CN1299833A - 抗人血管内皮生长因子单链抗体及其制备方法 - Google Patents

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王大章
杨西川
郑光勇
房思炼
李扬
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Abstract

本发明涉及用于治疗人体肿瘤的抗人血管内皮生长因子(VEGF)单链抗体(ScFv)及其设计与制备。制备了VEGF合成肽从而建立抗人VEGF单克隆抗体(MAb)杂交瘤细胞株。此MAb具有稳定的生物学活性和明显的抑瘤作用。对MAb可变区轻、重链基因进行RT－PCR扩增,用DNA片段进行连接,构建抗人VEGF ScFv基因。最终获得ScFv的高效表达,经测定证实抗人VEGF ScFv分子量小、对肿瘤组织穿透力强,免疫原性低,能阻遏肿瘤血管生成的抗肿瘤作用。

Description

抗人血管内皮生长因子单链抗体及其制备方法
本发明涉及用于治疗人体肿瘤的抗体，特别是用于抗人血管内皮生长因子的单链抗体及其制备方法。
肿瘤生长依赖血管生成，抑制肿瘤血管生成可以有效地遏制肿瘤生长。血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor VEGF)在诱导肿瘤血管生成过程中起着最关键的作用，因此，阻断VEGF活性可显著抑制肿瘤生长。在“Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesissuppresses tumor growth in vivo.”(Nature,1993；362(6423)：841-844))中Kim等首次公开了抗VEGF单克隆抗体可抑制荷瘤鼠肿瘤生长。但鼠源单抗易诱发人抗鼠抗体(HAMA)免疫反应，难以用于临床。在“Humanization of an anti-vascular endothelial factor monoclonal antibody for the therapy of solid tumorsand other disorders.”(Cancer Res.1997；57：4593-4599)中Leonard等从分泌上述单抗的杂交瘤细胞株中克隆出抗体可变区基因。构建了人-鼠嵌合抗体Fab，又通过计算机模建及定点突变方法，将Fab人源化．获得低免疫源性，同时又保持原亲本抗体生物学活性的人源化Fab，但Fab是一个异二聚体不适合于包涵大量表达，不易于构建抗体融合蛋白。目前研究最多的是单链抗体(ScFv)，其优越性在于可通过包涵体大量表达，易于基因工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白。近来，美国重组DNA顾问委员会(RAC)已批准了2项用单链抗体来治疗疾病的临床试验。但至今尚未见有抗人VEGF单链抗体的报道。
本发明的目的正是为了克服上述现有技术中的不足之处而提供一种分子量小、对肿瘤组织穿透力强，而自身免疫源性低的抗人血管内皮生长因子(VEGF)单链抗体(ScFv)及其制备方法，该抗人血管内皮生长因子单链抗体通过其阻遏人体肿瘤组织血管内皮生长因子的高表达，达到抑制肿瘤血管生成的抗肿瘤生长的目的。
本发明所设计的抗人血管内皮生长因子单链抗体的基因及氨基酸序列为：
                                                                         60GAG GTG CAG CTT CTG GAG TCT GGG GCA GAG CTT GTG AAG CCA GGG GCC TCA GTC AAG TTGGlu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu
                                                                        120TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT AAA GAC ACC TAT ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGGSer Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg
                                          CDR1
                                                                        180CCT GAA CAG GGC CTG GAG TGG ATT GGA AGG ATT GAT CCT GCG AAT GGT AAT ACT AAA TATPro Glu Gln Gly Leu Glu Tro Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr
                                           52a            CDR2
                                                                        240GAC CCG AAG TTC CAG GGC AAG GCC ACT ATA ACA GCA GAC ACA TCC TCC AAC ACA GCC TACAsn Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
                                                                        300CTG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT GCT AGG CCA TCTGln Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Ser
            82a 82b 82c
                                                                        360ATT TAC TAC GGT AGT AAC CAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA GGA ACC TCA GTC ACCIle Tyr Tyr Gly Ser Asn His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val ThrCDR3           100a100b100c100d100e100fGTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCGVal Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
                                       Linker
