DE10111165A1 - Verwendung von Hyaluronsäure-Uroniden zur Behandlung von entzündlichen Vorgängen - Google Patents

Verwendung von Hyaluronsäure-Uroniden zur Behandlung von entzündlichen Vorgängen

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Waltraut Hertel
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Abstract

Bekannt ist, dass bei der intrakorporalen Anwendung von hochmolekularer Hyaluronsäure sowie der niedermolekularen Oligohyaluronsäuren gesundheitsfördernde Wirkungen auftreten. Nachteilig ist die relativ schwache Wirkung, die hohe Viskosität der hochmolekularen Hyaluronsäurelösungen sowie die Gefahr der Übertragung infektiösen Materials tierischer Herkunft bei Anwendung der Oligohyaluronsäure, die aus der zur Hydrolyse eingesetzten Hyaluronidase stammen. DOLLAR A Die Erfindung beschreibt die intrakorporale Verwendung von niedermolekularen Hyaluronsäure-Uroniden biotechnischer Herkunft zur Behandlung von entzündlichen Vorgängen in Mensch und Tier.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von systemisch wirkenden Hyaluronsäure- Uroniden für die Behandlung von entzündlichen Prozessen bei Mensch und Tier. Die Erfindung kann mit Nutzen in der pharmazeutischen Industrie als auch für die Nahrungsmittel- und die Futtermittelindustrie eingesetzt werden.
Es ist bekannt, dass Hyaluronsäure in Mensch und Tier, bevorzugt dem monogastrischem Tier, eine Vielzahl die Gesundheit als auch das Befinden und das Aussehen fördernde Wirkungen entfaltet. Die hochmolekularen Hyaluronsäuren bewirkt im Körper vor allem mechanische Effekte. Insbesondere entwickeln sie wegen ihrer viskoelastischen Eigenschaften in der Synovialflüssigkeit einen die Gelenke schmierenden Effekt (US 4.801.619, US 5.972.909, US 5.079.236). In der Unterhaut bewirkt die hochmolekulare Hyaluronsäure den Turgor, der die Straffheit und damit für das jugendliche Aussehen verantwortlich ist. Durch Abbauprozesse, bei denen niedermolekulare Oligohyaluronsäuren entstehen, kann sich die Gleichgewichts­ konzentration der Hyaluronsäure in den Organen auf einem niedrigen, für die Gesundheit nachteiligen Pegel einstellen. Durch ein erhöhtes inkorporales Angebot an hochmolekularer aber auch von niedermolekularer Hyaluronsäure kann dieses Defizit ausgeglichen werden.
Nach JP 5.111.367 kann aus Hahnenkämmen ein Nahrungsmittel gewonnen werden, indem das Gewebe verschiedenen Reinigungs- und Aufschlußprozeduren unterworfen wird, wobei es auch zu einem partiellen Abbau der Hyaluronsäure kommt. Es wird darauf hingewiesen, dass Hyaluronsäure in Mensch und Tier bei inkorporaler Aufnahme eine Vielzahl von günstigen, die Gesundheit, insbesondere bei traumatischen Gewebe­ erscheinungen in Gelenkbereichen als auch das Befinden und Aussehen fördernde Wirkung entfaltet.
Eine Reihe von Schutzrechten beschreibt die topische Anwendung von Hyaluronsäure und deren Salzen bei Arthritiden durch intraartikuläre Injektion.
US 4.808.576 schützt systemisch wirkende Injektionspräparate, die injiziert oder topisch dermal an Stellen appliziert werden können, die nicht identisch mit dem Ort der traumatischen Gewebeveränderungen sind. Die Wirkungsorte bei der Heilung traumatisierter Gewebe unterscheiden sich von den Applikationsorten, z. B. erfordert die Behandlung von Arthritiden der Gelenke entsprechend US 4,808,576 keine intraarti­ kuläre Applikation.
Hyaluronsäure wird auch als die Verträglichkeit verbessernder Bestandteil in peritonal anzuwendenden Perfusionslösungen vorgeschlagen (JP 1.151.462).
