CN113150097B - 一种与植物耐逆性相关的蛋白OsERF096及其编码基因与应用 - Google Patents

一种与植物耐逆性相关的蛋白OsERF096及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与植物抗逆性相关的蛋白OsERF096及其编码基因与应用。所述OsERF096蛋白为氨基酸序列是序列3所示的蛋白质。本发明将编码OsERF096蛋白的DNA分子导入目的植物，得到OsERF096‑OX转基因水稻，本发明还将干扰OsERF096基因表达的DNA分子导入目的植物，得到OsERF096‑RNAi转基因水稻。通过实验证明：与野生型水稻相比，OsERF096‑OX转基因水稻的耐冷性低于受体植物，OsERF096‑RNAi转基因水稻的耐冷性高于受体植物。说明OsERF096蛋白具有调控植物耐冷性的功能，对于培育耐逆植物、增加植物产量具有重大价值。

Description

一种与植物耐逆性相关的蛋白OsERF096及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与植物耐逆性相关的蛋白OsERF096及其编码基因与应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)原产于中国，是世界上重要的粮食作物之一。水稻作为中国最重要的粮食作物，产量居粮食作物首位，播种面积占粮食作物总面积的1/3。低温冷害作为逆境胁迫，对水稻的各个时期均产生严重影响，是中国稻作生产中的主要限制因子。严重的低温寒害可导致东北粳稻主产区年产量平均减产50～100亿公斤，约占正常年总产的20％。水稻抽穗扬花期遭遇低温会降低水稻结实率，严重影响稻米的营养品质。因此，解决水稻冷害问题对于世界食物安全、促进水稻产区的经济发展具有十分重要的现实意义。
AP2/ERF转录因子是植物最大的转录因子家族之一，在水稻逆境应答过程中起着重要作用。目前，针对AP2/ERF转录因子的研究主要集中于逆境胁迫应答研究中。OsERF48可以增强水稻根系生长并调控其耐旱性；过表达OsERF71也可增强水稻营养生长阶段的抗旱性；敲除OsERF109对水稻的抗旱性有负调节作用；过表达OsERF922基因可降低水稻对盐胁迫的耐受性。虽然众多研究报道了水稻AP2/ERF转录因子参与调控应对非生物胁迫，但是对于OsERF096的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供OsERF096蛋白的新用途。
本发明提供了OsERF096蛋白在如下1)-3)中的应用：
1)调控植物耐逆性；
2)培育耐逆性降低的转基因植物；
3)培育耐逆性提高的转基因植物。
所述OsERF096蛋白为a1)或a2)或a3)或a4)：
a1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
a2)在序列3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物耐逆性相关的蛋白质；
a4)将序列3所示的氨基酸序列具有90％同一性、来源于水稻且与植物耐逆性相关的蛋白质。
其中，序列3由273个氨基酸残基组成。
上述a2)所述的蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述a3)所述的蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述a4)所述的蛋白质中，“同一性”包括与本发明的序列3所示的氨基酸序列具有90％或更高，或91％或更高，或92％或更高，或93％或更高，或94％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同源性的氨基酸序列。
上述a1)或a2)或a3)或a4)所述的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
本发明的第二个目的是提供与OsERF096蛋白相关的生物材料的新用途。
本发明提供了与OsERF096蛋白相关的生物材料在如下1)-3)中的应用：
1)调控植物耐逆性；
2)培育耐逆性降低的转基因植物；
3)培育耐逆性提高的转基因植物；
所述生物材料为下述A1)至A8)中的任一种：
A1)编码OsERF096蛋白的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。
上述应用中，A1)所述核酸分子为如下B1)或B2)或B3)或B4)所示的基因：
B1)序列1所示的基因组DNA分子；
B2)序列2所示的cDNA分子；
B3)与B1)或B2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码OsERF096蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；
B4)在严格条件下与B1)或B2)或B3)限定的核苷酸序列杂交，且编码OsERF096蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码蛋白质OsERF096的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码蛋白质OsERF096的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码蛋白质OsERF096且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述应用中，A2)所述的含有编码蛋白质OsERF096的核酸分子的表达盒(OsERF096基因表达盒)是指能够在宿主细胞中表达蛋白质OsERF096的DNA，该DNA不但可包括启动OsERF096转录的启动子，还可包括终止OsERF096转录的终止子。进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。
可用现有的表达载体构建含有所述OsERF096基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
上述应用中，所述调控植物耐逆性为降低植物耐逆性；所述耐逆性为耐冷性。
