CN118256548A - OsERD15B蛋白质及其相关生物材料在调控植物耐冷性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了OsERD15B蛋白质及其相关生物材料在调控植物耐冷性中的应用。本发明将编码OsERD15B蛋白的DNA分子导入目的植物，得到OsERD15B超量表达水稻。通过实验证明：在冷胁迫下，与野生型水稻相比，OsERD15B超量表达水稻的存活率和相对含水量提高，H2O2含量和O2 ‑含量降低，说明OsERD15B超量表达提高了植物对冷胁迫的耐受性。本发明首次发现OsERD15B及其编码基因具有调控植物耐冷性的功能，对于培育耐冷植物，增加植物产量具有重大价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及OsERD15B蛋白质及其相关生物材料在调控植物耐冷性中的应用。
背景技术
水稻作为最主要的粮食作物，养育了中国2/3的人口，水稻的安全生产直接关系到我国的粮食安全。水稻生长发育过程中，低温胁迫主要发生在芽期、苗期、孕穗期、抽穗扬花期和灌浆期。在华南和长江中下游双季稻区，早稻经常受寒潮侵袭，常发生温度急剧降低或持续低温阴雨天气造成的不同程度春寒，引起烂秧、死苗，最终影响水稻产量。在高纬度(如东北地区)和高海拔(如云贵高原)地区，水稻在生殖生长期受低温影响最为严重，平均每3-4年就会遭遇一次较大规模的冷害。除此之外，在华南及长江中下游地区的晚稻也易遭受“寒露风”的危害。每年秋季“寒露”节气前后(9月中下旬)是华南及长江中下游一带水稻抽穗扬花的关键时期，这时遇低温就会造成授粉和受精无法正常进行，水稻的瘪谷率大大增加，从而造成晚稻大幅减产。因此培育耐低温水稻品种是水稻育种工作的重要方向之一。
植物耐低温胁迫是一个复杂的遗传性状，受多个基因/数量性状基因座控制。与其他农艺性状相比，水稻低温耐受性的遗传研究进展缓慢，目前只鉴定出少数耐低温基因，但随着生物信息学、遗传学、现代分子生物学的飞速发展以及转基因技术的日趋成熟，通过现代基因工程技术进行分子育种已成为改良水稻耐冷性的一种快速有效途径之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何调控植物耐逆性。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了OsERD15B蛋白质的新用途。
本发明提供了OsERD15B蛋白质在如下A1)-A4)任一种中的应用：
A1)调控植物耐逆性；
A2)培育耐逆转基因植物；
A3)制备调控植物耐逆性的产品；
A4)制备培育耐逆转基因植物的产品；
所述OsERD15B蛋白质来源于水稻，为如下B1)-B4)中的任一种：
B1)氨基酸序列是序列1所示的蛋白质；
B2)在序列1所示的氨基酸序列的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
B3)将序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
B4)与序列1所示的氨基酸序列具有80％或80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
上述B2)所述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
上述B3)所述蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过9个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过8个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过7个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过6个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过4个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过2个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过1个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述B4)所述蛋白质中，所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。所述同一性包括与本发明的序列1所示的氨基酸序列具有80％或更高，或具有85％或更高，或具有90％或更高，或91％或更高，或92％或更高，或93％或更高，或94％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同源性的氨基酸序列。
上述B1)或B2)或B3)或B4)所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
为了解决上述技术问题，本发明又提供了与上述OsERD15B蛋白质相关的生物材料的新用途。
本发明提供了与上述OsERD15B蛋白质相关的生物材料在如下A1)-A4)任一种中的应用：
A1)调控植物耐逆性；
A2)培育耐逆转基因植物；
A3)制备调控植物耐逆性的产品；
A4)制备培育耐逆转基因植物的产品；
所述生物材料为下述E1)至E5)中的任一种：
E1)编码上述OsERD15B蛋白质的核酸分子；
E2)含有E1)所述核酸分子的表达盒；