DE 198 53 066 schützt niedermolekulare Fragmente der Hyaluronsäure (Oligohyaluron­ säuren) zur Herstellung von Impfstoffen, hergestellt durch Verdauung mit Hyaluronidase aus hochmolekularer Hyaluronsäure, und DE 198 339 113 setzt ebenfalls durch Ver­ dauung mit Hyaluronidase hergestellte niedermolekulare Hyaluronsäure bei der Herstellung von dendritischen Zellen ein. Darüber hinaus werden neben den Injektionspräparaten auch oral anzuwendende Präparate vorgeschlagen. In den Patentschriften wird ausgesagt, dass die polymeren Verbindungen den Magen-Darm- Kanal passieren und im Dünndarm durch die Darmwand weitgehend unzerstört absorbiert und über das Blut bzw. die Lymphe im Körper transportiert werden. Durch die erhöhte Versorgung mit Mucopolysacchariden kommt es zu einer gesundheits­ fördernden systemischen Wirkung besonders in Organen, in denen ein Hyaluronsäure­ defizit besteht.
Die orale Zuführung von Hyaluronsäure wird z. B. in JP 5.111.367 beschrieben. Die Hyaluronsäure wird aus Hahnenkämmen gewonnen, indem das Gewebe verschiedenen Reinigungs- und Aufschlußprozeduren unterworfen wird. JP 9.262.057 beschreiben eine Spezialnahrung, die u. a. Hyaluronsäure enthält und bei Halitosis empfohlen wird.
Ein die Gesundheit und Schönheit förderndes Nahrungsmittel enthält nach JP 10.165.138 spezielle Mucopolysaccharide und Nukleinsäuren. Die Mucopolysaccharide bestehen aus einem Komplex von Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat und Kollagen sowie Nukleinsäuren.
WO 97/25051 beschreibt Zubereitungen mit oral aufzunehmender Hyaluronsäure zur Verhinderung oder Vorbeugung von Krankheiten sowie therapeutische Zubereitungen bestehend aus Hyaluronan, einer Hyaluronsäure, die zusätzlich mit Formalin vernetztes Protein tierischer Herkunft insbesondere Vogelprotein enthält.
JP 11.124.401 schützt die Herstellung von Oligohyaluronsäuren mit Molmassen kleiner als 10.000 D mit einem Hyaluronsäure-abbauenden Enzym und setzt bei der Entfernung des Enzyms Ultrafiltermodule mit einem cut off nicht kleiner als 10.000 D ein. Auch JP 09.098.739 beschreibt die Herstellung von niedermolekularer Hyaluronsäure. Die Oligohyaluronsäuren bzw. niedermolekularen Hyaluronsäuren werden als Nahrungs­ zusatz oder für pharmazeutische und kosmetische Anwendungen, z. B. mit Wirkung gegen die Alterung der Haut vorgeschlagen.
RU 2.137.402 beschreibt eine spezielle Zusatz zu diätischer Nahrung, bestehend aus getrockneter Algenbiomasse mit einem Zusatz von Hyaluronsäure sowie gegebenenfalls Antioxydantien, Vitamin C und Stärke.
JP 10.056.983 setzt Hyaluronsäure oder Extrakte aus Hahnenkämmen ein, um die Textur von gelförmigen Nahrungsmittel zu verbessern. JP 4.197.145 verwendet Hyaluronsäure in einer Menge von 0,05 bis 0,8% zur Zubereitung stärkehaltiger Nahrungsmitteln wie Gebäck, gekochten Reis oder Kuchen. Auf diesem Weg wird nach dem Backprozess eine verbesserte Struktur erhalten und die Nahrungsmittel halten sich länger frisch.
Es besteht bei all den aus Tieren gewonnen Hyaluronsäure der gravierende Nachteil, dass durch die an sich für die Gesundheit günstige Zuführung von Hyaluronsäure es zu einer gleichzeitig stattfindenden Übertragung von infektiösem oder allergenen Material wie Viren, Prionen oder Nukleinsäuren kommen kann. Die tierischen Proteine, die als Verunreinigung immer dann vorhanden sind, wenn die Hyaluronsäure aus tierischem Material gewonnen wurde, können zu einer Antigenreaktion führen. Weiterhin besteht die Gefahr, dass es während des Sammeln der verderblichen tierischen Organe wie z. B. Hahnenkämme zu mikrobielle Infektionen in dem Material kommen kann, bei der mikrobielle Toxine auf die Konsumenten übertragen können. Diese Gefahr ist auch in tierischem Material, das zur Verhinderung mikrobieller Infektionen mit Formalin versetzt wurde, nicht aufgehoben. Im Gegenteil; es können dadurch tierische Bindungsproteine, die an Glycosaminoglycane binden, zusätzlich chemisch vernetzt werden. Sie sind dann als schwerlösliche und durch keine Reinigungsprozeduren zu entfernenden Verunreinigungen an diesem Material wie beispielsweise kommerziell gehandeltes Hyaluronan immobilisiert.