所述降低植物耐逆性体现为：在冷胁迫处理下，植物中OsERF096蛋白含量和/或活性越高或OsERF096基因表达量越高，植物的耐冷性越低；进一步体现为：在冷胁迫处理下，植物中OsERF096蛋白含量和/或活性越高或OsERF096基因表达量越高，植物的根长越短、芽长越短、存活率越低、相对导电率越高、游离脯氨酸含量越低、O2-含量越高。
本发明的第三个目的是提供m1或m2所示的物质的新用途；
m1、抑制或降低植物中OsERF096蛋白活性或者含量的物质；
m2、抑制或沉默植物中OsERF096蛋白编码核酸表达的物质或敲除植物中OsERF096蛋白编码核酸的物质。
本发明提供了m1或m2所示的物质在提高植物耐逆性或培育耐逆性提高的转基因植物中的应用。
所述提高植物耐逆性体现为：在冷胁迫处理下，植物中OsERF096蛋白含量和/或活性越低或OsERF096基因表达量越低或抑制或沉默植物中OsERF096基因的表达或敲除植物中的OsERF096基因，植物的耐冷性越高；进一步体现为：在冷胁迫处理下，植物中OsERF096蛋白含量和/或活性越低或OsERF096基因表达量越低或抑制或沉默植物中OsERF096基因的表达或敲除植物中的OsERF096基因，植物的根长越长、芽长越长、存活率越高、相对导电率越低、游离脯氨酸含量越高、O2-含量越低。
本发明的第四个目的是提供一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法。
本发明提供的耐逆性提高的转基因植物的方法包括如下步骤：降低受体植物中OsERF096蛋白的含量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。
进一步的，所述耐逆性为耐冷性；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物具体体现在如下P1)-P6)中的任一种：
P1)所述转基因植物的根长长于所述受体植物；
P2)所述转基因植物的芽长长于所述受体植物；
P3)所述转基因植物的存活率高于所述受体植物；
P4)所述转基因植物的相对导电率低于所述受体植物；
P5)所述转基因植物的游离脯氨酸含量高于所述受体植物；
P6)所述转基因植物的O2-含量(H2O2含量)低于所述受体植物。
所述降低受体植物中OsERF096蛋白的含量和/或活性的方法可通过对所述受体植物中OsERF096蛋白的编码基因进行敲除或抑制或沉默来实现。
沉默所述受体植物中的OsERF096蛋白的编码基因的物质可为干扰所述受体植物中的OsERF096蛋白的编码基因表达的核酸分子。
更进一步的，干扰所述受体植物中的OsERF096蛋白的编码基因表达的核酸分子为序列4。
干扰植物中的OsERF096蛋白的编码基因表达的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、载体、细胞系也属于本发明的保护范围。进一步的，所述核酸分子为序列4。
本发明的第五个目的是提供一种培育耐逆性降低的转基因植物的方法。
本发明提供的培育耐逆性降低的转基因植物的方法包括如下步骤：提高受体植物中OsERF096蛋白的含量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的耐逆性低于所述受体植物。
进一步的，所述耐逆性为耐冷性；所述转基因植物的耐逆性低于所述受体植物具体体现在如下X1)-X6)中的任一种：
X1)所述转基因植物的根长短于所述受体植物；
X2)所述转基因植物的芽长短于所述受体植物；
X3)所述转基因植物的存活率低于所述受体植物；
X4)所述转基因植物的相对导电率高于所述受体植物；
X5)所述转基因植物的游离脯氨酸含量低于所述受体植物；
X6)所述转基因植物的O2-含量(H2O2含量)高于所述受体植物。
所述提高受体植物中OsERF096蛋白的含量和/或活性的方法为在受体植物中过表达OsERF096蛋白。
更进一步的，所述过表达的方法为将OsERF096蛋白的编码基因导入受体植物中。
上述任一所述方法或应用中，所述耐冷性为萌发期耐冷性和/或幼苗期耐冷性。
上述任一所述方法或应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；进一步的，所述单子叶植物为禾本科植物；更进一步的，所述禾本科植物为水稻。
上述任一所述方法或应用中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述GsHA24基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明提供了OsERF096蛋白在调控植物耐逆性中的应用。本发明将编码OsERF096蛋白的DNA分子导入目的植物，得到OsERF096-OX转基因水稻，本发明还将干扰OsERF096基因表达的DNA分子导入目的植物，得到OsERF096-RNAi转基因水稻。通过实验证明：与野生型水稻相比，OsERF096-OX转基因水稻的耐冷性低于受体植物，OsERF096-RNAi转基因水稻的耐冷性高于受体植物。说明OsERF096蛋白具有调控植物耐冷性的功能，对于培育耐逆植物、增加植物产量具有重大价值。
附图说明
图1为OsERF096冷胁迫下表达模式分析。
图2为OsERF096-OX转基因水稻的获得。A为pC3300-35Su-OsERF096载体结构示意图；B为OsERF096基因的PCR扩增；C为OsERF096-OX抗性植株PCR检测；D为OsERF096-OX转基因水稻中OsERF096表达量检测。
图3为OsERF096-OX转基因水稻萌发期耐冷功能分析。A为OsERF096-OX转基因水稻萌发期冷胁迫表型；B和C分别为OsERF096-OX转基因水稻冷胁迫处理后的芽长和根长统计结果。
图4为OsERF096-OX转基因水稻幼苗期耐冷功能分析。A为OsERF096-OX转基因水稻幼苗期冷胁迫表型；B和C分别为OsERF096-OX转基因水稻冷胁迫处理后的游离脯氨酸含量和相对导电率的测定结果；D为OsERF096-OX转基因水稻冷胁迫处理后的存活率统计结果。
图5为OsERF096-RNAi转基因水稻的获得。A为OsERF096-RNAi载体结构示意图；B为OsERF096-siRNA序列，红色斜体为互补发卡结构，黑色下换线为Loop结构；C为OsERF096-RNAi抗性植株PCR检测；D为OsERF096-RNAi转基因水稻的RT-PCR检测。
图6为OsERF096-RNAi转基因水稻萌发期耐冷功能分析。A为OsERF096-RNAi转基因水稻萌发期冷胁迫表型；B和C分别为OsERF096-RNAi转基因水稻冷胁迫处理后的芽长和根长统计结果。
