CN118291394A - 一种肺炎克雷伯菌噬菌体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种肺炎克雷伯菌噬菌体及其应用，涉及微生物技术领域。所述肺炎克雷伯菌噬菌体为肺炎克雷伯菌噬菌体(Klebsiella pneumonia phagesp.)PKP K9，保藏编号为CCTCC M2024833，保藏时间为2024年04月30日。本发明提出一种肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9，该菌株能够特异性地裂解致病性肺炎克雷伯菌，具有宽裂解谱、高裂解活性以及良好的理化因子耐受性特征；其作为细菌的天敌，其裂解能力不受细菌耐药性的影响，也不破坏动物体内正常菌群构成，而且不存在药物残留等的问题，具有很高的使用安全性，在防治耐药性肺炎克雷伯菌感染中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种肺炎克雷伯菌噬菌体及其应用。
背景技术
肺炎克雷伯菌是一种革兰氏阴性菌，在环境中广泛分布，可引起多种类型的感染，如肺炎、***、败血症、脑膜炎、肝脓肿等。所有的哺乳动物以及许多其它脊椎动物甚至无脊椎动物都对肺炎克雷伯菌易感。近年来，肺炎克雷伯菌已成为仅次于大肠杆菌的第二大条件致病菌，严重威胁公共卫生安全及人类健康。鉴于肺炎克雷伯菌的耐药性问题日益严重，耐药菌快速传播带来人类-动物-环境中耐药因子的水平转移风险升高，动物养殖面临着更高的群体感染风险和耐药性挑战。
噬菌体作为一种专性侵染细菌的病毒，能够通过独特的裂解机制侵染对其易感的特定种属细菌，相对于抗生素具有多种优点，如杀伤细菌不受细菌耐药性影响，特异性强，不影响机体内正常的菌群结构；资源丰富、研发周期短、成本低等。噬菌体疗法已经开始应用于人群耐药菌感染的防治，取得了可喜的成果，在农业、养殖业和工业生物防治领域(如石油工业)中也备受青睐。尤其是在养殖业，噬菌体制剂能有效控制动物体内及环境中的病原菌，大幅减少抗生素使用，保障食品安全，促进绿色、可持续的养殖业发展，具有深远意义。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种肺炎克雷伯菌噬菌体及其应用，旨在提供一种肺炎克雷伯菌噬菌体，该噬菌体裂解谱宽、裂解性能强、理化因子耐受性好、不携带有害基因。
为实现上述目的，本发明利用采集自山东省多个养殖场的环境样品，以多株致病性肺炎克雷伯菌为宿主菌，从其中筛选、分离纯化得到一株肺炎克雷伯菌噬菌体(Klebsiella pneumonia phage sp.)PKP K9。本发明分离纯化得到的肺炎克雷伯菌噬菌体已经在中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号为CCTCC M2024833，保藏时间为2024年04月30日。
本发明还提出一种如上所述的肺炎克雷伯菌噬菌体在制备用于防治由致病性肺炎克雷伯菌引起的疾病或污染的生物制剂中的应用。
在一实施方式中，所述致病性肺炎克雷伯菌包括犬源、狐源、兔源肺炎克雷伯菌中的至少一种。
在一实施方式中，所述致病性肺炎克雷伯菌包括K2、K5、K20型肺炎克雷伯菌中的至少一种。
本发明还提出一种噬菌体制剂，所述噬菌体制剂包括如上所述的肺炎克雷伯菌噬菌体作为活性成分。
在一实施方式中，所述噬菌体制剂为液体制剂、冻干制剂、片状制剂中的一种。
本发明还提出一种如上所述的噬菌体制剂在饲料添加剂和/或饮用水添加剂中的应用。
本发明还提出一种如上所述的噬菌体制剂在环境消毒剂或环境清洁剂中的应用。
本发明的技术方案中，提出一种肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9，该菌株是从自然界中分离得到的一株新的噬菌体，具有宽宿主谱特征、高裂解活性以及良好的理化因子耐受性特征；其作为细菌的天敌，能够特异性地裂解致病性肺炎克雷伯菌，而不会破坏正常菌群构成，并且不受细菌耐药性的影响，也不存在药物残留等的问题，具有很高的使用安全性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的噬菌斑形态图；
图2为本发明提供的肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的透射电镜图；
图3为本发明提供的肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的pH稳定性结果图；
图4为本发明提供的肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的热稳定性测定结果图；
图5为本发明提供的肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的紫外线稳定性测定结果图；
图6为本发明提供的肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的一步生长曲线测定结果图；
图7为本发明提供的肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的体外抑菌实验测定结果图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