Nachteilig ist auch, dass die Wirkung der so gewonnenen Hyaluronsäure am traumatischen Gewebe nur sehr ungenügend charakterisiert ist.
Die Geweberesorption der in der Regel verwendeten Präparate von hochmolekularer Hyaluronsäure mit Molmassen zwischen etwa 100.000 D und etwa 2.500.000 D ist auf Grund der hohen Molmassen relativ gering; der größere Anteil wird über den Verdauungstrakt wieder ausgeschieden. Generell nachteilig an der hochmolekularen Hyaluronsäure ist weiterhin, dass sie in Injektionspräparaten auf Grund der hohen Viskosität ihrer wässrigen Lösungen nur bis zu einer Konzentration von 20 mg/ml eingesetzt werden kann.
Von den kleineren Bruchstücken der Hyaluronsäure ist sehr wahrscheinlich anzunehmen, dass sie besser resorbiert und über die Blutbahn oder das lymphatische System zu den Orten mit Mangelerscheinungen bzw. mit traumatischen Gewebeveränderungen gelangen. Es wird weiterhin angenommen, dass sie weniger mechanische Effekte sondern physiologische Wirkung hervorrufen.
In den Fällen, wo niedermolekulare Hyaluronsäure (Oligohyaluronsäuren) mit Molmassen kleiner als 100.000 D eingesetzt werden, wurde immer eine hydrolytische Spaltung der Hyaluromit Hyaluronidase vorgenommen, um die hochmolekulare Hyaluronsäure hydrolytisch unter Wasseranlagerung zu kleinen Bruchstücken zu zerlegen. Die Hyaluronidase wird z. Z. generell aus tierischem Gewebe insbesondere aus Rinderhoden gewonnen. Sehr nachteilig ist die Verwendung der Hyaluronidase tierischen Ursprungs wie z. B. aus Rinderhoden ist die Gefahr der Übertragung von infektiösem Material aus dem Tier auf den Anwender.
Als Alternative wurde in WO 0.038.647 das Enzym Hyaluronatlyase eingesetzt, um niedermolekulare Hyaluronsäurebruchstücke herzustellen. Auf Grund des spezifischen Spaltungsmechanismus dieses Enzyms entsteht in Δ-4,5-Stellung an dem Glucoronylrest eine Doppelbindung. Der Spaltung der Hyaluronsäure mit Hyaluronatlyase führt demnach zu chemischen Spaltprodukten, die sich von den Hydrolyseprodukten der Hydrolyse mit Hyaluronidase unterscheiden. Die Doppelbindungen nach Spaltung mit Hyaluronatlyase verändern die physiologischen Eigenschaften der Spaltprodukte. So ist sie beispielsweise verantwortlich für die besonderen radikalbindenden Eigenschaften des Uronids. Auf Grund dieser Wirkung wird in WO 0.038.647 die epidermal topische Anwendung von Formulierungen mit Hyaluronsäure-Uroniden zum Schutz, der Erhaltung bzw. Rekonstruktion der normalen Funktion und Struktur der menschlichen und tierischen Haut und/oder und zur Verhinderung umweltbedingter, einschließlich UV-bedingter Haut- bzw. Schleimhautschädigung durch UV-Strahlung beschrieben.
Es ist das Ziel der Erfindung, die Heilung von traumatischen Gewebe bzw. von Entzündungen, beispielsweise der Rheumatoidarthritis, wirksam zu fördern bzw. das Entstehen solcher Erscheinungen mit ihrer bekannten negativen Auswirkungen auf den Gesundheitszustand zu unterbinden und die Nachteile bekannter Vorgehensweisen bei der Versorgung von Mensch und Tier mit Hyaluronsäure oder Oligohyaluronsäuren als Wirkstoffkomponente zu umgehen.