图7为OsERF096-RNAi转基因水稻幼苗期耐冷功能分析。A为OsERF096-RNAi转基因水稻幼苗期的冷胁迫表型；B和C分别为OsERF096-RNAi转基因植株冷胁迫处理后的游离脯氨酸含量和相对导电率的测定结果；D为OsERF096-RNAi转基因水稻冷胁迫处理后的存活率统计结果。
图8为OsERF096-OX转基因水稻和OsERF096-RNAi转基因水稻的DAB染色结果。A为幼苗期；B为萌发期。
图9为OsERF096-OX转基因水稻和OsERF096-RNAi转基因水稻的NBT染色结果。A为幼苗期；B为萌发期。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的pCAMBIA330035Su载体记载于如下文献：Xiaoli Sun,Wei Ji,Xiaodong Ding,Xi Bai,Hua Cai,Shanshan Yang,Xue Qian,Mingzhe Sun,YanmingZhu.GsVAMP72，a novel Glycine soja R-SNARE protein,is involved in regulatingplant salt tolerance and ABA sensitivity.Plant Cell Tiss Organ Cult 2013,113:199–215中，公众可从申请人(黑龙江八一农垦大学)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pBWA(V)HS-ami载体记载于文献“Hewei Du,Min Huang,Jianxiong Zhu,Hang Su,Xiu Zeng.Identification of a novel submergence responsegene regulated by the Sub1A gene.African Journal of Biotechnology,2016,15(49)：2743-2752”中，公众可从申请人(黑龙江八一农垦大学)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pCAMBIA1300载体记载于如下文献：Nour-Eldin HH,Hansen BG,MH,Jensen JK,Halkier BA.Advancing uracil-excision based cloningtowards an ideal technique for cloning PCR fragments.Nucleic Acids Res.2006；34(18):e122中，公众可从申请人(黑龙江八一农垦大学)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、OsERF096在冷胁迫下的表达模式分析
对三叶期水稻(日本晴)幼苗进行4℃冷处理，在0，0.5，1，3，6，9，12，24h分别取地上部组织，采用Trizol法提取总RNA，采用反转录试剂盒SuperScriptTM III ReverseTranscriptase kit(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)反转录获得cDNA。将获得的cDNA稀释5倍作为模板，采用引物对OsERF096-qRT-F和OsERF096-qRT-R进行qRT-PCR的检测。以水稻的延伸因子1-α基因(elongation factor 1-gene)osa-ELF1-α为内参基因。检测所用引物序列如下：
OsERF096-qRT-F：TGAGGGAGGTGAAGAAGGAGAG；
OsERF096-qRT-R：TGAGCAGCAATAGAACGAAAGAAT；
osa-ELF1-α-qRT-F：CATGATCACCGGTACCTCG；
osa-ELF1-α-qRT-R：CCAGCATGTTGTCTCCGTG。
qRT-PCR结果如图1所示。结果显示：冷胁迫处理后，OsERF096表达量呈上升趋势，并在冷胁迫处理24h时达到最高，表明OsERF096的表达受冷胁迫诱导。
实施例2、OsERF096超量表达转基因水稻的获得及其耐冷性分析
一、OsERF096超量表达转基因水稻的获得及鉴定
1、以水稻(日本晴)cDNA为模板，采用引物对OsERF096-OX-U-F/OsERF096-OX-U-R进行PCR扩增，得到PCR产物(OsERF096片段)，PCR产物的检测结果如图2-B所示。扩增引物如下(下划线代表载体构建时所需的接头序列，其中U为USER酶切位点)：
OsERF096-OX-U-F：5’-GGCTTAAUGGCCGGCTTCG-3’；
OsERF096-OX-U-R：5’-GGTTTAAUTCTGTTTAATCATCAAATAGCATAGTC-3’。
2、将步骤1获得的PCR产物连接到pCAMBIA330035sU植物表达载体中，得到重组表达载体pCAMBIA330035sU-OsERF096(图2-A)。具体步骤如下：用限制性内切酶PacI和Nt.BbvCI对pCAMBIA330035Su载体进行双酶切，得到载体酶切产物。将获得的载体酶切产物、USER酶(NEB，M5505S)和步骤1获得的OsERF096片段在37℃下孵育20min，利用USER酶对OsERF096片段的尿嘧啶处进行切割，形成可与pCAMBIA330035Su载体互补的粘性末端，然后25℃下孵育20min。
3、将步骤2获得的重组表达载体pCAMBIA330035sU-OsERF096转化大肠杆菌感受态，酶切鉴定后送交测序。
测序结果表明：pCAMBIA330035sU-OsERF096为在pCAMBIA330035Su载体的两个PacI酶切位点间***序列2所示的DNA分子，且保持pCAMBIA330035Su载体的其他序列不变后得到的载体。
4、采用农杆菌介导法对水稻愈伤组织遗传转化，获得了28株抗性水稻植株(OsERF096-OX)，并对抗性植株进行PCR和RT-PCR分子鉴定。具体步骤如下：
1)采用冻融法将步骤3获得的pCAMBIA330035sU-OsERF096转化根癌农杆菌EHA105，得到重组菌pCAMBIA330035sU-OsERF096/EHA105。
2)采用农杆菌介导法将重组菌pCAMBIA330035sU-OsERF096/EHA105菌液侵染水稻品种“日本晴”的胚性愈伤组织20min，然后将愈伤组织转接到共培养培养基(含20mg/L乙酰丁香酮的NB培养基，pH5.2)。
