CN1212162C - 一种人工皮肤的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种人工皮肤的制备方法,属于医用材料制备技术领域。本发明以壳聚糖/甲壳素为主要原料,经过脱泡、干燥成膜、冷冻、用氨水浸泡,清洗、干燥成海绵状的人工皮肤,再经消毒灭菌后待用。使用时可用壳聚糖弱酸溶液、壳聚糖/PLGA/EDC、血清蛋白等涂抹与人体组织接触的海绵层表面以增加海绵的粘附性。本发明的方法工艺简单,所制产品不仅价格低廉,适合大众化生产、使用,而且与人体皮肤的柔软性接近,在湿态下也能保持一定的形态和强度。能与创面紧贴、粘附性和透气性良好、能吸收从创面流出的渗出液,且无不良反应。不但能促进伤口愈合,更能促进肉芽生长、血管化,在伤口愈合面达到最小的结痂;也便于消毒、灭菌、贮存,防止细菌感染。
Description
技术领域
本发明涉及一种人工皮肤的制备方法,属于生物医学材料制备技术领域。
背景技术
甲壳质(Chitin)是甲壳素和壳聚糖的统称。1811年法国Braconnot(Muzzarelli RAA.Chitin,Pergamen Press Ltd,Oxford,1977)从菌类中提出的一种类似纤维素结构的物质,因其大量存在于低等动物特别是节肢动物(如虾、蟹昆虫等)的甲壳中而得名。是一种维持和保护甲壳动物及微生物躯体的不溶于水、碱和常规溶剂的线性氨基多糖,常与蛋白质以共价键形式结合存在。每年海洋动物源产甲壳素近十亿吨,是一种取之不尽、用之不竭的再生资源。壳聚糖(Chitosan)是甲壳素的脱乙酰化产物,其结构N-乙酰氨基吡喃糖与细胞外基质中的糖胺聚糖(GAGs)组成类似,此碱性多糖具有独特的分子结构特征、化学性质及生物功能。壳聚糖具有良好的生物相容性和生物可降解性,降解产物为对人体无毒的N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖,降解过程中产生的中间产物在体内不积累,无免疫源性(姜雪松,王勃生等。生物医学工程学杂志,1996:13(4):353.)。近年来,随着研究的深入和广泛,壳聚糖已经被广泛应用于生物医学领域,如透析膜、可吸收缝线、药物释放载体、固定化酶载体等。有些项目已具有生产价值和实用意义。
人工皮肤是一种再生能力很强的组织,即使是大面积的损伤,也会由于治疗得当而逐渐恢复。但是,大面积的烧伤或创伤,就不能单靠自身皮肤或自体移植皮肤来愈合,需要人造皮肤作为治疗过程中的一种暂时性的创面保护覆盖材料来帮助。
用合成材料或胶原蛋白等制成的人造皮肤,已经在临床上使用多年,但没有一种能比较全面地满足以上条件。然而壳聚糖或甲壳素制成的人工皮肤,目前可认为是一种较理想的材料。它柔软、舒适,与创面的贴合性好,既透气,又吸水,具有抑止疼痛和止血的功能,有抑菌消炎作用,随着创伤慢慢愈合,自身皮肤生长,能自行溶解而被机体吸收。免除了揭除时流血多及病人的痛苦,也不会留下碎屑而延缓伤口的愈合,相反会促进皮肤再生,对治疗高热创伤特别有效。从20世纪40年代开始,就已有人研究壳聚糖人造皮肤了。日本开发了甲壳素无纺织物Beschitin W(BCW)创伤敷料,厚度为0.12mm,具有止血、止痛、抗溶化及促进表皮形成等功能。用于1度和2度烧伤,有效率高达90%,对3度烧伤,疗效也达53%(蒋挺大.甲壳素.化学工业出版社,2003.538)。Katakura-Chikarina制药公司(北海道,日本)开发了壳聚糖-胶原复合材料人工皮肤,以治疗创伤或烧伤。我国青岛海洋大学和青岛医学院研制的人造皮肤,除了壳聚糖和胶原蛋白掺用外,还加入了中药有效成分,收到了良好的效果。Sparkes等人(Sparkes B G,Murray D G.US Patent.4572906.1986)等人用壳聚糖、明胶和甘油制成了一种人造皮肤,能抑制伤口的收缩,防止严重烧伤的伤口产生硬伤疤。用壳聚糖、明胶、肝素等制成的复合人造皮肤,对修补伤口虽取得了一定的效果,但仍存在修复速度慢,愈合效果不够理想等缺陷。同时上述人造皮肤造价昂贵,难以被常人接受。