Die der Zielstellung zugrunde liegende Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung von Hyaluronsäure-Uroniden als Wirkstoffe zur Behandlung von entzündlichen Vorgängen in menschlichen und tierischen Geweben, wobei die Uronide intrakorporal zugeführt werden und systemisch wirken. Erfindungsgemäß werden Uronide der Hyaluronsäure mit Molmassen kleiner als 80.000 D, bevorzugt mit Molmassen zwischen 5.000 und 30.000 D angewendet. Die Uronide enthalten weniger als 0,5%, bei Anwendungen in Injektionspräparaten weniger als 0,05% Proteine.
Kennzeichnendes Merkmal der Hyaluronsäure-Uronide ist ihre in vitro ausgewiesene, bisher nicht bekannte Wirkung, stärker angiogen und entzündungshemmend zu wirken als entsprechende Mengen an hochmolekularer Hyaluronsäure oder der mit Hyalu­ ronidase gewonnenen niedermolekularer Hyaluronsäure. Vorteilhaft an der Zuführung angiogen wirkender Hyaluronsäure-Uronide bei denen mit Hyaluronsäure-unterver­ sorgten Menschen und Tiere ist, dass bei Ihnen das Wachstum von Blutgefäßen in traumatisierten Geweben verbessert bzw. der Gesundheitszustand gefördert bzw. die Heilung beschleunigt wird. Durch die intrakorporale Verabreichung der Uronide wird erreicht, dass die Abbaurate der körpereigenen hochmolekularen Hyaluronsäure, die ein Pool für die günstige physiologische Wirkungen aufweisende körpereigene nieder­ molekulare Hyaluronsäure darstellt, reduziert wird. Durch die Zuführung externer Hyalu­ ronsäure-Uronide wird der Pool hochmolekularer Hyaluronsäure positiv beeinflußt, weil der natürliche Abfluß zu den niedermolekularen Hyaluronsäuren sich verringert. Weiterhin ist an der Verwendung der Uronide vorteilhaft, dass sie in wässriger Lösung für die erfindungsgemäße Anwendung keine nachteilige Viskosität erzeugen.
Die erfindungsgemäße Verwendung der Uronide ist neu; Hyaluronsäure-Uronide wurden bisher auch nicht für orale Applikationen oder als Injektionspräparate, Infusionslösungen oder Spüllösungen vorgeschlagen. Die angiogenen und entzündungshemmenden Eigenschaften der Uronide wurden noch nicht beschrieben. Die epidermal topischen Anwendungen als Radikalfänger bzw. die Anwendung als Schutz vor UV-Strahlen sind ausdrücklich nicht Teil der vorliegenden Erfindung.
Erfindungsgemäße Möglichkeiten der intrakorporalen Applikation der Uronide sind die Anwendung in Form eines Injektionspräparates, einer Spüllösung oder einer Infusions­ lösung, mit der die Uronide direkt ohne Umweg über den Verdauungstrakt in den Körper gelangen. Spüllösungen sind Lösungen, mit denen Körperhohlräume und Wund­ kavitäten gespült werden, um einen zweifachen Effekt zu erreichen, die Entfernung von schädlichen Substanzen und die Unterstützung der Heilung.
Bei der Anwendung in Form eines Injektionspräparates werden isotonische sterile Lösungen vorgeschlagen, die zwischen 1 mg/ml und 200 mg/ml Hyaluronsäure-Uronide enthalten.
Bei der Anwendung als Perfusions-, Infusions- oder Spüllösungen enthalten diese zwischen 0,1 g/l, und 100 g/l, Uronide sowie Hilfsstoffe und gegebenenfalls andere Wirkstoffe oder Arzneimittel. Als Lösemittel wird bevorzugt physiologische Kochsalzlösung eingesetzt.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Weg für die indirekten Darreichung ist die Zumischung der Uronide zu Nahrungsmittel bzw. Futtermittel. Hierzu werden in nichtverderblicher bzw. lagerstabiler, nicht entmischbarer und definierter Form vorliegende konzentrierte Uronide den Nahrungsmitte oder Futtermitteln in den unterschiedlichsten Stadien der Nahrungs- oder Futterzubereitung zugemischt. Sie können auch direkt in Nahrungsergänzern eingesetzt werden. Die Uronide werden als Nahrungsergänzer in feste Form, z. B. als Pulver, Pellets, Kapseln oder Tabletten oder flüssige Formulierungen wie Getränkezusätze, Fertiggetränke oder pastöse, gelförmige oder halbfester Form vorgeschlagen. Ohne damit die Erfindung einzuschränken, werden für Anwendungen am Menschen bis zu 30 g Uronid pro Tag ohne für die Gesundheit nachträgliche Erscheinungen pro 80 kg Körpergewicht empfohlen. In weiteren Ausführung werden β-Sitosterol, α-Tocopherol, Vitamine und/oder Lecithin zugesetzt. Für monogastrische Tiere können entsprechend ihres Gewichtes höhere Dosen angesetzt werden. Die Möglichkeit, eine so hohe Tagesdosis zu realisieren, stellt einen deutlichen Vorteil der Erfindung gegenüber der an sich bekannten oralen Aufnahme von hochmolekularer bzw. hochviskoser Hyaluronsäure dar.