3)25℃黑暗培养2-4天后取愈伤组织，用含500mg/L头孢霉素的无菌水溶液清洗，然后接种至筛选培养基(含15mg/L固杀草和100mg/L阿莫西林克拉维酸钾的NB培养基，pH5.8)。
4)32℃、24h光照条件下培养6周后取愈伤组织，接种至分化培养基(含30g/L山梨醇、2g/L酪蛋白水解物、100mg/L阿莫西林克拉维酸钾、2mg/L KT和0.02mg/LNAA的MS培养基，pH5.8)，首先在25℃、黑暗的条件下培养5-7天，然后转移至26℃、16h光照/8h黑暗的条件下培养至愈伤组织表面有绿点产生。
5)将有绿点的愈伤组织转移至新的分化培养基，在26℃、16h光照/8h黑暗的条件下培养至幼苗再生芽长度约为2cm。
6)将幼苗转移至生根培养基(含100mg/L阿莫西林克拉维酸钾的MS培养基，pH5.8)，在26℃、16h光照/8h黑暗的条件下培养至株高为10-15cm且根系发达，得到再生植株(T0代)。
7)将再生植株(T0代)移栽到事先拌好的培养基质(培养基质的组成：1质量份草炭土+1质量份君子兰土+3质量份土壤)，浇水，先放置在暗光条件下培养3-5天，然后移至户外正常培养。
8)取再生植株的叶片，提取基因组DNA，采用Bar-277-F和Bar-277-R组成的引物对(以Bar基因为靶基因)进行PCR鉴定，阳性植株扩增片段大小为277bp，得到PCR鉴定阳性的再生植株。
引物序列如下：Bar-277-F：5’-TGGGCAGCCCGATGACAGCGACCAC-3’；
Bar-277-R：5’-ACCGAGCCGCAGGAACCGCAGGAGT-3’。
PCR鉴定结果如图2-C所示。结果表明：目的片段已整合到水稻基因组中，选取PCR鉴定阳性的再生植株进行RT-PCR鉴定。
9)分别取PCR鉴定阳性的再生植株的嫩叶，提取总RNA并反转录合成cDNA。以cDNA为模板，采用OsERF096-RT-F和OsERF096-RT-R进行RT-PCR，同时以水稻的延伸因子1-α基因(osa-ELF1-α)为内参基因。
OsERF096-RT-F：5’-GCCATCCTCAACTTCCCCAAC-3’；
OsERF096-RT-R：5’-GCCTCTCCTTCTTCACCTCCCTC-3’。
RT-PCR鉴定结果如图2-D所示。从图中可以看出：8个转基因株系OsERF096-OX在转录水平上均有不同程度的上调表达，均高于野生型，表明OsERF096片段在转基因水稻中可正常转录。
10)将RT-PCR鉴定阳性的再生植株自交，每个单株分别收获T1代种子，按照步骤9)的方法对T1代种子长成的植株进行RT-PCR鉴定；将RT-PCR鉴定阳性的T1代植株进行自交，每个单株分别收获T2代种子，按照步骤9)的方法对T2代种子长成的植株进行RT-PCR鉴定；对于某一T1代植株来说，如果其自交得到的T2代植株均为RT-PCR鉴定阳性，该T1代植株为一个纯合的转基因植株，该T1代植株及其自交后代为一个纯合的转基因株系，直至获得T3代OsERF096超量表达转基因水稻纯合体株系。随机选取2个T3代OsERF096超量表达转基因水稻纯合株系OsERF096-OX-1、OsERF096-OX-3用于下述耐冷性分析。
二、OsERF096超量表达转基因水稻的耐冷性分析
1、OsERF096超量表达转基因水稻萌发期耐冷性分析
将野生型水稻品种日本晴和T3代OsERF096超量表达转基因水稻纯合株系OsERF096-OX-1、OsERF096-OX-3进行萌发期冷胁迫处理。具体步骤如下：选取饱满的野生型水稻品种日本晴(简称WT)、T3代OsERF096超量表达转基因水稻纯合株系OsERF096-OX-1、OsERF096-OX-3种子，蒸馏水清洗后30℃浸种、催芽3～5天，至破胸露白。然后将种子移栽到Yoshida溶液中培养，对照组培养条件(未冷处理)为28℃、16h光照，22℃、8h黑暗，实验组培养条件(冷处理)为10℃、16h光照，10℃、8h黑暗。培养7天，分别拍照并统计根长和芽长。实验重复三次，每种处理各株系采用30株植株。
结果如图3所示。结果表明，冷处理后OsERF096-OX转基因水稻的生长较WT受抑制更严重(图3-A)。冷处理后WT平均芽长为2.30cm，T3代OsERF096超量表达转基因水稻纯合株系OsERF096-OX-1、OsERF096-OX-3的平均芽长分别为2.09cm和2.05cm，显著低于WT(图3-B)。根长与芽长的统计结果较为相似，冷处理后WT平均根长为2.70cm，T3代OsERF096超量表达转基因水稻纯合株系OsERF096-OX-1和OsERF096-OX-3的平均根长分别为2.55cm和2.54cm(图3-C)，只有OsERF096-OX-3株系显著低于WT，OsERF096-OX-1株系与WT之间根长的统计结果并无显著性。
以上结果表明：OsERF096的超量表达降低了萌发期水稻对冷胁迫的耐受性。
2、OsERF096超量表达转基因水稻幼苗期耐冷性分析
将野生型水稻品种日本晴和T3代OsERF096超量表达转基因水稻纯合株系OsERF096-OX-1、OsERF096-OX-3进行幼苗期的冷胁迫处理。具体步骤如下：选取饱满的野生型水稻品种日本晴(简称WT)、T3代OsERF096超量表达转基因水稻纯合株系OsERF096-OX-1、OsERF096-OX-3种子，蒸馏水清洗后30℃浸种、催芽3～5天，至破胸露白。将发芽的种子播种到湿润的育秧土中，培养至三叶期后进行幼苗期冷处理，冷处理方法如下：在4℃培养箱中培养3天，恢复培养6天。冷处理后拍照并统计芽长、根长和鲜重；在冷处理前和冷处理后，取水稻幼苗相同部位的叶片，采用紫外分光光度法参考文献“miR535 negatively regulatescold tolerance in rice”中的方法测定游离脯氨酸含量；使用电导率仪参考文献“Mingzhe Sun,Yang Shen,Junkai Yang,Xiaoxi Cai,Hongyu Li,Yanming Zhu,Bowei JiaXiaoli Sun.miR535 negatively regulates cold tolerance in rice.MolecularBreeding,2020,40(1):14”中的方法测定相对电导率，相对电导率(％)＝浸提液电导(R1)/浸提液电阻(R2)×100％。恢复培养后统计存活率。实验重复三次，每种处理各株系采用30株植株。
