KR102511500B1 - 파이브로넥틴 단편 단백질이 과발현된 세포외소포체 및 이의 약물 전달 용도 - Google Patents
파이브로넥틴 단편 단백질이 과발현된 세포외소포체 및 이의 약물 전달 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102511500B1 KR102511500B1 KR1020220137524A KR20220137524A KR102511500B1 KR 102511500 B1 KR102511500 B1 KR 102511500B1 KR 1020220137524 A KR1020220137524 A KR 1020220137524A KR 20220137524 A KR20220137524 A KR 20220137524A KR 102511500 B1 KR102511500 B1 KR 102511500B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- fibronectin
- evs
- domain
- cells
- protein
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 38
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims abstract description 58
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 30
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 claims description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 9
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 abstract description 7
- 238000010361 transduction Methods 0.000 abstract description 7
- 230000026683 transduction Effects 0.000 abstract description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 6
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 abstract description 4
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 abstract description 4
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 abstract description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 abstract description 2
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 9
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 4
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- BUOYTFVLNZIELF-UHFFFAOYSA-N 2-phenyl-1h-indole-4,6-dicarboximidamide Chemical compound N1C2=CC(C(=N)N)=CC(C(N)=N)=C2C=C1C1=CC=CC=C1 BUOYTFVLNZIELF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000378 calcium silicate Substances 0.000 description 1
- 229910052918 calcium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012241 calcium silicate Nutrition 0.000 description 1
- OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N calcium;dioxido(oxo)silane Chemical compound [Ca+2].[O-][Si]([O-])=O OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000845 maltitol Substances 0.000 description 1
- 235000010449 maltitol Nutrition 0.000 description 1
- VQHSOMBJVWLPSR-WUJBLJFYSA-N maltitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O VQHSOMBJVWLPSR-WUJBLJFYSA-N 0.000 description 1
- 229940035436 maltitol Drugs 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/46—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. skin, bone, milk, cotton fibre, eggshell, oxgall or plant extracts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Botany (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
Abstract
본 발명은 파이브로넥틴 단편 단백질이 과발현된 세포외소포체 및 이의 약물 전달 용도에 관한 것으로, 본 발명은 파이브로넥틴의 RGD 도메인과 Hep II 도메인을 EV 막 표면에 과발현시킴으로써 세포 내부로의 EV 전달 효율을 증가시키는 방법으로, 상기 방법을 통해서 파이브로넥틴 도메인 과발현 EV는 대조군 보다 세포 내부로의 EV 전달 효율이 증가함을 확인하였다. 유전자 형질도입을 통한 과발현 과정이 EV의 크기나 표지 유전자(CD9, HSP70)발현에 영향을 미치지 않고 세포 전달 효율만 증진시킬 수 있음을 확인하였다. 상기 방법은 EV의 효과적인 세포로의 전달을 통해 EV 연구에 소요되는 시간과 노력 비용을 줄여주며 세포 간의 메커니즘 연구와 질병과 질환의 약물 전달 매개체로써 제공될 수 있다.
Description
본 발명은 파이브로넥틴 단편 단백질이 과발현된 세포외소포체(extracellular vesicles; EV) 및 이의 약물 전달 용도에 대한 것이다.
EV는 세포가 세포 외부로 내보내는 소낭으로 지질 이중층 구조로 되어 있으며 세포 간의 상호작용을 담당하는 물질이다. 또한, EV는 유래 세포의 단백질, 핵산 등과 같은 대사물질들을 포함하고 있어, 세포 간의 신호 전달에도 중요한 역할을 하고 있다. 최근에는 EV 내부에 특정 물질을 넣어주는 공정 등을 통해서 치료와 재생을 위한 재료 및 약물 전달체로써도 가치를 주목받고 있다.
EV는 지질 이중층 막으로 되어있는데 그 막 표면에도 많은 단백질들을 함유하고 있다. 그 중에서도 EV 표면의 파이브로넥틴(fibronectin)과 헤파린 설페이트(heparan sulfate)가 세포와 EV의 상호작용을 담당하고 있다고 여러 논문들에서 주장한 바 있다.