E3)含有E1)所述核酸分子的重组载体、或含有E2)所述表达盒的重组载体；
E4)含有E1)所述核酸分子的重组微生物、或含有E2)所述表达盒的重组微生物、或含有E3)所述重组载体的重组微生物；
E5)含有E1)所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有E2)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有E3)所述重组载体的重组宿主细胞。
上述应用中，E1)所述核酸分子为下述任一种：
F1)序列2所示的DNA分子；
F2)与F1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上的同一性，并且编码上述OsERD15B蛋白质的DNA分子。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码OsERD15B蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的OsERD15B核苷酸序列80％或者更高同一性的核苷酸，只要编码OsERD15B蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。所述同一性是指与天然核酸序列的序列相似性，包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性可为75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性。所述75％以上的同一性可为至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述85％以上的同一性可为至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述95％以上的同一性可为至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
上述应用中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述OsERD15B蛋白质的DNA。所述表达盒还可包括表达上述OsERD15B蛋白质的核酸分子所必需的所有调控序列的单链或双链核酸分子。所述调控序列在其相容条件下能指导编码序列在合适的宿主细胞中表达上述OsERD15B蛋白质。所述调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入载体的特定限制性酶位点以便将调控序列与编码蛋白质的核酸序列的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。调控序列可以是合适的启动子序列，即可被表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导蛋白质表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中有转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，可以得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内蛋白质的基因。调控序列还可以是合适的转录终止序列，即能被宿主细胞识别从而终止转录的一段序列。终止序列可操作连接在编码蛋白质的核酸序列的3’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何终止子都可以用于本发明。调控序列还可以是合适的前导序列，即对宿主细胞的翻译十分重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作连接于编码蛋白质的核酸序列的5’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何前导序列均可用于本发明。调控序列还可以是信号肽编码区，该区编码一段连在蛋白质氨基端的氨基酸序列，能引导编码蛋白质进入细胞分泌途径。能引导表达后的蛋白质进入所用宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可以用于本发明。添加能根据宿主细胞的生长情况来调节蛋白质表达的调控序列可能也是需要的。
上述应用中，所述载体是指能够把OsERD15B基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒等)。
所述重组载体是指将OsERD15B基因与所述载体在体外连接构建而成的重组DNA分子。可用现有的植物表达载体构建含有所述OsERD15B基因或OsERD15B基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述应用中，所述微生物可为细菌、真菌、放线菌、原生动物、藻类或病毒。其中，所述细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、产碱菌属(Alcaligenessp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)等但不限于此，例如所述细菌可为大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。