                                                                         60GAC ATT GTG CTG ACA CAG TTT CCT GCT TCC CTT AGC GTA TTT TTG GGG CAG AGG GCC ACCAsp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ala Ser Leu Ser Val Pro Leu Gly Gln Arg Ala Thr
                                                                        120ATT TCA TGC AGG GCC AGC CAA AGT GTC AGT ACA TAT GGC TAT AGT TAT ATG CAC TGG AACIle Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn
                           27a 27b 27e 27d CDR1
                                                                        180CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AGA CTC CTC ATT TAT CTT GTA TCC AAC CTA GAA TTTGln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Phe
                                                           CDR2
                                                                        240GGG GTC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CATGly Val Pro Ala Arg Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Asn Ile His
                                                                        300CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAC ATT AGG GAG CTT CCG TACPro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Pro Tyr
                                                         CDR3
ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATC AAA
Thr Pro Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
上述抗人血管内皮生长因子单链抗体含249个氨基酸，分子量为26648.1道尔顿，等电点为5.90，是由三部分组成，即抗体可变区轻、重链和连结肽。该三部分共同完成识别和结合抗原(VEGF)，发挥阻断VEGF生物活性的作用。其三维结构图见图1。
制备上述抗人血管内皮生长因子单链抗体的方法是：将现有技术蛋白质二级结构预测方案、亲水方案及抗原指数方案相结合，设计了以人VEGF189N端26个氨基酸残基为模板的一段多肽，并在ABI431固相自动合成仪(Applied-Biosystems PE公司，美国)上合成，纯度为97.4％。按常规方法建立了抗人VEGF合成肽单克隆抗体(MAb)杂交瘤细胞株(定名为E11)。将E11杂交瘤细胞株进行培养、传代，重悬后接种于小鼠腹腔，12天后吸取腹水。而后采用快速批次吸附法纯化鼠腹水中的抗人VEGF MAb，并采用超滤膜透析方式进行浓缩。经测定，抗人VEGF MAb含量为2.4mg/ml，属IgG2b(γ,κ2b)。此MAb具备良好的抗原特异性和较高的抗原亲和力，并能有效地抑制人颊癌BCaCD885和鼠肉瘤S180的血管生成和肿瘤生长。在此基础上，对前述的生长良好，能持续、稳定分泌抗人VEGF MAb的杂交瘤细胞株E11(体外培养半年)提取总RNA，分别针对VL和VH基因设计两条和五条引物，而后进行PCR扩增，克隆了MAb的可变区基因片段。用编码亲水性多肽接头的DNA片段((GGGGS)3)将E11单克隆抗体轻、重链可变区基因连接，转导入PET-15YV(Novagen公司)载体，而后导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。进而针对以包涵体(IBS)形式表达的抗人VEGF ScFv表达***[PET-15YV/BL21(DE3)]、包涵体的分离、变性与复性等制备环节进行生产工艺改进。获得了占菌体总蛋白表达量52.9％的包涵体高效表达和48mg/ml的高产率。抗人VEGF ScFv采用Westemblot，间接ELISA法和竞争ELISA法证实能分别与VEGF合成肽、VEGF165特异性结合，反应滴度分别达8×10-3和5×10-5；且其对VEGF的亲和力与原亲本单克隆抗体相近。同时，还测定出抗人VEGF ScFv的重要属性之一－等电点为5.90。还对抗人VEGF单链抗体对移植颊癌组织穿透力及在荷人颊癌裸鼠血清中滞留的变化分别与抗人VEGF单克隆抗体(MAb)进行相应比较研究。结果发现：抗人VEGF ScFv颊癌组织穿透力(速度)大大高于抗人VEGF MAb(48∶1)；其1小时内的血清清除率约为抗人VEGF MAb的10倍。这些结果说明：抗人VEGF ScFv作为一种成功的小分子基因工程抗体，具有对肿瘤组织穿透力强而在血清中滞留时间短的特性，是一种理想的肿瘤免疫治疗和放射免疫治疗的抗体物质及放射自显影成像的理想载体，具有广泛的用途。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1．分子量小，对实体瘤穿透力强；
2．易于构建抗体融合蛋白；
3．适于包涵体大量表达；
4．制备程序简单，易于操作，效率高；
5．与抗原形成的抗原抗体复合物更易被消除，适合发挥抗体阻断VEGF的作用；
6．用于细胞内免疫，可作为基因治疗的一种方案；
7．标记核素，可用于免疫影像学诊断及治疗；
8．免疫源性小，减少HAMA反应的可能性，并可进一步人源化。
以下是说明书附图的图面说明：
图1是本发明抗人VEGF单链抗体(ScFv)三维模建结构图。图中黄色为抗原识别部位，绿色为骨架区，粉色为连接肽，Lignt Chain：轻链；Heavy Chain：重链；Linker：连接肽。
图2是本发明抗人VEGF单克隆抗体(MAb)对小鼠BCaCD885移植瘤的抑瘤作用。图中1．生理盐水组；2．MAb腹腔注射给药组(100μg/d)；3．MAb瘤周皮下注射给药组(200μg/d)。
图3是本发明抗人VEGF单克隆抗体(MAb)对小鼠S180移植肉瘤的抑瘤作用。图中1．生理盐水组；2．MAb腹腔注射给药组(100μg/d)；3．MAb腹腔注射给药组(200μg/d)；4．MAb瘤周皮下注射给药组(200μg/d)；5．5-Fu腹腔注射给药组。
图4是本发明VH VL PCR扩增产物凝胶电泳。图中A：VH；B：Marker，由下至上依次为657,(458,434),328,289,267bp C：VL。