结果如图4所示。结果表明：WT冷胁迫处理后长势略好于OsERF096-OX转基因水稻(图4-A)。冷处理后WT的平均游离脯氨酸含量为206.75μg/g，T3代OsERF096超量表达转基因水稻纯合株系OsERF096-OX-1、OsERF096-OX-3的平均游离脯氨酸含量分别为194.25μg/g和188.8μg/g(图4-B)；冷处理后WT的平均相对导电率为42.93％，T3代OsERF096超量表达转基因水稻纯合株系OsERF096-OX-1、OsERF096-OX-3的平均相对导电率分别为49.37％和51.68％(图4-C)；与WT相比，OsERF096-OX转基因水稻细胞中的游离脯氨酸含量减少，细胞膜通透性增加。恢复培养后WT的平均存活率为86.90％，T3代OsERF096超量表达转基因水稻纯合株系OsERF096-OX-1、OsERF096-OX-3的平均存活率分别为80.21％和77.60％(图4-D)，与WT相比，恢复培养后的OsERF096-OX转基因水稻的存活率显著下降。
以上结果表明：OsERF096超量表达降低了幼苗期水稻对冷胁迫的耐受性。
实施例3、OsERF096-RNAi转基因水稻的获得及其耐冷性分析
一、OsERF096-RNAi转基因水稻的获得及鉴定
1、OsERF096-siRNA序列的设计
根据OsERF096序列，使用Invitrogen公司在线RNAi设计软件：BLOCK-iT RNAiDesigner设计OsERF096-RNAi干扰序列(OsERF096-siRNA序列)，OsERF096-siRNA序列具体如下：
TAAATCACGTGTTCTGAGCGGCAGGAGATTCAGTTTGAAGCTGGACTTCACTTTTGCCTCTCTCCGCTGAGATCACGTGATTTA(序列4)，见图5-B。
2、OsERF096基因沉默载体OsERF096-RNAi的构建
1)根据步骤1设计的OsERF096-siRNA序列，委托公司合成如下双链DNA：TAAATCACGTGTTCTGAGCGGCAGGAGATTCAGTTTGAAGCTGGACTTCACTTTTGCCTCTCTCCGCTGAGATCACGTGATTTA，然后将该双链DNA通过重组酶与pBWA(V)HS-ami载体连接，获得pBWA(V)HS-ami-OsERF096-RNAi载体，并送交测序。
2)采用BsaI与Eco31I双酶切步骤1)获得的pBWA(V)HS-ami-OsERF096-RNAi载体，获得OsERF096-siRNA片段；将OsERF096-siRNA片段与经BsaI/Eco31I消化过的pCAMBIA1300载体连接，获得OsERF096-RNAi载体(图5-A)，并送交测序。
测序结果表明：OsERF096-RNAi载体为在pCAMBIA1300载体的BsaI和Eco31I酶切位点间***序列4所示的DNA分子，且保持pCAMBIA1300载体的其他序列不变后得到的载体。
3、OsERF096-RNAi转基因水稻的获得及鉴定
采用农杆菌介导法对水稻愈伤组织遗传转化，获得了抗性水稻植株35株，并对抗性植株进行PCR和RT-PCR的分子鉴定。具体步骤如下：
1)采用冻融法将步骤2获得的OsERF096-RNAi载体转化根癌农杆菌EHA105，得到重组菌OsERF096-RNAi/EHA105。
2)采用农杆菌介导法用重组菌OsERF096-RNAi/EHA105菌液侵染水稻品种“日本晴”的胚性愈伤组织20min，然后将愈伤组织转接到共培养培养基(含20mg/L乙酰丁香酮的NB培养基，pH5.2)。
3)25℃黑暗培养2-4天后取愈伤组织，用含500mg/L头孢霉素的无菌水溶液清洗，然后接种至筛选培养基(含15mg/L固杀草和100mg/L阿莫西林克拉维酸钾的NB培养基，pH5.8)。
4)32℃、24h光照条件下培养6周后取愈伤组织，接种至分化培养基(含30g/L山梨醇、2g/L酪蛋白水解物、100mg/L阿莫西林克拉维酸钾、2mg/L KT和0.02mg/LNAA的MS培养基，pH5.8)，首先在25℃、黑暗的条件下培养5-7天，然后转移至26℃、16h光照/8h黑暗的条件下培养至愈伤组织表面有绿点产生。
5)将有绿点的愈伤组织转移至新的分化培养基，在26℃、16h光照/8h黑暗的条件下培养至幼苗再生芽长度约为2cm。
6)将幼苗转移至生根培养基(含100mg/L阿莫西林克拉维酸钾的MS培养基，pH5.8)，在26℃、16h光照/8h黑暗的条件下培养至株高为10-15cm且根系发达，得到再生植株(T0代)。
7)将再生植株(T0代)移栽到事先拌好的培养基质(培养基质的组成：1质量份草炭土+1质量份君子兰土+3质量份土壤)，浇水，先放置在暗光条件下培养3-5天，然后移至户外正常培养。
8)取再生植株的叶片，提取基因组DNA，采用Hyg-280-F/R进行PCR鉴定，阳性植株扩增片段大小为280bp，得到PCR鉴定阳性的再生植株。
引物序列如下：Hyg-280-F：5’-ACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCC-3’；
Hyg-280-R：5’-TTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGA-3’。
PCR鉴定结果如图5-C所示。结果表明：目的片段已整合到水稻基因组中。
9)分别取PCR鉴定阳性的再生植株的嫩叶，提取总RNA并反转录合成cDNA。以cDNA为模板，采用OsERF096-RT-F：5’-GCCATCCTCAACTTCCCCAAC-3’和OsERF096-RT-R：5’-GCCTCTCCTTCTTCACCTCCCTC-3’进行RT-PCR，同时以水稻的延伸因子1-α基因(osa-ELF1-α)为内参基因。
RT-PCR鉴定结果如图5-D所示。从图中可以看出：6个OsERF096-RNAi转基因株系在转录水平上均有不同程度的下调表达，均低于野生型。
10)将RT-PCR鉴定阳性的再生植株自交，每个单株分别收获T1代种子，按照步骤9)的方法对T1代种子长成的植株进行RT-PCR鉴定；将RT-PCR鉴定阳性的T1代植株进行自交，每个单株分别收获T2代种子，按照步骤9)的方法对T2代种子长成的植株进行RT-PCR鉴定；对于某一T1代植株来说，如果其自交得到的T2代植株均为RT-PCR鉴定阳性，该T1代植株为一个纯合的转基因植株，该T1代植株及其自交后代为一个纯合的转基因株系，直至获得T3代OsERF096-RNAi转基因水稻纯合体株系。随机选取3个T3代OsERF096-RNAi转基因水稻纯合株系OsERF096-RNAi-1、OsERF096-RNAi-2、OsERF096-RNAi-3用于下述耐冷性分析。