肺炎克雷伯菌是一种革兰氏阴性菌，在环境中广泛分布，可引起多种类型的感染，如肺炎、***、败血症、脑膜炎、肝脓肿等。所有的哺乳动物以及许多其它脊椎动物甚至无脊椎动物都对肺炎克雷伯菌易感。近年来，肺炎克雷伯菌已成为仅次于大肠杆菌的第二大条件致病菌，严重威胁公共卫生安全及人类健康。鉴于肺炎克雷伯菌的耐药性问题日益严重，耐药菌快速传播带来人类-动物-环境中耐药因子的水平转移风险升高，动物养殖面临着更高的群体感染风险和耐药性挑战。
噬菌体作为一种专性侵染细菌的病毒，能够通过独特的裂解机制侵染对其易感的特定种属细菌，相对于抗生素具有多种优点，如杀伤细菌不受细菌耐药性影响，特异性强，不影响机体内正常的菌群结构；资源丰富、研发周期短、成本低等。噬菌体疗法已经开始应用于人群耐药菌感染的防治，取得了可喜的成果，在农业、养殖业和工业生物防治领域(如石油工业)中也备受青睐。尤其是在养殖业，噬菌体制剂能有效控制动物体内及环境中的病原菌，大幅减少抗生素使用，保障食品安全，促进绿色、可持续的养殖业发展，具有深远意义。
鉴于此，本发明利用采集自山东省多个养殖场的环境样品，以多株致病性肺炎克雷伯菌为宿主菌，从其中筛选分离、纯化得到一株肺炎克雷伯菌噬菌体。本发明分离纯化得到的肺炎克雷伯菌噬菌体已经在中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号为CCTCC M2024833，保藏时间为2024年04月30日。
该菌株是从自然界中分离得到的一株新的噬菌体，具有宽宿主谱特征、高裂解活性以及良好的理化因子耐受性特征；其作为细菌的天敌，能够特异性地裂解致病性肺炎克雷伯菌，而不会破坏正常菌群构成，并且不受细菌耐药性的影响，也不存在药物残留等的问题，具有很高的使用安全性。
具体地，本发明提供的肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的分离方法如下：
以34株肺炎克雷伯菌临床分离株为宿主菌，对养殖场采集的粪便样品进行噬菌体的分离。取20g粪便样品于50mL离心管中，加入30mL LB液体培养基中37℃浸泡4h后，4000rpm离心30min，取20mL上清液于新的离心管中，分别加入肺炎克雷伯菌34株混合菌液30mL，混合均匀后放入37℃恒温温箱里培养4h后，4000rpm离心30min，取5mL上清液通过0.22μm水系滤器抽滤，滤液做好标记，保存于4℃冰箱待用。
采用点板法和双层平板法进行噬菌体的分离。取制备好的滤液3μL与菌液7μL混匀，吸取7μL点琼脂板，做好标记，在37℃条件下培养4h，观察噬菌斑(如图2所示)，记录出现噬菌斑所对应的菌液和滤液，随后以记录的菌液为宿主菌，用双层平板法对记录的相应滤液进行噬菌体的纯化。
将初步分离到的噬菌体用单斑法进行纯化。纯化方法如下：
抠取单个噬菌斑加入生理盐水，37℃孵育1h后，12000rpm离心5min后取上清液用0.22μL滤器抽滤，取噬菌体滤液加入等体积宿主菌，双层平板法培养。重复该过程3次，得到噬菌斑形态均一的纯化噬菌体，加入终浓度为30％的甘油，保存于-80℃超低温冰箱，即为肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9。
所述肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9在固体培养基上可以形成透亮的空斑，边缘清晰规则，直径为1～1.5mm；在透射电子显微镜下，该肺炎克雷伯菌噬菌体具有一个正多面体的头部，头部直径约为70nm。
对所述肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9进行了生物学性能测定，结果如下：
a.通过裂解谱测定试验可知，所述肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9能够裂解34株致病性肺炎克雷伯菌中的34株，裂解率为100％；
b.通过效价测定和最佳感染复数测定试验可知，所述肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的效价为1.2×109pfu/mL，最佳感染复数为0.0001；
c.通过pH、热及紫外线稳定性试验可知，所述肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9在pH 4～11的条件下性能稳定，当温度在50℃以下时，活性稳定，对紫外线具有一定的抵抗力；
d.通过一步生长曲线测定可知，所述肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的潜伏期约为30min，暴发期约为30min，暴发量约为100；
e.通过体外抑菌实验测定可知，不同感染复数的肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9在12h内均可有效抑制细菌生长，即使是MOI为0.0001时，也能够显著抑制细菌生长。
综合上述，本发明提供了一株新发现的肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9，具有理化因素耐受性好、裂解性能高、裂解谱宽、安全性好等特点，是一种新型的防治肺炎克雷伯菌的产品和手段；所述肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9在极低浓度水平下就能够显著抑制致病性肺炎克雷伯菌的生长，有利于减少抗生素的用量，避免大量使用抗生素所带来的危害。