图5是本发明重组质粒PET15-YV酶切鉴定。图中A：NcoⅠ+NotⅠ+BamHⅠ切下VL及VH+Linker；B：Marker。
图6是本发明分泌表达质粒PET15-YV的构建。
图7是本发明抗人VEGF单链抗体基因测序载体的构建。
图8是本发明PET15-YV的表达及纯化15％SDS-PAGE结果。图中A：低分子量蛋白标准；B：PET15-YV全菌；C：PET15-YV上清；D：PET15-YV包涵体。
图9是本发明低分化颊癌组织VEGF免疫组化染色(ScFv)癌巢呈深棕色。
本发明以下将结合实施例作进一步详述：
实施例1．人VEGF189合成肽的设计和制备：将现有技术蛋白质二级结构预测方案、亲水方案及抗原指数方案相结合，设计了以人VEGF189N端26个氨基酸残基为模板的一段多肽，根据前三项综合判断，总结为表一，共发现6个连续性表位，标为：P1(10-22),P2(27-36),P3(39-49),P4(66-75),P5(78-95),P6(103-112)。人VEGF189第75位氨基酸为谷氨酰胺，系糖基化位点，多糖可能掩盖该位点，故P4可不考虑。为增加成功率，首选N-端的P1，因末端比中间更柔韧、更亲水。结合VEGF二级结构，21-25有一个β-转角，因转角常在已知蛋白质和多肽中作识别位点，故结合肽应设计为P10-25，肽段长度与其抗原性呈正比，最终合成肽确定为N-端1-26残基(26位系半胱氨酸，为与载体蛋白的共价结合点)。以下为人VEGF189的氨基酸序列：
APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFK
PSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSF
LQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRYKSWSVPCG
PCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR
表1
方案 预测的VEGF表位
抗原指数 10-19 27-36 40-49 66-75 82-91 103-112
亲水 15-21 31-37 42-48 76-82 91-97
易接近度 7-13 18-24 36-42 70-76 84-90 107-113
综合判断 10-22 27-36 39-49 66-75 78-95 103-112
抗人VEGF合成肽在ABI431固相自动合成仪(Applied-Biosystems PE公司，美国)上合成，纯度为97.4％。
实施例2.抗人VEGF合成肽单克隆抗体(MAb)杂交瘤细胞株的建立及抗人VEGF合成肽MAb的制备：采用实施例1所制备的合成肽作为抗原，按常规方法建立了抗人VEGF合成肽单克隆抗体(MAb)杂交瘤细胞株(定名为E11)。将E11杂交瘤细胞株进行培养、传代，重悬后接种于小鼠腹腔，12天后吸取腹水。而后采用快速批次吸附法纯化鼠腹水中的抗人VEGF MAb，并采用超滤膜透析方式进行浓缩。经测定，抗人VEGF MAb含量为2.4mg/ml，属IgG2b(γ,κ2b)。此MAb具备良好的抗原特异性和较高的抗原亲和力，并能有效地抑制人颊癌BCaCD885和鼠肉瘤S180的血管生成和肿瘤生长(见图2、图3)。
实施例3.抗人VEGF单链抗体(ScFv)的构建、表达及活性鉴定：在实施例1和实施例2的基础上，对前述的生长良好，能持续、稳定分泌抗人VEGFMAb的杂交瘤细胞株E11(体外培养半年)提取总RNA，分别针对VL和VH基因设计两条和五条引物，而后进行PCR扩增，克隆了MAb的可变区基因片段。抗人VEGF单克隆抗体轻链和重链可变区核苷酸及其氨基酸推导序列如下：
                                                                             60
GAG GTG CAG CTT CTG GAG TCT GGG GCA GAG CTT GTG AAG CCA GGG GCC TCA GTC AAG TTG
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu
                                                                            120
TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT AAA GAC ACC TAT ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG
Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg
                                               CDR1
                                                                            180
CCT GAA CAG GGC CTG GAG TGG ATT GGA AGG ATT GAT CCT GCG AAT GGT AAT ACT AAA TAT
Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp lle Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr
                                               52a             CDR2
                                                                            240
GAC CCG AAG TTC CAG GGC AAG GCC ACT ATA ACA GCA GAC ACA TCC TCC AAC ACA GCC TAC
Asn Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
                                                                            300
CTG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT GCT AGG CCA TCT
Gln Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Ser
            82a 82b 82c
                                                                            360
ATT TAC TAC GGT AGT AAC CAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA GGA ACC TCA GTC ACC
Ile Tyr Tyr Gly Ser Asn His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val Thr