发明内容
本发明的目的是提供一种人工皮肽的制备方法,该方法制备工艺简单,可大幅度降低人工皮肽的成本,同时制得的人工皮肤透气、吸湿、柔软、舒适、抗菌、与伤口粘附性好,涵盖了以往人工皮肤的所有优点。兼顾了修复效果好与价格低廉两大优势,可适合大众化生产、使用。
本发明的技术方案如下:
一种人工皮肤的制备方法,其特征在于该方法按如下步骤进行:
(1)以壳聚糖或甲壳素为原料分别配成重量百分比浓度为0.5~5%溶液,壳聚糖溶液以弱酸为溶剂,甲壳素溶液以三氯乙酸/氯代烃为溶剂;
(2)将所制部分溶液倒在平板聚四氟乙烯、玻璃或聚苯乙烯上,在20~70℃下干燥成保护膜;
(3)再将部分所配壳聚糖/甲壳素溶液倒在培养皿中,迅速冷冻结冰形成0.5~4毫米的冰块;
(4)将步骤(2)中制备的保护膜,贴在由步骤(3)制备的冰块上,再迅速冷冻结冰后冻干,制成海绵层;
(5)用氨水或氨水/乙醇、氨水/丙酮或氨水/甲醇混合溶液浸泡由步骤(4)制备的样品,蒸馏水冲洗干净,然后再冻干、消毒后备用。
本发明所述原料可采用壳聚糖与胶原、壳聚糖与明胶、壳聚糖与聚乙烯醇的混合物,壳聚糖与所加入的胶原、明胶或聚乙烯醇的重量比为1~50∶1。
本发明中配制壳聚糖弱酸溶液所用溶剂采用稀盐酸、醋酸、甲酸、丙酸、乳酸或马来酸中的任一种。
为增加所得产品的机械强度,本发明在所配制的溶液中也可加入重量比为0.5~5%的增塑剂;所述的增塑剂采用甘油或山梨醇。
本发明的技术特征还在于:在步骤(5)中冻干前的海绵层中加入重量比0.1~1%的纤维蛋白原、聚氨基酸、肝素、透明质酸、聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物、凝血酶、生长因子或促进皮肤愈合的中草药有效成分。其中纤维蛋白原、聚氨基酸也可加在上述步骤(3)中冻干前的溶液中,肝素、透明质酸也可溶于氨水或氨水与醇类的混合液中。
该人工皮肤在使用时还可用壳聚糖弱酸溶液、明胶/PLGA/EDC、壳聚糖/PLGA/EDC、羧甲基纤维素水溶液、血清蛋白涂抹与人体组织接触的海绵层表面以增加海绵的粘附性。
在上述样品的海绵层中还可加入由患者的骨髓干细胞或其它组织培养出来的表皮细胞或血管内皮细胞的悬浮液,用于加速伤口愈合速度。
本发明与现有技术相比,具有以下有点及突出性效果:该方法制备工艺简单,成本低廉,适合大众化生产、使用。用本发明提供的方法所制备的人工皮肤,经动物实验表明,这种人工皮肤与人体皮肤的柔软性接近,在湿态下也能保持一定的形态和强度。能与创伤面紧贴、粘附性较强而不脱落;同时透气性良好、能吸收从创伤面流出的渗出液,且无不良反应。不但能促进伤口愈合,更能促进肉芽生长、血管化,在伤口愈合面达到最小的结痂。也便于消毒、灭菌、贮存,防止细菌感染,完全可以与现有人工皮肤相媲美。
具体实施方式
本发明提供的一种人工皮肤的制备方法,是以壳聚糖或甲壳素为原料,或者是在壳聚糖或甲壳素中加入一种或两种其它的生物可降解材料的复合物为原料,例如:壳聚糖与胶原、壳聚糖与明胶、甲壳素与聚乙烯醇的混合物,其中壳聚糖/甲壳素与所加入的生物可降解材料的重量比为1~50∶1。把上述原料制成溶液,溶液所用的溶剂根据所用原料的不同而有所不同。以壳聚糖为原料,可采用稀盐酸、醋酸、马来酸、乳酸作为溶剂,制成弱酸溶液,溶液的浓度范围为0.5~5%;若以甲壳素为原料,其溶剂采用三氯乙酸或三氯乙酸/氯代烃,其浓度范围在浓度为0.5~5%。