所述真菌可为酵母，所述酵母可来自酵母属(如酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae)、克鲁维酵母属(如乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis)、毕赤酵母属(如巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris)、裂殖酵母属(如非洲粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe)、汉逊酵母属(如多态汉逊酵母Hansenula polymorpha)等但不限于此。所述真菌还可来自镰刀菌属(Fusarium sp.)、丝核菌属(Rhizoctonia sp.)、轮枝菌属(Verticillium sp.)、青霉属(Penicillium sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、头孢霉属(Cephalosporium sp.)等但不限于此。所述放线菌可来自链霉菌属(Streptomycessp.)、诺卡菌属(Nocardia sp.)、小单孢菌属(Micromonosporasp.)、链孢囊菌属(Streptosporangium sp.)、游动放线菌属(Actinoplanes sp.)、高温放线菌属(Thermoactinomyces sp.)等但不限于此。所述藻类可来自墨角藻属(Fucussp.)、曲壳藻属(Achnanthes sp.)、茧形藻属(Amphiprora sp.)、双眉藻属(Amphorasp.)、纤维藻属(Ankistrodesmus sp.)、星胞藻属(Asteromonas sp.)、黄金色藻属(Boekelovia sp.)等但不限于此。所述病毒可为轮状病毒、疱疹病毒、流感病毒、腺病毒等但不限于此。
上述应用中，所述宿主细胞(也称为受体细胞)可为植物细胞或动物细胞。所述宿主细胞可理解为不仅是指特定的受体细胞，而且也指这种细胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致，但仍包括在宿主细胞的范围中。合适的宿主细胞为本领域已知的，其中：所述植物细胞可为拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)、玉米(Zea mays)、水稻(Oryzasativa)、小麦(Triticum aestivum)等植物细胞但不限于此；所述动物细胞可为哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK细胞)、小鼠乳腺癌细胞(C127细胞)、人胚胎肾细胞(HEK293细胞)、人HeLa细胞、成纤维细胞、骨髓细胞系、T细胞或NK细胞等)、禽类细胞(例如鸡或鸭细胞)、两栖类细胞(例如非洲爪蟾(Xenopus laevis)细胞或大鲵(Andrias davidianus)细胞)、鱼类细胞(例如草鱼、鲤鱼、虹鳟鱼或鲶鱼细胞)、昆虫细胞(例如Sf21细胞或Sf-9细胞)等但不限于此。
在本发明中，所述重组微生物(或重组宿主细胞)是指对目的微生物(或目的宿主细胞)的基因进行操作和修饰，从而得到功能发生变化的重组微生物(或功能发生变化的重组宿主细胞)。如将OsERD15B基因或上述重组载体导入目的微生物(或目的宿主细胞)后得到的重组微生物(或重组宿主细胞)。所述重组微生物(或重组宿主细胞)可理解为不仅是指特定的重组微生物(或重组宿主细胞)，而且也指这种细胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致，但仍包括在重组微生物(或重组宿主细胞)的范围中。
上述应用中，所述调控植物耐逆性为提高植物耐逆性。
进一步的，所述耐逆性为耐冷性。
更进一步的，所述耐冷性为苗期耐冷性。
在本发明的一个实施方案中，所述调控植物耐逆性为提高植物耐冷性，所述提高植物耐冷性具体体现为：在冷胁迫处理下，植物中OsERD15B蛋白含量和/或活性越高或OsERD15B基因表达量越高，植物的耐冷性越高；进一步体现为：在冷胁迫处理下，植物中OsERD15B蛋白含量和/或活性越高或OsERD15B基因表达量越高，植物存活率越高、相对含水量越高、H2O2含量越低、O2 -含量越低。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育耐逆转基因植物的方法。
本发明提供的培育耐逆转基因植物的方法的包括如下步骤：提高目的植物中OsERD15B蛋白的含量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
上述方法中，所述耐逆性为耐冷性，具体为苗期耐冷性。
上述方法中，所述提高目的植物中OsERD15B蛋白的含量和/或活性的方法为在目的植物中过表达上述OsERD15B蛋白。所述过表达的方法可为将上述OsERD15B蛋白的编码基因导入目的植物。所述导入包括但不限于：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转染植物细胞或组织，并将转染的植物细胞或组织培育成植株。
在本发明的一个实施方案中，所述OsERD15B蛋白的编码基因可通过重组载体导入目的植物。
在本发明的一个具体实施方案中，所述OsERD15B蛋白的编码基因通过pCAMBIA330035sU-OsERD15B导入目的植物。所述pCAMBIA330035sU-OsERD15B为在pCAMBIA330035Su载体的两个PacI酶切位点间***序列2所示的DNA分子后得到的载体。