   CDR3           100a100b100c100d100e100f
GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
                                           Linker
                                                                             60
GAC ATT GTG CTG ACA CAG TTT CCT GCT TCC CTT AGC GTA TTT TTG GGG CAG AGG GCC ACC
Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ala Ser Leu Ser Val Pro Leu Gly Gln Arg Ala Thr
                                                                            120
ATT TCA TGC AGG GCC AGC CAA AGT GTC AGT ACA TAT GGC TAT AGT TAT ATG CAC TGG AAC
Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn
                               27a 27b 27c 27d CDR1
                                                                            180
CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AGA CTC CTC ATT TAT CTT GTA TCC AAC CTA GAA TTT
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Phe
                                                               CDR2
                                                                            240
GGG GTC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CAT
Gly Val Pro Ala Arg Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Asn Ile His
                                                                            300
CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAC ATT AGG GAG CTT CCG TAC
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Pro Tyr
                                                             CDR3
ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATC AAA
Thr Pro Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
表2
Figure 9911749500131
用编码亲水性多肽接头的DNA片段((GGGGS)3)将E11单克隆抗体轻、重链可变区基因连接，转导入PET-15YV(Novagen公司)载体，而后导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
(1)抗人VEGF单链抗体(ScFv)的基因构建：
根据轻、重链可变区的酶切图谱及构建载体PET-15S(含有E-tag)的酶切位点，设计PCR引物(表2)中P5-P8。VH以P5、P6为引物，P6含连接肽序列。VL以P7-P8为引物，分别用已克隆的VH及VL为模板进行PCR扩增。扩增产物经电泳纯化回收。纯化的VH及VL分别酶切、再纯化后连接，最后用P5、P8行PCR扩增，即得到ScFv全基因序列。
(2)抗人VEGF单链抗体(ScFv)的基因表达
将ScFv及载体PET-15S分别用同一对酶(NcoⅠ,NotⅠ)进行酶切，连接后转化DH5α，菌液PCR挑选阳性克隆，抽提质粒行酶切分析。将经筛选的质粒命名为PET15-YV，将PET15-YV转化BL21(DE3)。挑选阳性克隆。表达菌株的诱导培养、SDS-PAGE、超声破菌、分别取上清及沉淀，确定表达产物的形式。稀释法复性单链抗体。①包涵体的获得5000×g，离心15分收集100ml菌体(1mM IPTG诱导，37℃培养3.0小时)。以5ml GTE(0.3mmol/L蔗糖；25mmol/L Tris.HCL,pH8.0；25mmol/L EDTA)重悬，再次离心收菌，以3mlGTE重悬。加入溶菌酶(10mg/ml)400μl，颠倒混匀30分；加入100μl脱氧胆酸钠(40mg/ml),30μl MgCl2(1mol/L),10μl DNaseⅠ(1mg/ml)，混匀至菌体由稠变稀。12000rpm离心10分，弃上清，沉淀用STET(0.1mol/L NaCl-10mmol/L This·HCl pH8.0),1mmol/L EDTA,0.5％Triton-X 100)洗涤3次，再用3.5mol/L尿素的TE溶液洗涤2次。5000×g离心5分弃沉淀；12000rpm离心10分弃上清。沉淀为包涵体，用于变性、复性。②变性、复性：用1ml变性液(0.1mol/L Tris·HCl,pH8.0；6mol/L)盐酸胍；2mmol/L EDTA；0.5％β-羟基乙醇)溶解包涵体，室温放置2.0小时，30000×g离心15分，取上清，测定样品的蛋白含量，用变性液将其浓度调整为10mg/ml。取上清1ml，快速加入到100ml的复性液(0.1mol/L Tris·HCl,pH8.0；0.5mol/L L-精氨酸，50μlmol/L CuSO4；2mmol/L EDTA)，10℃至少保温24小时。③透析、浓缩：将样品装入透析袋中，以2000ml透析液(0.1mol/L尿素；20mmol/L Tris·HCl,pH8.0；25mmol/L NaCl)于4℃透析12小时，并以磁棒搅伴之。再用PBST(PBS+1％Triton-X100)透析24小时。20％PEG20000(PBS配制)浓缩。
(3)抗人VEGF单链抗体(ScFy)的序列测定
将获正确表达带的菌种，抽提质粒PET15-YV，将其中的ScFv序列用一对酶切EcoRⅠ,XholⅠ)下，PUC19用EcoRⅠ及SalⅠ酶切，因XholⅠ与SalⅠ酶切的粘性末端互补，因此，即可将ScFy克隆入PUC19中，进行全自动双向测序。
(4)抗人VEGF单链抗体(ScFv)的活性鉴定及免疫组化