EV의 표면에 존재하는 Lamp2b라는 막 단백질에 특정 단백질이나 아미노산 서열을 달도록 공정을 한 후에 원하는 물질을 전달하고 특정 조직이나 세포에 특이성을 가진 EV를 만들어 내는 연구들도 활발히 진행되고 있다. 이처럼 EV는 미래의 치료 약물 및 세포 간의 메커니즘을 이해하게 해줄 매개체로 유망하며 그 작용 기전과 정확한 정의를 내리기 위해서 더욱 더 많은 연구들이 진행되고 있다.
EV는 체액, 혈청 또는 세포의 배양액 등에서 얻을 수 있는데, 비록 EV들이 목표로 정해진 세포에 들어가 효과를 보이더라도 실험과 치료를 위해서는 엄청난 양의 체액과 혈청 및 세포가 필요하며, 그에 따라 많은 시간과 노력 및 비용이 수반된다.
이러한 한계점을 극복하기 위해서 적은 양의 EV를 처리하더라도 세포가 많은 양의 EV를 받아들일 수 있도록 하여 그에 따른 EV의 효과를 효과적으로 활용할 수 있는 방안이 하나의 해결책으로 제시될 수 있다.
본 발명의 목적은 파이브로넥틴 RGD 도메인 및 파이브로넥틴 Hep II 도메인으로 이루어진 파이브로넥틴 단편 단백질 및 Lamp2b 단백질이 결합되어, 상기 파이브로넥틴 단편 단백질이 세포외소포체 막 표면에 과발현된 세포외소포체 및 이의 약물 전달 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 파이브로넥틴 RGD 도메인 및 파이브로넥틴 Hep II 도메인으로 이루어진 파이브로넥틴 단편 단백질 및 Lamp2b 단백질이 결합되어, 상기 파이브로넥틴 단편 단백질이 세포외소포체 막 표면에 과발현된 세포외소포체를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 세포외소포체를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명은 파이브로넥틴 단편 단백질이 과발현된 세포외소포체 및 이의 약물 전달 용도에 관한 것으로, 본 발명은 적은 양의 EV를 처리하더라도 많은 양의 EV를 처리했을 때와 같은 치료 효과 및 변화를 이끌어낼 수 있다. 파이브로넥틴의 RGD 도메인과 Hep II 도메인은 세포의 부착성(adhesive behavior)을 담당한다. 따라서 두 가지 도메인은 유기적으로 세포의 부착성을 증가시키기 때문에 이 부분을 EV 막에 과발현시킴으로써 EV가 세포에 더욱 잘 부착해 내부로 수월하게 들어갈 수 있도록 한다. 즉, 본 발명에 따르면 EV는 세포에 대한 부착성이 증가하고 세포 내부로 더욱 잘 들어가게 됨으로써 적은 양의 EV를 처리함에도 많은 양의 EV를 처리했을 때와 같은 효과를 보이므로, 많은 시간과 노력 및 재료를 줄일 수 있고 효과적인 약물 전달 물질로 이용될 수 있다.
도 1은 파이브로넥틴의 RGD 와 Hep II 도메인이 결합된 Lamp2b 단백질 과발현 백터의 ORF(open reading frame) 서열을 나타낸 것이다.
도 2(A)는 Lamp2b와 결합한 파이브로넥틴의 RGD 와 Hep II 도메인을 발현시킬 수 있는 벡터의 모식도이다. 도 2(B)는 벡터 내의 목표 단백질을 시각화해서 보여주는 모식도이고, 도 2(C)는 그 결과물인 공정된 EV를 나타내는 모식도이다.
