CN118256377A

CN118256377A - 一株苜蓿链霉菌a1及其应用

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Publication number: CN118256377A
Application number: CN202410333919.6A
Authority: CN
Inventors: 段鹏飞; 王静怡; 连美佳; 张�浩; 赵地; 曾習; 吴慧玲; 陈兆进; 李娜; 曹玲玲; 杨树琼
Original assignee: Nanyang Normal University
Current assignee: Nanyang Normal University
Priority date: 2024-03-22
Filing date: 2024-03-22
Publication date: 2024-06-28

Abstract

本发明公开了一株苜蓿链霉菌A1及其应用，属于微生物技术领域。菌株A1分离自河南省南阳市卧龙区种植基地土壤中，该菌株于2024年01月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.29628，分类命名为苜蓿链霉菌(Streptomyces alfalfae)A1。菌株A1具有优异的广谱抑菌性能，对油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌、番茄灰霉病菌、桃树褐腐病菌、棉花黄萎病菌、白菜黑斑病菌均具有较好的拮抗作用；菌株A1的发现也为微生物资源的开发和在植物土传病害防治方面的利用提供了新的菌种资源。

Description

一株苜蓿链霉菌A1及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株苜蓿链霉菌A1及其应用。

背景技术

油菜菌核病，又称之为菌核杆腐病，是由核盘菌引起的，发生在油菜等作物的一种病害。该病主要为害油菜的茎、叶、花、角果、种子。油菜菌核病是世界性病害，在我国的油菜产区常有发生，以长江中下游及东南沿海的油菜区发病最为严重，该病害不仅会导致大量减产，还会使病株种子含油量锐减，严重影响油菜的产量和品质。油菜菌核病的治理策略是以种植抗(耐)病品种为基础，结合清除菌源、改进栽培管理措施、适时化学防治。加强管理对人员的技术要求较高，抗(耐)病品种的研发耗时耗力，这两种方式实施起来难度都较大，药剂防治方法虽可在短时间内达到较佳的治理效果，但是容易造成土质污染问题。

番茄灰霉病是由灰葡萄孢引起的、发生在番茄的病害，主要发生在花期和结果期，可危害花、果实、叶片和茎。番茄灰霉病发生时间早、持续时期长，加之主要为害果实，故造成的损失极大。番茄发病后造成早春大量烂果。一般减产20～30％，严重地块甚至高达50％左右。该病不仅在植株生长期间严重发生，而且在采后的储藏、运输过程中还可继续造成严重危害。此类疫病的防治方法主要有栽培防病、物理防治和化学防治，栽培防病和物理防治对技术要求较高，化学防治一来会产生二次污染问题，二来灰霉病菌易产生抗药性，应尽量减少用药量和施药次数。

桃树褐腐病、棉花黄萎病和棉花枯萎病等疫病均属于常见植物病害，与番茄灰霉病等疫病相似，目前在对此类病害进行防治时主要依靠轮作法或者化学法进行，轮作法对场地要求高，化学防治法虽见效快，但造成的二次污染问题不可忽视，且由于一些病菌易于产生抗药性，所以还会影响防治效果。

生物防治是利用有益生物或其他生物来抑制或消灭有害生物的一种防治方法，其中，微生物防治技术具有高效、广谱、无污染、成本低、作用范围广、不会引起植物病原菌产生抗性的特点。拮抗微生物通过分泌脂肽、抗生素和其他抗真菌代谢产物，直接抑制植物病原体，所以，寻找拮抗微生物和活性代谢物是生物防治的关键。放线菌是最早发现的具有生防作用的一类微生物，许多放线菌对植物病原真菌均具有较强的抑制作用，已被广泛用来保护植物免受多种植物病原真菌的侵害。其中，对链霉菌属(Streptomyces sp.)的研究最为充分，已从该属中分离获得阿维菌素、四环素、链霉素、制霉菌素、红霉素等化合物。研究发现，大部分链霉菌都可以产生具有抗菌作用的抗生素等活性物质，它们常被用作高效的土传性病害的生物防治剂。