Die Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Uronide erfolgt in jedem Fall in an sich bekannter Weise durch die Einwirkung einer endogen spaltenden Hyaluronatlyase aus Mikroorganismen, beispielsweise mit einer endo-Hyaluronatlyase aus einem Streptococcus. Das gereinigte Enzym wird in eine Lösung hochmolekularer Hyaluronsäure mit Molmassen größer als 500.000 D gegeben. Die Konzentrationen der Hyaluronsäure in den Lösungen beträgt zwischen 1 g/l bis 20 g/l,. Die Ausgangslösungen können durch Lösen von Hyaluronsäure in Wasser bzw. Pufferlösungen hergestellt werden. Eine wirtschaftlichere Möglichkeit der Herstellung besteht darin, von Hyaluronsäurelösungen auszugehen, die im Herstellungsprozeß der Hyaluronsäure anfallen. Vorteilhaft an der letzten Herstellungsvariante ist, dass ein Trocknungsschritt vermieden werden kann. Die Spaltungsreaktion wird durch eine Temperaturerhöhung über 50 C durch Denaturierung der Hyaluronatlyase unterbrochen.
Die Reaktion als auch das Reaktionsende wird photometrisch über die Bildung einer Doppelbindung in Δ-4,5-Stellung an dem Gluconylrest mit einem Absorptionmaximum bei 232 nm, verfolgt. Die Molmassen werden mit einer Laserlichtstreumethode berechnet.
In Anschluß an die Spaltung besteht die Möglichkeit, durch Zusatz von Proteasen, insbesondere mikrobieller oder pflanzlicher Herkunft die in Lösung vorhandenen Proteinverunreinigungen, darunter auch die denaturierte Hyaluronatlyase, zu hydrolysieren. Als Proteasen werden bevorzugt neutrale Proteasen pflanzlicher oder mikrobieller Herkunft eingesetzt. Die optional zugesetzten Proteasen oder andere, in der Hyaluronsäure noch anwesende hochmolekulare Verunreinigungen wie Lipoproteine, können durch Ultrafiltration mit einem Ultrafiltermodul entfernt werden, dessen cut off maximal um den Faktor 0,7 bis 0,3 niedriger sein kann als die mittlere Molmasse der Uronide. Das uronidfreie Retentat wird verworfen und der Durchlauf mit einem Ultrafilter konzentriert.
Zur Konzentrierung und partiellen Reinigung wird die Lösung oder das Retentat, welche die Uronide und möglicherweise Spaltprodukte der Proteasebehandlung enthält, durch Ultrafiltration über Ultrafiltermodule konzentriert. Überraschend wurde gefunden, dass der Ultrafilter bevorzugt einen cut off für die Retentatbildung aufweisen muß, der um den Faktor 15 bis 35 bis niedriger liegt als die mittlere Molmasse der nach dem enzymatischen Abbau vorliegenden Uronide.
Durch die Anreicherung mit einem Ultrafilter von 1 kD wird eine konzentrierte Uronidlösung mit einer mittleren Molmasse zwischen 20.000 und 30.000 D erhalten. Die Verwendung von Ultrafiltern mit einem größerem cut off, beispielsweise von 5 kD anstatt 1 kD führt erfahrungsgemäß zu erheblichen Verlusten der Uronide mit Molmassen 20.000 bis 30.000 D im Konzentrat. Uronide mit Molmassen größer als 80.000 können dagegen mit einem Ultrafilter mit einem cut off von 5 kD gereinigt werden. Bei der Herstellung eines für orale Anwendungen geeigneten Uronids mit Molmassen zwischen 20.000 und 30.000 D kann bei Verwendung ausreichend sauberer Hyaluronsäurepräparate der Schritt der Proteinentfernung durch Ultrafiltration entfallen. Die uronidhaltigen Konzentrate werden durch eine der Maßnahmen wie Ausfällen in Alkoholen wie beispielsweise Ethanol, Gefriertrocknen oder Sprühtrocknen in eine feste Form gebracht.