本发明还提出一种如上所述的肺炎克雷伯菌噬菌体在制备用于防治由致病性肺炎克雷伯菌引起的疾病或污染的生物制剂中的应用。所述肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9能够有效抑制致病性肺炎克雷伯菌的生长，纯化的所述肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9可作为防治由致病性肺炎克雷伯菌引起的疾病的生物制剂中的有效成分，具有显著的抑菌效果。
进一步地，所述致病性肺炎克雷伯菌包括犬源、狐源、兔源肺炎克雷伯菌中的至少一种。所述肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9能够有效抑制犬源、狐源、兔源肺炎克雷伯菌的生长，具有更好的抑菌效果。
进一步地，所述致病性肺炎克雷伯菌包括K2、K5、K20型肺炎克雷伯菌中的至少一种。所述肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9能够有效抑制K2、K5、K20型肺炎克雷伯菌的生长，具有更好的抑菌效果。
本发明还提出一种噬菌体制剂，用于防治由致病性肺炎克雷伯菌引起的疾病或污染，所述噬菌体制剂包括如上所述的肺炎克雷伯菌噬菌体作为活性成分。以纯化的所述肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9作为生物制剂的有效成分，可有效防治由致病性肺炎克雷伯菌所引起的疾病，以及抑制环境中致病性肺炎克雷伯菌的增殖。
在一实施方式中，所述噬菌体制剂为液体制剂、冻干制剂、片状制剂中的一种。液体制剂中的噬菌体含量高活性好，对致病性肺炎克雷伯菌的抑制效果更好；冻干制剂和片状制剂易保存，能够在存放一段时间之后进行使用。在实际应用过程中，还可以将所述噬菌体制剂制成其他形式的制剂，本发明在此不做限制。
本发明还提出一种如上所述的噬菌体制剂在饲料添加剂和/或饮用水添加剂中的应用。所述生物制剂在应用时可以作为添加剂添加至饲料和/或饮用水中，用于防治养殖过程中致病性肺炎克雷伯菌的污染。进一步地，在本发明的一些具体实施例中，所述饲料添加剂用于添加至动物饲料；所述饮用水添加剂用于添加至动物饮用水。
本发明还提出一种如上所述的噬菌体制剂在环境消毒剂和/或环境清洁剂中的应用。所述噬菌体制剂在应用时可以作为环境清洁剂或者环境消毒剂对环境进行清理，以防治养殖过程中致病性肺炎克雷伯菌的污染。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的分离制备
(1)试验材料：
养殖场采集的粪便样品、筛选用的噬菌体宿主菌致病性肺炎克雷伯菌共34株，均采集自山东省多个养殖场。
(2)试验方法：
以34株肺炎克雷伯菌临床分离株为宿主菌，对养殖场采集的粪便样品进行噬菌体的分离。取20g粪便样品于50mL离心管中，加入30mL LB液体培养基中37℃浸泡4h后，4000rpm离心30min，取20mL上清液于新的离心管中，加入34株肺炎克雷伯菌混合菌液30mL，混合均匀后放入37℃恒温温箱里培养4h后，4000rpm离心30min，取5mL上清液通过0.22μm水系滤器抽滤，滤液做好标记，保存于4℃冰箱待用。
采用点板法和双层平板法进行噬菌体的分离。取制备好的滤液3μL与菌液7μL混匀，吸取7μL点琼脂板，做好标记，在37℃条件下培养4h，观察噬菌斑，如图1所示，并记录出现噬菌斑所对应的菌液和滤液，在本实施例中具体为：肺炎克雷伯菌KP9，随后以肺炎克雷伯菌KP9的菌液为宿主菌，用双层平板法对记录的相应滤液进行噬菌体的分离。
实施例2肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的纯化与增殖
(1)肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的纯化
将上述实施例1中初步分离到的噬菌体用单斑法进行纯化。抠取单个噬菌斑加入生理盐水后，37℃孵育1h后，12000rpm离心5min后取上清液用0.22μL滤器抽滤，取噬菌体滤液加入等体积宿主菌KP-K9菌液，双层平板法培养。重复该过程3次，得到噬菌斑形态均一的纯化噬菌体，加入终浓度30％的甘油，保存于-80℃超低温冰箱待用。
(2)肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的纯化的增殖
将1mL噬菌体原液和1mL新鲜培养的宿主菌KP-K9菌液加入100mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2h，加入体积比5％的氯仿，继续震荡培养30min，12000rpm离心2min，取上清，得到噬菌体的大量增殖液，获得肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9。
实施例3肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的透射电镜形态观察
取10μL纯化的肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9增殖液滴于铜网上，静置15min左右，用滤纸吸去多余的液体。在铜网上滴加5μL的2％的磷钨酸(PTA)染色5min，用滤纸吸去多余的染液，干燥后用透射电子显微镜观察。
肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的透射电镜结果如图2所示，可以看出，肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9具有明显的正多面体头部结构，头部直径约为70nm。
实施例4：肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的裂解谱检测
试验选择34株致病性肺炎克雷伯菌分离株，通过双层琼脂平板法对肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的裂解谱进行测定。具体操作如下：分别将34株肺炎克雷伯菌增殖液50μL与50μL实施例2中得到的噬菌体增殖液(1.2×109pfu/mL)混合后，加入至3mL加热后(约40℃)的上层营养琼脂培养基，混合均匀后立即倒入普通营养琼脂固体平板上，于37℃恒温培养箱中倒置培养4h，观察并记录结果，如表1所示。
表1中的结果显示，试验选择的34株不同血清型的肺炎克雷伯菌菌株在LB固体培养基平板上生长良好，形成菌苔。34株肺炎克雷伯菌的平板上出现边缘光滑、大小均一的噬菌斑，说明分离到的肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9能够裂解全部34株肺炎克雷伯菌，裂解率为100％。
表1肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的裂解谱测定结果
实施例5：肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的效价测定
将实施例2得到的肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9增殖液依次进行10倍比稀释，取100μL各稀释度的增殖液分别与等体积的宿主菌KP9菌液混匀，用双层平板法进行噬菌斑计数，每个稀释度做3个平行。根据噬菌斑数量计算噬菌体效价，测得肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的效价1.2×109pfu/mL。
需要说明的是，在本实施例中，随机选取肺炎克雷伯菌KP9菌液作为试验对象，以检测肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的效价，也可采用KP1～34中任一菌液作为试验对象，得出相近的实验结果，并非表示肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9仅对肺炎克雷伯菌KP9菌液才有作用效果。后续的实施例中采用肺炎克雷伯菌KP9菌液作为试验对象，同样可以替换为其他肺炎克雷伯菌菌液。
实施例6：肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的最佳感染复数测定
取实施例2得到的肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9增殖液和培养至对数期的宿主菌KP-K9菌液，进行计数。分别按照感染复数为0.0001、0.001、0.01、0.1、1和10的比例混匀，加入5mL LB肉汤，37℃摇床振荡培养4h，12000rpm离心20min，0.22μm滤器抽滤除菌，获得噬菌体增殖液，双层平板法测定噬菌体效价，每组做三个平行，根据测定噬菌体效价测定结果计算最佳感染复数，记录结果如表1所示。
表2中的结果显示，当感染复数为0.0001时，肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的效价最高达到3.3×109pfu/mL。因此肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的最佳感染复数为0.0001。
表2肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的最佳感染复数测定结果
实施例7：肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的pH稳定性测定
将500μL效价为109pfu/mL的噬菌体增殖液分别加入不同pH值(3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)的LB液体培养基4.5mL，置于37℃条件下震荡培养，分别于1h、2h、3h取样，进行十倍比稀释，取100μL各梯度稀释液分别与等体积的KP9菌液混匀，通过双层平板法测定噬菌体效价(Titer)，每组两个平行。根据测定结果绘制噬菌体pH稳定性曲线，结果如图3所示。
图3中的结果显示，肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9在pH 4-11范围内较为稳定，当pH<4或pH>11时，肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的活性随着酸碱度的增加而迅速下降。当pH降低到3或升高到12时，噬菌体在1h内全部失活。因此，肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9在pH 4～11的条件下较稳定。