上述方法中，所述转基因植物的耐冷性高于所述目的植物体现为如下X1)-X4)中任一种：
X1)在冷胁迫下，所述转基因植物的存活率大于所述目的植物；
X2)在冷胁迫下，所述转基因植物的含水量大于所述目的植物；
X3)在冷胁迫下，所述转基因植物的H2O2含量小于所述目的植物；
X4)在冷胁迫下，所述转基因植物的O2 -含量小于所述目的植物。
在本发明的一个具体实施方案中，所述冷胁迫为4℃条件下胁迫3天。
上述任一所述应用或方法中，所述转基因植物不仅包含将所述OsERD15B基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
上述任一所述应用或方法中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；进一步的，所述单子叶植物为禾本科植物；更进一步的，所述禾本科植物为水稻(如空育131)。
本发明将编码OsERD15B蛋白的DNA分子导入目的植物，得到OsERD15B超量表达水稻。通过实验证明：在冷胁迫下，与野生型水稻相比，OsERD15B超量表达水稻的存活率和相对含水量提高，H2O2含量和O2 -含量降低，说明OsERD15B超量表达提高了植物对冷胁迫的耐受性。本发明首次发现OsERD15B及其编码基因具有调控植物耐冷性的功能，对于培育耐冷植物，增加植物产量具有重大价值。
附图说明
图1为OsERD15B冷胁迫下表达模式分析。
图2为OsERD15B超量表达水稻的鉴定。A为RT-PCR鉴定结果；B为草铵膦抗性筛选结果，阴性对照为水稻空育131，阳性对照为已知草铵膦抗性品种OsERF096超量表达纯合水稻；C为qRT-PCR鉴定结果。
图3为OsERD15B超量表达水稻的苗期耐冷性分析。A为WT和OsERD15B超量表达水稻在冷处理前和恢复后的表型；B为WT和OsERD15B超量表达水稻在冷处理后的存活率统计结果；C为WT和OsERD15B超量表达水稻在冷处理后的相对含水量统计结果；D为WT和OsERD15B超量表达水稻在冷处理3天后的DAB染色结果；E为WT和OsERD15B超量表达水稻在冷处理3天后的NBT染色结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的pCAMBIA330035Su载体记载于文献“Xiaoli Sun,Wei Ji,Xiaodong Ding,Xi Bai,Hua Cai,Shanshan Yang,Xue Qian,Mingzhe Sun,YanmingZhu.GsVAMP72，a novel Glycine soja R-SNARE protein,is involved in regulatingplant salt tolerance and ABA sensitivity.Plant Cell Tiss Organ Cult 2013,113:199-215”中，公众可从申请人(黑龙江八一农垦大学)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的水稻品种空育131记载于文献“MIR1868 negatively regulatesrice cold tolerance at both the seedling and booting stages”中，公众可从申请人(黑龙江八一农垦大学)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、水稻中OsERD15B基因的获得
1、水稻幼苗的获得
选取成熟的、饱满的水稻(空育131)种子，在42℃下处理2-4天打破休眠，用5％的NaClO消毒30min，蒸馏水清洗4～5次后，放置28℃培养箱催芽2～4天，待芽长生长至2mm时转移至Youshida营养液，放置于人工培养室培养至三叶期，得到水稻幼苗。
2、cDNA的获得
取水稻幼苗的叶片，采用Trizol(Invitrogen公司)提取总RNA，反转录获得cDNA。
3、PCR扩增
以获得的cDNA为模板，利用高保真DNA聚合酶KOD OneTM PCR Master Mix-Blue(TOYOBO)及OsERD15B-FP和OsERD15B-RP引物进行PCR扩增，得到PCR产物。引物序列如下：
OsERD15B-FP：5’-ATGAGTGCTATGGCGATGTC-3’；
OsERD15B-RP：5’-CTAGCGAGGCTGGTGGAT-3’。
4、PCR产物测序
将PCR产物与pEASY-T载体连接，鉴定阳性克隆后并对其进行测序。将测序正确的载体保存至-80℃冰箱用于后续研究。
测序结果表明：PCR扩增得到大小为465bp的片段，其核苷酸序列如序列2所示，该片段包含OsERD15B基因的CDS区序列。
实施例2、OsERD15B在冷胁迫下的表达模式分析
按照实施例1中的方法，得到三叶期水稻幼苗，对水稻幼苗进行4℃冷处理，分别在处理0h、0.5h、1h、3h、6h、9h、12h、24h后进行叶片取样。然后采用Trizol法提取总RNA，利用反转录试剂盒5×HiScript III RT SuperMix(Vazyme)反转录获得cDNA。再将反转录获得的cDNA稀释5倍，以稀释后的cDNA为模板，水稻的延伸因子1-α基因(elongation factor 1-gene，osa-ELF1-α)为内参基因，采用OsERD15B-qRT-F和OsERD15B-qRT-R引物进行RT-PCR。引物序列如下：
OsERD15B-qRT-FP：5’-CTGCGGCGGAGGAGGACC-3’；
OsERD15B-qRT-RP：5’-CTCGGCGAGTTGAGGCTGAG-3’；