도 3은 일반 MSC에서 뽑은 EV와 형질 도입된 MSC에서 뽑은 EV를 나노입자 추적 분석기(Nanoparticle tracking analysis)를 이용하여 각 EV의 크기와 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4(A)는 일반 MSC에서 뽑은 EV와 형질 도입된 MSC에서 뽑은 EV의 파이브로넥틴과 EV의 발현 단백질인 CD 9와 HSP 70의 발현양을 웨스턴 블랏 (Western blot)을 이용해 확인한 결과를 나타내고, 도 4(B)는 도 4 (A)의 밴드 강도를 image J 프로그램을 이용하여 정량한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 일반 EV 보다 파이브로넥틴 항체 또는 RGD 펩타이드를 EV에 처리했을 때 세포의 EV 흡수율이 더 낮음을 보여주는 이미지이다.
도 6은 EV를 처리하지 않은 대조군과 일반 EV, 파이브로넥틴 도메인 과발현 EV를 각각 MSC에 처리하여 EV의 세포 내 전달 효율을 비교하였을 때, 파이브로넥틴 도메인 과발현 EV의 전달효율이 더 높음을 보여주는 이미지이다.
도 2(A)는 Lamp2b와 결합한 파이브로넥틴의 RGD 와 Hep II 도메인을 발현시킬 수 있는 벡터의 모식도이다. 도 2(B)는 벡터 내의 목표 단백질을 시각화해서 보여주는 모식도이고, 도 2(C)는 그 결과물인 공정된 EV를 나타내는 모식도이다.
도 3은 일반 MSC에서 뽑은 EV와 형질 도입된 MSC에서 뽑은 EV를 나노입자 추적 분석기(Nanoparticle tracking analysis)를 이용하여 각 EV의 크기와 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4(A)는 일반 MSC에서 뽑은 EV와 형질 도입된 MSC에서 뽑은 EV의 파이브로넥틴과 EV의 발현 단백질인 CD 9와 HSP 70의 발현양을 웨스턴 블랏 (Western blot)을 이용해 확인한 결과를 나타내고, 도 4(B)는 도 4 (A)의 밴드 강도를 image J 프로그램을 이용하여 정량한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 일반 EV 보다 파이브로넥틴 항체 또는 RGD 펩타이드를 EV에 처리했을 때 세포의 EV 흡수율이 더 낮음을 보여주는 이미지이다.
도 6은 EV를 처리하지 않은 대조군과 일반 EV, 파이브로넥틴 도메인 과발현 EV를 각각 MSC에 처리하여 EV의 세포 내 전달 효율을 비교하였을 때, 파이브로넥틴 도메인 과발현 EV의 전달효율이 더 높음을 보여주는 이미지이다.
본 발명은 적은 양의 EV를 처리하더라도 많은 양의 EV를 처리했을 때와 같은 치료 효과 및 변화를 이끌어내고자 하였다. 파이브로넥틴의 RGD 도메인과 Hep II 도메인은 세포의 부착성(adhesive behavior)을 담당한다. 따라서 두 가지 도메인은 유기적으로 세포의 부착성을 증가시키기 때문에, 이 부분을 EV 막에 과발현시킴으로써 EV가 세포에 더욱 잘 부착해 내부로 수월하게 들어갈 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 파이브로넥틴 RGD 도메인 및 파이브로넥틴 Hep II 도메인으로 이루어진 파이브로넥틴 단편 단백질 및 Lamp2b 단백질이 결합되어, 상기 파이브로넥틴 단편 단백질이 세포외소포체 막 표면에 과발현된 세포외소포체를 제공한다.
바람직하게는, 상기 파이브로넥틴 RGD 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고, 상기 파이브로넥틴 Hep II 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되며, 상기 Lamp2b 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 파이브로넥틴 단편 단백질 및 상기 Lamp2b 단백질은 링커로 결합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 세포외소포체는 100 내지 200nm의 크기일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 세포외소포체를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 세포 내부로의 세포외소포체 전달 효율을 증진시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 상기 약물은 동물 또는 사람의 체내에서 생리적인 기능을 촉진 또는 억제하여 목적하는 생물학적 또는 약리학적 효과를 유도할 수 있는 물질로서, 동물 또는 사람에게 투여하기 적합한 화학적 또는 생물학적 물질 또는 화합물을 의미하며, 감염 예방과 같은 원하지 않은 생물학적 효과를 예방하여 유기물에 대한 예방효과를 가지고, 질병으로 생기는 컨디션을 경감시키며, 예를 들어 질병의 결과로 생기는 고통 또는 감염을 완화시키며, 유기물로부터 질병을 완화, 감소 또는 완전히 제거할 수 있는 역할을 할 수 있다.