二、OsERF096-RNAi转基因水稻的耐冷性分析
1、OsERF096-RNAi转基因水稻萌发期耐冷性分析
将野生型水稻品种日本晴(简称WT)、实施例2中的T3代OsERF096超量表达转基因水稻纯合株系OsERF096-OX-1(简称OsERF096-OX)和T3代OsERF096-RNAi转基因水稻纯合株系OsERF096-RNAi-2(简称OsERF096-RNAi)进行萌发期冷胁迫处理。具体步骤如下：选取饱满的野生型水稻品种日本晴、T3代OsERF096超量表达转基因水稻纯合株系OsERF096-OX、T3代OsERF096-RNAi转基因水稻纯合株系OsERF096-RNAi种子，蒸馏水清洗后30℃浸种、催芽3～5天，至破胸露白。然后将种子移栽到Yoshida溶液中培养，对照组培养条件(未冷处理)为28℃、16h光照，22℃、8h黑暗，实验组培养条件(冷处理)为10℃、16h光照，10℃、8h黑暗。培养7天，分别拍照并统计根长和芽长。实验重复三次，每种处理各株系采用30株植株。
结果如图6所示。结果表明，冷胁迫处理下，OsERF096-RNAi转基因水稻相较于WT并未表现出显著的受抑制表型，OsERF096-RNAi转基因水稻与WT的平均芽长分别为2.25cm和2.19cm(图6-B)，并无显著差异，但OsERF096-RNAi转基因水稻平均根长为2.8cm，显著高于WT(2.59cm)(图6-C)。OsERF096-RNAi和OsERF096-OX转基因水稻的冷处理结果显示，OsERF096-RNAi转基因水稻冷处理后长势显著好于OsERF096-OX转基因水稻，根长与芽长的统计结果较为相似，冷处理后WT平均根长为2.60cm，OsERF096-OX转基因水稻、OsERF096-RNAi转基因水稻的平均根长分别为2.47cm和2.80cm(图6-C)。
上述结果表明，干扰OsERF096基因表达提高了萌发期水稻的冷胁迫耐受性。
2、OsERF096-RNAi转基因水稻幼苗期耐冷性分析
选取饱满的野生型水稻品种日本晴(简称WT)、实施例2中的T3代OsERF096超量表达水稻纯合体株系OsERF096-OX-1和OsERF096-OX-3、T3代OsERF096-RNAi转基因水稻纯合株系OsERF096-RNAi-2和OsERF096-RNAi-3种子为实验材料，按照实施例2中的方法进行耐冷性分析。将WT和OsERF096-RNAi、OsERF096-OX转基因水稻幼苗期进行冷胁迫处理。检测4℃处理后的WT与转基因幼苗的游离脯氨酸及电导率，恢复培养后统计存活率。
结果如图7所示。结果表明：冷处理后WT的平均游离脯氨酸含量为211.4μg/g，T3代OsERF096超量表达转基因水稻纯合株系OsERF096-OX-1和OsERF096-OX-3的平均游离脯氨酸含量分别为195.6μg/g和198.0μg/g，T3代OsERF096-RNAi转基因水稻纯合株系OsERF096-RNAi-2和OsERF096-RNAi-3的平均游离脯氨酸含量分别为229.6μg/g和229.6μg/g(图7-B)；冷处理后WT的平均相对导电率为47.40％，T3代OsERF096超量表达转基因水稻纯合株系OsERF096-OX-1和OsERF096-OX-3的平均相对导电率分别为52.08％和53.15％，T3代OsERF096-RNAi转基因水稻纯合株系OsERF096-RNAi-2和OsERF096-RNAi-3的平均相对导电率分别为44.81％和41.93％(图7-C)；恢复培养后WT的平均存活率为44.44％，T3代OsERF096超量表达转基因水稻纯合株系OsERF096-OX-1、OsERF096-OX-3的平均存活率分别为36.67％和34.44％，T3代OsERF096-RNAi转基因水稻纯合株系OsERF096-RNAi-2和OsERF096-RNAi-3的平均存活率分别为47.78％和48.89％(图7-D)。
上述结果表明：干扰OsERF096基因表达提高了幼苗期水稻的冷胁迫耐受性。
3、OsERF096调控冷胁迫下活性氧(ROS)积累及清除
分别将萌发期和幼苗期的野生型水稻品种日本晴(简称WT)、实施例2中的T3代OsERF096超量表达转基因水稻纯合株系OsERF096-OX-1和OsERF096-RNAi转基因水稻纯合株系OsERF096-RNAi-1在4℃-光照-12h/4℃-黑暗-12h处理24h后进行DAB染色和NBT染色，对照组处理条件为：28℃-光照-12h/24℃-黑暗-12h。DAB染色和NBT染色的具体步骤参考文献“miR535 negatively regulates cold tolerance in rice”中的方法。
DAB染色结果如图8所示。结果表明：冷处理前幼苗期各水稻株系叶片中并未出现H2O2，冷处理后OsERF096-OX转基因水稻中出现了较多的H2O2，而OsERF096-RNAi转基因水稻则与WT结果类似(图8-A)，萌发期实验结果与幼苗期叶片染色结果一致，处理后OsERF096-OX转基因水稻中H2O2含量较高(图8-B)。
NBT染色结果如图9所示。结果表明：冷处理前叶片中O2-含量极少，处理后OsERF096-OX转基因水稻叶片中积累了较多的O2-，而OsERF096-RNAi转基因水稻染色结果与WT较为一致(图9-A)，与DAB染色结果一致；萌发期实验结果与幼苗期的NBT染色结果一致(图9-B)。
以上结果表明：OsERF096可调控冷胁迫下活性氧(ROS)积累及清除。
综上所述，OsERF096是水稻冷胁迫应答的负调控因子。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 一种与植物耐逆性相关的蛋白OsERF096及其编码基因与应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1564
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ctcgctcgcg cgccacactc ctcgaaccac caccaccacc accacgtgtt cgatcgcgtc 60
ctccaagccc cagcacctac gcgtcgtcgc gccatggccg gcttcggctt ggaccagcac 120
ctcgacctca tccgcgccca cctcctcgaa gacgcccacc accacgtcct cgcgccatcg 180
ccgtcgccct cgccaccggg tactgggcgt gtcaggccgg cgcccgtgtc gctgcccccg 240
aggccgccgc tcctgtgggc ggcggcgtcg gcggcgccgc ggcagcagga ggagtgcttc 300
gagctcggcg gcggctacgc gggggagggg gagggggagg aggaggacga cttccggcgg 360
taccgcgggg tgcggcagcg gccgtggggc aagtacgcgg cggagatccg ggacccggcg 420
aggaagggcg cgagggtgtg gctcggcacc tacgacaccg ccgtcgaggc cgcgcgcgcc 480
tacgaccgcg ccgcgttcca gctccgcggg tccaaggcca tcctcaactt ccccaacgag 540
gtcgccgccg acgccgccgt caagtgggcc cctcccgtcg cccctatccc cgccgccgcc 600
atgtccgccg gaagaggcaa gagggtgagg tcggaggagc agtactactt gagggaggtg 660
aagaaggaga ggctgatcat ggcgccgccg gagaactcct cctcgtcgtc gtcgtcggcg 720
gcggcggcag ccggagacat ctgggacgag ctgaagggga tctgcagcct gccgccgctc 780
tcgccgctgt cgccgcaccc gcacatggcc ttcccgcagc tgttcgtaag ctgatcgatc 840
gctagctccg gccatggacg gcgccgtggc gagcttggag tgcagccatg gcgcgcgccc 900
ggcgcggtac acgcatggct gccgcgtggt ggtgtccgtg acgtcacgtg cgaaggatat 960
ggccttaatc ctgaattaga tagggtgttc tttgattaat tcgctaaact tcgtaatatt 1020
aggtaatcga tttggctttc ggccaaatat tgaattcttt cgttctattg ctgctcaggt 1080
gatcgatgat catagtagct tcattgcgat ttgtcaatga aatgatataa atatgtatta 1140
attacaagtt gaagagtact aatgaagaac atcagaggct cagagcaatt gagcgcacat 1200
ctcgttaact ccagtctcct tttggaatga ttggctagta gtacttgtaa gacatcgacc 1260
gttgaagtcg tgatgtttgc tttcttcttt tcctttttag aacacgtgat tttgcttttg 1320
actatgctat ttgatgatta aacagagaag aaatattcgt cttacaagat catatcaccg 1380
aaaagactag ctaggcgcat ggagtagtac tggaaacaag ctctgctaag gccctctttg 1440
tttaggctta agcttattgg actagacttt taagccagct gtggttaatc taggcccatt 1500
ttggaaaaaa aaacattagc tgtaattttt ctcgaagtta tatatttctt gcactaaaaa 1560
atta 1564
<210> 2
<211> 822
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atggccggct tcggcttgga ccagcacctc gacctcatcc gcgcccacct cctcgaagac 60
gcccaccacc acgtcctcgc gccatcgccg tcgccctcgc caccgggtac tgggcgtgtc 120
aggccggcgc ccgtgtcgct gcccccgagg ccgccgctcc tgtgggcggc ggcgtcggcg 180
gcgccgcggc agcaggagga gtgcttcgag ctcggcggcg gctacgcggg ggagggggag 240
ggggaggagg aggacgactt ccggcggtac cgcggggtgc ggcagcggcc gtggggcaag 300
tacgcggcgg agatccggga cccggcgagg aagggcgcga gggtgtggct cggcacctac 360
gacaccgccg tcgaggccgc gcgcgcctac gaccgcgccg cgttccagct ccgcgggtcc 420
aaggccatcc tcaacttccc caacgaggtc gccgccgacg ccgccgtcaa gtgggcccct 480
cccgtcgccc ctatccccgc cgccgccatg tccgccggaa gaggcaagag ggtgaggtcg 540
gaggagcagt actacttgag ggaggtgaag aaggagaggc tgatcatggc gccgccggag 600
aactcctcct cgtcgtcgtc gtcggcggcg gcggcagccg gagacatctg ggacgagctg 660
aaggggatct gcagcctgcc gccgctctcg ccgctgtcgc cgcacccgca catggccttc 720
ccgcagctgt tcgtaatcga tttggctttc ggccaaatat tgaattcttt cgttctattg 780
ctgctcagaa cacgtgattt tgcttttgac tatgctattt ga 822
<210> 3
<211> 273
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Met Ala Gly Phe Gly Leu Asp Gln His Leu Asp Leu Ile Arg Ala His
1 5 10 15
Leu Leu Glu Asp Ala His His His Val Leu Ala Pro Ser Pro Ser Pro
20 25 30
Ser Pro Pro Gly Thr Gly Arg Val Arg Pro Ala Pro Val Ser Leu Pro
35 40 45
Pro Arg Pro Pro Leu Leu Trp Ala Ala Ala Ser Ala Ala Pro Arg Gln
50 55 60
Gln Glu Glu Cys Phe Glu Leu Gly Gly Gly Tyr Ala Gly Glu Gly Glu
65 70 75 80
Gly Glu Glu Glu Asp Asp Phe Arg Arg Tyr Arg Gly Val Arg Gln Arg
85 90 95
Pro Trp Gly Lys Tyr Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro Ala Arg Lys Gly
100 105 110
Ala Arg Val Trp Leu Gly Thr Tyr Asp Thr Ala Val Glu Ala Ala Arg
115 120 125
Ala Tyr Asp Arg Ala Ala Phe Gln Leu Arg Gly Ser Lys Ala Ile Leu
130 135 140
Asn Phe Pro Asn Glu Val Ala Ala Asp Ala Ala Val Lys Trp Ala Pro
145 150 155 160
Pro Val Ala Pro Ile Pro Ala Ala Ala Met Ser Ala Gly Arg Gly Lys
165 170 175
Arg Val Arg Ser Glu Glu Gln Tyr Tyr Leu Arg Glu Val Lys Lys Glu
180 185 190
Arg Leu Ile Met Ala Pro Pro Glu Asn Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser
195 200 205
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Asp Ile Trp Asp Glu Leu Lys Gly Ile Cys
210 215 220
Ser Leu Pro Pro Leu Ser Pro Leu Ser Pro His Pro His Met Ala Phe
225 230 235 240
Pro Gln Leu Phe Val Ile Asp Leu Ala Phe Gly Gln Ile Leu Asn Ser
245 250 255
Phe Val Leu Leu Leu Leu Arg Thr Arg Asp Phe Ala Phe Asp Tyr Ala
260 265 270
Ile
<210> 4
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
taaatcacgt gttctgagcg gcaggagatt cagtttgaag ctggacttca cttttgcctc 60
tctccgctga gatcacgtga ttta 84

Claims (8)

1.m1或m2所示的物质在提高植物耐逆性或培育耐逆性提高的转基因植物中的应用；
m1、抑制或降低植物中OsERF096蛋白活性或者含量的物质；
m2、抑制或沉默植物中OsERF096蛋白编码核酸表达的物质或敲除植物中OsERF096蛋白编码核酸的物质；
所述OsERF096蛋白为氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
所述植物为水稻；
所述耐逆性为耐冷性。
2.一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：降低受体植物中OsERF096蛋白的含量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物；
所述OsERF096蛋白为氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
所述植物为水稻；
所述耐逆性为耐冷性。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述降低受体植物中OsERF096蛋白的含量和/或活性的方法通过对所述受体植物中OsERF096蛋白的编码基因进行敲除或抑制或沉默来实现。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：沉默所述受体植物中的OsERF096蛋白的编码基因的物质为干扰所述受体植物中的OsERF096蛋白的编码基因表达的核酸分子。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：干扰所述受体植物中的OsERF096蛋白的编码基因表达的核酸分子为序列4。
6.一种培育耐逆性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：提高受体植物中OsERF096蛋白的含量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的耐逆性低于所述受体植物；
所述OsERF096蛋白为氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
所述植物为水稻；
所述耐逆性为耐冷性。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中OsERF096蛋白的含量和/或活性的方法为在受体植物中过表达OsERF096蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述过表达的方法为将OsERF096蛋白的编码基因导入受体植物中。
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