取颊癌组织标本，分化程度较好(高、中分化)16例，分化程度差(低分化)4例，共20例。染色后约5μm的石蜡切片，脱蜡后先经0.3％H2O2甲醇溶液浸泡30’，然后滴加正常羊血清，37℃下10’，一抗先后为ScFv复性原液及鼠Anti-E tag antibody，二抗为兔抗鼠-HRP，室温反应1小时后洗涤，以含有DAB及H2O2的底物液显色，显微镜下棕色着染为阳性，深棕色为强阳性。
经以上实验所得结果：
①E11可变区基因(VH,VL)的克隆及序列测定
经RT-PCR，VL及VH均得已扩增，扩增VH的3’端引物为GH4，琼脂糖凝胶电泳显示两者的区带位置分别在430及370左右，与预计大小相符。序列测定结果，VL基因全长333bp，编码111个氨基酸，归属小鼠轻链可变区基因第Ⅲ亚组。VH基因全长369bp，编码123个氨基酸，归属小鼠重链可变区基因Ⅱ(A)亚组。(见图4)
②抗人血管内皮生长因子单链抗体基因的构建
根据轻、重链的可变区基因序列设计引物P5-P8，分别对VL及VH进行扩增，其中重链可变区的边接肽(GGGGS)3基因相连。因VH的3’端及VL的5’端均引入了BamHⅠ位点，经T4连接酶连接，用P5,P8行PCR扩增，即得到完整的ScFv全基因序列。电泳结果为760的条带。将ScFv基因克隆表达载体PET-15(S)中，转化之后挑阳性克隆，抽提质粒酶切鉴定(图5)。鉴定结果表明，VH-linker-VL已连接并定向克隆在PET-15S中，命名为PET15-YV。PET15-YV的构建如(见图6)。
③抗人VEGF单链抗体基因的序列测定
单链抗体基因序列测定载体的构建见图7。DNA自动测序证明，获得表达的PET15-YV中ScFv基因序列阅读框架正确。
④抗人VEGF单链抗体基因的表达
BL21(DE3)感受态经含单链抗体基因的PET15-YV转化，在0.2mmol/L IPTG终浓度的诱导下，主要以包涵体的形式获得大量表达。包涵体占总蛋白的40％。SDS-PAGE显示在接近分子量30KD处有一强表达带(见图8)。包涵体经变性复性后，进行透析、浓缩。
⑤抗人VEGF单链抗体的活性鉴定
用免疫组织化学方法，检测包涵体复性产物对20例颊癌及正常组织的石蜡切片的特异反应，检测结果表明，ScFv对颊癌组织的特异性反应与原亲本抗体相同。除4例高分化标本未见阳性反应外，余16例均为阳性反应，其中4例低分化标本呈强阳性。(见图9)
实施例4：根据实施例1-3所得到的抗人血管内皮生长因子单链抗体的基因及氨基酸序列为：
                                                                             60
GAG GTG CAG CTT CTG GAG TCT GGG GCA GAG CTT GTG AAG CCA GGG GCC TCA GTC AAG TTG
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu
                                                                            120
TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT AAA GAC ACC TAT ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG
Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg
                                               CDR1
                                                                            180
CCT GAA CAG GGC CTG GAG TGG ATT GGA AGG ATT GAT CCT GCG AAT GGT AAT ACT AAA TAT
Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr
                                               52a             CDR2
                                                                            240
GAC CCG AAG TTC CAG GGC AAG GCC ACT ATA ACA GCA GAC ACA TCC TCC AAC ACA GCC TAC
Asn Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
                                                                            300
CTG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT GCT AGG CCA TCT
Gln Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Ser
            82a 82b 82c
                                                                            360
ATT TAC TAC GGT AGT AAC CAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA GGA ACC TCA GTC ACC
Ile Tyr Tyr Gly Ser Asn His Trp Tyr Phe Asp val Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val Thr
   CDR3           100a100b100c100d100e100f
GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
                                           Linker
                                                                             60
GAC ATT GTG CTG ACA CAG TTT CCT GCT TCC CTT ACC GTA TTT TTG GGG CAG AGG GCC ACC
Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ala Ser Leu Ser Val Pro Leu Gly Gln Arg Ala Thr
                                                                            120
ATT TCA TGC AGG GCC AGC CAA AGT GTC AGT ACA TAT GGC TAT AGT TAT ATG CAC TGG AAC
Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn
                               27a 27b 27c 27d CDR1