在冻干前的溶液中或海绵层中可以入少量(0.1~1%)的纤维蛋白原、复合聚氨基酸(如聚丙氨酸、聚谷氨酸-γ-酯、聚天冬氨酸-β-酯、聚赖氨酸、聚酪氨酸、聚缬氨酸、聚亮氨酸)、肝素、透明脂酸、聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物PLGA)、凝血酶、各种生长因子(如表皮生长因子、纤维生长因子、细胞识别因子)、促进皮肤愈合的中草药有效成分(如甙VI、甙VII);或由患者的骨髓干细胞或其它组织培养出来的表皮细胞或血管内皮细胞的悬浮液,用于加速伤口愈合速度。
所用壳聚糖的脱乙酰度为1~100%,分子量为5000~600000道尔顿;通过选用不同脱乙酰度的甲壳素/壳聚糖或海绵层的机械强度来控制海绵在体内的降解时间。
本发明用氨水或氨水/乙醇、氨水/丙酮或氨水/甲醇浸泡所制备的海绵层,氨水的浓度可为20%-100%;也可用甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、丁酮浸泡。浸泡海绵层后,用蒸馏水冲洗干净,然后再冻干、用Co60消毒后,即可制成人工皮肤。
使用时,将上述步骤制备的海绵层样品可以直接与人体组织接触,也可以在海绵层与人体组织接触一面涂抹粘附剂,例如壳聚糖弱酸溶液(可用碳酸氢钠调节pH)、明胶/PLGA/EDC、壳聚糖/PLGA/EDC、羧甲基纤维素水溶液、血清蛋白等,用于促进人工皮肤与创伤面的结合。
下面的实施例将对本发明做进一步说明。
实施例1:
将一部分脱乙酰度为50%、分子量为5000道尔顿的壳聚糖溶解在为0.5%的醋酸溶液中,制成浓度为2%的壳聚糖溶液,静止脱泡,倒在平板聚四氟乙烯上,在室温下干燥成0.1mm厚的包护膜;将另一部分壳聚糖酸溶液倒在培养皿中,迅速冷冻结冰形成1毫米厚的壳聚糖冰块;将制备得壳聚糖膜,剪成适当得大小,贴在壳聚糖冰块上,再迅速冷冻结冰后冻干,形成双层结构的复合物。用纯氨水浸泡所制备的样品,再用蒸馏水冲洗干净,然后再冻干、Co60消毒、备用。使用时直接将上述制品放在伤口表面,海绵层在下,薄膜层在上。
实施例2:
将脱乙酰度为70%的、分子量为为10000道尔顿的壳聚糖溶解在0.1M的稀盐酸酸溶液中,脱去气泡,倒在平板聚四氟乙烯上,在60℃度下干燥形成保护膜;将壳聚糖酸/胶原(5∶1)溶液装在玻璃容器中,迅速冷冻结冰形成3毫米厚的冰块。将制备的壳聚糖保护膜,剪成适当得大小,贴在壳聚糖酸/胶原冰块上,再迅速冷冻结冰后冻干。用含有1%的肝素的氨水/甲醇(10∶3)溶液浸泡所制备的样品(5分钟)后,蒸馏水冲洗干净。然后再冻干、Co60消毒、备用。
使用时上述样品用明胶/聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物(PLGA)/碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液(100∶100∶1)涂抹伤口表面或涂在海绵层表面,促进样品粘附性。
实施例3:
将脱乙酰度为20%、分子量为590000道尔顿的甲壳素,溶解在三氯乙酸溶剂中,制成浓度为1%的甲壳素溶液,脱去气泡,将所制部分溶液倒在平板聚苯乙烯上,在室温下干燥成保护膜;