한편, 본 발명에서 상기 약물 전달용 조성물은 상기 세포외소포체 외에 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 "약학적으로 허용되는"은 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 의미한다.
상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
또한, 이외에도 상기 약물 전달용 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약물 전달용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 약물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 약물 전달용 조성물은 약물이 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이며 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐이므로 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1.
파이브로넥틴
도메인 과발현 EV 생산을 위한 유전자 형질 도입
형질 주입(Transfection) 이틀 전에, GP2-293 세포를 100 미리미터 크기의 배양 접시에 200만 세포씩 씨딩하였다. 형질 주입을 위해서 Eppendorf tube(1)에 DNA 5 마이크로그램 + pMX-vsvg 2.5 마이크로그램 + OPTI-MEM을 총 용량 400 마이크로리터로 제작하였다. Eppendorf tube(2)에 Lipofectamine 2000 22.5 마이크로리터와 OPTI-MEM 377.5 마이크로리터를 넣어 총 용량을 400 마이크로리터로 제작하였다. Eppendorf tube(1) 과 Eppendorf tube(2)를 섞은 후 상온에서 5분간 반응시켰다. 그 후에 Fetal Bovine Serum (FBS)를 넣지 않은 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM/High glucose media) 7 미리리터와 섞은 후에 세포에 처리하였다.
형질 주입 24시간 후에 미디어 1차 수득을 진행하였으며 같은 날 형질 도입 (Transduction)을 진행할 중간엽 줄기세포를 100 미리미터 배양 접시에 100만 개씩 씨딩하였다. 형질 주입 후 48시간째에 미디어 2차 수득을 진행하였으며 전날 수득한 미디어와 섞은 후 1,300 rpm에서 3분간 원심분리를 진행하였다. 그 후에 상층액만 모아 0.45 마이크로미터 필터로 필터처리를 진행한 후에 10 키로달톤 크기의 Millipore Amicon filter로 4,000 ×g에서 20분 간 2 번 원심분리를 진행하였다. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM/Low glucose media) 10 미리리터와 1 미리리터 당 8 미리그램으로 녹아있는 Polyblene 10 마이크로리터 와 함께 필터에 걸려있는 바이러스를 형질 도입할 세포에 처리하였다. 형질 도입 24시간 후에 DMEM/Low Glucose Media로 교체하였다.
2.
중간엽
줄기세포에서 EV의 추출 방법
세포가 약 90% 정도 찼을 때 PBS로 2번 세척한 후에 Fetal Bovine serum (FBS)가 없는 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM/Low glucose media) 로 갈아준다. 24시간 후에 미디어를 수득하고 세포의 잔여물질 등을 제거하기 위해 1,300 rpm 에 3분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 다시 모은 후에 0.22 마이크로미터 크기로 필터 하였다. 필터 된 미디어를 10 키로달톤 크기인 Millipore Amicon filter를 이용하여 4000 ×g에서 20분 동안 세 번 원심 분리하였다. 얻어진 EV를 총 용량이 200 마이크로리터 가 되도록 PBS로 희석하였다. 공정된 EV를 추출할 때는 형질 도입을 하고 이틀 후에 PBS로 2번 세척을 시작하는 상기 방법과 동일하게 진행하였다.
3. 추출된 EV의 농도 및 크기 측정
총 200 마이크로리터로 희석된 EV의 희석액 10 마이크로리터와 990 마이크로리터의 PBS를 섞은 후에 Nanoparticle tracking analysis (NTA)를 이용하여 EV의 농도를 측정하였다.