                                                                            180
CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AGA CTC CTC ATT TAT CTT GTA TCC AAC CTA GAA TTT
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Phe
                                                               CDR2
                                                                            240
GGG GTC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CAT
Gly Val Pro Ala Arg Pro 5er Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Asn Ile His
                                                                            300
CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAC ATT AGG GAG CTT CCG TAC
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Pro Tyr
                                                             CDR3
ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATC AAA
Thr Pro Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
实施例5：抗人VEGF单链抗体的三维结构模建：根据实施例4所得到的抗人血管内皮生长因子单链抗体，其总长度为249个氨基酸残基。N-端为VH结构域(123个残基)，中间为连接区(15个残基)，C-端为VL结构域(111个残基)。一级结构序列为(划线序列为连接区)：
EVQLLESGAELVKPGASVKFSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGR
IDPRNGNTKYLGLNQGKATITATDSSNTAYQQLSSLTSEDTAVYYCARPSI
YYGSSHSYFDVWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQFPASLSVF
LGQRATISCRASQSVSTYGSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLEFGVPARF
SGSGSGTDSTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELPYTFGGGTKLEIK
抗体轻、重链三维结构的模建主要利用Biosym的同源蛋白质模建***(homology)在SGI计算机图形工作站上进行。其主要步骤如下：在蛋白质数据(Brookhaven protein data bank,PDB)库中搜索同源蛋白；用同源蛋白结构叠加以确定结构保守区(SCR区)和结构表面的回折部分(LOOP区)；模建蛋白与同源蛋白序列联配以确定模建蛋白的SCR区和LOOP区；安装侧链；对模建结构进行分子力学及动力学优化；对模建结构进行合理性验证。发现实施例4所得到的抗人血管内皮生长因子单链抗体由三部分，即组成抗体可变区轻、重链和连结肽。该三部分共同完成识别和结合抗原(VEGF)，发挥阻断VEGF生物活性的作用。其三维结构图见图1。
实施例6．抗人血管内皮生长因子单链抗体可做为模板，根据其核苷酸序列及氨基酸一级结构和三维空间构型进行改建(包括人源化方案)，成为肿瘤免疫治疗及放射免疫治疗的抗体物质。

Claims (4)

1．一种抗人血管内皮生长因子单链抗体，其特征在于：1．1抗人血管内皮生长因子(VEGF)单链抗体(ScFv)的基因及氨基酸序列为：
GAG GTG CAG CTT CTG GAG TCT GGG GCA GAG CTT GTG AAG CCA GGG GCC TCA GTC AAG TTG
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu
                                                                            120
TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT AAA GAC ACC TAT ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG
Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg
                                               CDR1
                                                                            180
CCT GAA CAG GGC CTG GAG TGG ATT GGA AGG ATT GAT CCT GCG AAT GGT AAT ACT AAA TAT
Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr
                                               52a             CDR2
                                                                            240
GAC CCG AAG TTC CAG GGC AAG GCC ACT ATA ACA GCA GAC ACA TCC TCC AAC ACA GCC TAC
Asn Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
                                                                            300
CTG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT GCT AGG CCA TCT
Gln Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Ser
            82a 82b 82c
                                                                            360