osa-ELF1-α-FP：5’-GCACGCTCTTCTTGCTTTCAC-3’；
osa-ELF1-α-RP：5’TCTTGTCAGGGTTGTAGCCGAC-3’。
结果如图1所示，结果显示：冷胁迫下，OsERD15B基因的表达量随着处理时间的增加而逐渐上升，并在24时达到最大值，说明OsERD15B的表达受冷诱导。
实施例3、OsERD15B超量表达水稻的获得及耐冷性分析
一、OsERD15B植物超量表达载体构建
1、以基于USERTM克隆技术的pCAMBIA330035Su载体作为植物超量表达载体。以OsERD15B基因cDNA为模板设计引物，引物序列如下(下划线代表载体构建时所需的接头序列，其中U为USER酶切位点)：
OsERD15B-u-F：5’-GGCTTAAUATGAGTGCTATGGCGATGTC-3’；
OsERD15B-u-R：5’-GGTTTAAUCTAGCGAGGCTGGTGGAT-3’。
2、以水稻空育131的cDNA为模板，采用高保真DNA聚合酶KOD OneTM PCR MasterMix-Blue(TOYOBO)、OsERD15B-u-F和OsERD15B-u-R引物进行PCR扩增，得到PCR产物，即OsERD15B基因序列。
3、用限制性内切酶PacI和Nt.BbvCI对pCAMBIA330035Su载体进行双酶切，得到载体酶切产物。
4、将步骤2获得的PCR产物、步骤3获得的载体酶切产物及USER酶(NEB，M5505S)37℃下孵育20min，然后25℃下孵育20min，得到重组表达载体pCAMBIA330035sU-OsERD15B，并送交测序。测序结果表明：重组表达载体pCAMBIA330035sU-OsERD15B为在pCAMBIA330035Su载体的两个PacI酶切位点间***序列2所示的DNA分子后得到的载体。
二、OsERD15B超量表达水稻的获得及鉴定
1、采用冻融法将步骤一获得的pCAMBIA330035sU-OsERD15B转化根癌农杆菌EHA105，得到重组菌pCAMBIA330035sU-OsERD15B/EHA105。
2、采用农杆菌介导法将重组菌pCAMBIA330035sU-OsERD15B/EHA105菌液侵染水稻品种“空育131”的胚性愈伤组织20min，然后将愈伤组织转接到共培养培养基(含20mg/L乙酰丁香酮的NB培养基，pH5.2)。
3、25℃黑暗培养2-4天后取愈伤组织，用含500mg/L头孢霉素的无菌水溶液清洗，然后接种至筛选培养基(含15mg/L固杀草和100mg/L阿莫西林克拉维酸钾的NB培养基，pH5.8)。
4、32℃、24h光照条件下培养6周后取愈伤组织，接种至分化培养基(含30g/L山梨醇、2g/L酪蛋白水解物、100mg/L阿莫西林克拉维酸钾、2mg/L KT、0.02mg/L NAA的MS培养基，pH5.8)，先在25℃、黑暗的条件下培养5-7天，然后转移至26℃、16h光照/8h黑暗的条件下培养至愈伤组织表面有绿点产生。
5、将有绿点的愈伤组织转移至新的分化培养基，在26℃、16h光照/8h黑暗的条件下培养至幼苗再生芽长度约为2cm。
6、将幼苗转移至生根培养基(含100mg/L阿莫西林克拉维酸钾的MS培养基，pH5.8)，在26℃、16h光照/8h黑暗的条件下培养至株高为10-15cm且根系发达，得到再生植株(T0代)，将再生植株(T0代)移栽到营养土中，在暗光条件下培养3-5天，然后移至室外正常培养。
7、取再生植株和野生型植株的叶片，提取总RNA，反转录合成cDNA，以此cDNA为模板，OsUBQ为内参基因，采用引物OsERD15B-qRT-FP和OsERD15B-qRT-RP进行RT-PCR。
RT-PCR鉴定结果如图2A所示。从图中可以看出：5个转基因株系(#1-#5)在转录水平上，OsERD15B表达量均高于野生型。
8、将RT-PCR鉴定阳性的再生植株自交，每个单株分别收获T1代种子，对T1代植株进行RT-PCR鉴定；将鉴定阳性的T1代植株进行自交，收获T2代种子，对T2代植株进行RT-PCR鉴定；对于某一T1代植株来说，如果其自交得到的T2代植株均为RT-PCR鉴定阳性，该T1代植株为一个纯合的转基因植株，该T1代植株及其自交后代为一个纯合的转基因株系，直至获得T3代OsERD15B转基因水稻纯合体株系。
9、将T3代OsERD15B转基因水稻纯合体株系进行固沙草筛选，确保该株系为OsERD15B转基因纯合株系。
10、选取T3代OsERD15B转基因水稻纯合体株系OsERD15B-OX#2和OsERD15B-OX#4培养至三叶期，提取总RNA后反转录合成cDNA，并以此cDNA为模板，延伸因子1-α基因(osa-ELF1-α)为内参基因，采用引物OsERD15B-qRT-FP和OsERD15B-qRT-RP进行qRT-PCR。
结果如图1C所示，结果显示：T3代OsERD15B转基因水稻纯合体株系OsERD15B-OX#2和OsERD15B-OX#4均为OsERD15B超量表达转基因水稻纯合株系，可用于下述耐冷性实验。
三、OsERD15B超量表达水稻的耐冷性分析
选取饱满的野生型水稻品种空育131(WT)、T3代OsERD15B转基因水稻纯合体株系OsERD15B-OX#2和OsERD15B-OX#4种子，蒸馏水清洗后30℃浸种、催芽3～5天，至破胸露白。将发芽的种子播种到湿润的育秧土中，培养至三叶期后进行冷处理，冷处理方法如下：在4℃培养箱中培养3天，在25℃条件下恢复培养6天。恢复后拍照并统计存活率和相对含水量，存活率(％)＝(恢复后植株存活数/供试植株总数)×100％，相对含水量(％)＝(恢复后植株干重/处理后植株鲜重)×100％。