4. EV의 단백질 발현 분석
1×109개의 EV를 PAGE gel의 한 웰에 주입하고 전기 영동법으로 분리한 후에 nitrocellulose 필터 막으로 옮겼다. 필터 막을 5% skim milk를 녹인 TBST 용액에 (Tris-buffered saline Triton ×100) 1시간 동안 반응시킨 후에 1차 항체 Fibronectin (abcam), CD9 (santacruz), HSP70 (santacruz), GAPDH (santacrus)를 1:500의 비율로 희석된 5% BSA(Bovine serum albumin)와 18시간 동안 반응시켰다. 필터막을 다시 TBST로 8분간 3번 세척한 후에 이차 항체 anti-mouse-HRP 와 anti-goat-HRP를 1:2500의 비율로 5% skim milk에 희석하고 1시간 동안 반응시켰다. 필터막을 다시 TBST로 8분간 3번 세척한 후에 ECL 용액을 처리하여 단백질 밴드의 강도를 Bio-Rad Image Lab software 로 측정하였다.
5.
세포내
EV 전달 효율 분석
35 미리미터 크기의 배양 접시 안에 한 개의 커버 글라스를 넣고 그 위에 0.1 % Gelatin 코팅 후, MSC를 10만 개씩 씨딩하였다. 미디어는 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM/Low glucose media)를 사용하였고 하루 동안 37℃ 이산화탄소 5%의 인큐베이터 안에서 배양시켰다. 또한 EV에 형광염색을 하기 위해서 PKH26 염색키트를 사용하였다. 추출한 Exosome 10^9개를 400 마이크로 리터의 PBS와 함께 100 키로달톤 크기인 Millipore Amicon filter에 넣고, 13000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 EV를 농축하였다. PKH 26 염색 키트의 Diluent C 용액 400 마이크로 리터와 PKH26 Dye 0.8 마이크로 리터를 섞어 1분간 반응시킨다. 이를 농축시킨 EV와 5분간 반응시킨다. 5분 후 13000 rpm으로 20분씩 두 번 원심분리 진행하였다. 원심분리 후 필터링 된 용액을 파이펫으로 추출하여 100 키로달톤 크기인 새로운 Millipore Amicon filter에 옮겨 400 마이크로 리터의 PBS를 넣고 13000 rpm에서 20분 원심분리 진행하였다. 100 키로달톤 크기인 Millipore Amicon filter을 뒤집어서 13000 rpm으로 1분 원심분리 후 PKH 26이 염색된 EV를 수득하였다. 200 마이크로 리터의 PBS를 넣어 냉장 보관하였다.
다음날 미디어를 교체해주면서 PKH26이 염색된 EV를 1×108 개씩 35 미리미터 크기 배양 접시 한 개에 미디어와 함께 섞어서 처리해주었다. 인큐베이터 안에서 3시간 동안 반응 후에 꺼내고 PBS로 5분 동안 워싱해 주었다. 그 후에 4% paraformaldehyde로 5 분간 상온에서 처리한 후 PBS로 3번씩 1분 동안 워싱해 주었다. 1 미리리터 당 1 미리그램의 DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)가 녹은 용액을 1:500의 비율로 PBS에 희석 후 상온에서 1분간 반응시킨 후 PBS로 2분 동안 3 번씩 워싱해 주었다. 커버글라스를 뒤집어서 슬라이드 글라스 위에 올린 후 고해상도 자동형광 현미경 (Fluorescence Microscopy)를 이용하여 관찰하였다.
<
실시예
1>
파이브로넥틴의
RGD
와 Hep II 도메인이
결합된
Lamp2b
단백질 과발현 벡터의 제작
파이브로넥틴의 RGD와 Hep II 도메인이 Lamp2b와 결합된 단백질을 과발현시킬 수 있는 백터를 제작하였다. 각 단백질의 아미노산 서열들을 연결시켰고 Hep II 도메인과 Lamp2b 사이에 링커 단백질인 GGGSGGGS을 추가하였으며, pMX 레트로바이러스(retrovirus) 벡터를 백본(backbone)으로 하는 과발현 벡터를 제작하였다.