ATT TAC TAC GGT AGT AAC CAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA GGA ACC TCA GTC ACC
Ile Tyr Tyr Gly Ser Asn His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val Thr
   CDR3           100a100b100c100d100e100f
GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
                                          Linker
                                                                             60
GAC ATT GTG CTG ACA CAG TTT CCT GCT TCC CTT AGC GTA TTT TTG GGG CAG AGG GCC ACC
Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ala Ser Leu Ser Val Pro Leu Gly Gln Arg Ala Thr
                                                                            120
ATT TCA TGC AGG GCC AGC CAA AGT GTC AGT ACA TAT GGC TAT AGT TAT ATG CAC TGG AAC
Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Tyr Mer His Trp Asn
                               27a 27b 27c 27d CDR1
                                                                                               180
CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AGA CTC CTC ATT TAT CTT GTA TCC AAC CTA GAA TTT
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Phe
                                                               CDR2
                                                                            240
GGG GTC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CAT
Gly Val Pro Ala Arg Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Asn Ile His
                                                                            300
CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAC ATT AGG GAG CTT CCG TAC
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Pro Tyr
                                                             CDR3
ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATC AAA
Thr Pro Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys1．2 抗人血管内皮生长因子单链抗体含249个氨基酸，分子量为26648.1道
尔顿，等电点为5.90，1．3 上述抗人血管内皮生长因子单链抗体由三部分组成，即抗体可变区轻、重
链和连结肽，该三部分共同完成识别和结合抗原(VEGF)，发挥阻断
VEGF生物活性的作用，其三维结构图见图1，
2．一种获得权利要求1所述的抗人血管内皮生长因子单链抗体的制备方法：其特征在于：
2．1 人VEGF189合成肽的设计和制备：将现有技术蛋白质二级结构预测方
案、亲水方案及抗原指数方案相结合，设计了以人VEGF189N端26个氨
基酸残基为模板的一段多肽，根据前三项综合判断，并采用固相化学合
成法在ABI431固相自动合成仪(Applied-Biosystems PE公司，美国)上合
成，纯度为97.4％，人VEGF189氨基酸序列为：
APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFK
PSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSF
LQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRYKSWSVPCG
PCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR2．2 抗人VEGF合成肽单克隆抗体(MAb)杂交瘤细胞株的建立及抗人
VEGF合成肽MAb的制备：采用2.1所制备的合成肽作为抗原，按常规
方法建立了抗人VEGF合成肽单克隆抗体(MAb)杂交瘤细胞株(定名为
E11)。将E11杂交瘤细胞株进行培养、传代，重悬后接种于小鼠腹腔，12
天后吸取腹水，而后采用快速批次吸附法纯化鼠腹水中的抗人VEGF
MAb，并采用超滤膜透析方式进行浓缩，经测定，抗人VEGF MAb含量
为2.4mg/ml，属IgG2b(γ,κ2b)，此MAb具备良好的抗原特异性和较高
的抗原亲和力，并能有效地抑制人颊癌BCaCD885和鼠肉瘤S180的血
管生成和肿瘤生长，2．3 抗人VEGF单链抗体(ScFv)的构建、表达及活性鉴定：在2．1和2．2的
基础上，对前述的生长良好，能持续、稳定分泌抗人VEGF MAb的杂交
瘤细胞株E11(体外培养半年)提取总RNA，分别针对VL和VH基因设
计两条和五条引物，而后进行PCR扩增，克隆了MAb的可变区基因片
段，用编码亲水性多肽接头的DNA片段((GGGGS)3)将E11单克隆抗体
轻、重链可变区基因连接，转导入PET-15YV(Novagen公司)载体，而后
导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，进而针对以包涵体(IBS)形式表
达的抗人VEGF ScFv表达***[PET-15YV /BL21(DE3)]、包涵体的
分离、变性与复性等制备环节进行生产工艺改进，获得了占菌体总蛋白表
达量52.9％的包涵体高效表达和48mg/ml的高产率，
抗人VEGF单克隆抗体重链可变区核苷酸及其氨基酸推导序列如
下：
                                                                             60