将所制的另一部分溶液中加入0.5%的纤维蛋白原及1%的山梨醇,分装在容器冷冻结冰。将制备的甲壳素膜,剪成适当得大小,贴在甲壳素/纤维蛋白/山梨醇冰块上,再迅速冷冻结冰后冻干制成0.2mm厚的包护膜加3mm厚的海绵层双层结构。用氨水/丙酮(9∶1)浸泡5分钟后,蒸馏水冲洗干净,然后在海绵层中加入1%的透明质酸,再冻干、Co60消毒、备用。
使用中可用少量1%的羧甲基纤维素水溶液涂抹甲壳素/纤维蛋白海绵附着面,以增强海绵的粘附性。
实施例4:
将一部分1%的壳聚糖(脱乙酰度为80%)甲酸溶液与5%的明胶水溶液按5∶1比例混匀,脱去气泡,将所制部分溶液倒在平板玻璃上,在室温下干燥成保护膜;
将另一部分壳聚糖/明胶溶液分装在容器冷冻结冰。将制备的壳聚糖/明胶膜,剪成适当得大小,贴在壳聚糖/明胶冰块上,再迅速冷冻结冰后冻干制成3mm厚的海绵层加保护膜双层复合结构。用氨水/甲醇(9∶1)浸泡5分钟后,蒸馏水冲洗干净,然后海绵层中再加入1%的凝血酶,冻干、Co60消毒、备用。
使用时将伤口渗出液揭干,用1%的壳聚糖醋酸溶液(用碳酸氢钠调节溶液pH至5左右)涂抹海绵层。海绵层在下,薄膜层在上贴在烧伤处。
实施例5:
将1%的甲壳素(脱乙酰度为30%,分子量为500000)三氯乙酸/氯代烃(3∶1)溶液与10%聚乙烯醇水溶液混合均匀,脱去气泡,将一部分甲壳素/聚乙醇酸溶液倒在平板玻璃上,在室温下干燥成保护膜;
将另一部分甲壳素/聚乙醇酸溶液分装在容器冷冻结冰。将制备的甲壳素/聚乙醇酸剪成适当得大小,贴在甲壳素/聚乙醇酸冰块上,再迅速冷冻结冰后冻干制成3mm厚的海绵层加保护膜双层复合结构。含有透明质酸(1.5%)的氨水浸泡5分钟后,蒸馏水冲洗干净,然后海绵层中再加入1%表皮生长因子及1%的聚丙氨酸(三氯甲烷溶液),冻干、Co60消毒、备用。
使用中壳聚糖海绵可用1%的血清蛋白水溶液涂抹创伤面,以增强样品的粘附性。
实施例7:
将脱乙酰度为50%的、分子量为为300000道尔顿的壳聚糖溶解在0.1M的稀盐酸酸溶液中,脱去气泡,倒在平板玻璃上,在60℃度下干燥形成保护膜;将壳聚糖酸/胶原(10∶1)溶液装在玻璃容器中,迅速冷冻结冰形成2毫米厚的冰块。将制备的壳聚糖保护膜,剪成适当得大小,贴在壳聚糖酸/胶原冰块上,再迅速冷冻结冰后冻干。用80%氨水浸泡20分钟后,蒸馏水冲洗干净。然后加入0.5%的甙VI,冻干、Co60消毒、备用。
使用时上述样品可用壳聚糖/PLGA/EDC溶液涂抹伤口表面,或涂抹在海绵层表面促进样品与创伤面的结合。
壳聚糖/PLGA/EDC胶粘剂的配制:将等量的壳聚糖醋酸溶液和PLGA的1,4-二氧六环溶液混合,37℃下预热后加入一定量的EDC的水溶液中即可。使用时将上述液体滴于伤口表面涂抹开后将上述样品放上。海绵层朝下,紧贴伤口或皮层。
实施例8:
将脱乙酰度为90%的、分子量为为80000道尔顿的壳聚糖溶解在0.1M的马来酸溶液中,脱去气泡,倒在平板聚四氟乙烯上,在70℃度下干燥形成保护膜;将壳聚糖酸/胶原(10∶1)溶液装在玻璃容器中,迅速冷冻结冰形成2毫米厚的冰块。将制备的壳聚糖保护膜,剪成适当得大小,贴在壳聚糖酸/胶原冰块上,再迅速冷冻结冰后冻干。用60%氨水浸泡20分钟后,蒸馏水冲洗干净。然后加入0.5%的甙VI,冻干、Co60消毒、备用。
使用中壳聚糖海绵可用明胶/PLGA/EDC胶粘剂涂抹创伤面,以增强海绵层的粘附性。
明胶/PLGA/EDC胶粘剂的配制:将等量的明胶水溶液和PLGA氯仿溶液混合,37℃下预热后滴于出血处。随即加入少量的EDC的磷酸缓冲液或水溶液,最后贴上止血海绵。
实施例9:
将脱乙酰度为70%的、分子量为为200000道尔顿的壳聚糖溶解在50%的乳酸溶液中,脱去气泡,倒在平板聚四氟乙烯上,在60℃度下干燥形成保护膜;将另一部分壳聚糖酸溶液装在玻璃容器中,迅速冷冻结冰形成3毫米厚的冰块。将制备的壳聚糖保护膜,剪成适当得大小,贴在壳聚糖酸冰块上,再迅速冷冻结冰后冻干。用含有1%肝素的甲醇溶液浸泡所制备的样品(5分钟)后,蒸馏水冲洗干净。然后在海绵层再冻干、Co60消毒、备用。
使用时上述样品可用纤维蛋白胶粘剂涂抹伤口表面,促进样品与创伤面的结合。
纤维蛋白胶粘剂的配制:将1g猪(血)纤维蛋白原37℃下溶于约10mL的蒸馏水中制成溶液A。将5000单位的人的凝血酶溶于由1mL 0.5M氯化钙(CaCI2),4mL抑肽酶(5000KIE)及7mL蒸馏水配制成的B溶液中。使用前将相同体积的A液和B液混合均匀,取一定量剂涂抹于出血处或伤口周围,然后贴上止血海绵。
使用前可将胎儿表皮细胞悬浮液滴入海绵层,以加速伤口愈合速度。
用2度烧伤的大鼠实验表面,上述样品(2cm×2cm)四周后降解代之以修复完好的新生皮肤。
Claims (7)
1.一种人工皮肤的制备方法,其特征在于该方法按如下步骤进行:
(1)以壳聚糖或甲壳素为原料分别配成重量百分比浓度为0.5~5%溶液,壳聚糖溶液以弱酸为溶剂,甲壳素溶液以三氯乙酸/氯代烃为溶剂;
(2)将所制部分溶液倒在平板聚四氟乙烯、玻璃或聚苯乙烯上,在20~70℃下干燥成保护膜;
(3)将部分所配壳聚糖酸/甲壳素溶液倒在培养皿中,迅速冷冻结冰形成0.5~4毫米的冰块;
(4)将步骤(2)中制备的保护膜,贴在由步骤(3)制备的冰块上,再迅速冷冻结冰后冻干,制成海绵层;
(5)用氨水或氨水/乙醇、氨水/丙酮或氨水/甲醇混合溶液浸泡由步骤(4)制备的样品,蒸馏水冲洗干净,然后再冻干、消毒后备用。
2.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:所述原料可采用壳聚糖与胶原、壳聚糖与明胶、壳聚糖与聚乙烯醇的混合物,壳聚糖与所加入的胶原、明胶或聚乙烯醇的重量比为1~50∶1。
3.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:所述的弱酸采用稀盐酸、醋酸、甲酸、丙酸、乳酸或马来酸中的任一种。
4.按照权利要求1、2或3所述的方法,其特征在于:在所配制的溶液中加入重量比为0.5~5%的增塑剂,所述的增塑剂采用甘油或山梨醇。
5.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:在步骤(5)中冻干前的海绵层中加入重量比0.1~1%的纤维蛋白原、聚氨基酸、肝素、透明质酸、聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物、凝血酶、生长因子、促进皮肤愈合的中草药有效成分;其中纤维蛋白原、聚氨基酸还可加在上述步骤(3)中冻干前的溶液中;肝素、透明质酸还可溶于氨水或氨水与醇类的混合液中。
的纤维蛋白原、聚氨基酸也可加入步骤(3)中冻干前的溶液中或
6.按照权利要求1所述的的方法,其特征在于:该人工皮肤在使用时还可用壳聚糖弱酸溶液、明胶/PLGA/碳二亚胺盐酸盐、壳聚糖/PLGA/碳二亚胺盐酸盐、羧甲基纤维素水溶液或血清蛋白涂抹与人体组织接触的海绵层表面。
7.按照权利要求1或5所述的的方法,其特征在于:在上述样品的海绵层中还可加入由患者的骨髓干细胞或其它组织培养出来的表皮细胞或血管内皮细胞的悬浮液。
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