도 1은 파이브로넥틴의 RGD 와 Hep II 도메인 그리고 Lamp2b 의 아미노산 서열을 나타낸다. 주황색은 신호 펩타이드(Signal peptide), 초록색은 RGD 도메인 서열을, 파란색은 Hep II 도메인 서열을 나타내며 노란색은 연결 단백질 서열이고 검정색은 Lamp2b 서열이다.
도 2(A)는 Lamp2b 와 결합한 파이브로넥틴의 RGD 와 Hep II 도메인을 발현시킬 수 있는 벡터의 모식도이다. 도 2(B)는 벡터 내의 목표 단백질을 시각화해서 보여주는 모식도이고, 도 2(C)는 그 결과물인 공정된 EV를 나타내는 모식도이다.
<
실시예
2> EV의 크기 분석
도 3은 파이브로넥틴 도메인 과발현 EV와 대조군의 크기 분포를 NTA를 통해 측정한 결과이다. 표 1과 같이 대조군을 pMXs 공벡터(Mock vector)로 설정하였다.
| 구분 | 유전자 형질도입 백터 | 명명 |
| 대조군 | pMXs-Mock | Control EV |
| 실험군 | pMXs-FN-fg | FN-fg EV |
EV의 크기 분포를 측정한 결과에서는 대조군과 실험군 모두 유사한 크기 분포를 나타내는 것으로 확인되었다.
<
실시예
3> EV의 단백질 발현 분석
파이브로넥틴 도메인 과발현 EV의 파이브로넥틴 도메인 과발현 및 EV 표지 유전자 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. 표 2와 같이 대조군 및 실험군의 단백질 발현을 비교하였다.
| 구분 | 유전자 형질도입 백터 | 명명 |
| 대조군 | pMXs-Mock | Control Exo |
| 실험군 | pMXs-FN-fg | FN-fg Exo |
도 4(A)는 대조군과 실험군의 파이브로넥틴, EV 표지 유전자(CD9, HSP70), GAPDH의 발현을 확인한 결과이다. 그 결과에서는 파이브로넥틴의 발현이 실험군에서 대조군에 비해 증가함을 확인하였다. 또한, EV 표지 유전자(CD9, SHP70)가 대조군과 실험군 모두에서 발현되는 것을 확인하였다.
GAPDH 발현 정도를 통해서 비교군들의 단백질 총량에 대한 정규화를 진행하였다. 도 4(B)는 도 4(A)의 파이브로넥틴의 밴드 강도를 image J 프로그램을 사용하여 정량한 것이다. GAPDH 밴드 강도를 기준으로 파이브로넥틴의 밴드 강도에 대한 정규화를 진행하였다. 그 결과에서는 실험군에서 대조군에 비해 파이브로넥틴 발현이 증가한 것을 확인하였다.
<
실시예
4>
파이브로넥틴
도메인 블로킹(blocking)을 통한
세포내
전달효능 분석
세포내 EV 전달이 파이브로넥틴이나 RGD 서열에 의해서 매개되는 것인지 확인하기 위해서 표 3과 같이 비교군을 성정하여 EV 1×108 개에 파이브로넥틴 항체 1 마이크로리터와 RGD 펩타이드 50 마이크로그램을 각각 처리하였고, 4℃에서 12시간 동안 반응시킨 후 상기 방법을 통하여 EV에 PKH67 염색을 실시하고 세포에 처리하였다. DAPI로 염색된 세포의 핵 주위에 초록색 형광을 띄는 EV가 얼마나 존재하는 지로 흡수율을 확인하였다.
| 구분 | 처리 | 명명 |
| 대조군 | - | Control |
| 실험군1 | 파이브로넥틴 항체 | FN antibody |
| 실험군2 | RGD 펩타이드 | RGD peptide |
도 5는 파이브로넥틴 항체와 RGD 펩타이드를 처리한 경우에는 세포 내부로의 EV 전달율이 아무것도 넣지 않은 대조군보다 현저히 떨어지는 것을 확인하였다. 따라서, 파이브로넥틴과 RGD 펩타이드 결합 수용체가 세포 내부로의 EV 전달에 관여한다는 것을 확인하였다.