GAG GTG CAG CTT CTG GAG TCT GGG GCA GAG CTT GTG AAG CCA GGG GCC TCA GTC AAG TTG
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu
                                                                            120
TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT AAA GAC ACC TAT ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG
Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg
                                              CDR1
                                                                            180
CCT GAA CAG GGC CTG GAG TGG ATT GGA AGG ATT GAT CCT GCG AAT GGT AAT ACT AAA TAT
Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr
                                               52a             CDR2
                                                                            240
GAC CCG AAG TTC CAG GGC AAG GCC ACT ATA ACA GCA GAC ACA TCC TCC AAC ACA GCC TAC
Asn Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
                                                                            300
CTG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT GCT AGG CCA TCT
Gln Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Ser
            82a 82b 82c
                                                                            360
ATT TAC TAC GGT AGT AAC CAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA GGA ACC TCA GTC ACC
Ile Tyr Tyr Gly Ser Asn His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val Thr
   CDR3           100a100b100c100d100e100f
GTC TCC TCA
Val Ser Ser抗人VEGF单克隆抗体轻链可变区核苷酸及其氨基酸推导序列如下：
                                                                             60
GAC ATT GTG CTG ACA CAG TTT CCT GCT TCC CTT AGC GTA TTT TTG GGG CAG AGG GCC ACC
Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ala Ser Leu Ser Val Pro Leu Gly Gln Arg Ala Thr
                                                                            120
ATT TCA TGC AGG GCC AGC CAA AGT GTC AGT ACA TAT GGC TAT AGT TAT ATG CAC TGG AAC
Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn
                               27a 27b 27c 27d CDR1
                                                                            180
CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AGA CTC CTC ATT TAT CTT GTA TCC AAC CTA GAA TTT
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Phe
                                                               CDR2
                                                                            240
GGG GTC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CAT
Gly Val Pro Ala Arg Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Asn Ile His
                                                                            300
CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAC ATT AGG GAG CTT CCG TAC
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Pro Tyr
                                                             CDR3
ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATC AAA
Thr Pro Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
3．根据权利要求1所述一种抗人血管内皮生长因子单链抗体，其特征在于：该单链抗体可作为放射免疫治疗及放射自显影成像的载体。
4．根据权利要求1所述一种抗人血管内皮生长因子单链抗体，其特征在于：该单链抗体可做为模板，根据其核苷酸序列及氨基酸一级结构和三维空间构型进行改建(包括人源化方案)，成为肿瘤免疫治疗及放射免疫治疗的抗体物质。
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