实施例8：肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的热稳定性测定
取500μL浓度为109pfu/mL肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9增殖液，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下水浴孵育，于20min、40min和60min各取样200μL，依次做十倍比稀释后，取100μL稀释液与等体积的KP9菌液混匀，采用双层平板法测定噬菌体效价(Titer)，每组设两个平行。依据统计结果绘制噬菌体的热稳定性曲线，结果如图4所示。
图4中的结果显示，肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9在40℃件下，效价基本保持不变；在50℃条件下，肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9在20min内效价下降两个数量级，20min后仍缓慢下降；当温度为50℃以上时，随着作用时间的延长，噬菌体活性迅速下降。因此，当温度在50℃以下的时候，肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9活性较稳定。
实施例9：肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的紫外线稳定性测定
取4mL已经测定效价为109pfu/mL的噬菌体PKP K9置于平皿中，将其置于据紫外灯(功率：30W)40cm连续照射。每隔十分钟取200μL噬菌体增殖液，10倍比稀释，取100μL各梯度稀释液分别与等体积的KP9菌液混匀，利用双层平板法测定噬菌体效价，连续测定120min，每组设两个平行。根据测定结果绘制噬菌体紫外线稳定性曲线，结果如图5所示。
图5中的结果显示，噬菌体PKP K9的效价总体随紫外线照射时间的延长而逐渐下降。当在紫外线照射10min时噬菌体的效价下降约一个数量级。当在紫外连续照射30min时，噬菌体的效价下降约两个数量级。当噬菌体连续照射120min时，噬菌体的效价降低到105pfu/mL。因此，噬菌体PKP K9在短时间内对紫外线具有一定的耐受性。
实施例10：肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的一步生长曲线
按感染复数比例为10:1，取浓度为107pfu/mL肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9增殖液和浓度为108cfu/mL过夜培养的宿主菌KP9菌液各200μL，充分混匀，用7mL的LB液体培养基重悬沉淀，37℃条件下震荡培养。在不同的时间点(从零时刻开始，前20min每隔5min，20min后每隔10min)分别取200μL的增殖液，12000rpm离心1min，取上清，双层平板法测噬菌体效价，每组设两个平行，根据测定结果绘制一步生长曲线，计算噬菌体的潜伏期、暴发期和暴发量，结果如图6所示。
图6中的结果显示，肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9的潜伏期约为30min，暴发期约为30min，暴发量约为100。
实施例11：噬菌体体外抑菌试验
无菌条件下，利用双层平板法测定噬菌体增殖液的效价，使用涂布法测定宿主菌菌液的效价。按照感染复数(MOI)0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10比例对噬菌体增殖液与宿主菌菌液进行稀释后各取100μL加入到96孔板中，并设置三个平行重复，最后设置只含宿主菌菌液的阴性对照，并设置三个平行重复，每隔1h在OD＝600时测定吸光度，以时间为横标、OD600nm为纵坐标绘制曲线，结果如图7所示。
图7中的结果显示，不同感染复数的肺炎克雷伯菌噬菌体PKP K9在12h内均可有效抑制细菌生长。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种肺炎克雷伯菌噬菌体，其特征在于，所述噬菌体为肺炎克雷伯菌噬菌体(Klebsiella pneumonia phage sp.)PKP K9，保藏编号为CCTCC M2024833，保藏时间为2024年04月30日。
2.一种如权利要求1所述的肺炎克雷伯菌噬菌体在制备用于防治由致病性肺炎克雷伯菌引起的疾病或污染的生物制剂中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述致病性肺炎克雷伯菌包括犬源、狐源、兔源肺炎克雷伯菌中的至少一种。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述致病性肺炎克雷伯菌包括K2、K5、K20型肺炎克雷伯菌中的至少一种。
5.一种噬菌体制剂，其特征在于，所述噬菌体制剂包括权利要求1所述的肺炎克雷伯菌噬菌体作为活性成分。
6.如权利要求5所述的噬菌体制剂，其特征在于，所述噬菌体制剂为液体制剂、冻干制剂、片状制剂中的一种。
7.一种如权利要求5或6所述的噬菌体制剂在饲料添加剂和/或饮用水添加剂中的应用。
8.一种如权利要求5或6所述的噬菌体制剂在环境消毒剂或环境清洁剂中的应用。
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