Nach Gefriertrocknung wird ein weißes Festprodukt erhalten, welches sich leicht in Wasser löst. In einem Ausführungsbeispiel wird das Konzentrat in Ethanol oder in Isobutanol ausgefällt. Das Festprodukt wird gesammelt und getrocknet.
Ausführungsbeispiel 1
Der Nachweis der angiogenen Wirkung der Hyaluronsäure-Uronide erfolgt mit einem Test zur Gefäßbildung an der Chorionallantois-Membran (CAM) des Hühnerembryos ex ovo. Dabei werden Uronide mit Molmassen von 30 kD, 100 kD und 235 kD werden auf einer mit 0,25%iger Natriumdodecylsulfat (SDS) irritierten CAM plaziert und nach 24 h die angiogene Reaktionen subjektiv beurteilt.
Befruchtete Hühnereier werden 3 Tage unter Standardbedingungen bebrütet. Am 3. Bruttag werden die Eier mit 70%igen Ethanol desinfiziert. Nach dem Tauchen in Ethanol werden die Eier einige Minuten an der Luft getrocknet. In dieser Zeit positioniert sich der Embryo in Normallage. Die Bruteier werden an der Unterseite aufgeschlagen und der Inhalt vorsichtig in sterile Petrischalen (20 mm Höhe, 200 mm Durchmesser) befördert. In jede Petrischale werden noch 2,5 ml Zellkulturmedium (89,5% Eagles minimum essential medium, 10% fötales Kälberserum, 500 IU/ml Penicillin und 50 µg/ml Streptomycin) gefüllt. Die schalenlosen Hühnerembryonen werden im Brutschrank bei 36,5 C und über 96% Luftfeuchte sowie 0,7% CO2-Konzentration weiter bebrütet.
Prüfablauf
Die Schädigung der CAM erfolgt ab 8. Bruttag mit 0,25%iger SDS (20 µl) an zwei unterschiedlichen Stellen. Etwa eine Stunde später wird auf die eine Schädigungsstelle Prüflösung (20 µl) oberflächlich aufgetragen, die zweite bleibt unbehandelt als Kontrolle. Nach 24 Stunden werden die CAM. Reaktion und die Gefäßneubildung subjektiv auf dem Farbmonitorbild verbal beurteilt.
Prüfdokumentation
Die Angiogenese der verletzten CAM wird mit dem Steriomikroskop 'Stemi 2000-C, Schott-Kaltlichtquelle 'KL 1500", Farbkamera 2 1-CCD, Typ: MC-1009S, Farbmonitor und JVC Videokassetenrecorder SR-S388E dokumentiert.
Die 30 kD, 100 kD und 235 kD Hyaluronsäure-Uronide beschleunigen deutlich die angiogenen Reaktionen in den ersten 24 Stunden nach CAM-Irritation der ex ovo bebrüteten Hühnerembryonen nach SDS-Behandlung.
Ausführungsbeispiel 2 2.1 Herstellung von Uroniden mit einer mittleren Molmasse von 25 kD
50 g Hyaluronsäure werden in 4,9 L 0,01 M Acetatpuffer pH 7,0 bei 4 C über Nacht unter Rühren gelöst. Anschließend wird die Lösung in einem Thermostaten unter Rühren auf 30 C erwärmt. Zur Spaltung werden dieser Lösung 100 ml einer Hyaluronatlyaselösung zugesetzt, die 1000 E Hyaluronatlyase/ml 0,01 M Acetatpuffer pH 7,0 enthält. Die Hyaluronatlyaseaktivität wird nach der oben beschriebenen Methode bestimmt. Die 100 ml Hyaluronatlyaselösung werden möglichst schnell untergemischt, wobei bereits nach 3 min die Viskosität der Hyaluronsäurelösung rapide abfällt. Es wird unter Rühren für 1 h bei 30 C inkubiert. Während der Spaltung werden kontinuierlich Proben entnommen und deren Extinktion bei 232 nm in 1 cm Küvetten vermessen. Nach der Inkubation von einer Stunde wird die Hyaluronatlyaseaktivität durch 5 minütiges Erhitzen auf 75 C inaktiviert. Nach Abkühlen der Lösung auf 40 C werden die Uronide in einer Ultrafiltration über ein Ultrafilter mit einem cut off von 1 kD (0,07 m2) auf ein 1/10 des Ausgangsvolumens konzentriert. Dabei werden gleichzeitig die Oligo- und Disaccharide abgetrennt. Das Konzentrat wird lyophilisiert und davon die Molmasse bestimmt.
2.2 Herstellung von Uroniden mit einer mittleren Molmasse von 80 kD
50 g Hyaluronsäure werden in 4,9 L 0,01 M Acetatpuffer pH 7,0 bei 4 C über Nacht unter Rühren gelöst. Anschließend wird die Lösung in einem Thermostaten unter Rühren auf 30 C erwärmt. Zur Spaltung werden dieser Lösung 100 ml einer Hyaluronatlyaselösung zugesetzt, die 100 E Hyaluronatlyase/ml 0,01 M Acetatpuffer pH 7,0 enthält. Die Hyaluronatlyaseaktivität wird nach der oben beschriebenen Methode bestimmt. Die 100 ml Hyaluronatlyaselösung werden möglichst schnell untergemischt, wobei nach 10 min die Viskosität der Hyaluronsäurelösung rapide abfällt. Es wird unter Rühren für 1 h bei 30 C inkubiert. Während der Spaltung werden kontinuierlich Proben entnommen und deren Extinktion bei 232 nm in 1 cm Küvetten vermessen. Nach der Inkubation von einer Stunde wird die Hyaluronatlyaseaktivität durch 5 minütiges Erhitzen auf 75 C inaktiviert. Nach Abkühlen der Lösung auf 40 C werden die Uronide in der Minisette durch Ultrafiltration über ein 5 kD Ultrafilter (0,07 m2) auf ein 1/5 des Ausgangsvolumens konzentriert. Dabei werden gleichzeitig die Oligo- und Disaccharide abgetrennt. Das Konzentrat wird lyophilisiert und davon die Molmasse bestimmt.
2.3 Bestimmung der Molmasse
Die Bestimmung der Molmasse erfolgt mit Hilfe der HPLC Chromatographie an PSSG Gel über eine HEMA Bio 2000 7.5 × 300 mm Säule.
2.4 Bestimmung von Hyaluronatlyase Lösungen
0,1 M Acetatpuffer pH 6,0:
8,1 g Natriumacetat werden in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert mit 1 M HCl auf pH 6,0 eingestellt und auf 1 l mit destilliertem. Wasser aufgefüllt.
Hyaluronsäurelösung
20 mg Hyaluronsäure werden in 100 ml 0,1 M Acetatpuffer pH 6,0 gelöst
CTA-Lösung
2,5 g Cetyltrimethylammoniumbromid werden in 100 ml 2%iger (2 g/100 ml) Natronlauge unter leichter Erwärmung gelöst.
Enzymbestimmung
Es werden in einer Mikrotiterplatte 50 µl 0,1 M Acetatpuffer pH 6,0 vorgelegt. Danach wird von 50 µl Probelösung eine geometrische Verdünnungsreihe angelegt und 50 µl Hyaluronsäurelösung hinzugefügt. Dieser Ansatz wird für 30 min bei 37 C inkubiert. Anschließend werden 200 µl CTA-Lösung hinzugefügt. Nach 10 Minuten wird die Platte im ELISA-Reader bei 600 nm vermessen. Die reziproke Verdünnung bei der 50% der Hyaluronsäure abgebaut werden, gibt die Aktivität der Hyaluronatlyase an.
Definition der Einheit
Eine Hyaluronatlyaseeinheit entspricht der Aktivität, die 0,05 mg Hyaluronsäure in 30 Minuten spaltet.
Ausführungsbeispiel 3
Die Spaltung der Hyaluronsäure wird entsprechend Ausführungsbeispiel 2.1 durchgeführt. Der Schritt der Ultrafiltration wird modifiziert. Es werden 50 Anson- Einheiten der Protease Bromelain (Merck Eurolab GmbH) zugesetzt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt. Anschließend wird die Lösung durch einen Ultrafilter mit einem cut off von 20 kD ultrafiltriert. Der Durchlauf wird anschließend mit einem Ultrafilter mit einem cut off von 1 kD auf ein Retentatvolumen von 3 l konzentriert. Das Konzentrat anschließend gefriergetrocknet und in Form von Lösungen inkorporal und als Lösung oder Beimengungen zu Nahrungs- und Futtermittel oral aufgenommen.
Ausführungsbeispiel 4
10 g Uronide mit einer durchschnittlichen Molmasse von 20 bis 30 kD werden mit 90 g Trockenmilchpulver, 0,2 g Lecithin, 0,02 g Tocopherol, 1 g β-Sitosterol und 2 g Saccharose durch gemeinsames Vermahlen gemischt und anschließend als Nahrungsergänzer oral aufgenommen.
Ausführungsbeispiel 5
90 g Cerealienstärke werden mit 10 g Hyaluronsäure-Uronid in Form ihres Natriumssalzes und 0,1 g einer Vitaminmischung gemischt und als Nahrungsergänzer oral aufgenommen.
Ausführungsbeispiel 6
Zur Herstellung einer etwa 50 mg/ml enthaltenden Injektionslösung werden 50 g Hyaluronsäure-Uronid einer mittlere Molmasse von 25.000 D in Form ihres Natriumsalzes in 1 l pyrogenfreier physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Die Lösung wird sterilfiltriert, als Injektionslösung in Ampullen abgefüllt und in Mensch oder Tier injiziert.
Ausführungsbeispiel 7
Zur Herstellung einer Lösung für Anwendungen bei der peritonalen Perfusion werden 1 g Glucose, 2 g Glycerol und 1 g Hyaluronsäure-Uronid in Form ihres Natriumsalzes in einem Liter Injektionswasser gelöst und mit mit Kochsalzlösung isotonisch eingestellt und sterilfiltriert.
Ausführungsbeispiel 8
100 g Hyaluronsäure-Uronid in Form ihres Natriumsalzes werden mit 100 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst und mit 0,02% Kaliumsorbat, 5 g Glukose und 0,1% Sorbinsäure versetzt. Die Azidität wird mit verdünnter Zitronensäure auf einen pH- Wert von 5,2 eingestellt. Bis zu 10 ml der Lösung werden täglich für die orale Aufnahme eines Erwachsenen empfohlen.

Claims (11)

1. Verwendung von Hyaluronsäure-Uroniden als Wirkstoffe zur Behandlung von entzündlichen Vorgängen in menschlichen und tierischen Geweben
2. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hyaluronsäure-Uronide Molmassen zwischen 1.000 D und 80.000 D und einen Proteingehalt von kleiner als 0,5% aufweisen.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hyaluronsäure-Uronide intrakorporal zugeführt werden.
4. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Hyaluronsäure-Uronide um Substanzen handelt, die aus Hyaluronsäure bzw. Hyaluronat biotechnischer Herkunft durch Einwirkung mikrobieller Hyaluronatlyasen hergestellt werden.
5. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hyaluronsäure-Uronide in intravenös, subkutan oder intramuskulär anzuwendenden isotonischen Injektionslösungen eingesetzt werden, welche die Uronide in Konzentrationen zwischen 1 mg/ml und 200 mg/ml enthalten und welche weniger als 0,05% Protein, bezogen auf die eingesetzten Uronide, enthalten.
6. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hyaluronsäure-Uronide in Form von isotonischen Perfusions-, Spül- oder Infusionslösung eingesetzt werden, welche die Uronide in Konzentrationen zwischen 0,1 mg/ml und 100 mg/ml enthalten
7. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hyaluronsäure-Uronide. Nahrungsmitteln bzw. Tierfutter zugemischt werden.
8. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hyaluronsäure-Uronide in Nahrungsergänzern eingesetzt und diese gegebenenfalls Tocopherole und/oder β-Sitosterol enthalten.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Hyaluronsäure-Uronide in gelöster Form eingesetzt werden.
10. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hyaluronsäure-Uronide in fester Form als Pulver, Pellets, Kapseln oder Tabletten oder in pastöser bis gelförmiger halbfester Form eingesetzt werden.
11. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bis zu 30 g Hyaluronat-Uronid Tagesdosis pro 80 kg Lebendgewicht gegeben werden.
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