% |
实施例28
将鼠白血病细胞株P-388(1×106细胞/毫升)在同时含有实施例27中制备的试样(1mg/ml)及10%胎牛血清的RPMI1640培养基内体外培养6小时后,直接给5周龄的DBA/2鼠(雌性,体重约20克)腹腔内注射给以(1ml/鼠)(P-388:1×106细胞/鼠,本试样:50毫克/千克体重)。
另外,给对照组鼠注射生理食盐水和在同样条件下培养的P-388。
在每组8只鼠的两组鼠中,测定了鼠的存活数、平均存活天数和存活率。结果示于附图15中。附图15是表示本试样对白血病细胞抗癌作用的图,纵轴表示鼠的存活数,而横轴表示存活的天数。图中的虚线和实线分别表示对照组和给以本试样组的情况。也就是说,对照组鼠的平均存活天数为8.0,而给以本试样组鼠的平均存活天数为14.6日,存活率为182.5,本试样具有显著的存活效果。
在同时进行的平行试验中,经过6小小体外培养后,P-388细胞的存活率对于是否添加本试样来说没有差异,细胞的存活率均为100%。实施例29
将半乳糖醛酸和葡糖醛酸分别溶解在蒸馏水中至各达到50毫克/毫升浓度,在121℃下热处理20分钟后,用1N氢氧化钠调整pH=7.0。将本试样用生理食盐水稀释到规定浓度,进行了以下试验:
(1)将Meth A细胞(4×106个细胞/鼠)皮下注射到8周龄BALB/c鼠(雌性,体重约20克)腹部。然后在相同地方连续皮下注射10天半乳糖醛酸的热处理产物(100毫克/千克/日)或葡糖醛酸的热处理产物(100毫克/千克/日)。
两周后,摘除鼠腹部形成的癌组织,测定其重量。
结果示于表21中。也就是说,与对照组平均癌重量1.48克相比,半乳糖醛酸热处理产物给以组和葡糖醛酸热处理产物给以组的癌重量分别为0.94克和0.86克,抑制率分别为26.5%和41.9%,证明都具有显著的(相对于对照组,P<0.05)抗癌作用。
表21
鼠 |
数目 |
肿瘤重量(克)平均±SD |
抑制率(%) |
对照组半乳糖醛酸热处理产物葡糖醛酸热处理产物 |
867 |
1.48±0.540.94±0.250.86±0.31 |
-26.541.9 |
(2)使用16只6周龄雌性ICR系鼠(体重约26克),在其腹部皮下注射Sarcoma-180(5.5×106细胞/鼠),8只鼠用作对照,8只鼠给以葡糖醛酸的热处理产物。
对于葡糖醛酸热处理产物给以组,将葡糖醛酸热处理产物在自来水中稀释后,鼠由给水瓶自由摄取这种水,使得葡糖醛酸热处理产物的摄取量达到大约1克/千克/天。对于对照组同样给与这种自来水。实验期间使这两组鼠自由摄取饵料。
在皮下注射Sarcoma-180后第35天的存活数目,对照组8只鼠中有2只,葡糖醛酸热处理产物给以组的8只鼠全部存活,这证明经口摄取葡糖醛酸热处理产物具有显著的存活效果。实施例30
将鼠白血病细胞株P-388(1×106细胞/毫升)在含有实施例29中制备的半乳糖醛酸热处理产物(1毫克/毫升)、葡糖醛酸热处理产物(1毫克/毫升)及10%胎牛血清的RPMI1640培养基中体外培养6小时后,给8周龄的DBA/2鼠(雌性,体重约20克)腹腔内注射给以(P-388:1×106细胞/鼠,热处理产物50毫克/千克体重)1毫升。给对照组鼠注射生理食盐水和在同样条件下培养的P-388细胞(1×106细胞/鼠)。在同时进行的平行试验中,经过6小时体外培养后P-388细胞的存活率,在热处理产物添加组和生理食盐水添加组之间没有差异,存活率均为100%。
每组各使用8只鼠,由其存活数计算了平均存活天数和存活率。
结果示于附图16中。附图16是表示各组经过P-388细胞移植后的天数与鼠存活数之间的关系图,纵轴表示鼠的存活数,而横轴表示鼠的存活天数,该图中实线、虚线和点划线分别表示对照组、半乳糖醛酸热处理产物给以组和葡糖醛酸给以组。
由附图16的结果可以算出,对照组的平均存活天数为11.4天,而半乳糖醛酸热处理产物给以组(50毫克/千克)在细胞移植后24天的平均存活天数我23.5天以上,存活率为206.1%以上,葡糖醛酸热处理产物给以组(50毫克/千克)平均存活天数为16.8天以上,存活率为147.3%,与对照组相比均具有显著的存活效果。实施例31
将10克D-葡糖醛酸(Sigma公司出品,G5269)溶解在1升水中,于121℃下加热4小时后,用氢氧化钠中和至pH7。
在含有1×105个/mlHL-60细胞(ATCC CCL-240)的10%胎牛血清的RPMI1640培养基中加入500、5或0.05微克/毫升本热处理产物,在5%二氧化碳存在下于37℃培养3日。然后取一部分培养细胞涂于玻璃载片上,按照《组织培养技术》(日本组织培养学会编,朝仓书店,1982年)191页上记载的Wright-Giemsa进行染色,使用光学显微镜观察分化程度。结果发现,癌细胞根据葡糖醛酸热处理产物的浓度分化为单核细胞和巨噬细胞状细胞,培养细胞中成熟骨髓细胞的比例增高。结果示于附图17中。也就是说,附图17表示培养时间与成熟骨髓细胞在培养细胞中所占比例(%)之间的关系,横轴表示培养时间(日),而纵轴表示成熟骨髓细胞在培养细胞中所占比例(%)。附图17中,白色方形符号(□)表示未添加试样(对照),白色菱形符号(◇)表示加入了500微克/毫升葡糖醛酸热处理产物,白色圆形符号(○)表示加入了5微克/毫升葡糖醛酸热处理产物,而白色三角形符号(△)表示加入了0.05微克/毫升葡糖醛酸热处理产物。实施例32
葡糖醛酸热处理产物的抗溃疡作用
将D-葡糖醛酸(Sigma公司出品,G 5269)溶解在蒸馏水中至10毫克/毫升浓度,于121℃下加热4小时后,用氢氧化钠中和至pH7.0,然后通过冷冻干燥处理浓缩至200毫克/毫升,用这种方法制备了葡糖醛酸的热处理产物,并且进行了以下实验。
使Wistar种大鼠(体重220~275克)禁食24小时,在实验开始3小时之前禁水。
给大鼠经口给以1毫升99.5%乙醇,1小时后在***麻醉下摘除胃。结扎摘除胃的幽门和贲门,注入1%甲醛溶液后,在甲醛溶液中浸泡10分钟。沿着胃的大弯部分切开,测定胃腺区域形成溃疡的长度(毫米)。
葡糖醛酸热处理产物给以组,在给以乙醇30分钟之前,以1克/千克的比例经口给以上述葡糖醛酸热处理产物。而且与对照组同样给以蒸馏水。
给以乙醇1小时后溃疡的长度,对照组(N=6)为78.2+28.5毫米(平均值±S.E.)。而葡糖醛酸热处理产物给以组(N-3)完全没有发现溃疡,这证明具有显著的抗溃疡作用。实施例33注射剂
将实施例8记载的经乙醇处理的上清液浓缩干燥物溶解在注射用蒸馏水中,制成1%溶液。将此溶液装入冷冻干燥用安培瓶中进行冷冻干燥,按照干燥物计每个安培瓶中装入10毫克。作为溶剂单独添加2毫升生理食盐水。实施例34注射剂
将半乳糖醛酸溶解在注射用蒸馏水中制成10毫克/毫升浓度,121℃下加热处理20分钟,冷却后中和处理,制备热处理产物的中性溶液。将此溶液装入冷冻干燥用安瓶中进行冷冻干燥,按照热处理产物的干燥物计,每个安瓶中装入50毫克,进行冷冻干燥。作为溶剂单独添加2毫升生理食盐水。实施例35片剂
按照以下处方制备了片剂。
葡糖醛酸热处理产物 10毫克
玉米淀粉 65毫克
羧甲基纤维素 20毫克
聚乙烯基吡咯烷酮 3毫克
硬脂酸镁 2毫克
每片 合计100毫克
按照实施例7的方法热处理果胶,使用中和后的冷冻干燥物作为果胶的热处理产物。实施例36
使用10克绿茶、0.2克维生素C和1000毫升离子交换水,按照常法制备了绿茶。本发明品1使用实施例16记载的果胶热处理液Ⅰ,按照固形物计算,每100毫升产品中加入了50毫克。对照中没有加入热处理液。由20名评判员分五级(5:优良,1:差)进行评价,评价结果示于表22中。
表22感官评价
|
本发明品1 |
对照 |
味道的浓淡味道的多样性综合味道 |
4.13.84.1 |
3.23.43.3 |
从表22可知,与对照品相比,本发明品1味道变浓,味道的多样性好,茶叶的香味改善,具有余味的效果。实施例37
按照表23所示的比例,利用常法制备了含乙醇饮料。
表23 配比表
温州冷冻浓缩果汁(Brix度45) 110克
粒状蔗糖 80克
柠檬酸 2克
柠檬酸钠 0.5克
橙香精 2克
5(V/V)%乙醇水溶液 余量
合计 1000毫升
注:制备的饮料冷却到5℃后,利用苏打虹吸法使之含有碳酸。
本发明品2使用实施例16记载的果胶热处理产物Ⅰ,按照固形物计算,每100毫升制品加入了45毫克。对照中未添加热处理产物Ⅰ。与实施例36进行同样的感官评价,结果示于表24中。
表24感官评价
|
本发明品2 |
对照 |
味道的浓淡味道的多样性综合味道 |
3.94.03.9 |
3.32.73.0 |
如表24中所示,本发明品2与对照相比,本发明品2味道变浓。尤其是本发明品2的酸味变得更柔和,提高了密桔的味道。实施例38
本发明品3使用常法制备的清酒和实施例9记载的果胶热处理产物Ⅱ,按照固形物计算,每100毫升制品中加入了35毫克热处理产物。对照中没有加入果胶热处理产物。
按照与实施例36同样进行了感官评价。在评价项目中增加了香味和口感,其结果示于表25之中。
表25感官评价
|
本发明品3 |
对照 |
味道的幅度味道的多样性香味口感柔和度滑润度综合味道 |
3.83.42.93.84.03.6 |
3.02.92.92.62.92.8 |
从表25可以看出,本发明品3与对照相比,味道的幅度得到改善,口感提高,改善了这种嗜好品的口味和食感。实施例39
使用按照常法制备的料酒(みりん)和发酵调料,本发明品4(料酒)和5(发酵调料)使用了实施例16中记载的热处理液Ⅰ,按照固形物计算每100毫升制品加入了40毫克。对照使用未加入果胶热处理产物的。
感官评价按照与实施例36同样进行,结果示于表26中。
表26
|
料酒 |
发酵调料 |
|
本发明品4 |
对照 |
本发明品5 |
对照 |
味道的浓淡味道的多样性综合味道 |
3.83.53.6 |
3.03.03.1 |
2.92.72.8 |
2.42.12.2 |
表26说明,与对照相比,本发明品4和5在味道的多样性和浓淡上显示出提高的效果,可以用来制备具有很浓味道的调味品。实施例40
混合4.7千克鱼粉、0.8千克海藻、2.5千克芝麻。1.0千克食盐和0.5千克谷氨酸钠,按照常法造粒,制成鱼味调料粉(ふりかけ)。
本发明品6使用实施例9记载的热处理液Ⅱ,按照固形物计算每100克制品加入了1000毫克。对照中没有加入果胶热处理产物。将这些鱼味调料粉撒在米饭上,与实施例36同样进行感官评价。
评价结果发现,与对照相比,本发明品6含在口中时,能充分附着在米饭上,味道的多样性明显,而且味道柔和,能够综合提高鱼味调料粉的品质。实施例41
使用蔬菜、水果的热处理产物制成饮料。其配比示于表27之中。表27
胡萝卜(根茎部分) 200克
菠萝(果实) 500克
香蕉(果实) 500克
颗粒状蔗糖 76克
无水柠檬酸 2克
水 余量
合计 2000克
表27配料中使用的胡萝卜、菠萝、香蕉是市售品,充分搅拌、粉碎后制成泥状。本发明品是将胡萝卜、菠萝、香蕉分别在密闭状态下经121℃热处理4小时后,按照配比表混合制成饮料。
另外,对照是不经热处理而直接将粉碎物按照配比表混合制成对照饮料。本发明品和对照的感官评价与实施例36同样进行。结果示于表28中。
表28感官评价(平均值)
|
本发明品 |
对照 |
香气味道质感综合评价 |
3.54.04.34.0 |
3.02.63.22.8 |
评价 |
柔和,综合味道好,香味合一,口感柔和 |
没有柔和感,味道分离,香味多样性差,口感差、不细腻 |
表28说明,与对照相比,本发明品味道柔和、综合味道好、香味合一、口感柔和,因而制成了适于饮用的饮料。发明效果