结果如图3所示，结果显示：相比OsERD15B转基因水稻纯合体株系，4℃低温处理恢复后的WT植株损伤更为严重(图3A)。相对含水量统计结果表明：OsERD15B转基因水稻纯合体株系OsERD15B-OX#2和OsERD15B-OX#4的平均相对含水量分别为73％和72％，WT株系的平均相对含水量约为51％(图3B)。存活率统计结果表明：OsERD15B转基因水稻纯合体株系OsERD15B-OX#2和OsERD15B-OX#4的平均存活率分别为72％和70％，WT株系的平均存活率为36％(图3C)。这些结果说明OsERD15B-OX#2和OsERD15B-OX#4水稻苗期耐冷性更强。
为从生理角度探究OsERD15B是否影响水稻ROS平衡，通过DAB染色和NBT染色检测了冷处理前和冷处理3天后WT和转基因水稻中的H2O2含量和O2 -含量。
DAB染色结果如图3D所示，结果显示：冷处理前，WT、OsERD15B-OX株系的水稻叶片染色均很浅，脱色后叶片基本呈透明状。冷处理后，WT株系的叶片染色较深，说明冷处理后其积累了较多H2O2，而OsERD15B-OX株系叶片染色则较浅，说明H2O2含量较低。
NBT染色结果如图3E所示，结果显示：冷处理前，WT、OsERD15B-OX株系的水稻叶片染色均较浅，且多数都分布在伤口处，说明O2 -含量较低。冷处理后，WT株系叶片呈蓝色，累积了较多的O2 -，而OsERD15B-OX株系叶片形成的蓝色络合物较少，呈浅蓝色，累积的O2 -含量较少。
以上DAB和NBT染色结果表明OsERD15B影响冷胁迫下水稻体内ROS积累和/或清除过程。
综上所述，OsERD15B超量表达增强了水稻对冷胁迫的耐受性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.蛋白质在如下A1)-A4)任一种中的应用：
A1)调控植物耐逆性；
A2)培育耐逆转基因植物；
A3)制备调控植物耐逆性的产品；
A4)制备培育耐逆转基因植物的产品；
所述蛋白质为如下B1)-B4)中的任一种：
B1)氨基酸序列是序列1所示的蛋白质；
B2)在序列1所示的氨基酸序列的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
B3)将序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
B4)与序列1所示的氨基酸序列具有80％或80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
2.与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料在如下A1)-A4)任一种中的应用：
A1)调控植物耐逆性；
A2)培育耐逆转基因植物；
A3)制备调控植物耐逆性的产品；
A4)制备培育耐逆转基因植物的产品；
所述生物材料为下述E1)至E5)中的任一种：
E1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；
E2)含有E1)所述核酸分子的表达盒；
E3)含有E1)所述核酸分子的重组载体、或含有E2)所述表达盒的重组载体；
E4)含有E1)所述核酸分子的重组微生物、或含有E2)所述表达盒的重组微生物、或含有E3)所述重组载体的重组微生物；
E5)含有E1)所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有E2)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有E3)所述重组载体的重组宿主细胞。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：E1)所述核酸分子为下述任一种：
F1)序列2所示的DNA分子；
F2)与F1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上的同一性，并且编码所述蛋白质的DNA分子。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述耐逆性为耐冷性。
5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
6.一种培育耐逆转基因植物的方法，包括如下步骤：提高目的植物中权利要求1中所述蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述耐逆性为耐冷性。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述提高目的植物中权利要求1中所述蛋白质的含量和/或活性的方法为在目的植物中过表达权利要求1中所述蛋白质。
9.根据权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于：所述转基因植物的耐冷性高于所述目的植物体现为如下X1)-X4)中任一种：
X1)在冷胁迫下，所述转基因植物的存活率大于所述目的植物；
X2)在冷胁迫下，所述转基因植物的含水量大于所述目的植物；
X3)在冷胁迫下，所述转基因植物的H2O2含量小于所述目的植物；
X4)在冷胁迫下，所述转基因植物的O2 -含量小于所述目的植物。
10.根据权利要求6-9任一所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
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