<
실시예
5>
파이브로넥틴
도메인 과발현 EV의
세포내
전달효율 분석
파이브로넥틴 도메인 과발현 EV의 세포내 전달 효율을 확인하기 위해 표 4와 같이 비교군을 설정하여 비교 실험을 진행하였다. 세포내 전달효율을 확인하기 위해서 PKH26으로 형광 표지된 EV를 사용하였으며, 형광 강도를 형광현미경으로 측정하였다.
| 구분 | 처리 |
| 대조군 | None |
| 실험군1 | Control EV |
| 실험군2 | FN-fg EV |
도 6은 파이브로넥틴 도메인 과발현 EV의 세포내 전달 효율을 확인한 결과이다. 그 결과에서는 실험군 2에서 대조군 및 실험군 1에 비해 형광 강도가 높게 나타난 것을 형광 이미징을 통해 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
Claims (6)
- 파이브로넥틴 RGD 도메인 및 파이브로넥틴 Hep II 도메인으로 이루어진 파이브로넥틴 단편 단백질 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 Lamp2b 단백질이 결합되어, 상기 파이브로넥틴 단편 단백질이 세포외소포체 막 표면에 과발현된 세포외소포체.
- 제1항에 있어서, 상기 파이브로넥틴 RGD 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고, 상기 파이브로넥틴 Hep II 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 세포외소포체.
- 제1항에 있어서, 상기 파이브로넥틴 단편 단백질 및 상기 Lamp2b 단백질은 링커로 결합되는 것을 특징으로 하는 세포외소포체.
- 제1항에 있어서, 상기 세포외소포체는 100 내지 200nm의 크기인 것을 특징으로 하는 세포외소포체.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 세포외소포체를 포함하는 약물 전달용 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 조성물은 세포 내부로의 세포외소포체 전달 효율을 증진시키는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220137524A KR102511500B1 (ko) | 2022-10-24 | 2022-10-24 | 파이브로넥틴 단편 단백질이 과발현된 세포외소포체 및 이의 약물 전달 용도 |
| PCT/KR2023/016244 WO2024090893A1 (ko) | 2022-10-24 | 2023-10-19 | 파이브로넥틴 단편 단백질이 과발현된 세포외소포체 및 이의 약물 전달 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220137524A KR102511500B1 (ko) | 2022-10-24 | 2022-10-24 | 파이브로넥틴 단편 단백질이 과발현된 세포외소포체 및 이의 약물 전달 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102511500B1 true KR102511500B1 (ko) | 2023-03-21 |
Family
ID=85801463
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220137524A KR102511500B1 (ko) | 2022-10-24 | 2022-10-24 | 파이브로넥틴 단편 단백질이 과발현된 세포외소포체 및 이의 약물 전달 용도 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102511500B1 (ko) |
| WO (1) | WO2024090893A1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024090893A1 (ko) * | 2022-10-24 | 2024-05-02 | 동국대학교 산학협력단 | 파이브로넥틴 단편 단백질이 과발현된 세포외소포체 및 이의 약물 전달 용도 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220004035A (ko) * | 2019-03-21 | 2022-01-11 | 코디악 바이오사이언시즈, 인크. | 백신 전달을 위한 세포외 소포 |
| WO2022133301A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Entelexo Biotherapeutics, Inc. | Platforms, compositions, and methods for therapeutic delivery |
| KR20220101559A (ko) * | 2021-01-11 | 2022-07-19 | 주식회사 엑소코바이오 | 과발현된 Fc 수용체 또는 이의 일부를 포함하는 엑소좀 및 이의 제조방법 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102511500B1 (ko) * | 2022-10-24 | 2023-03-21 | 동국대학교 산학협력단 | 파이브로넥틴 단편 단백질이 과발현된 세포외소포체 및 이의 약물 전달 용도 |
-
2022
- 2022-10-24 KR KR1020220137524A patent/KR102511500B1/ko active IP Right Grant
-
2023
- 2023-10-19 WO PCT/KR2023/016244 patent/WO2024090893A1/ko unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220004035A (ko) * | 2019-03-21 | 2022-01-11 | 코디악 바이오사이언시즈, 인크. | 백신 전달을 위한 세포외 소포 |