现有技术中报道过一些具有广谱抗菌性的链霉菌，并着力对其进行产品化和产业化研发，链霉菌对一系列植物病原真菌均表现出较强的生物活性。如中国专利CN116536224 B公开的盐屋链霉菌Y88及其应用，其指出Y88对14种病原真菌和5种病原细菌都有较强的抑制作用，具有很广的抑菌谱，不仅可以在植物生长过程中起到生防作用，还可以显著降低由假禾谷镰刀菌引起的小麦茎基腐病和尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌引起的黄瓜根腐病的发病率和病情指数。中国专利CN 115627248B公开一株临高链霉菌1-7，并指出该菌株具有广谱抑菌活性，对其进行发酵培养后，制成生防菌剂，对香蕉枯萎病菌4号生理小种、黄瓜枯萎病菌、辣椒炭疽病菌、灰葡萄孢霉病菌、香蕉长形斑病菌、小麦赤霉病菌、胶孢炭疽病菌、草莓炭疽病菌等具有良好的拮抗作用。但是还未见报道过具有优异广谱抑菌性能的苜蓿链霉菌，未见苜蓿链霉菌防治桃树褐腐病、棉花黄萎病、油菜菌核病等疫病的相关报道。同时，由于现有的生防菌资源库资源有限，有些生防菌防控效果不稳定，在实际应用过程中经常发生突变和退化，因此需要不断增加新的高效生防菌株，且拮抗放线菌的分离与功能鉴定也被认为是农业发展、生态安全和植物病害防治中不可或缺的重要环节。

因而，如能从自然环境中分离得到一株具有广谱抗菌性的苜蓿链霉菌不仅可进一步丰富现有的具有抑菌活性的菌种资源，且无疑会对农作物的疫病防治起到至关重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于为多行业提供更为丰富的菌种资源，分离得到一株苜蓿链霉菌(Streptomyces alfalfae)A1，此菌株对多种植物病害均具有明显的拮抗作用，应用前景良好。

本发明的技术方案为：本发明所述的一株苜蓿链霉菌A1，分离自河南省南阳市卧龙区种植基地土壤中，该菌株于2024年01月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.29628，分类命名为苜蓿链霉菌(Streptomycesalfalfae)A1。

菌株A1的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

上述苜蓿链霉菌A1可应用在防治植物病害中，所述植物病害包括但不限于油菜菌核病、棉花枯萎病、番茄灰霉病、桃树褐腐病、棉花黄蒌病和白菜黑斑病。

上述苜蓿链霉菌A1可用于制备防治油菜菌核病、棉花枯萎病、番茄灰霉病、桃树褐腐病、棉花黄蒌病和白菜黑斑病等植物病害的菌剂，所述生防菌剂为生防菌株A1通过液体发酵培养后获得的发酵液。

上述生防菌剂可用于制备防治油菜菌核病、棉花枯萎病、番茄灰霉病、桃树褐腐病、棉花黄蒌病或白菜黑斑病等植物病害的生物农药。

本发明的有益效果是：

1.本申请分离得到的菌株A1经鉴定为苜蓿链霉菌(Streptomyces alfalfae)，其具有优异的光谱抑菌性能，能有效抑制油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)的生长，对其它病菌如棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、桃树褐腐病菌(Monilinia fructicola)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae(Berk.)Sace.)等也有较好的拮抗作用，且作用效果明显，具有良好的应用前景；

2.由本申请公开的苜蓿链霉菌A1制备的生物防治制剂，可以作为生物农药或生物肥料，高效防治多种植物土传病害；

3.本申请发现并公开一种对多种植物病害均有防治效果的拮抗菌株，为微生物资源的开发和在植物土传病害防治方面的利用提供了新的菌种资源，也能对农作物的疫病防治起到至关重要的作用。

附图说明

图1是菌株A1的菌落形态图，其中，左侧小图为平板正面图片，右侧小图为平板背面图片；

图2为菌株A1的***发育树；

图3为苜蓿链霉菌A1对不同病原菌的抑菌效果图，其中(a)小图为A1对油菜菌核病菌的抑菌效果图，(b)小图为A1对棉花枯萎病菌的抑菌效果图，(c)小图为A1对番茄灰霉病菌的抑菌效果图，(d)小图为A1对白菜黑斑病菌的抑菌效果图，(e)小图为A1对桃树褐腐病菌的抑菌效果图，(f)小图为A1对棉花黄萎病菌的抑菌效果图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。

供试样品及培养基

供试样品：2022年7月采自河南省南阳市卧龙区种植基地土壤；

高氏一号液体培养基：可溶性淀粉20.0g，NaCl 0.5g，KNO₃ 1.0g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄ 0.02g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4，121℃灭菌30min。

高氏一号琼脂培养基：可溶性淀粉20.0g，NaCl 0.5g，KNO₃ 1.0g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄ 0.02g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2-7.4，121℃灭菌30min。

PDB液体培养液：马铃薯去皮，200g切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，加20g葡萄糖，蒸馏水定容到1000mL，煮沸混匀，121℃条件下灭菌20min，得到PDB液体培养基。

PDA固体培养基：马铃薯去皮，200g切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，加20g葡萄糖、18g琼脂，蒸馏水定容到1000mL，煮沸混匀，121℃条件下灭菌20min，得到PDA固体培养基。

以下实施例中所用到的测试病原菌如下，均从南阳师范学院获得：油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、桃树褐腐病菌(Monilinia fructicola)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae(Berk.)Sace.)。

1、实验方法

1.1菌株A1的分离与筛选

将10g土壤样品放入90mL无菌水中，振荡均匀即为10^-1浓度的菌液，用1mL无菌移液管吸取1mL 10^-1浓度的菌液转移至9mL无菌水中，摇匀即为10^-2浓度的菌液，同样方法，依次梯度稀释到10^-4。将上述10^-2、10^-3和10^-4浓度的土壤菌液分别涂布到高氏一号琼脂平板上，吹干后倒置于28℃培养箱中培养3d。挑取单菌落转接到高氏一号琼脂平板上进行纯化培养，得到纯培养菌株后编号A1，置于冰箱中保存，备用。

1.2菌株A1的形态学、生理生化特征分析

菌株在高氏一号琼脂平板上培养48h(30℃)，观察菌落形态。菌株的生理生化特征鉴定参照《常见细菌***鉴定手册》和《Bergey’s Manual of DeterminativeBacteriology》，包括革兰氏染色、厌氧生长、碳源利用与产酸等，通过MicrobialIdentification System(MIDI)提取细胞脂肪酸并进行分析。

接种菌株至高氏一号液体培养基中，分别在4、10、15、20、25、30、37、45、50℃下培养，观察菌株的生长情况，确定菌株生长的最适温度范围。

调节高氏一号液体培养基pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，11.0，30℃培养，确定菌株生长的最适pH范围。

调节高氏一号液体培养基中NaCl浓度分别为0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％(w/v)，30℃培养，确定菌株生长的最适NaCl范围。

菌株A1为需氧的、革兰氏阳性放线菌，可形成基质菌丝和气生菌丝，其孢子链长而弯曲，表面光滑，孢子呈长杆状。在高氏一号琼脂平板上的菌落正面呈白色，背面呈淡黄色，圆形，光滑，生长48h后直径达到0.9-1.5mm(见图1)。菌株A1可以在15-45℃、pH 6.0-10.0、0-6％NaCl的条件下生长，最佳生长发生在37℃，pH 8.0以及0％NaCl。菌株可以在含有D-核糖、D-葡萄糖，N-乙酰基-D-葡糖胺、甘油、D-半乳糖、果糖和D-甘露糖的培养基中生长时产生酸。菌株可以利用甘油、蔗糖、海藻糖、D-木糖、D-甘露醇、D-半乳糖、明胶、淀粉、乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖作为唯一碳源进行生长，而蔗糖、麦芽糖、D-山梨醇、D-***糖、D-水杨酸、赤藓糖醇、肌醇、纤维二糖和蜜二糖不能作为碳源供菌株生长。菌株A1的脂肪酸主要由anteiso-C_15:0,iso-C_16:0and anteiso-C_17:0组成。

1.3***发育分析

基于16S rRNA基因序列进行***发育分析，确定菌株A1的准确分类地位。菌株A1在28℃下高氏一号液体培养基中培养48h，提取基因组DNA。利用细菌通用引物扩增菌株16SrRNA基因序列：27F：5′-AGAGTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQ ID NO.2)，1492R：5′-TACTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID NO.3)。扩增产物纯化后送至金斯瑞生物科技股份有限公司进行序列测定，并通过在线比对(www.ezbiocloud.net)，构建***发育进化树(邻接法，Neighbor-joining method)。

以菌株A1的基因组DNA为模板，16S rRNA基因通用引物为引物进行PCR扩增，得到总长为1353bp的基因序列(SEQ ID NO.1)：

TTGGGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCGTGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACCGGCTTTTTGAGATTCGCTCCACCTCGCGGTATCGCAGCTCATTGTACCGGCCATTGTAGCACGTGTGCAGCCCAAGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCTCCCGTGAGTCCCCAACACCCCCGAAGGGGCTTGCTGGCAACACGGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATYTCASGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTACACCGACCACAAGGGGGGCACCATCTCTGATGCTTTCCGGTGTATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAGCCACATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGAACTTAATGCGTTAGCTGCGGCACGGACGACGTGGAATGTCGCCCACACCTAGTTCCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTATCGGCCCAGAGATCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAATTCCGATCTCCCCTACCGAACTCTAGCCTGCCCGTATCGACTGCAGACCCGGGGTTAAGCCCCGGGCTTTCACAACCGACGTGACAAGCCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCGCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCACTTTCGCTTCTTCCCTGCTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTGAGCTTCTACCTCACCAACTAGCTGATAGGCCGCGGGCTCATCCTTCACCGCCGGAGCTTTCAACCCTCTCCCATGCGAGAGAGAGTGTTATCCGGTATTAGACCCCGTTTCCAGGGCTTGTCCCAGAGTGAAGGGCAGATTGCCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTAATCCACCCCGAA

将该序列在EzBioCloud数据库(https://www.ezbiocloud.net)中进行比对，结果表明菌株A1与Streptomyces alfalfa XY25^T的亲缘关系最近，达到100％，与Streptomycessilaceus NRRL B-24166的相似性达到99.04％，与其他菌株的相似性均低于99％。根据Neighbor-joining邻接法构建菌株A1的***发育树(见图2)，结果表明菌株A1位于Streptomyces菌属的簇中，并与Streptomyces alfalfa XY25^T单独在一个分枝上，距离最近。

根据形态特征、生理生化特征和16S rRNA序列分析结果，将菌株A1鉴定为苜蓿链霉菌(Streptomyces alfalfae)。

菌株A1的保藏信息

菌株A1已于2024年01月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCCNO.29628，该菌株的分类命名是苜蓿链霉菌(Streptomyces alfalfae)A1。

菌株A1广谱抗菌效果的测定

1)菌株A1对植物病原菌的抑制

将菌株A1和油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌、番茄灰霉病菌、桃树褐腐病菌、棉花黄萎病菌和白菜黑斑病菌对峙培养后，按照如下公式计算抑菌率。抑菌率％＝(对照病原菌直径-与拮抗菌对峙的病原菌直径)/对照病原菌直径×100％。

对峙实验结果如下：

结果表明，菌株A1对6种植物病原菌均有明显的抑制效果，具有广谱的抑菌作用。对油菜菌核病菌的抑菌率达到84.5％，对番茄灰霉病菌抑制率达到70.9％，对棉花枯萎病菌、白菜黑斑病菌和的抑菌率分别为69.9％、66.7％和65.8％，对桃树褐腐病菌的抑菌率较低，但也能达到42.1％，推测菌株A1产生的抗菌物质可能为抗生素类物质，且该物质能够拮抗大部分病原菌(见图3)。

A1菌剂的制备与应用

将高氏一号琼脂培养基上的A1单菌落接种至装有50mL液体发酵培养基(高氏一号液体培养基)的500mL三角瓶中，培养至对数中期，作为种子液备用。发酵罐400升，投料量300升，发酵培养基为高氏一号液体培养基。投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至30℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种入发酵罐，接种后的发酵罐温度控制在25℃，28℃，30℃，培养过程中无菌空气的通气量分别为1:0.5，1:0.6，1:0.7，搅拌速度分别为160，180，200转/分。整个工艺流程培养时间为60h。发酵结束后利用稀释涂平板法测定菌株A1的数量。通过菌株数量最多的平板确定最佳发酵条件为温度28℃，通气量1:0.6，搅拌速度为180转/分，在此条件下发酵60h后，菌株数量达到10¹¹CFU/mL。

2)盆栽实验

2.1油菜菌核病菌防治

油菜菌核病原菌孢子液制备:将病原菌接种到PDB培养基中，28℃，180r/min培养5-7d，调至孢子浓度为10⁸个/mL。

选择成熟且饱满的油菜种子，并将其置于质量浓度为0.5％的硫酸铜溶液中浸泡25min，用清水冲洗4次，洗净之后吸干种子上的水备用。在培养皿内垫入脱脂棉和滤纸，均匀放入种子，并置于人工气候箱内培养，每日光照及黑暗时间均维持在12h，相对湿度维持在60％，催芽3d后，种植于土壤中。土壤中预先接种油菜菌核病的病原菌孢子至10⁵个/g，处理组同时接种A1菌悬液至浓度为10⁶CFU/g，并设不接种A1菌剂和病原菌孢子为空白对照，每个处理3次重复，每次重复5株苗。播种后，观察记录发病情况，并于病原菌处理组发病明显时进行分级调查，计算病情指数和防治效果。叶片病斑分级标准为：

0级：无病斑；

1级：病斑面积占整个叶片面积的5％以下；

3级：病斑面积占整个叶片面积的6％-15％；

5级：病斑面积占整个叶片面积的16％～25％；

7级：病斑面积占整个叶片面积的26％～50％；

9级：病斑面积占整个叶片面积的50％以上或枯死。

病情指数＝Σ(各级病株数×相应级别)/(调查总株数×最大级数)×100。

防治效果(％)＝(病原菌接种处理对照病情指数-处理病情指数)/病原菌接种处理对照病情指数×100。

A1菌剂对油菜菌核病的防治效果如下：

结果表明A1菌剂对油菜菌核病的防治效果达到83.18％，具有良好的防治作用。

2.2番茄灰霉病防治

育苗

番茄灰霉病原菌孢子液制备:将病原菌接种到PDB培养基中，28℃，180r/min培养5-7d，调至孢子浓度为10⁸个/mL。

番茄种子用2％的H₂O₂消毒后，用超纯水洗净，置于滤纸上吸干表面水分。每个10cm培养皿中均匀放置10粒番茄种子，下方放置2层纱布，加入4mL超纯水。将培养皿放入温度为(26±2)℃、湿度为60％的恒温培养箱中黑暗培养数天，选长势一致的幼苗进行盆栽实验。土壤中预先接种番茄灰霉病的病原菌孢子至10⁵个/g，处理组同时接种A1菌悬液至浓度为10⁶CFU/g，并设不接种A1菌剂和病原菌孢子为空白对照，每个处理3次重复，每次重复5株苗，播种后，观察记录发病情况，并于病原菌处理组发病明显时进行分级调查，计算病情指数和防治效果。叶片病斑分级标准为：

0级：无病斑；

1级：病斑面积占整个叶面积5％以下；

3级：病斑面积占整个叶面积5％～10％；

5级：病斑面积占整个叶面积10％～20％；

7级：病斑面积占整个叶面积20％～50％；

9级：病斑面积占整个叶面积50％以上。

菌剂A1对番茄灰霉病的防治效果如下：

结果表明A1菌剂对番茄灰霉病的防治效果达到81.31％，具有良好的防治作用。

2.3棉花枯萎病防治

育苗：

棉花枯萎病原菌孢子液制备:将病原菌接种到PDB培养基中，28℃，180r/min培养5-7d，调至孢子浓度为10⁸个/mL。

将棉花种子在含有无菌水的无菌培养皿中浸泡过夜后，将其转移至8％的NaClO中消毒5min，即用无菌水清洗5次，置于无菌水浸湿的纱布上，25℃避光萌发2.5d。挑选萌发优良的种子至霍格兰营养液中，以25℃，16h光照，25℃，8h黑暗为一周期，随后挑选长势相同的棉花幼苗种植于土壤中，土壤中预先接种棉花枯萎病的病原菌孢子至10⁵个/g，处理组同时接种A1菌悬液至浓度为10⁶CFU/g，并设不接种A1菌剂和病原菌孢子为空白对照，每个处理3次重复，每次重复5株苗。播种后，观察记录发病情况，并于病原菌处理组发病明显时进行分级调查，计算病情指数和防治效果。病情分级标准为：

0级：健苗、无病状；

1级：1片枯萎的子叶，子叶边缘呈黄色网状或子叶变黄，发紫，真叶未显病状；

2级：2片枯萎的子叶或2片子叶脱落，叶子变黄或发紫叶脉呈黄色网状，株型出现矮化病状；

3级：第一片真叶枯萎或3片以上叶子(含2片子叶)脱落，株型矮缩或萎蔫；

4级：植株萎蔫、青枯死亡。

菌剂A1对棉花枯萎病的防治效果如下：

结果表明A1菌剂对棉花枯萎病的防治效果达到61.17％，具有良好的防治作用。

2.4白菜黑斑病防治

白菜黑斑病原菌孢子液制备:将病原菌接种到PDB培养基中，28℃，180r/min培养5-7d，调至孢子浓度为10⁸个/mL。

在人工气候箱中，采用培养滤纸法进行白菜种子萌发试验。白菜种子用体积分数0.2％的次氯酸钠溶液消毒10min，然后用蒸馏水漂洗3次，晾干备用。培养皿经过高温灭菌后铺上2层滤纸，选取籽粒饱满、大小均匀的白菜种子置于培养皿中，每个培养皿均匀放置30粒种子，置于人工气候箱中恒温培养(温度25℃，湿度75％，光照12h·d^-1)。培养过程中添加适量水以保持培养皿内滤纸的湿度，选取长势一致的白菜幼苗种植于土壤中。土壤中预先接种白菜黑斑病的病原菌孢子至10⁵个/g，处理组同时接种A1菌悬液至浓度为10⁶CFU/g，并设不接种A1菌剂和病原菌孢子为空白对照，每个处理3次重复，每次重复5株苗。播种后，观察记录发病情况，并于病原菌处理组发病明显时进行分级调查，计算病情指数和防治效果。根据白菜植株感病程度共分为9级：

0级：无病斑；

1级：病斑占叶片面积的5％以下；

3级：病斑占叶片面积的6％～10％；

5级：病斑占叶片面积的11％～25％；

7级：病斑占叶片面积的26％～50％；

9级：病斑占叶片面积的50％以上。

A1菌剂对白菜黑斑病的防治效果如下：

结果表明A1菌剂对白菜黑斑病的防治效果达到75.33％，具有良好的防治作用。

2.5棉花黄萎病防治

棉花黄萎病原菌孢子液制备：将病原菌接种到PDB培养基中，28℃，180r/min培养5-7d，调至孢子浓度为10⁸个/mL。

将棉花种子在含有无菌水的无菌培养皿中浸泡过夜后，将其转移至8％的NaClO中消毒5min，即用无菌水清洗5次，置于无菌水浸湿的纱布上，25℃避光萌发2.5d。挑选萌发优良的种子至霍格兰营养液中，以25℃，16h光照，25℃，8h黑暗为一周期，随后挑选长势相同的棉花幼苗种植于土壤中，土壤中预先接种棉花黄萎病的病原菌孢子至10⁵个/g，处理组同时接种A1菌悬液至浓度为10⁶CFU/g，并设不接种A1菌剂和病原菌孢子为空白对照，每个处理3次重复，每次重复5株苗。播种后，观察记录发病情况，并于病原菌处理组发病明显时进行分级调查，计算病情指数和防治效果。根据受病害的枯黄面积占整个叶片面积的百分比，将病情分级标准为：

正常(SL0)：0；

轻度(SL1)：0～25％；

中度(SL2)：25％～50％；

重度(SL3)：50％～75％；

极严重(SL4)：75％～100％。

A1菌剂对棉花黄萎病的防治效果如下：

结果表明A1菌剂对棉花黄萎病的防治效果达到55.55％，具有良好的防治作用。

2.6桃树褐腐病防治

桃树褐腐病原菌孢子液制备:将病原菌接种到PDB培养基中，28℃，180r/min培养5-7d，调至孢子浓度为10⁸个/mL。

将种子用0.3％高锰酸钾消毒，流水冲洗干净后，置于铺有纱布的培养皿中，25℃避光催芽。挑选萌发优良的种子至霍格兰营养液中，以25℃，16h光照，25℃，8h黑暗为一周期，随后挑选长势一致的幼苗种植于土壤中，土壤中预先接种桃树褐腐病的病原菌孢子至10⁵个/g，处理组同时接种A1菌悬液至浓度为10⁶CFU/g，并设不接种A1菌剂和病原菌孢子为空白对照，每个处理3次重复，每次重复5株苗。播种后，观察记录发病情况，并于病原菌处理组发病明显时进行分级调查，计算病情指数和防治效果。桃树褐腐病病害分级标准(叶片)：

0级：无病斑；

1级：病斑面积占整个叶面积的10％以下；

3级：病斑面积占整个叶面积的11％～25％；

5级：病斑面积占整个叶面积的26％～40％；

7级：病斑面积占整个叶面积的41％～65％；

9级：病斑面积占整个叶面积的66％以上。

A1菌剂对桃树褐腐病的防治效果如下：

结果表明A1菌剂对桃树褐腐病的防治效果达到50.67％，具有良好的防治作用。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本发明的具体实施例，本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims

1.一株苜蓿链霉菌A1，其特征在于，该菌株分离自河南省南阳市卧龙区种植基地土壤中，该菌株于2024年01月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.29628，分类命名为苜蓿链霉菌(Streptomyces alfalfae)A1。

2.如权利要求1所述的一株苜蓿链霉菌A1，其特征在于，菌株A1的16SrRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1-2中任一项所述的苜蓿链霉菌A1在防治植物病害中的应用。

4.如权利要求3所述的苜蓿链霉菌A1在防治农作物病害中的应用，其特征在于，所述植物病害包括但不限于油菜菌核病、棉花枯萎病、番茄灰霉病、桃树褐腐病、棉花黄蒌病和白菜黑斑病。

5.如权利要求1-2中任一项所述的苜蓿链霉菌A1在制备防治植物病害的菌剂中的应用，所述植物病害包括但不限于油菜菌核病、棉花枯萎病、番茄灰霉病、桃树褐腐病、棉花黄蒌病和白菜黑斑病。

6.一种生防菌剂，其特征在于，该生防菌剂是根据权利要求1-2中任一项所述的苜蓿链霉菌A1制备得到的，所述生防菌剂为生防菌株A1通过液体发酵培养后获得的发酵液。

7.如权利要求6所述的生防菌剂在制备生物农药中的应用，其特征在于，所述生物农药为防治油菜菌核病、棉花枯萎病、番茄灰霉病、桃树褐腐病、棉花黄蒌病或白菜黑斑病的生物农药。