| WO2022133301A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Entelexo Biotherapeutics, Inc. | Platforms, compositions, and methods for therapeutic delivery |
| KR20220101559A (ko) * | 2021-01-11 | 2022-07-19 | 주식회사 엑소코바이오 | 과발현된 Fc 수용체 또는 이의 일부를 포함하는 엑소좀 및 이의 제조방법 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Encyclopedia.,1(2):350-359(2021.4.8.) * |
| Experimental & Molecular Medicine.,51:1-12(2019.3.15.) * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024090893A1 (ko) * | 2022-10-24 | 2024-05-02 | 동국대학교 산학협력단 | 파이브로넥틴 단편 단백질이 과발현된 세포외소포체 및 이의 약물 전달 용도 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2024090893A1 (ko) | 2024-05-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102262260B1 (ko) | 엔도좀 탈출능을 갖는 펩티드 핵산 복합체 및 이의 용도 | |
| JP6818889B2 (ja) | 細胞透過性が向上したペプチド核酸複合体およびそれを含む薬学的組成物 | |
| JP2022084697A (ja) | 神経変性を治療するための方法及び組成物 | |
| AU2017245384A1 (en) | Compositions and methods for tolerizing cellular systems | |
| US20120122210A1 (en) | Carrier peptide fragment and use thereof | |
| JP2016538829A (ja) | 低密度リポタンパク質受容体をコードするポリヌクレオチド | |
| WO2021093298A1 (zh) | 一种Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体及其制备方法和应用 | |
| KR102511500B1 (ko) | 파이브로넥틴 단편 단백질이 과발현된 세포외소포체 및 이의 약물 전달 용도 | |
| Sun et al. | An Antisense Oligonucleotide-Loaded Blood–Brain Barrier Penetrable Nanoparticle Mediating Recruitment of Endogenous Neural Stem Cells for the Treatment of Parkinson’s Disease | |
| KR20220041397A (ko) | 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 조성물 | |
| EP3723732A1 (en) | Arc protein extracellular vesicle nucleic acid delivery platform | |
| WO2014046423A1 (ko) | 종양선택적 투과기능성을 가지는 펩타이드 및 그 용도 | |
| Lian et al. | Pentraxin 3 secreted by human adipose‐derived stem cells promotes dopaminergic neuron repair in Parkinson's disease via the inhibition of apoptosis | |
| US20210332363A1 (en) | Blood-brain barrier permeable aptamer and application thereof | |
| KR20210039495A (ko) | 피드백이 가능한 합성 유전자, 표적 시드 매치 카세트, 및 그 용도 | |
| KR102519059B1 (ko) | 혈뇌장벽 투과능을 가지는 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 조성물 | |
| US10925933B2 (en) | Method of preventing rheumatoid arthritis comprising administering polynucleotide encoding SSU72 | |
| RU2317097C2 (ru) | Гетерокарпин, белок растительного происхождения, обладающий противораковыми свойствами | |
| CN113337468A (zh) | 一种双功能化外泌体及其制备方法和在脑卒中修复的应用 | |
| Reis et al. | Prospects of TAT-mediated protein therapy for fragile X syndrome | |
| CN111686124A (zh) | miR-486-3p在制备治疗SAH导致的神经炎症产品中的应用 | |
| CN111057708B (zh) | 一种核酸及其在治疗或改善男性代谢综合征中的应用 | |
| US20240002855A1 (en) | Nucleic Acid Molecule Binding to YB-1 Protein | |
| US20100292454A1 (en) | Neuronal regeneration promoting agent | |
| JPH04507251A (ja) | パーキンソン病治療用のドーパミン作動性神経栄養因子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |